KR101229995B1 - 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 - Google Patents

생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR101229995B1
KR101229995B1 KR1020010072713A KR20010072713A KR101229995B1 KR 101229995 B1 KR101229995 B1 KR 101229995B1 KR 1020010072713 A KR1020010072713 A KR 1020010072713A KR 20010072713 A KR20010072713 A KR 20010072713A KR 101229995 B1 KR101229995 B1 KR 101229995B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
epo
leu
ectp
fusion protein
gene
Prior art date
Application number
KR1020010072713A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020046150A (ko
Inventor
이동억
오명석
김기완
정보섭
박지숙
Original Assignee
씨제이 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이 주식회사 filed Critical 씨제이 주식회사
Priority to US10/433,508 priority Critical patent/US8008454B2/en
Priority to AT01270554T priority patent/ATE320449T1/de
Priority to AU2002222740A priority patent/AU2002222740A1/en
Priority to EP01270554A priority patent/EP1342730B1/en
Priority to JP2002549725A priority patent/JP3946638B2/ja
Priority to PCT/KR2001/002137 priority patent/WO2002048194A1/en
Priority to DE60117919T priority patent/DE60117919T2/de
Publication of KR20020046150A publication Critical patent/KR20020046150A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101229995B1 publication Critical patent/KR101229995B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin)의 카르복시 말단에 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin) β 서브유닛의 카르복시 말단 펩타이드 단편(carboxy terminal peptide)이 융합된, 인간 에리스로포이에틴의 생체내(in vivo) 활성이 증진된 융합단백질(fusion protein)에 관한 것으로서, 상기 융합단백질은 에리스로포이에틴의 고유활성 자체는 그대로 보유하면서 당쇄 함량이 증가되어 생체내 반감기가 획기적으로 증가되는 한편, 체내 적용시 항원성을 유발하지 않는다.

