DE69829881T2

DE69829881T2 - Synthetische antineoplastische wirkstoffe abgeleitet von dolastatin 15 sowie verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE69829881T2
Application number: DE69829881T
Authority: DE
Inventors: R. George PETTIT; J. Erik FLAHIVE
Original assignee: ARIZONA BOARD OF REGENTS TEMPE; Arizona Board of Regents of ASU
Current assignee: ARIZONA BOARD OF REGENTS TEMPE; Arizona Board of Regents of ASU
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-09-24
Also published as: WO1999015130A2; EP1049481B1; WO1999015130A3; CA2298639A1; ATE293638T1; JP2001517604A; EP1049481A2; CA2298639C; DE69829881D1; EP1049481A4

Description

Dolastatin 15, ein bekannter und wirksamer antineoplastischer Bestandteil des gehäuselosen Weichtiers des Indischen Ozeans Dolabella auricularia, wurde als die Leitsubstanz verwendet, aus der eine Reihe neuer Derivate entwickelt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur synthetischen Herstellung dieser neuen Mittel und zeigt deren In-vitro-Bewertungen gegenüber einer Vielzahl muriner und humaner Krebszelllinien und gegenüber einer Auswahl von Bakterien und Pilzen. Die Wirkung dieser Derivate auf die Hemmung der Tubulinpolymerisation ist ebenfalls offenbart. Überraschenderweise zeigen alle der neuen Verbindungen, in denen die C-terminale (S)-Dolapyrrolidinoneinheit (Dpy, 5) von Dolastatin 15 durch eine Reihe strukturell unterschiedlicher, leichter verfügbarer und kostengünstigerer Amide ersetzt wurde, Aktivitäten der Hemmung von Krebszellwachstum, die denen von Dolastatin 15 ganz vergleichbar sind (siehe US-Patent 4 879 278, Pettit et al.). Alle der neuen Verbindungen waren jedoch als Inhibitoren der Tubulinpolymerisation weniger wirksam als Dolastatin 15. Die strukturell modifizierten Peptide bewirkten ferner einen Mitosestopp in kultivierten Zellen und sie hemmten das Wachstum eines gramnegativen Bakteriums.
Ein Teil dieser Arbeit wurde durch Outstanding Investigator Grant CA-44344-01-08, verliehen von der Division of Cancer Treatment, National Cancer Institute, DHHS, unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann gewisse Rechte an dieser Erfindung besitzen.
Meeresorganismen sind eine außergewöhnlich produktive Quelle biologisch aktiver und medizinisch wichtiger Substanzen, die einzigartige Strukturen tragen (siehe D. J. Faulkner, 1994, Marine Natural Products, Natural Products Reports, 11, 355; M. Kobayashi et al., 1994, Bioactive substances isolated from marine sponge, a miniature conglomerate of various organisms, Pure and Applied Chemistry, 819; und G. König et al., 1994, Biological activities of selected marine natural products, Planta Medica, 60, 532–537). Beispiele sind die Arten des Seehasen Dolabella auricularia aus dem Indischen Ozean (siehe Pettit et al., 1993, The isolation of dolastatins 10–15 from the marine mollusk Dolabella auricularia, Tetrahedron, 49, 9151) und Japan (siehe Nakamura et al., 1995, Stereochemistry and total synthesis of Dolastatin E. Tetrahedron Letters, 36, 5059 und die dort angegebenen Literaturstellen), aus denen eine große Zahl antineoplastischer und/oder cytostatischer linearer und cyclischer Peptide, die als die Dolastatine bezeichnet werden, isoliert wurden. Die meisten dieser potentiell bedeutenden Peptide enthalten beispiellose Aminosäureeinheiten. Von diesen zeigten die linearen Peptide Dolastatin 15 (1) (siehe Pettit et al., 1989a, Isolation and structure of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15, Journal of Organic Chemistry, 54, 6005) und Dolastatin 10 (2) (siehe Pettit et al., 1987, The isolation and structure of a remarkable marine animal antineoplastic constituent: Dolastatin 10, Journal of the American Chemical Society, 109, 6883), die stärkste antineoplastische Aktivität (siehe US-Patente 4 816 444, 4 879 278, 4 978 744 und 5 554 725; und Hu et al., 1993, Effects of dolastatins on human B-lymphocytic leukaemia cell lines, Leukemia Research, 17, 333) und wurden zur klinischen Entwicklung ausgewählt. Tatsächlich laufen klinische Untersuchungen der Phase 1 von Dolastatin 10 (2) unter der Schirmherrschaft des US National Cancer Institute seit November 1995.
Seit 1984 sind beträchtliche Forschungsarbeiten auf die Erforschung von Strukturmodifikationen von Dolastatin 10 (2) (Pettit et al., 1995, Antineoplastic Agents 337, Synthesis of Dolastatin 10 Structural Modifications, Anticancer Drug Design, 10, 529) und Dolastatin 15 (1) zum Zweck der Entwicklung neuer potentieller Antikrebsmittel gerichtet. Eine Zahl von Strukturmodifikationen dieser Peptide wurde untersucht, um die antineoplastische Aktivität des Stammmoleküls zu ändern und von jedem Peptid, wenn möglich, die synthesemäßig stärker herausfordernden Einheiten, insbesondere die von Phenylalanin abgeleiteten C-terminalen Segmente, zu eliminieren. Struktur/Aktivität-Voruntersuchungen auf der Basis von Dolastatin 10 (2) legten nahe, dass die Thiazol enthaltende C-terminale Einheit ohne signifikanten Aktivitätsverlust in adäquater Weise durch β-Phenethylamin ersetzt werden könnte, während bestimmte andere Modifikationen zu einer mäßigen oder drastischeren Abnahme der antiproliferativen Aktivität (siehe Pettit et al., 1995, Antineoplastic Agents 337, Synthesis of Dolastatin 10 Structural Modifikations, Anticancer Drug Design, 10, 529) ohne signifikante Änderung der Hemmwirkungen auf die Tubulinaggregation führten. In dem angegebenen Fall wurde eine Reihe struktureller Modifikationen von Dolastatin 15 durchgeführt, wobei die C-terminale Dolapyrrolidinoneinheit (5) durch verschiedene Amide ersetzt wurde. Im Gegensatz zu Dolastatin 10 hatten größere strukturelle Änderungen in der C-terminalen Amideinheit von Dolastatin 15 im wesentlichen keine nachteilige Wirkung auf die Hemmwirkungen des Depsipeptids gegenüber Tumorzellwachstum, führten jedoch zu einer mäßigen Verringerung der Hemmung der Tubulinpolymerisation.
Die WO 93/23424 betrifft neue Derivate von Dolastatin 10, die eine antineoplastische Wirkung aufweisen, und sie beschreibt die Herstellung derselben.
Die WO 97/17364 betrifft neue Peptide von Dolastatin 15, die zur Kontrolle einer Erkrankung geeignet sind, und sie beschreibt die Herstellung derselben.
Ein Hauptfaktor, der die derzeitige Forschung antreibt, ergibt sich aufgrund der unausweichlichen Tatsache, dass es auf der Welt nicht ausreichend Dolabella auricularia gibt, um eine Isolierung ausreichender Mengen wirksamer Komponenten aus dieser zu ermöglichen, um den Bedarf der von Krebs betroffenen Bevölkerung in kommerziell möglicher Weise zu decken. Daher muss eine kommerziell effektive Synthese entwickelt werden, die ein Molekül, das nur die Substituenten, die zur Kontrolle oder zum Stoppen oder Abschwächen der Ausbreitung von Krebszellen in einem damit befallenen humanen System wirksam sind, enthält, replizieren kann. Auf dieses Ziel ist die vorliegende Erfindung gerichtet.
Materialien und Verfahren
Alle Aminosäuren (S-Konfigurationen) und Derivate, die hier diskutiert sind, wurden wie von Sigma-Aldrich Co. erhalten verwendet. Andere beschriebene Reagentien (DEPC, DCC, EDC-HCl, HOBt, NMM, Et₃N, 4-Pyrrolidinopyridin, TFA, und dgl. {verwendete Abkürzungen: DEPC (Diethylphosphorocyanidat), DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid), EDC-HCl (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid), WRK (Woodward-Reagens K, 2-Ethyl-phenylisoxazolium-3'-sulfonat), BroP (Tris(dimethylamino)phosphoniumbromidhexafluorphosphat), HOBt (1-Hydroxybenzotriazol), NMM (4-Methylmorpholin), Et₃N (Triethylamin), TFA (Trifluoressigsäure), THF (Tetrahydrofuran), EtOAc (Ethylacetat), AcOH (Essigsäure), Z (Benzyloxycarbonyl), Boc (ter-Butyloxycarbonyl)}) wurden ebenfalls von Sigma-Aldrich erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Amine 6a-r wurden entweder redestilliert oder umkristallisiert. Alle Lösemittel wurden redestilliert und Lösemittelextrakte wässriger Lösungen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat getrocknet. THF wurde von LiAlH₄ destilliert. Reaktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von ANALTECH Silica Gel GF (0,25 mm)-Platten mit Sichtbarmachung durch entweder UV-Strahlung oder ggf. 3% Cersulfat in 3 N H₂SO₄-Lösung überwacht. Rohe Produkte wurden durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt (E. Merck, Darmstadt, 70–230 mesh). Die Peptidendprodukte (12a-r) wurden durch Schnellgelpermeationschromatographie in Methanol auf einer Säule von lipophilem SEPHADEX LH-20 weiter gereinigt.