Description

생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질{Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin}
도 1은 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG)의 카르복시 말단 펩타이드(CTP)의 염기 및 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 2는 에리스로포이에틴(EPO)과 CTP의 융합단백질(ECTP)의 염기 및 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 3은 발현벡터 pCMV-ECTP의 제작과정을 나타내는 모식도;
도 4는 발현벡터 pcDNA3.1-ECTP의 제작과정을 나타내는 모식도;
도 5a는 정제된 ECTP의 전기영동 사진;
도 5b는 발현된 EPO와 ECTP의 IEF 사진; 및,
도 6는 EPO와 ECTP의 약동력학 결과를 나타내는 그래프.
본 발명은 신성 빈혈치료제인 에리스로포이에틴(erythropoietin: 이하, EPO"라 함)의 생체내(in vivo) 활성이 증진된 융합단백질(fusion protein)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 EPO 분자에 반감기(half-life) 증가활성을 갖는, 생체내 유래의 특정 펩타이드가 융합됨으로써, 생체내 반감기가 증가되어 에리스로포이에틴 활성이 획기적으로 증진된 융합단백질에 관한 것이다.
EPO는 분자량 30,000∼34,000의 당단백질로서, 적혈구의 생성 및 분화를 촉진하는 조혈인자이다. 이 단백질은 적혈구 전구세포의 수용체에 결합하여 작용을 시작하며 세포내 칼슘이온 농도의 증가, DNA 생합성의 증가 및 헤모글로빈 생성 자극 등을 일으킨다. 이 자극인자 EPO는 신장병 환자의 빈혈, 미숙아의 빈혈, 갑상선기능부전(hypothyroidism)으로 인한 빈혈, 영양실조로 인한 빈혈 등의 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 인간 천연형 EPO의 임상적 이용은 계속 확대되고 있는 추세이나, 짧은 반감기로 인해 평균 매주 3 회 정도의 투여를 필요로 하므로 불편함과 고비용을 유발한다. 따라서, 이들의 생체내 활성을 장기간 유지시키면 그 이용빈도를 훨씬 감소시킬 수 있다.
EPO의 생체내 활성도는 생체내 반감기와 비례한다. 생체내에서의 반감기는 EPO가 갖는 당쇄의 말단에 위치하는 사이알릭산(sialic acid)의 함량과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, EPO의 생체내 활성은 당쇄의 존재에 의해 크게 좌우된다. 그런데, 당쇄의 형태는 세포의 종류에 따라 각각 다르게 나타나므로, 동일한 당단백질을 서로 다른 종류의 세포에서 발현시키면 각기 독특한 당쇄 형태를 나타낸다. 박테리아, 예를 들어 대장균(E. coli)은 단백질에 당쇄를 붙이지 못하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 대장균에서 발현되는 단백질에는 당이 첨가되어 있지 아니하므로, 대장균에서 발현된 EPO는 당쇄를 포함하지 않고, 이 경우 시험관내(in vitro)에서는 활성이 확인되지만 생체내에서는 전혀 활성을 갖지 못한 다. 그 이유는 당쇄가 결여된 EPO는 당쇄를 갖는 것에 비해 체내에서 급속히 제거되어 그 반감기가 극히 짧기 때문이다. 결국, 당쇄의 존재 유무는 EPO의 활성에 매우 중요한 역할을 담당한다.
그동안 EPO의 활성을 증가시키기 위하여 많은 연구가 이루어져 왔다. 그중 주류를 이룬 것은 돌연변이 유발방법(mutagenesis)을 이용하여 EPO 유전자에 돌연변이를 유발시킴으로써 몇몇 아미노산을 치환시켜 그 목적을 달성하는 방법이다. 예를 들어, PCT/US94/09257(명칭: 에리스로포이에틴 유사체, 출원인: 암젠)에는 돌연변이 유발에 의해 EPO의 당 함량을 증가시킴으로써 체내 반감기를 증가시키는 방법이 개시되어 있다. 또한, EPO의 이합체(dimer) 형성에 의해 생체내 반감기를 증가시키려는 시도도 있었다(A.J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778). 그밖에도, 유전공학적 방법을 이용하여 EPO 분자에 새로운 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 단편을 융합시켜 EPO의 당쇄 함량, 구체적으로는, 사이알릭산의 함량을 증가시킴으로써 생체내 활성도를 증진시키는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이때 아미노산, 펩타이드 또는 이종의 단백질 단편으로 아무 것이나 사용할 수는 없다. 대부분의 경우, 이러한 변형은 단백질 고유의 활성을 저하 또는 상실시키는 결과를 초래하며 체내에 사용될 때 통상 발생할 수 있는 항원성의 문제를 일으킬 수 있기 때문이다.
EPO에 대한 것은 아니지만 융합단백질 또는 키메라 단백질(chimeric protein) 등이 연구되고 있으며, 잘 알려진 예로는 성호르몬의 일종인 난포형성호르몬에 대한 것이 있다(Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol.). 그러나, 실 제 산업상 이용 가능한 적용 예는 없었다. 그 이유는 유전공학을 이용한 단백질의 변형 시도는 많은 위험을 내포하는데, 일단 그 목적단백질 자체를 얻는 것도 쉽지 않은 전문성을 요구하는데다가, 새로운 아미노산 등이 첨가되거나 치환됨으로써 단백질 고유의 활성 자체가 상실되거나 감소되는 정반대의 결과를 가져오는 경우가 거의 대부분이기 때문이다.
본 발명자들은 EPO 분자에 새로운 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 단편을 융합시켜 EPO의 당쇄 함량을 증가시킴으로써 그의 생체내 활성도를 증진시킬 수 있는 새로운 방법을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 체내에 이미 존재하는 단백질인 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, 이하, HCG"라 함)의 β 서브유닛(subunit)의 카르복시 말단에 위치하는 펩타이드 단편(carboxy terminal peptide, 이하 CTP"라 함)을 EPO의 카르복시 말단에 융합시켜 얻은 융합단백질이 EPO의 고유활성 자체는 그대로 보유하면서 당쇄(glycosylation site)를 증가시키는 아미노산을 다량 함유하여 생체내 반감기가 획기적으로 증가되는 한편, 체내 적용시 항원성도 유발하지 않는다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 EPO의 카르복시 말단에 HCG β 서브유닛의 CTP가 융합된, 인간 EPO의 생체내 활성이 증진된 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이 다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 증진된 인간 EPO 활성을 갖는 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