Schmelzpunkte wurden mit einer digitalen Schmelzpunktvorrichtung von ELECTROTHERMAL, Modell IA9200, ermittelt und sind unkorrigiert. Messungen der optischen Rotation wurden auf einem PERKIN-ELMER 241-Polarimeter in Methanol (falls nicht anders angegeben) bei 25°C aufgezeichnet. IR-Spektren wurden unter Verwendung eines NICOLET FTIR Modell MX-1-Instruments erhalten. Alle ¹H-NMR-Spektren wurden auf einem VARIAN GEMINI 300 MHz-Instrument mit CDCl₃ oder DMSO-d₆ als Lösemittel wie angegeben beobachtet. Die ¹³C-NMR-Spektren wurden mit einem UNITY 500 MHz-Instrument in CDCl₃ erhalten. EIMS-Daten wurden mit einem MAT 312-Massenspektrometer aufgezeichnet. Elementaranalysen wurden durch Galbraith Laboratories, Inc., in Knoxville, TN, bestimmt.
Alle synthetisierten Verbindungen wurden zunächst auf In-vitro-Antitumoraktivität gegenüber murinen P388-lymphatische-Leukämie-Zellen und murinen L1210-Leukämiezellen und humanen CA46-Burkitt-Lymphomzellen unter Verwendung von Techniken gemäß der Beschreibung bei Hamel & Lin bewertet (siehe E. Hamel und C. M. Lin, 1993, Interaction of combretastatin, a new plant-derived antimitotic agent, with tubulin, Biochemical Pharmacology, 32, 3864). Die Verbindungen wurden auch in dem In-vitro-Primärscreening einer humanen Tumor-60-Zelllinie des NCI gemäß der Beschreibung bei Monks et al. bewertet (siehe A. Monks, Scudiero et al., 1991, New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening, Journal of the National Cancer Institute, 83, 757). Datenanalysen wurden unter Verwendung von Verfahren gemäß der Beschreibung bei Boyd und Paul durchgeführt (siehe M. R. Boyd et al., 1995, Some practical considerations and applications of the National Cancer Institute in vitro anticancer drug discovery screen, Drug Development Research, 34, 91). Ein Tubulinpolymerisationshemmtest wurde gemäß einer modifizierten Version des Verfahrens, das von Muzaffar et al. früher verwendet und beschrieben wurde (siehe A. Muzaffar et al., 1990, Antitubulin effects of derivatives of 3-demethylthiocolchicine, methylthioesters of natural colchicinoids, and thioketones derived from thiocolchicine, Comparison with colchicine, Journal of Medicinal Chemistry, 33, 567) durchgeführt, um die Wirkungen von Dolastatin 15 auf die zelluläre Mikrobutuliaggregation zu bewerten. Der neue Test für diese Verbindungen verwendete eine Arzneimittel-Tubulin-Vorinkubation (15 min) mit 10 μM Tubulin in 0,8 M Glutamat bei 30°C und die anschließende Zugabe von GTP und Inkubation (20 min) bei 30°C, wobei die Tubulinpolymerisation turbidimetrisch in GILFORD Aufzeichnungsspektrophotometern überwacht wurde.
Antimikrobielle Scheibenempfindlichkeitstests wurden gemäß dem durch das National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997) etablierten Verfahren durchgeführt. Mueller-Hinton-Agar wurde für Empfindlichkeitstests von Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa und Erwinia carotovora, verwendet, Gonococcal Typing Agar wurde für Neisseria gonorrhoeae verwendet und YM-Agar wurde für Candida albicans und Cryptococcus neoformans verwendet. Unmittelbar vor Empfindlichkeitstests wurden Verbindungen in sterilem DMSO rekonstituiert und Zweifachverdünnungen auf sterile 6-mm-Scheiben appliziert. Hemmzonen wurden nach 16 h für Bakterienkulturen (mit Ausnahme von M. luteus) und nach 42 h für Pilzkulturen und M. luteus abgelesen. MIC-Bestimmungen wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt.
Allgemeines Verfahren zur Synthese von α-Hydroxyamiden 7a-r Verfahren A (Amide 7b-o)
N-(2-Phenyl)ethyl-(2S)-2-hydroxyisovaleramid (7c). Zu einer gerührten und gekühlten (0°C) Lösung von (S)-(+)-Hiva (3, 2,0 g, 16,9 mmol), frisch redestilliertem 2-Phenylethylamin (6c, 2,10 ml, 16,9 mmol) und NMM (1,86 ml, 16,9 mmol) in 30 ml trockenem CH₂Cl₂ wird DEPC (2,56 ml, 16,9 mmol) tropfenweise gegeben. Das Gemisch wird dann über 2 h Raumtemperatur erreichen gelassen und unter Ar kontinuierlich gerührt. Die Lösung wird mit gleichen Volumina von destilliertem H₂O (dreimal) gewaschen und getrocknet, und das Lösemittel wird unter Vakuum entfernt, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde, das kristallisierte. Das Produkt wird (dreimal) aus Toluol-Hexan umkristallisiert, wobei analysenreines Amid 7c als farblose Nadeln erhalten wird (2,14 g, 58%). Fp 100,2–100,5°C; R_f 0,28 (Hexan-Aceton, 2:1); [α]²⁴ _D –42,0° (c = 1,0); MS m/z (relative Intensität) 221 (48, M⁺), 168 (12), 48 (11), 130 (9), 104 (100), 91 (25), 73 (21), 55 (17); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,81 (d, J = 7,0 Hz, 3H, Val CH₃), 1,00 (d, J = 7,1 Hz, 3H, Val-CH₃), 2,11 [spd(Septett von Dubletts), J₁ = 7,0 Hz, J₂ = 3,3 Hz, 1H, Hiva-CH_β], 2,49 (bs, 1H, -OH), 2,84 (t, J = 7,1 Hz, 2H, Ph-CH₂), 3,58 (m, J = 6,8 Hz, 2H, N-CH₂) 3,94 (d, J = 3,3 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 6,42 (bs, 1H, NH), 7,20–7,34 (m, 5H, ArH). Anal. berechnet für C₁₃H₁₉NO₂: C, 70,56; H, 8,65; N, 6,33. Gefunden: C, 70,89; H, 9,01; N, 6,17.
Verfahren B (Amide 7a, 7p-r)
N-(2-Benzothiazolyl)-(2S)-2-hydroxyisolvaleramid (7q). Eine Lösung von (S)-(+)-Hiva (3, 1,00 g, 8,5 mmol), 2-Aminobenzothiazol (6q, 1,27 g, 8,5 mmol) und HOBt (2,29 g, 17 mmol, 2 Äq.) in trockenem THF (15 ml) wird unter N₂ unter Rühren auf 0°C gekühlt. Zu der Lösung werden MMM (0,93 ml, 8,5 mmol) und eine Lösung von DCC (1,75 g, 8,5 mmol) in THF (5 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann über 2 h Raumtemperatur erreichen gelassen. Die Lösung wird filtriert und zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wird in CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst und nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (50 ml), H₂O (50 ml), 10%-iger Citronensäurelösung (50 ml) und H₂O (2 × 50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wird dann getrocknet und das Lösemittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, wobei ein roher weißer Feststoff erhalten wird. Harnstoffnebenprodukt wird durch wiederholte Ausfällungen aus eiskaltem EtOAc entfernt, und das Produkt wird (dreimal) aus Aceton-Heptan umkristallisiert, wobei das reine Amid als farblose mikrokristalline Nadeln erhalten wird (1,8 g, 85%). Fp 184,1–184,2°C; R_f 0,59 (CH₂Cl₂-EtOAc, 4:1); [α]²⁴ _D –69,3° (c = 1,0); MS m/z 250 (9, M⁺), 151 (14), 150 (100), 123 (8), 96 (7), 82 (21), 73 (6), 55 (13); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,97 (d, J = 6,9 Hz, 3H, Val-CH₃), 1,23 (d, J = 6,9 Hz, 3H, Val-CH₃), 2,45 (spd, J₁ = 6,9 Hz, J₂ = 3,0 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 4,41 (bt, J = 3,0 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 5,00 (bd, J = 3,9 Hz, 1H, OH), 7,35 (t, J = 8,4 Hz, 2H, ArH), 7,47 (t, J = 8,4 Hz, 1H, ArH), 7,76 (d, J = 8,4 Hz, 1H, ArH), 7,85 (d, J = 7,5 Hz, 1H, ArH), 10,55 (bs, 1H, NH). Anal. berechnet für C₁₂H₁₄N₂O₂S: C, 57,78; H, 5,64; N, 11,9. Gefunden: C, 57,90; H, 5,87; N, 10,89.
Für die physikalischen Eigenschaften der Amide 7a-r siehe die folgende Tabelle I.
Tabelle I Physikalische Konstanten für die α-Hydroxyamide 7a-r
Allgemeines Verfahren zur Synthese der Boc-Depsipeptide 8a-r
N-[(2S)-O-[N-(tert-Butyloxycarbonyl)prolyl]-2-hydroxyisovaleryl]-2-phenylethylamid (8c). Eine Lösung des Amids 7c (0,50 g, 2,26 mmol) in CH₂Cl₂ (2 ml) wird langsam zu einer trockenen gerührten Lösung von t-Boc-S-Prolin (0,58 g, 2,71 mmol, 1,2 Äq.), 4-Pyrrolidinopyridin (0,335 g, 2,71 mmol, 1,2 Äq.) und DCC (0,56 g, 2,71 mmol, 1,2 Äq.) in CH₂Cl₂ gegeben. Die Lösung wird 20 h bei Raumtemperatur unter Ar gerührt, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Öl erhalten wird. Der ölige Rückstand wird dann auf Silicagel chromatographiert (25 Aceton/Hexan), wobei 0,95 g (100%) des Esters 8c als farbloser Gummi (nach Trocknen unter Vakuum) erhalten werden. R_f 0,52 (Hexan-Aceton, 2:1); [α]²⁵ _D –63,5° (c = 0,2); MS m/z 418 (16, M⁺), 362 (8), 327 (8), 271 (15), 170 (6), 142 (29), 114 (66), 105 (30), 91 (6), 70 (100), 57 (54); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,87 (d, J = 6,9 Hz, 3H, Val-CH₃), 0,95 (d, J = 6,9 Hz, 3H, Val-CH₃), 1,48 (s, 9H, tert-Butyl), 1,82–2,00 (m, 2H, Pro-CH₂), 2,05–2,14 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 2,22–2,31 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 2,44 (spd, J₁ = 6,9 Hz, J₂ = 2,7 Hz, 1H, Hiva-CH_β], 2,87 (t, J = 7,2 Hz, 2H, Ph-CH₂), 3,34–3,61 (m, 4H, Pro-CH₂, N-CH₂), 4,39 (dd, J₁ = 8,7 Hz, J₂ = 4,2 Hz, 1H, Pro-CH_α), 5,07 (d, J = 2,7 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 7,16–7,32 (m, 5H, ArH), 7,66 (bs, 1H, NH).
Für die physikalischen Eigenschaften der Verbindungen 8a-r siehe die folgende Tabelle II.
Tabelle II Physikalische Konstanten für die Depsidipeptidderivate 8a-r
Allgemeines Verfahren zum Entschützen der Boc-Depsipeptide 8a-r
Zu einer gekühlten (0°C) und gerührten Lösung des entsprechenden Dipeptidderivats (8a-r, 1 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wird TFA (5 ml) unter Inertatmosphäre gegeben. Die Lösung wird dann bei dieser Temperatur 1 h gerührt und das Lösemittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Verbliebene TFA wird mit Toluol (3 × 20 ml) azeotrop entfernt und die gebildeten öligen Trifluoracetatsalze (9a-r) werden unter Vakuum getrocknet und in der anschließenden Reaktion direkt verwendet.
Z- und Boc-Valyl-N-methylvalyl-prolin (10a,b). Die Scaleup-Herstellung von Z-Val-N-Me-Val-Pro (10a) basierte auf einem früheren, von Dr. Pettit berichteten Verfahren (siehe G. R. Pettit et al., 1991, Antineoplastic agents 220, Synthesis of natural (–)-dolastatin 15, Journal of the American Chemical Society, 113, 6692). Das gleiche Verfahren, das zur Synthese von Boc-Val-N-Me-Val-Pro (10b) verwendet wird, wird hier wie nun beschrieben verwendet.
Zu einer auf –23°C gekühlten Lösung von t-Boc-Valin (6,64 g, 30,5 mmol, 2 Äq.) in trockenem CH₂Cl₂ (100 ml) unter Ar werden NMM (6,70 ml, 61,1 mmol, 4 Äq.) und Pivaloylchlorid (3,76 ml, 30,5 mmol, 2 Äq.) gegeben. Nach 3 h bei dieser Temperatur wird eine gekühlte (–23°C) Lösung von Me-Val-Pro-OMe (5,3 mmol; 3,7 g) in trockenem CH₂Cl₂ (15 ml) langsam zugegeben. Die Reaktion wird 4 h bei dieser Temperatur und 24 h bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit gesättigter Citronensäurelösung (3 × 100 ml), Wasser (100 ml), gesättigter NaHCO₃-Lösung (2 × 100 ml) und Wasser (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet und das Lösemittel wird abgedampft, wobei ein strohfarbenes Öl erhalten wird. Flashchromatographie (Silicagel, 2,5'' × 18''-Säule, 15% Aceton-Hexan als Elutionsmittel) führte zu 6,5 g (97%) des reinen Dipeptids als farbloses Öl: [α]_D ²⁵ = –187° (c = 0,2). Ein 4,5-g (10,5 mmol)-Aliquot des reinen Produkts wird in 100 ml 1:1 EtOH-H₂O gelöst und mit 1 N NaOH (17 ml) versetzt. Das Gemisch wird kräftig gerührt, bis die Verseifung vollständig ist, was mittels DC beurteilt wird, (2 h) und die klare Lösung wird unter vermindertem Druck auf das halbe Volumen eingeengt. Die Lösung wird dann mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und das Produkt wird mit EtOHc (3 × 60 ml) extrahiert. Der vereinigte Lösemittelextrakt wird getrocknet (Na₂SO₄) und unter Vakuum eingeengt, wobei die reine Tripeptidsäure als farbloses Glas erhalten wird (4,26 g, 98%). R_f 0,24 (Hexan-EtOAc-AcOH, 8:2:1); [α]²⁵ _D –188° (c = 0,2); MS m/z 427 (1, M⁺), 312 (3), 285 (3), 257 (2), 229 (7), 185 (5), 170 (4), 144 (5), 116 (23), 86 (100), 84 (21), 72 (28), 70 (14), 57 (35); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,86 (d, J = 6,6 Hz, 3H, Val-CH₃), 0,91 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 × Val-CH₃), 0,97 (d, J = 6,9 Hz, 3H, Val-CH₃), 1,42 (s, 9H, tert-Butyl), 1,84–2,40 (m, 6H, 2 × Val-CH_β, 2 × Pro-CH₂) 3,15 (s, 3H, N-CH₂), 3,62–3,71 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 3,87–3,97 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 4,42 (dd, J₁ = 7,5 Hz, J₂ = 6,3 Hz, 1H, Pro-CH_α), 4,49 (dd, J₁ = 7,5 Hz, J₂ = 6,3 Hz, 1H, Pro-CH_α), 5,00 (d, J = 10,8 Hz, 1H, N-Me-Val-CH_α), 5,22 (bd, J = 9,3 Hz, 1H, NH). Anal. berechnet für C₂₂H₃₆N₃O₆: C, 59,84; H, 8,90; N, 9,52. Gefunden: C, 59,61; H, 9,04; N, 9,34.