첫째, 본 발명은 인간 EPO의 카르복시 말단에 HCG β 서브유닛의 CTP가 융합된, 생체내 인간 EPO 활성이 증진된 융합단백질에 관한 것이다. 상기 CTP는 서열번호 1에 기재된 HCG β 서브유닛의 112 내지 145번 위치 아미노산 또는 그 일부, 특히 118 내지 145번 위치 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에 따른 융합단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
둘째, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 바람직하게는 CHO(chinese hamster ovary) 세포에 관한 것이다.
셋째, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 증진된 인간 EPO의 활성을 갖는 융합단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 목적하는 융합단백질의 유전자 확보 및 클로닝, 목적 유전자의 발현벡터 제작, 동물세포의 형질전환, 발현, 분리 및 활성도 측정의 단계를 거친다.
(1) 유전자 확보
EPO의 cDNA는 인간유래 태아 간의 cDNA 라이브러리(인비트로젠(Invitrogen) 사)에서 미리 제작된 EPO cDNA의 양 말단과 상보적인 프라이머(EP1, EC2)를 사용한 통상의 RT-PCR(바이오니아(Bioneer)사, RT-PCR 프리믹스 키트(PreMix Kit))을 수행함으로써 얻을 수 있다:
EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(서열번호 3)
EC2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(서열번호 4)
EPO cDNA를 클로닝 벡터인 pGEM-T(프로메가(Promega)사)에 클로닝하고(pGEMT-EPO로 명명) 염기서열을 확인한 후 이후 작업의 주형으로 이용한다.
본 발명에서 이용되는 HCG β 서브유닛의 CTP 유전자는 합성 및 PCR 셔플링(shuffling)에 의해 얻는다. 합성된 유전자 단편은 EC1, C2, C3 및 C4이다:
EC1: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCT(서열번호 5)
C2: GGAAGGCTGGGGGGAGGGGCCTTTGAGGAAGAGGA(서열번호 6)
C3: CCAGCCTTCCAAGCCCATCCCGACTCCCGGGGCCC(서열번호 7)
C4: TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCCGAGGGCCCCG(서열번호 8)
이들 4 가지 유전자를 1 ㎕씩 취하고(50 pmole/㎕) BM사의 고정확도 태그 (high fidelity Taq) 시스템을 사용하여 PCR을 수행한다.
1% 아가로스 젤에서 약 100 bp의 유전자 단편(CTP 유전자)을 확인한다. 이 유전자는 HCG β 서브유닛의 카르복시 말단 28 개의 아미노산(118 내지 145 위치 아미노산)을 코딩하는 것이다(도 1).
pGEMT-EPO를 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 EC2를 사용하여 PCR을 수행 하여 EPO 유전자만을 얻는다. 이 EPO 유전자와 CTP 유전자를 동시에 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 C4를 이용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 원하는 융합유전자인 ECTP 유전자를 얻는다. 이 유전자를 클로닝 벡터인 pGEM-T에 클로닝한 후(역방향 확인) 염기서열을 확인한다(pGEMT-ECTP라 명명함, 도 2).
(2) 발현벡터의 제작
발현벡터는 pCMV-Script(스트라타진(Stratagene)사) 벡터 또는 pcDNA3.1 벡터(인비트로젠사)를 이용한다.
(ⅰ) 발현벡터로 pCMV-Script를 이용하는 경우
pCMV-Script와 pGEMT-ECTP를 제한효소 SacⅠ과 SacⅡ로 각각 처리하고 아가로스 젤상에서 선형화된 pCMV-Script와 ECTP 유전자를 퀴아젠(Qiagen) 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰(ligation)시켜 대장균 NM522를 형질전환시킨다. LB-카나마이신 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소 SacⅠ과 SacⅡ로 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 ECTP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별한다. 이 플라스미드를 pCMV-ECTP로 명명한다(도 3).
(ⅱ) 발현벡터로 pcDNA3.1을 이용하는 경우
pGEMT-ECTP를 주형으로 이용하고 프라이머 EP11과 EP22를 사용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 원하는 융합유전자인 ECTP 유전자만을 얻는다:
EP11: TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(서열번호 9)
EP22: TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(서열번호 10)
이 ECTP 유전자 말단은 각각 제한효소 HindⅢ 및 BamHⅠ 위치를 갖는다. pcDNA3.1과 위에서 얻은 ECTP 유전자를 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ으로 각각 처리한다. 아가로스 젤상에서 선형화된 pcDNA3.1과 ECTP 유전자를 퀴아젠 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰시켜 대장균 NM522를 형질전환시킨다. LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ을 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 ECTP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별한다. 이 플라스미드를 pcDNA3.1-ECTP라 명명한다(도 4).
(3) CHO 세포의 형질전환 및 ECTP 발현
(ⅰ) pCMV-Script 벡터를 이용하는 경우