Allgemeines Verfahren zur Synthese der Z- oder Boc-Depsipeptide 11a-r
N-[(2S)-O-[[N-(Benzyloxycarbonyl)-valyl]-(N-methyl-valyl)-prolyl-prolyl]-2-hydroxyisovaleryl]-2-phenethylamid (11c). Das Amid 8c (0,35 g, 0,84 mol) wurde in 1:1 TFA-CH₂Cl₂ (10 ml) bei 0°C 1 h entschützt, wobei das Trifluoracetatsalz 9c als Öl (nach Trocknen unter Vakuum während 1 h) erhalten wurde. Zu einem gekühlten (Eisbad) Gemisch des Amids 9c (0,27 g, 0,84 mmol) und Z-Tripeptids 10a (0,37 g, 0,80 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (10 ml) werden Et₃N (0,23 ml, 1,68 mmol) und DEPC (0, 13 ml, 0, 88 mmol) gegeben. Die klare Lösung wird 2 h bei 18°C, 18 h bei Raumtemperatur gerührt und dann eingeengt. Das Produkt wird durch Silicagelchromatographie (1'' × 16''-Säule) mit 1:3 Aceton-Hexan als Elutionsmittel getrennt. Die passenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt, wobei das Tetrapeptid (11c) als farbloses Glas erhalten wird (0,61 g, 100%). R_f 0,43 (Hexan-Aceton, 1:1); [α]²⁵ _D –185° (c = 0,1); MS m/z 761 (0,5, M⁺), 6,53 (5), 562 (3), 499 (2), 442 (4), 416 (12), 347 (38), 324 (12), 239 (100), 211 (42), 196 (9), 139 (4), 109 (47); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,80–0,95 (m, 15H, 2 × Val-CH₃), 1,02 (d, J = 6,6 Hz, 3H, Val-CH₃), 1,82–2,35 (m, 10H, 2 × Val-CH_β, 4 × Pro-CH₂), 2,43 (spd, J₁ = 6,9 Hz, J₂ = 3,3 Hz, 1H, Hiva-CH_β), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2H, Ph-CH₂), 3,15 (s, 3H, N-CH₃), 3,35–3,52 (m, 2H, Pro-CH₂), 3,55–3,70 (m, 2H, N-CH₂), 3,83–3,92 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 3,96–4,06 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 4,52 (dd, J₁ = 9,0 Hz, J₂ = 6,3 Hz, 1H, CH_α), 4,58–4,66 (m, 2H, 2 × CH_α), 5,07 (d, J = 12,0 Hz, 1H, N-Me-Val-CH_α), 5,08 (d, J = 3,0 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 5,10 (s, 2H, Ph-CH₂-O), 5,42 (bd, J = 9,3 Hz, 1H, NH), 7,17–7,40 (m, 10H), ArH).
Für die physikalischen Eigenschaften der Verbindungen 11a-r siehe die folgende Tabelle III.
Tabelle III Physikalische Konstanten für die Pentapeptidderivate 11a-r
Allgemeines Verfahren zum Entschützen der Z- oder Boc-Depsipeptide 11a-r
Verfahren A (Z-Depsipeptide)
Eine Lösung des entsprechenden Z-Depsipeptids (0,1 mmol) in EtOAc (20 ml) wird hergestellt und 0,8 mmol eines 10%-Pd/C-Katalysators werden unter einer Ar-Decke zugegeben. Die Lösung wird dann 18 h unter Wasserstoff kräftig gerührt und der Katalysator wird durch Filtration über Celite entfernt. Die gebildete klare Lösung wird unter Vakuum eingeengt, wobei das entsprechende freie Amin als viskoses Öl erhalten wird, das in der anschließenden Kopplungsstufe direkt verwendet wird.
Verfahren B (Boc-Depsipeptide)
Zu einer gekühlten (0°C) und gerührten Lösung des Boc-Tetrapeptidderivats (0,5 mmol) in CH₂Cl₂ (2,5 ml) wird TFA (2,5 ml) unter Ar gegeben. Die Lösung wird 1 h bei dieser Temperatur gerührt. Entfernen des Lösemittels unter vermindertem Druck ergibt ein Öl. Verbliebene TFA wird mit Toluol (3 × 20 ml) azeotrop entfernt, wobei das Trifluoracetatsalz als glasartiger Feststoff erhalten wird, der unter Vakuum getrocknet und in der anschließenden Reaktionsstufe direkt verwendet wird.
Verfahren C (unter Verwendung des Z-Depsipeptids 11e)
Eine 0,48-g-Probe der Verbindung 11e wird in 0,5 ml Eisessig suspendiert und 1,5 ml eines 33% HBr/AcOH-Reagens werden langsam unter Rühren zugegeben. Nach der Beendigung der CO₂-Entwicklung (30 min) wird Ethylether (15 ml) zugegeben und die Lösung gekühlt. Nach mehreren Minuten trennt sich ein Öl aus der Lösung ab, das ein Gemisch aus entschütztem Peptid und unverändertem Ausgangsmaterial ist. Das Produkt wird isoliert und die Etherlösung wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung auf einen pH-Wert von ~8 eingestellt und anschließend mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wird eingeengt, wobei ein gelber glasartiger Feststoff erhalten wird, der unter Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion verwendet wird.
Allgemeines Verfahren zur Kopplung von Dolavalin 4 mit den entschützten Depsipeptiden unter Bildung neuer Dolastatin-15-Derivate 12a-r
N-[(2S)-O-[(N,N-Dimethyl-valyl)-valyl-(N-methyl-valyl)-prolyl-prolyl]-2-hydroxyisovaleryl]-2-phenethylamid (12c). Das Depsipeptid 11c (0,37 g, 0,49 mmol) wird durch katalytische Hydrogenolyse entschützt (Verfahren A), wobei ein Öl erhalten wird, das in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst und unter Ar auf 0°C gekühlt wird. Zu der Lösung werden Dolavalin (4, 71 mg, 0,58 mmol), Et₃N (0,081 ml, 0,58 mmol) und DEPC (0,088 ml, 0,58 mmol) tropfenweise gegeben. Nach 2 h wird das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein Öl erhalten wird. Auf eine Reinigung durch Flashchromatographie (Silicagel, 1'' × 16''-Säule, 3:2 Hexan-Aceton) folgt eine Schnellgelpermeationschromatographie auf SEPHADEX LH-20 (CH₃OH-Elution) unter Bildung eines farblosen Schaums (0,26 g, 71%). R_f 0,21 (Hexan-Aceton, 2:1); [α]²⁵ _D –206° (c = 0,1); MS m/z 754 (1, M⁺), 711 (2), 663 (0,5), 499 (0,5), 437 (3,5), 416 (5), 340 (32), 324 (5), 329 (4), 227 (7), 211 (5), 196 (9), 196 (10), 154 (5), 109 (9), 101 (59), 100 (100); IR (NaCl) ν_max 3312, 2963, 2874, 1744, 1638, 1535, 1497, 1443, 1279, 1204, 1186, 1096, 1038, 1003 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,78 (d, J = 6,6 Hz, 3H, Val-CH₃), 0,83 (d, J = 6,6 Hz, Val-CH₃), 0,89–0,98 (m, 12H, 5 × Val-CH₃), 1,00 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 × Val-CH₃), 1,74–2,43 (m, 12H, Hiva-CH_β, 3 × Val-CH_β, 4 × Pro-CH₂), 2,24 (s, 6H, 2 × Dov-CH₃), 2,45 (d, J = 6,0 Hz, 1H, Dov-CH_α), 2,82 (t, J = 7,8 Hz, 2H, Ph-CH₂), 3,20 (s, 3H, N-CH₃), 3,38–3,51 (m, 2H, Pro-CH₂), 3,56–3,71 (m, 1H, N-CH₂), 3,83–3,94 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 3,96–4,06 (m, 1H, ½ Pro-CH₂), 4,59–4,68 (m, 2H, 2 × CH_α), 4,79 (dd, J₁ = 9,0 Hz, J₂ = 6,9 Hz, 1H, CH_α), 5,09 (d, J = 3,0 Hz, 1H, Hiva-CH_α), 5,11 (d, J = 12,0 Hz, 1H, N-Me-Val-CH_α), 6,89 (bd, J = 9,3 Hz, 1H, NH), 7,17–7,31 (m, 5H, ArH), 7,39 (bs, 1H, NH); ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 16,5, 17,6, 18,2, 18,6, 18,9, 19,2, 20,2, 25,1, 25,2, 27,4, 27,7, 28,4, 29,3, 29,8, 30,7, 31,1, 35,4, 40,8, 43,0, 47,1, 47,8, 53,7, 57,9, 59,1, 59,6, 76,5, 78,6, 126,3, 128,4 (2), 128,7 (2), 139,0, 169,1, 169,4, 170,7, 171,5, 171,8, 173,2. Anal. berechnet für C₄₀H₆₆N₆O₇·½H₂O: C, 64,46; H, 8,84; N, 11,0. Gefunden: C, 64,69; H, 9,00; N, 10,77.
Für die physikalischen Eigenschaften der Verbindungen 12a-r siehe die Tabelle IV.