60 ㎜ 세포배양 디쉬(dish)에서 CHO 세포(tk-)를 키워 40∼80% 컨플루언트(confluent)하게(1∼4×105 세포/60 ㎜ 디쉬) 준비한다. BM사의 슈퍼펙션 시약(superfection reagent) 3 ㎕와 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕를 잘 혼합하고 플라스미드 pCMV-ECTP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가한다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지로 교환한다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지(α-MEM with media, 10% 혈청)로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로 부터 발현된 ECTP 단백질을 확인한다.
(ⅱ) pcDNA3.1 벡터를 이용하는 경우
60 ㎜ 세포배양 디쉬에서 CHO 세포(DG44)를 키워 40∼80% 컨플루언트하게(1∼4×105 세포/60 ㎜ 디쉬) 준비한다. BM사의 슈퍼펙션 시약 3 ㎕와 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕를 잘 혼합하고 플라스미드 pcDNA3.1-ECTP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2㎍)와 pLTRdhfr26(ATCC37295, 0.2 ㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가한다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지(α-MEM without media, 10% FBS)로 교환한다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로부터 발현된 ECTP 단백질을 확인한다.
(4) 발현된 ECTP의 정제
R&D사의 항-EPO 모노클로날 항체(anti-EPO monoclonal antibody)를 이용하여 분리정제용 친화성 수지(affinity resin)을 아래와 같이 제작한다.
CNBr 활성화된 세파로스(Sepharose) 4B 0.3 g을 1 mM HCl에서 20 분간 팽윤시키고(swelling) 수지를 칼럼으로 옮긴 후 1 mM HCl로 세척한다. 수지를 4 ㎖의 커플링 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)으로 세척한 후 바로 4 ㎖ 커플링 완충액에 들어 있는 항-EPO 모노클로날 항체(500 ㎍/바이알)와 튜브내에서 섞어주 고 상온에서 2 시간 반응시킨다. 이때 튜브를 잘 흔들어 준다. 블록킹 완충액(0.2 M 글리신, pH 8.0)으로 바꾸어 준 후 상온에서 2 시간 동안 흔들면서 반응시킨다. 6.5 ㎖ 커플링 완충액, 6.5 ㎖ 아세테이트 완충액(0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 4) 및 6.5 ㎖ 커플링 완충액으로 차례로 세척한다. 이렇게 제작된 수지를 이용하여 칼럼을 제작하고 다음과 같이 정제를 실시한다.
세포를 무혈청 배양액에서 하루 동안 키운 후 배양액만을 밀리포어(Millipore)사의 센트리프렙(컷오프 10,000)을 이용하여 약 5 배로 농축시킨다. 약 20 ㎖/hr의 유속으로 PBS로 평형시킨 칼럼에 로딩하고 다시 PBS로 세척한다. 용출완충액(0.1 M 글리신, pH 2.8)으로 용출시킨 후 즉시 1 M 트리스(Tris)로 pH 7.5로 적정한다. SDS-PAGE 및 은(silver) 염색으로 확인할 때 순도는 최소 97% 이상이다(도 5a).
(5) 바이오어세이(Bioassay)법에 의한 활성측정 및 생화학적 분석
페닐하이드라진이 처리된 마우스의 비장세포를 이용하는 바이오어세이 시험에서 발현 및 적당히 정제된 EPO 및 ECTP의 활성을 측정하면 ECTP의 활성이 EPO 보다 높게 나타난다. 이로부터 ECTP에서 첨가된 카르복시 말단의 존재는 EPO의 활성 자체를 방해하지 않음을 확인할 수 있다.
EPO의 생체내 활성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 당, 구체적으로는, 당쇄 말단에 위치하는 사이알릭산의 추가여부를 확인하기 위하여, IEF (isoelectric focusing)을 수행한다. 사이알릭산은 음전하를 매우 강하게 띠고 있으므로 사이알릭산의 증가는 IEF 젤상에서 그를 포함한 단백질을 pH 음성으로 이동 시킬 것이다. 노벡스(Novex)사의 IEF 젤 패턴에서 ECTP는 EPO에 비해 pH 음성으로 크게 이동하는 패턴을 나타냄을 확인할 수 있다(도 5b). 이는 ECTP가 EPO에 비해 생체내 활성이 현저히 오래 지속될 수 있음을 의미하는 것이다.
(6) 약동력학 시험
제조된 후보 물질이 실제 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 약동력학 시험을 마우스를 대상으로 실시한다. 이때 후보 물질을 총 4 마리의 마우스에 대해 1 마리당 20 유닛의 투여량으로 정맥내(iv) 투여한다. 경시적 혈중 농도를 확인하기 위하여, 채혈한 후 베링거만하임(Boehringer Mannheim)사의 EIA 키트를 사용하여 농도를 결정한다. 마우스 약동력학 시험에서 후보 물질 ECTP는 대조 약물인 EPO 보다 훨씬 긴 반감기를 가짐을 알 수 있다(도 6).
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 유전자 확보
EPO의 cDNA는 인간유래 태아 간의 cDNA 라이브러리(인비트로젠)에서 미리 제작된 EPO cDNA의 양 말단과 상보적인 프라이머(EP1, EC2)를 사용한 통상의 RT-PCR(바이오니아 RT-PCR 프리믹스 키트)을 수행하여 얻었다. PCR을 55 ℃에서 아닐링(annealing) 35 초, 72 ℃에서 40 초, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 30 사이클 수행하고 얻은 EPO cDNA를 클로닝 벡터인 pGEM-T(프로메가)에 클로닝하였다. 즉, PCR 산물을 1% 아가로스 젤로부터 용출하여 pGEM-T에 결찰시킨 후, 대장균 NM522를 형질전환시켰다. X-gal/IPTG를 도말한 LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후, 흰색 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 정제하고 제한효소(SacⅠ, SacⅡ)와 반응시켜 EPO cDNA가 삽입되어 있는 콜로니를 선별하였다. 이때 얻은 벡터를 pGEMT-EPO로 명명하고 염기서열(역방향)을 확인한 후 이후 작업의 주형으로 이용하였다.
HCG β 서브유닛의 CTP 유전자는 합성 및 PCR 셔플링을 이용하여 얻었다. 합성된 유전자 단편은 EC1, C2, C3 및 C4이다. 이들 4 가지 유전자를 1 ㎕씩 취하고(50 pmole/㎕) BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 55 ℃에서 아닐링 40 초, 72 ℃에서 40 초, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 15 사이클의 PCR을 수행하였다. 1% 아가로스 젤에서 약 100 bp의 유전자 단편을 확인하였다(CTP 유전자). 이 유전자는 HCG의 카르복시 말단 28 개의 아미노산을 코딩하는 것이다(도 1).