Tabelle IV Physikalische Konstanten für die Dolastatin-15-Strukturmodifikationen 12a-r
Sowohl Dolastatin 10 (siehe R. Bai et al., 1990a, Dolastatin 10, a powerful cytostatic peptide derived from a marine animal: Inhibition of tubulin polymerization mediated through the vinca alkaloid binding domain, Biochemical Pharmacology, 39, 1941) als auch Dolastatin 15 (siehe Bai et al., 1992, Dolastatin 15, a potent antimitotic depsipeptide derived from Dolabella auricularia: Interaction with tubulin and effects on cellular microtubules, Biochemical Pharmacology, 43, 2637) wechselwirken mit Tubulin und bewirken einen Stopp der Zellmitose. Die Wirkungen auf Tubulin in vitro mit Dolastatin 10 wurden im Detail untersucht (siehe Bai et al., 1990b: Binding of dolastatin 10 to tubulin at a distinct site for peptide antimitotic agents near the exchangeable nucleotide and vinca alkaloid sites, Journal of Biological Chemistry, 265, 17141; und Bai et al., 1995, Interaction of dolastatin 10 with tubulin: Induction of aggregation and binding and dissociation reactions, Molecular Pharmacology, 47, 965). Da die Wechselwirkung von Dolastatin 15 mit Tubulin beträchtlich schwächer zu sein scheint, wurde den biochemischen Eigenschaften dieses Depsipeptids weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Indessen beschrieb eine Zahl von Untersuchungen die antiproliferativen Wirkungen von Dolastatin 15 gegenüber humanen Lymphomzellen (siehe Beckwith et al., 1993, Growth inhibition of human lymphoma cell lines by the marine natural products dolastatins 10 and 15, Journal of the National Cancer Institute, 85, 483), auf marine Knochenmarkvorläuferzellen (siehe Jacobsen et al., 1991, Antineoplastic dolastatins: Potant inhibitors of hematopoietic progenitor cells, Journal of the National Cancer Institute, 83, 1672) und auf maligne periphere Blutzellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (siehe Steube et al., 1992, Dolastatin 10 and dolastatin 15: Effects of two natural peptides on growth and differentiation of leukemia cells, Leukemia, 6, 1048).
Alle diese Untersuchungen wurden durch die Synthese (siehe Pettit et al., 1991, Antineoplastic agents 220, Synthesis of natural (–)-dolastatin 15, Journal of the American Chemical Society, 113, 6692) von Dolastatin 15 am Cancer Research Institute in Tempe, Arizona, ermöglicht, das die ersten synthetischen Proben des Peptids, die überhaupt verfügbar waren, lieferte. Ein anschließendes modifiziertes Syntheseverfahren (siehe Pettit et al., 1994, The dolastatins 20, A convenient synthetic route to dolastatin 15, Tetrahedron, 50, 12097) erwies sich zur Herstellung dieses vielversprechenden Antikrebsmittels im großen Maßstab als sehr praktikabel. Eine noch weitere Synthese von Dolastatin 15, die anschließend an Pettits ursprüngliche Synthese abgeleitet wurde, ist bei Patino et al. beschrieben (siehe Patino et al., 1992, Total synthesis of the proposed structure of dolastatin 15, Tetrahedron, 48, 4115–4122). Der potentielle Vorteil der Identifizierung geeigneter Substitutionen für die Dpy-Einheit von Dolastatin 15 wurde zu Beginn der Anstrengungen zur Synthese einer kommerziell durchführbaren Alternative offensichtlich. Von größter Bedeutung war der potentielle Ausschluss von sechs Synthesestufen und die Eliminierung der nicht vorherzusagenden Dolapyrrolidinon-Cyclisierungssequenz. Daher wurde bestimmt, die modifizierte Aminosäureeinheit durch ohne weiteres verfügbare Arylalkylamine auf der Basis von β-Phenethylamin und durch verschiedene andere Gruppen zu ersetzen.
Zur Herstellung der α-Hydroxyamide 7a-r wurde bestimmt, dass es äußerst effizient ist, diese Substanzen ohne Schutz der Hydroxylgruppe zu erhalten. Für die aliphatischen Amine 6b-o wurde dieses Ziel durch Verwendung des ursprünglichen Syntheseansatzes von Pettit (op. cit.) ohne weiteres erreicht. So wurden 2-(S)-Hydroxyisovaleriansäure (Hiva, 3) und das entsprechende Amin unter Verwendung von DEPC mit NMM als Base kondensiert, wobei die Verbindungen 7b-o in guten Ausbeuten, wie in Reaktionsschema 1 angegeben, erhalten wurden. Aufgrund der verringerten Nukleophilie der Aminokomponente war die Acylierung der aromatischen Amine (6a, 6p-r) mit aktivierter Hiva eine größere Herausforderung. Milde Kopplungsreagentien, wie DEPC (siehe Yamada et al., 1975, Diphenyl phosphorazidate (DPPA) and diethyl phosphorocyanidate (DEPC), Two new reagents for solid-phase peptide synthesis and their application to the synthesis of porcine motilin, Journal of the American Chemical Society, 97, 7174), WRK (siehe Pettit et al., 1966, Structural biochemistry II, Synthesis of 3β-Hydroxy-17β-(L-prolyl-L-prolyl)amino-5α-androstane, Canadian Journal of Chemistry, 44, 2023; und Pettit et al., 1967, Synthesis of 3β-Acetoxy-17β-(L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl)amino-5α-androstane, J. Med. Chem., 10, 145), ergaben keine Reaktion, während eine starke Aktivierung mit DCC, BrOP (siehe Coste et al., 1990, A new reagent for coupling N-methylated amino acids, Tetrahedron Letters, 31, 669) oder mit verschiedenen Chlorformiaten (siehe van Bogart et al., 1993, Synthesis and antitrypanosomal evaluation of some thiazole-containing amino acids and peptides, European Journal of Medicinal Chemistry, 28, 387; und Nedev et al., 1993, A convenient Method for synthesis of Fmoc-amino acid p-nitroanilides based on isobutyl chloroformate as condensation agent, Tetrahedron Letters, 34, 4201) die kompetitive Veresterung der ungeschützten α-Hydroxylgruppe ermöglichte, was zu komplexen Gemischen führte. Jedoch wurde der HOBt-Ester von Hiva, der in situ mit DCC bei 0°C in wasserfreiem THF hergestellt wurde, als sehr geeignet für die selektive Acylierung derartiger aromatischer Amine ermittelt. Tatsächlich resultierten moderate bis gute Ausbeuten des gewünschten Amids ohne eine Spur von Veresterungsnebenprodukten. In der anschließenden Stufe wurden Boc-Prolin mit den Alkoholen 7a-r unter Verwendung von DCC in CH₂Cl₂ mit 4-Pyrrolidinopyridin als Katalysator verestert (Raumtemperatur, 18 h), wobei hervorragende Ausbeuten der Ester 8a-r als viskose Öle erhalten wurden. Es wurde dann entdeckt, dass das wasserlösliche Carbodiimid EDC-HCl gleich gut funktionierte und weniger Reinigungsprobleme als DCC ergab. Die Boc-Schutzgruppe wurde mit TFA entfernt, wobei die entsprechenden Trifluoracetate 9a-r erhalten wurden.
Zur Synthese und anschließenden Deblockierung der Depsipeptide 11a-r wurde zunächst an die Verwendung des Z-Schutzreaktionsschemas gedacht, das zum ersten Mal in der ursprünglichen Synthese von Dolastatin 15 beschrieben wurde (siehe US-Patent 4 879 278). Jedoch erwiesen sich die Bedingungen der zur Entfernung dieser Gruppe verwendeten katalytischen Hydrogenolyse für mehrere der im folgenden angegebenen Peptidzwischenprodukte als ungeeignet. Infolgedessen wurde Boc-Val-N-Me-Val-Pro (10b) zusätzlich zu dem üblichen Z-Tripeptidzwischenprodukt (10a) synthetisiert, um eine katalytische Hydrogenolyse zu umgehen. Die DEPC-vermittelte Segmentkondensation des entsprechenden Tripeptids (10a oder 10b) mit Trifluoracetaten 9a-r ergab durchgängig hohe Ausbeuten des entsprechenden Depsipeptidderivats (11a-r) wie in Reaktionsschema 2 angegeben.
Es wurde ermittelt, dass die zuvor zur Entfernung der Z-Schutzgruppe verwendeten milden Bedingungen einer katalytischen Hydrogenolyse eine quantitative Dechlorierung der Verbindung 11e bewirkten und daher die Entwicklung einer alternativen Route für die halogenierten aromatischen Amide 9d-h erzwang. Obwohl das versuchte Entschützen des Peptids 11e mit 33% Bromwasserstoff in Eisessig unter üblichen Bedingungen keinen Halogenverlust verursachte, wurde eine intensive Racemisierung von mindestens einer der Aminosäureeinheiten beobachtet, die sehr wahrscheinlich die stark säureempfindliche N-Me-Val-Einheit ist, wie von Benoiton et al. angegeben (siehe Benoiton et al., 1973, N-methylamino acids in peptide synthesis, III, Racemization during deprotection by saponification and acidolysis, Canadian Journal of Chemistry, 51, 2555). Daher wurden alle übrigen Peptide, die halogenierte aromatische Ringe enthielten, als Boc-geschützte Depsipeptide hergestellt (11d, 11f-h). Das Entschützen dieser Peptide in TFA-CH₂Cl₂ (1:1) bei 0°C während 1 h erfolgte glatt und ergab quantitative Ausbeuten der entsprechenden Trifluoracetatsalze (die in den anschließenden Kopplungsreaktionen direkt verwendet wurden). Die Boc-Strategie wurde für die p-Nitro-phenethylamin-(11i), Met-OMe-(11n), Thiazol-(11p) und Benzothiazol-(11q)amide verwendet, um eine unerwünschte Reduktion der Nitrogruppe oder Katalysatorvergiftung durch die schwefelhaltigen Peptide zu vermeiden. Das Entschützen aller anderen Peptidzwischenprodukte durch katalytische Hydrogenolyse (10% Pd/C, EtOAc, 18 h) ergab die entsprechenden Amine in hervorragenden Ausbeuten.
Die letzte Kopplung jedes Peptids an den N-terminalen Dolavalinrest wurde in guter Ausbeute mit DEPC/Et₃N in CH₂Cl₂ wie in Reaktionsschema 3 angegeben durchgeführt. In einigen Fällen ist aufgrund der basischen Natur der Endpeptide 12a-r eine weitere Reinigung nach einer Silicagelchromatographie notwendig. In derartigen Fällen ergab eine Schnellgelpermeationschromatographie (SEPHADEX LH-20, Methanolelution) sehr zufriedenstellende Ergebnisse, wobei die Endpeptide als farblose Schäume oder amorphe Pulver erhalten wurden.
Die Ergebnisse von In-vitro-Tests der synthetischen Derivate (12a-r) gegenüber den murinen Leukämiezelllinien P388 und L1210 und der humanen Burkitt-Lymphom-CA46-Linie zusammen mit den entsprechenden Tubulinantipolymerisationsergebnissen sind in der folgenden Tabelle V angegeben.
Tabelle V Hemmaktivitäten von Dolastatin 15 (1) und synthetischen Modifikationen (12a-r) auf murine P388-lymphatische-Leukämie [ED₅₀ (ng/ml)]^a, murine L1210-Leukämie [IC₅₀ (nM)]^b, humanes CA46-Burkitt-Lymphom [IC₅₀ (nM)]^b,c und Tubulinpolymerisation (IC₅₀(:M) ± [SD]).
Alle Derivate zeigten antiproliferative Aktivitäten, die mit den Eigenschaften der Stammverbindung Dolastatin 15 (1) vergleichbar waren, und in den Burkitt-Zellen verursachten alle Analoga einen deutlichen Anstieg des Mitoseindex.
Keines war jedoch ein so starker Inhibitor der Tubulinpolymerisation wie Dolastatin 15 (1). In ähnlicher Weise ergaben wiederholte Tests von 12a-r in dem Primärscreening von 60 Zelllinien humaner Tumore des NCI konsistent mittlere Panel-GI₅₀-Werte ähnlicher Stärke wie die des Dolastatin-15-Standard, wie in der folgenden Tabelle VI angegeben ist.
Tabelle VI Mittlere Panel-GI₅₀-Werte (nM) ± Standardabweichung^a und GI₅₀-Vergleichskorrelationen^b mit Dolastatin 15 für synthetische Modifikationen (12a-r), die in dem Panel^d von 60 Zelllinien eines humanen Tumors in vitro des NCI getestet wurden^c.
Darüber hinaus waren unter Verwendung der von Boyd und Paull beschriebenen COMPARE-Analysen bzw. Vergleichsanalysen (siehe Boyd et al., 1995, Some practical considerations and applications of the National Cancer Institute in vitro anticancer drug discovery screen, Drug Development Research, 34, 91) die Mittelwert-Fingerprints von 12a-r in dem NCI-Screening alle mit dem von Dolastatin 15 hoch korreliert (beispielsweise ≥ 0,7). Daher wurde bestimmt, dass die antiproliferativen und antimitotischen Aktivitäten von Dolastatin 15 gegenüber Änderungen des C-terminalen Rests bemerkenswert tolerant sind, während die Antitubulineigenschaften gegenüber derartigen Änderungen empfindlicher sind. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu analogen Untersuchungen, die von Pettit et al. berichtet wurden (siehe Pettit et al., 1995, Antineoplastic Agents 337, Synthesis of Dolastatin 10 Structural Modifications, Anticancer Drug Design, 10, 529), wobei die Derivate von Dolastatin 10, bei denen die C-terminale Dolaphenineinheit durch Gruppen, die kein β-Phenethylaminkohlenstoffrückgrat enthielten, ersetzt war, kleine Unterschiede der Antitubulinwirksamkeiten zeigten, jedoch bis zu 100-fache Abnahmen der Zytotoxizität zeigten.
Die Wechselwirkung von Dolastatin 15 mit gereinigtem Tubulin ist beträchtlich schwächer als die von Dolastatin 10 (etwa 20-fach) trotz dessen starker antiproliferativer Wirkung auf zelluläre Mikrotubuli (ein Viertel der Aktivität von Dolastatin 10, jedoch zehnfach stärker aktiv als das Antitumormittel Vinblastin) (siehe Bai et al., 1992, Dolastatin 15, a potent antimitotic depsipeptide derived from Dolabella auricularia: Interaction with tubulin and effects on cellular microtubules, Biochemical Pharmacology, 43, 2637). In früheren ursprünglichen Untersuchungen der Antitubulineigenschaften von Dolastatin 15, die von Bai et al. berichtet wurden (siehe Id.), wurden die Wirkungen dieses Depsipeptids auf die Polymerisation von 10 μM Tubulin in 1 M Mononatriumglutamat-1 mM MgCl₂ untersucht und ergaben eine IC₅₀-Wert von 23 μM (50% Hemmung des Ausmaßes der Polymerisation nach 20 min bei 37°C). Dieses Ergebnis wurde in neuen Experimenten bestätigt, wo ein Wert von 19 ± 0,3 (Standardabweichung) μM erhalten wurde. Jedoch wurde kein IC₅₀-Wert für eines der hier angegebenen Dolastatin-15-Derivate unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen erhalten, obwohl eine klare Hemmung der Aggregationsraten mit diesen Verbindungen erfolgte (maximale verwendete Konzentration 40 μM).
Mit zunehmender Zahl antimitotischer Arzneimittel, insbesondere derjenigen, die an der Colchicinstelle binden, hatten die gebildeten Tubulinpolymere eine stark abweichende Morphologie in 1 M Glutamat-1 mM MgCl₂ (siehe beispielsweise Hamel et al., 1995, Limitations in the use of tubulin polymerization assays as a screen for the identification of new antimitotic agents: The potent marine natural product curacin A as an example, Drug Development Research, 3). Da diese Polymere mit hohem Molekulargewicht, wie Mikrotubuli, Licht streuen, machen sie es unmöglich, Arzneimittelwirkungen durch Turbidimetrie oder Zentrifugation quantitativ zu bestimmen. Bei der Erforschung alternativer Testbedingungen für derartige Verbindungen wurde entdeckt, dass die abweichenden Polymere in 0,8 M Glutamat bei 30°C (ohne Zugabe von MgCl₂ zu den Reaktionsgemischen) allgemein nicht gebildet wurden. Unter dieser Reaktionsbedingung erfolgte die normale Aggregationsreaktion immer noch mit einer verringerten Reaktionsrate und es bestand eine wesentliche Verringerung des IC₅₀-Werts, die mit Mitteln, die unter beiden Reaktionsbedingungen geprüft werden konnten, erhalten wurde.
Eine abweichende Polymerbildung wurde mit Dolastatin 15 nicht beobachtet, obwohl eine derartige Reaktion mit Dolastatin 10 erfolgt (siehe Bai et al., 1995, Interaction of dolastatin 10 with tubulin: Induction of aggregation and binding and dissociation reactions, Molecular Pharmacology, 47, 965). Indessen wurde, wenn Dolastatin 15 bezüglich Hemmung der Aggregation in 0,8 M Glutamat bei 30°C bewertet wurde, die Wirkung eines verringerten IC₅₀-Werts wiederum beobachtet. Es wurde ein Wert von 5,2 ± 0,6 μM erhalten. Von noch größerer Bedeutung ist, dass es unter dieser Reaktionsbedingung möglich war, einen quantitativen Vergleich der hier beschriebenen Reihe von Dolastatin-15-Analoga durchzuführen (siehe Tabelle V). Obwohl keine der bewerteten 16 Verbindungen einen so niedrigen IC₅₀-Wert wie Dolastatin 15 aufwies, wurden unzweifelhafte Hemmwirkungen mit allen untersuchten Mitteln beobachtet. Die erhaltenen IC₅₀-Werte lagen im Bereich von 8,4 μM für die Verbindung 12p bis 26 μM für 12a. Einschließlich von Dolastatin 15 gab es einen Fünffachbereich der IC₅₀-Werte, der in dieser Folge von Experimenten erhalten wurde.