pGEMT-EPO를 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 EC2를 사용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 EPO 유전자만을 얻었다. 이 EPO 유전자와 CTP 유전자를 동시에 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 C4를 이용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 58 ℃에서 아닐링 40 초, 72 ℃에서 1 분, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 30 사이클의 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 융합유전자인 ECTP 유전자를 얻었다. 이 유전자를 클로닝 벡터인 pGEM-T에 상기와 동일한 방법으로 클로닝 한 후 염기서열을 확인하였다(pGEMT-ECTP라 명명함, 도 2).
실시예 2: 발현벡터 pCMV-ECTP의 제작
발현벡터로 스트라타진사의 pCMV-Script를 이용하였다. pCMV-Script와 pGEMT-ECTP를 제한효소 SacⅠ과 SacⅡ로 각각 처리하고 아가로스 젤상에서 선형화된 pCMV-Script와 ECTP 유전자를 퀴아젠 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰시켜 대장균 NM522를 형질전환시켰다. LB-카나마이신 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소 SacⅠ과 SacⅡ로 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 ECTP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별하였다. 이 플라스미드를 pCMV-ECTP로 명명하였다(도 3).
실시예 3: 발현벡터 pcDNA3.1-ECTP의 제작
발현벡터로 인비트로젠사의 pcDNA3.1 벡터를 이용하였다. pGEMT-ECTP를 주형으로 이용하고 프라이머 EP11과 EP22를 사용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 원하는 융합유전자인 ECTP 유전자만을 얻었다. 이 ECTP 유전자 말단은 각각 제한효소 HindⅢ 및 BamHⅠ 위치를 갖는다.
pcDNA3.1과 위에서 얻은 ECTP를 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ으로 각각 처리하였다. 아가로스 젤상에서 선형화된 pcDNA3.1과 ECTP 유전자를 퀴아젠 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰시켜 대장균 NM522을 형질전환시켰다. LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ을 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 ECTP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별하였다. 이 플라스미드를 pcDNA3.1-ECTP로 명명하였다(도 4).
실시예 4: CHO 세포의 형질전환 및 ECTP 발현
(1) pCMV 벡터를 이용한 경우
60 ㎜ 세포배양 디쉬에서 CHO 세포(tk-)를 키워 40∼80% 컨플루언트하게(1∼4×105세포/60 ㎜ 디쉬) 준비하였다. BM사의 슈퍼펙션 시약 3 ㎕와 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕를 잘 혼합하고 플라스미드 pCMV-ECTP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2 ㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가하였다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지로 교환하였다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지(α-MEM with media, 10% 혈청)로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로부터 발현된 ECTP 단백질을 확인하였다.
(2) pcDNA3.1 벡터를 이용한 경우
60 ㎜ 세포배양 디쉬에서 CHO 세포(DG44)를 키워 40∼80% 컨플루언트하게(1∼4×105 세포/60 ㎜ 디쉬) 준비하였다. BM사의 슈퍼펙션 시약 3 ㎕과 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕을 잘 혼합하고 플라스미드 pcDNA3.1-ECTP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2 ㎍)와 pLTRdhfr26(ATCC37295, 0.2 ㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가하였다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지로 교환(α-MEM without media, 10% FBS)하였다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로부터 발현된 ECTP 단백질을 확인하였다.
실시예 5: 발현된 ECTP의 정제
R&D사의 항-EPO 모노클로날 항체를 이용하여 분리정제용 친화성 수지를 아래와 같이 제작하였다.
CNBr 활성화된 세파로스 4B 0.3 g을 1 mM HCl에서 20 분간 팽윤시키고 수지를 칼럼으로 옮긴 후 1 mM HCl로 세척하였다. 수지를 4 ㎖의 커플링 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)로 세척한 후 바로 4 ㎖ 커플링 완충액에 들어 있는 항-EPO 모노클로날 항체(500 ㎍/바이알)와 튜브내에서 섞어주고 상온에서 2 시간 반응시켰다. 이때 튜브를 잘 흔들어 주었다. 블록킹 완충액(0.2 M 글리신, pH 8.0)으로 바꾸어준 후 상온에서 2 시간 동안 흔들면서 반응시켰다. 6.5 ㎖ 커플링 완충액, 6.5 ㎖ 아세테이트 완충액(0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 4) 및 6.5 ㎖ 커플링 완충액으로 차례로 세척하였다. 제작된 수지를 이용하여 칼럼을 제작하고 다음과 같이 정제하였다.
세포를 무혈청 배양액에서 하루 키운 후 배양액만을 밀리포어사의 센트리프렙(컷오프 10,000)을 이용하여 약 5 배로 농축시켰다. 약 20 ㎖/hr의 유속으로 PBS로 평형시킨 칼럼에 로딩하고 다시 PBS로 세척하였다. 용출 완충액(0.1 M 글리 신, pH 2.8)으로 용출시킨 후 즉시 1 M 트리스로 pH 7.5로 적정하였다. 정제된 ECTP의 SDS-PAGE 결과를 도 5a에 나타내었다. SDS-PAGE 및 은 염색으로 확인할 때 순도는 97% 이상이었다.
실시예 6: 바이오어세이법에 의한 활성측정 및 IEF 분석
페닐하이드라진을 마우스에 1 일 1 회 2 일간 60 ㎎/㎏씩 주사하였다. 3 일 경과후 확대된 비장을 분리하고 호모게나이저(homogenizer)로 파쇄하여 비장세포를 얻었다. 비장세포를 6×106 세포/㎖로 희석하여 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. 분주된 각 웰에 표준 EPO(0∼500 mU/㎖)와 발현된 EPO 및 ECTP를 100 mU/㎖의 농도로 각각 가한 후 플레이트를 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 22 시간동안 방치하였다. 각 웰에 디메틸3[H]-티미딘(20 μCi/㎖)을 50 ㎕씩 분주한 후 동일한 인큐베이터에서 2 시간 더 반응시켜 각 웰별로 글래스 필터(Nunc 1-73164)에 흡착시켰다. 생리식염수로 3 회 세척하고 β 카운터를 이용하여 각 필터의 방사능량을 측정하였다. 적당히 정제된 EPO 및 ECTP의 활성을 측정하였을 때 ECTP의 활성이 EPO와 유사하거나 약간 더 높게 나타났다. 이로부터 EPO에 첨가된 카르복시 말단의 존재는 EPO의 활성 자체를 방해하지 않음을 확인할 수 있었다.
또한, EPO의 생체내 활성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 당, 즉, 당쇄 말단에 위치하는 사이알릭산의 추가여부를 확인하기 위하여 IEF를 수행하였다. 노벡스사의 IEF 젤 패턴을 도 5b에 나타내었다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, ECTP는 EPO에 비해 현저히 음극으로 이동하는 패턴을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 ECTP가 EPO에 비하여 생체내 활성이 현저히 오래 지속될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 7: 약동력학 시험
제조된 후보 물질이 실제 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 약동력학 시험을 마우스를 대상으로 실시하였다. 실시예 6에 기재된 방법에 의해 정제된 융합 단백질을 총 4 마리의 마우스에 대해 1 마리당 20 유닛으로 정맥내(iv) 투여하였다. 경시적 혈중 농도를 확인하기 위하여, 처음에는 30 분 간격, 2 시간 이후에는 2 시간 간격으로 채혈한 후, 베링거만하임사의 EIA 키트를 사용하여 농도를 결정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 후보 물질 ECTP는 대조 약물인 EPO 보다 약 2.5 배 이상의 훨씬 긴 반감기를 가짐을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, EPO의 고유활성 자체에는 영향을 주지 않으면서 당쇄를 증가시키는 아미노산을 다량으로 함유하고 있어 EPO의 생체내 반감기를 획기적으로 증가시키는 한편, 이미 체내에 존재하는 펩타이드를 사용하여 체내 적용시 항원성도 유발하지 않는다.
<110> Cheil Jedang Corporation <120> Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin <130> PC01-0331-JIJD <150> KR10-2000-0075230 <151> 2000-12-11 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Amino acids in the positions of 112 to 145 of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 1 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 Pro Gln <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(ECTP) of erythropoietin(EPO) and carboxy terminal peptide(CTP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 2 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 210 215 220 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP1 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 3 atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EC2 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 4 gtcccctgtc ctgcaggcct 20 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCG beta subunit CTP gene fragment EC1 <400> 5 aggggaggcc tgcaggacag gggactcctc ttcct 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCG beta subunit CTP gene fragment C2 <400> 6 ggaaggctgg ggggaggggc ctttgaggaa gagga 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCG beta subunit CTP gene fragment C3 <400> 7 ccagccttcc aagcccatcc cgactcccgg ggccc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCG beta subunit CTP gene fragment C4 <400> 8 ttattgtggg aggatcgggg tgtccgaggg ccccg 35 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP11 for PCR to obtain the desired fusion gene ECTP <400> 9 taagcttatg ggggtgcacg aatgt 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP22 for PCR to obtain the desired fusion gene ECTP <400> 10 tggatcctta ttgtgggagg atcggggt 28 <210> 11 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(ECTP) of erythropoietin(EPO) and carboxy terminal peptide(CTP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 11 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 210 215 220 Pro Gln 225