Die Untersuchung der Wechselwirkung von Dolastatin 15 mit Tubulin wurde im Zusammenhang mit einer Bewertung der Wirkungen des Mittels auf das Wachstum von murinen L1210-Leukämiezellen und humanen CA46-Burkitt-Lymphom-Zellen durchgeführt (siehe Bai et al., 1992, Dolastatin 15, a potent antimitotic depsipeptide derived from Dolabella auricularia: Interaction with tubulin and effects on cellular microtubules, Biochemical Pharmacology, 43, 2637). Die Wirkungen der meisten dieser neuen Dolastatin-15-Derivate wurden an diesen gleichen Zelllinien überprüft und es wurden geringe Unterschiede zwischen den Verbindungen ermittelt, wie in Tabelle V angegeben.
Bei den L1210-Zellen lagen die IC₅₀-Werte für Zellwachstum im 1–4 nM-Bereich und mit den Burkitt-Zellen betrug der Bereich der IC₅₀-Werte 0,3–4 nM. Obwohl der beobachtete Wertebereich ähnlich der Fünffachvariation der IC₅₀-Werte für die Tubulinpolymerisation war, gab es eine geringe Korrelation zwischen den für spezielle Verbindungen erhaltenen Werten. Beispielsweise war Dolastatin 15 der stärkste Inhibitor der Tubulinaggregation, jedoch lag es bei den L1210- und Burkitt-Zellen unter den am wenigsten aktiven Verbindungen.
Zur weiteren Verifizierung der Annahme, dass diese gesamte Verbindungsreihe intrazellulär durch Eingreifen in die Tubulinfunktion wirkt, wurden die arzneimittelbehandelten Burkitt-Zellen hinsichtlich Mitosestopp analysiert. Wie früher für Dolastatin 15 beobachtet wurde (siehe Bai et al., 1992, Dolastatin 15, a potent antimitotic depsipeptide derived from Dolabella auricularia: Interaction with tubulin and effects on cellular microtubules, Biochemical Pharmacology, 43, 2637), verursachten mit allen Verbindungen mit 80 nM behandelte Zellen die Ansammlung hoher Zahlen von Burkitt-Zellen in offensichtlichem Metaphasestillstand (Tabelle V).
Es wurde vorgeschlagen, dass die starke Zytotoxizität und Tubulinhemmwirkungen von Dolastatin 15 nicht auf dem Stammmolekül, sondern einem davon abgeleiteten stärker aktiven Metabolit beruhen. Beispielsweise kann die intrazelluläre Hydrolyse der Esterbindung des Depsipeptids ein stärker wirksames Peptidfragment oder ein Fragment, das zu einer stärker aktiven Spezies weiter metabolisiert wird, ergeben. Diese Möglichkeit scheint mit der offensichtlichen Unempfindlichkeit der Dolastatin-15-Aktivität auf eine strukturelle Modifikation des C-Terminus und der jüngsten Beobachtung von Roux et al. (siehe Roux et al., 1994, Synthesis and in vitro cytotoxicity of diastereomerically modified dolastatin 15 analogues, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 4, 1947), dass Änderungen der Stereochemie der Hiva-Dpy-Einheit von einer minimalen Abnahme der Zytotoxizität begleitet sind, konsistent. Besonders interessant ist hierbei die Beobachtung, dass das Peptidsegment Dov-Val-Me-Val-Pro-Pro scheinbar inaktiv ist, während das synthetische Dolastatin-15-Derivat LU103793, das bei Dearruda et al. angegeben ist (siehe Dearruda et al., 1995, Lu103793 (NSC D-669356): A synthetic peptide that interacts with microtubules, Cancer Research, 55, 3085), Dov-Val-Me-Val-Pro-Pro-Benzamid (NSC 669356), sowohl hoch zytotoxisch (IC₅₀ 3 nM gegenüber L1210-Leukämiezellen) als auch ein starker Inhibitor der Tubulinpolymerisation (IC₅₀ 4,0 ± 0,6 μM) unter den gleichen Reaktionsbedingungen, unter denen Dolastatin 15 mit 5,2 μM 50% hemmend war, ist. Alternativ kann das Benzamidderivat LU103793 für einen passenden Transport des Peptids zum Ort bzw. zu den Orten der Aktivität notwendig sein.
Es ist nun klar, dass die strukturell singuläre Dpy-Einheit von Dolastatin 15 eine sehr beschränkte Rolle in den für Dolastatin 15 beobachteten Zellwachstumshemmwirkungen spielt und wahrscheinlich keine kritische Komponente der aktiven Stelle(n) von Dolastatin 15 ist. Diese Tatsache bietet eine ungewöhnliche Möglichkeit zur weiteren Verstärkung der Fähigkeit, die Vorteile von Dolastatin 15 auf eine viel einfachere und kostengünstigere Weise zu erreichen und die In-vivo-Antitumorwirkung dieser singulären Verbindungen zu optimieren oder in anderer Weise zu nutzen. Es ist daher offensichtlich, dass die komplexe Dpy-Einheit von Dolastatin 15 ohne weiteres durch Amide, die von dem leichter verfügbaren Phenethylamin, 2-Aminothiazol und 2-Aminobenzothiazol abgeleitet sind, oder durch andere relativ verfügbare und unschädliche Substituenten ohne eine signifikante Verringerung der Krebszellwachstumshemmaktivität des gebildeten Derivats ersetzt werden kann.
Von neun Bakterien und zwei Pilzen, die gescreent wurden, hemmten Dolastatin 15 und die acht hier beschriebenen Derivate spezifisch das Wachstum des Darmbakteriums Erwinia carotovora (Tabelle VII). Die Stammverbindung war die wirksamste gegenüber E. carotovora.
Tabelle VII Minimale Hemmkonzentrationen (μg/Scheibe) von Dolastatin 15 und strukturellen Modifikationen für das Bakterium Erwinia carotovora
Die hier verwendeten fettgedruckten Ziffern 1, 2 und dgl. bezeichnen die Verbindungen, deren Strukturen im folgenden angegeben sind.
Die Synthese der Depsidipeptidderivate 9a-r ist im folgenden Reaktionsschema 1 angegeben.

a) R = NHPh; Methode B
b) R = NHCH₂Ph; Methode A
c) R = NH(CH₂)₂Ph; Methode A
d) R = NH(CH₂)₂-4-F-Ph; Methode A
e) R = NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph; Methode A
f) R = NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph; Methode A
g) R = NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph; Methode A
h) R = NH(CH₂)₂-4-Br-Ph; Methode A
i) R = NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph; Methode A
j) R = NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂-Ph; Methode A
k) R = NH(CH₂)₂-2-Pyridin; Methode A
l) R = NH(CH₂)₃Ph; Methode A
m) R = L-Phe-OCH₃; Methode A
n) R = L-Met-OCH₃; Methode A
o) R = L-Pro-OCH₃; Methode A
p) R = NH-2-Thiazolyl; Methode B
q) R = NH-2-Benzothiazolyl; Methode B
r) R = NH-3-Chinolyl; Methode B
(i) Methode A: DEPC, NMM, CH₂Cl₂, 0°C, 2 h. Methode B: DCC, HOBt (2 Äq.), NMM, THF, 0°C, 2 h.
(ii) Boc-L-Pro (1,2 Äq.), DCC (1,2 Äq.), 4-Pyrrolidinopyridin (1,2 Äq.), CH₂Cl₂, 23°C, 18 h. oder Boc-L-Pro (1,2 Äq.), EDC-HCl (1,2 Äq.), 4-Pyrrolidinopyridin (2,4 Äq.), CH₂Cl₂, 23°C, 18 h.
(iii) TFA, CH₂Cl₂, 0°C, 1 h.

Die Synthese der Z- oder Boc-Pentapeptidderivate 11a-r ist im folgenden Reaktionsschema 2 angegeben.

a) R₁ = Z, R₂ = NHPh
b) R₁ = Z, R₂ = NHCH₂Ph
c) R₁ = Z, R₂ = NH(CH₂)₂Ph
d) R₁ = Boc, R₂ = NH(CH₂)₂-4-F-Ph
e) R₁ = Z, R₂ = NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph
f) R₁ = Boc, R₂ = NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph
g) R₁ = Boc, R₂ = NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph
h) R₁ = Boc, R₂ = NH(CH₂)₂-4-Br-Ph
i) R₁ = Boc, R₂ = NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph
j) R₁ = Z, R₂ = NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂-Ph
k) R₁ = Z, R₂ = NH(CH₂)₂-2-Pyridin
l) R₁ = Z, R₂ = NH(CH₂)₃Ph
m) R₁ = Z, R₂ = L-Phe-OCH₃
n) R₁ = Boc, R₂ = L-Met-OCH₃
o) R₁ = Z, R₂ = L-Pro-OCH₃
p) R₁ = Boc, R₂ = NH-2-Thiazolyl
q) R₁ = Boc, R₂ = NH-2-Benzothiazolyl
r) R₁ = Z, R₂ = NH-3-Chinolyl

Die Synthese der Dolastatin-15-Derivate 12a-r ist im folgenden Reaktionsschema 3 angegeben.