Claims (5)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는, 생체내에서 증진된 에리스로포이에틴(EPO) 활성을 갖는, 인간 EPO와 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) β 서브유닛 카르복시 말단 펩타이드(CTP)의 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 따른 융합단백질을 코딩하는 핵산.
  5. 제4항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하여 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질을 제조하는 방법.
KR1020010072713A 2000-12-11 2001-11-21 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 KR101229995B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/433,508 US8008454B2 (en) 2000-12-11 2001-12-10 Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
AT01270554T ATE320449T1 (de) 2000-12-11 2001-12-10 Fusionsprotein mit verbesserter in vivo erythropoietinwirkung
AU2002222740A AU2002222740A1 (en) 2000-12-11 2001-12-10 Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
EP01270554A EP1342730B1 (en) 2000-12-11 2001-12-10 Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
JP2002549725A JP3946638B2 (ja) 2000-12-11 2001-12-10 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質
PCT/KR2001/002137 WO2002048194A1 (en) 2000-12-11 2001-12-10 Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
DE60117919T DE60117919T2 (de) 2000-12-11 2001-12-10 Fusionsprotein mit verbesserter in vivo erythropoietinwirkung

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20000075230 2000-12-11
KR1020000075230 2000-12-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020046150A KR20020046150A (ko) 2002-06-20
KR101229995B1 true KR101229995B1 (ko) 2013-02-06