a) R = NHPh; Methode A
b) R = NHCH₂Ph; Methode A
c) R = NH(CH₂)₂Ph; Methode A
d) R = NH(CH₂)₂-4-F-Ph; Methode B
e) R = NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph; Methode C
f) R = NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph; Methode B
g) R = NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph; Methode B
h) R = NH(CH₂)₂-4-Br-Ph; Methode B
i) R = NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph; Methode B
j) R = NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂-Ph; Methode A
k) R = NH(CH₂)₂-2-Pyridin; Methode A
l) R = NH(CH₂)₃Ph; Methode A
m) R = L-Phe-OCH₃; Methode A
n) R = L-Met-OCH₃; Methode B
o) R = L-Pro-OCH₃; Methode A
p) R = NH-2-Thiazolyl; Methode B
q) R = NH-2-Benzothiazolyl; Methode B
r) R = NH-3-Chinolyl; Methode A
(i) Methoden A, B oder C. Methode A: H₂ 10% Pd/C, EtOAc, 18 h. Methode B: TFA, CH₂Cl₂, 0°C, 1 h. Methode C: 33% HBr/AcOH, 23°C, 30 min.
(ii) Dolavalin (4, 1,2 Äq.), DEPC (1,2 Äq.), Et₃N (1,2 Äq. bei Methode A; 2,4 Äq. bei Methode B oder C), DEPC (1,2 Äq.), CH₂Cl₂, 0°C, 2 h.

Claims

Dolastatin-15-Derivat der Formel 12a-r
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe von: NHPh, NHCH₂Ph, NH(CH₂)₂Ph, NH(CH₂)₂-4-F-Ph, NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-4-Br-Ph, NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph, NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂Ph, NH(CH₂)₂-2-Pyridin, NH(CH₂)₃-Ph, L-Phe-OCH₃, L-Met-OCH₃, L-Pro-OCH₃, NH-2-Thiazolyl, NH-2-Benzothiazolyl und NH-3-Chinolyl.
Verfahren zur Synthese eines Dolastatin-15-Derivats der Formel 12a-r
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe von: NHPh, NHCH₂Ph, NH(CH₂)₂Ph, NH(CH₂)₂-4-F-Ph, NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-4-Br-Ph, NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph, NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂Ph, NH(CH₂)₂-2-Pyridin, NH(CH₂)₃-Ph, L-Phe-OCH₃, L-Met-OCH₃, L-Pro-OCH₃, NH-2-Thiazolyl, NH-2-Benzothiazolyl und NH-3-Chinolyl; wobei das Verfahren umfasst: (a) Umsetzen von 2-Hydroxyisovaleriansäure mit einem Amin der Formel R-H über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Amids der Formel 7a-r
worin R wie im vorhergehenden definiert ist, wirksam sind; (b) Umsetzen des Amids der Formel 7a-r mit tBoc-L-Prolin über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Esters der Formel 8a-r
wirksam sind; (c) Behandeln des Esters der Formel 8a-r mit Trifluoressigsäure über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Entfernung der tBoc-Gruppe von dem Ester der Formel 8a-r wirksam sind, wodurch ein Trifluoressigsäuresalz der Formel 9a-r
gebildet wird; (d) Umsetzen des Trifluoressigsäuresalzes der Formel 9a-r mit dem Tripeptid der Formel 10ab über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Tetrapeptids der Formel 11a-r wirksam sind;
worin Z Carboxybenzyloxy bedeutet; (e) Entfernen der Carboxybenzyloxygruppe von dem Tetrapeptid der Formel 11a-r unter Bildung eines entschützten Tetrapeptids und Umsetzen des entschützten Tetrapeptids mit N,N'-Dimethylvalin über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Do lastatin-15-Derivats der Formel 12a-r wirksam sind; und (f) Gewinnen des Dolastatin-15-Derivats der Formel 12a-r.
Verfahren zur Synthese eines Dolastatin-15-Derivats nach Anspruch 2, wobei die Stufe (a) in Gegenwart von 4-Methylmorpholin (NMM) und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe (a) in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), 4-Methylmorpholin (NMM) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe (b) in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4-Pyrrolidinopyridin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe (b) in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC-HCl) und 4-Pyrrolidinopyridin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe (b) in Gegenwart von Et₃N und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r in EtOAc, der ein 10 Pd/C-Katalysator zugesetzt wurde, entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r in CH₂Cl₂, der ein 10 Pd/C-Katalysator zugesetzt wurde, entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in Gegenwart einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r, das in Eisessig suspendiert ist, unter Zusatz von 33% HBr/AcOH entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in der Stufe (e) die Umsetzung des Tetrapeptids der Formel 11a-R mit N,N'-Dimethylvalin in Gegenwart von Et₃N und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Verfahren zur Synthese eines Dolastatin-15-Derivats der Formel 12a-r
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe von: NHPh, NHCH₂Ph, NH(CH₂)₂Ph, NH(CH₂)₂-4-F-Ph, NH(CH₂)₂-4-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-3-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-2-Cl-Ph, NH(CH₂)₂-4-Br-Ph, NH(CH₂)₂-4-NO₂-Ph, NH(CH₂)₂-3,4-(CH₃O)₂Ph, NH(CH₂)₂-2-Pyridin, NH(CH₂)₃-Ph, L-Phe-OCH₃, L-Met-OCH₃, L-Pro-OCH₃, NH-2-Thiazolyl, NH-2-Benzothiazolyl und NH-3-Chinolyl; wobei das Verfahren umfasst: (a) Umsetzen von 2-Hydroxyisovaleriansäure mit einem Amin der Formel R-H über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Amids der Formel 7a-r
worin R wie im vorhergehenden definiert ist, wirksam sind; (b) Umsetzen des Amids der Formel 7a-r mit tBoc-L-Prolin über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Esters der Formel 8a-r
wirksam sind; (c) Behandeln des Esters der Formel 8a-r mit Trifluoressigsäure über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Entfernung der tBoc-Gruppe von dem Ester der Formel 8a-r wirksam sind, wodurch ein Trifluoressigsäuresalz der Formel 9a-r
gebildet wird; (d) Umsetzen des Trifluoressigsäuresalzes der Formel 9a-r mit dem Tripeptid der Formel 10ab über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Tetrapeptids der Formel 11a-r wirksam sind;
worin Z tBoc bedeutet; (e) Entfernen der tBoc-Gruppe von dem Tetrapeptid der Formel 11a-r unter Bildung eines entschützten Tetrapeptids und Umsetzen des entschützten Tetrapeptids mit N,N'-Dimethylvalin über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Dolastatin-15-Derivats der Formel 12a-r wirksam sind; und (f) Gewinnen des Dolastatin-15-Derivats der Formel 12a-r.
Verfahren zur Synthese eines Dolastatin-15-Derivats nach Anspruch 12, wobei die Stufe (a) in Gegenwart von 4-Methylmorpholin (NMM) und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe (a) in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), 4-Methylmorpholin (NMM) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe (b) in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4-Pyrrolidinopyridin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe (b) in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC-HCl) und 4-Pyrrolidinopyridin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe (d) in Gegenwart von Et₃N und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in Gegenwart einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r in EtOAc, der ein 10% Pd/C-Katalysator zugesetzt wurde, entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in Gegenwart einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r in CH₂Cl₂, der ein 10% Pd/C-Katalysator zugesetzt wurde, entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in der Stufe (e) das Tetrapeptid der Formel 11a-r in Gegenwart einer Lösung eines Tetrapeptids der Formel 11a-r, das in Eisessig suspendiert ist, unter Zusatz von 33% HBr/AcOH entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in der Stufe (e) die Umsetzung des Tetrapeptids der Formel 11a-r mit N,N'-Dimethylvalin in Gegenwart von Et₃N und Diethylphosphorocyanidat (DEPC) durchgeführt wird.
Dolastatin-15-Derivat nach Anspruch 1, wobei R = NH(CH₂)₂Ph.
Verbindungen nach Anspruch 1 oder 22, zur Verwendung in der Medizin.
Verbindungen nach Anspruch 23, wobei die Verbindungen zur Behandlung von Krebs und/oder zur Hemmung der Tubulinpolymerisation und/oder zur Hemmung des Wachstums von Bakterien verwendet werden.
Verwendung von Verbindungen nach den Ansprüchen 1 oder 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs und/oder zur Hemmung der Tubulinpolymerisation und/oder zur Hemmung des Wachstums von Bakterien.
Verwendung nach den Ansprüchen 24 oder 25, wobei der Krebs Leukämie ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 24 oder 25, wobei der Krebs Burkitt-Lymphom ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 24 oder 25, wobei das Bakterium Erwinia carotovora ist.