Family

ID=27680928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020010072713A KR101229995B1 (ko) 2000-12-11 2001-11-21 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질

Country Status (2)

Country Link
US (1) US8008454B2 (ko)
KR (1) KR101229995B1 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
US8304386B2 (en) * 2006-02-03 2012-11-06 Prolor Biotech, Inc. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2007092252A2 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2009099763A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8946147B2 (en) 2010-06-24 2015-02-03 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
JP6392123B2 (ja) * 2011-12-20 2018-09-19 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 糖尿病治療のためのｃｔｐ系インスリンアナローグ
WO2013157002A1 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Prolor Biotech Inc. Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
JP6387008B2 (ja) 2012-09-26 2018-09-05 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ インスリンアナローグダイマー
KR102202255B1 (ko) * 2012-11-20 2021-01-13 옵코 바이오로직스 리미티드 생식샘자극 호르몬 카복시 말단 펩타이드들과 부착하여 폴리펩타이드들의 유체역학적 부피를 증가시키는 방법
CN103864913A (zh) * 2012-12-18 2014-06-18 联亚生技开发股份有限公司 重组蛋白
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
JP6538645B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-03 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ インスリン‐インクレチン複合物
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
CN107001441A (zh) 2014-09-24 2017-08-01 印第安纳大学研究及科技有限公司 脂质化的基于酰胺的胰岛素前药
CN108271356A (zh) 2014-09-24 2018-07-10 印第安纳大学研究及科技有限公司 肠降血糖素-胰岛素缀合物
ES2893616T3 (es) 2015-06-19 2022-02-09 Opko Biologics Ltd Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para la producción de los mismos
SG10202100189WA (en) 2016-07-11 2021-02-25 Opko Biologics Ltd Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0640619A1 (en) * 1993-08-17 1995-03-01 Amgen Inc. Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites
US5585345A (en) * 1989-02-21 1996-12-17 Washington University CTP extended form of glycoprotein hormones
US5792460A (en) * 1989-02-21 1998-08-11 Washington University Modified glycoprotein hormones having a CTP at the amino terminus
WO2001002017A2 (en) * 1999-07-02 2001-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6225449B1 (en) * 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585345A (en) * 1989-02-21 1996-12-17 Washington University CTP extended form of glycoprotein hormones
US5712122A (en) * 1989-02-21 1998-01-27 Washington University Carboxy terminal peptide-extended proteins
US5792460A (en) * 1989-02-21 1998-08-11 Washington University Modified glycoprotein hormones having a CTP at the amino terminus
EP0640619A1 (en) * 1993-08-17 1995-03-01 Amgen Inc. Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites
WO2001002017A2 (en) * 1999-07-02 2001-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020046150A (ko) 2002-06-20
US20090221037A1 (en) 2009-09-03
US8008454B2 (en) 2011-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101229995B1 (ko) 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467751B1 (ko) 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467750B1 (ko) 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
JP3946638B2 (ja) 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質
AU697453B2 (en) Erythropoietin analog compositions and methods
Kato et al. Purification and characterization of thrombopoietin
EP0640619B2 (en) Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites
US20120322730A1 (en) Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
CA2066618C (en) Plasmids containing dna encoding the amino acid sequence of tcf-ii, transformed cells with the plasmids, and production method of biologically active substance using the transformed cells
CA2690018A1 (en) Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US6376218B1 (en) Expression system for producing recombinant human erythropoietin, method for purifying secreted human erythropoietin and uses thereof
EP1010758A2 (en) An expression system for producing recombinant human erythropoietin, a method for purifying the secreted human erythropoietin and uses thereof
JPH05103675A (ja) ヒト神経成長因子２の製造法
JPH0144317B2 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
E801 Decision on dismissal of amendment
B601 Maintenance of original decision after re-examination before a trial
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20050202

Effective date: 20060131

J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

J302 Written judgement (patent court)

Free format text: JUDGMENT (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20060308

Effective date: 20070329

J2X2 Appeal (before the supreme court)

Free format text: APPEAL BEFORE THE SUPREME COURT FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

J303 Written judgement (supreme court)

Free format text: JUDGMENT (SUPREME COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20070417

Effective date: 20100128

J222 Remand (patent court)

Free format text: REMAND (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

J302 Written judgement (patent court)

Free format text: JUDGMENT (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20100209

Effective date: 20100813

GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151228

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171129

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee