DE69020783T2 - Stabilisierung von Wasserstoffsuperoxyd in Tests. - Google Patents

Description

• Das Fachgebiet der vorliegenden Erfindung betrifft diagnostische Assays oder andere Systeme, die die Stabilisierung von Wasserstoffperoxid erfordern.
• In vielen Assays wird Wasserstoffperoxid als Reagens verwendet. Wenn die Assays quantitativ oder halb-quantitativ sind, ist es notwendig, daß das Wasserstoffperoxid in der Weise reagiert, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals geeignet ist (üblicherweise Chromogen-Bildung). In vielen Assays sind Blul oder Blutderivate wie z.B. Serum oder Plasma vorhanden, wobei die Blutprobe ein komplexes Komponentengemisch enthält. Diese Komponenten variieren von Patient zu Patient und können wie man feststellte, einen Einfluß auf die Quantifizierung von Wasserstoffperoxid ausüben. Es ist daher wichtig, Systeme bereitzustellen, die die Reaktion von Wasserstoffperoxid auf anderen Wegen als dem erwünschten Wege des Assays verhindern.
• Die laufende Anmeldung EP-A-0 296 826 beschreibt einen diagnostischen Festphasen- Assay unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Reagens. Die laufende Anmeldung EP-A-0 342 447 beschreibt einen diagnostischen Festphasen-Assay, worin Serumkomponenten enzymatisch zu Wasserstoffperoxid umgewandelt werden, das anschließend zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals verwendet wird.
• In Systemen unter Verwendung von Blut oder Blut ohne rote Blutkörperchen, z.B. Plasma oder Serum, worin Wasserstoffperoxid als Reagens verwendet wird, um eine Komponente in der Blutprobe zu quantifizieren, wird eine Formulierung zur Stabilisierung des Wasserstoffperoxids vorgesehen, um seine Reaktion auf anderem Wege als für den Assay zu verhindern. Insbesondere enthält die Formulierung einen Chelatbildner, umfassend ein hydroxyliertes Carboxylat, ein Oxidationsmittel auf Basis eines Metalloxids, umfassend Stannat, Nitroprussid und wahlweise einen Katalase- Inhibitor, z.B. ein Azid, insbesondere Natriumazid.
• Die Additive können kombiniert werden, sodaß der Chelatbildner, Stannat und Nitroprussid, ein Molverhältnis von etwa 0,2-5 : 0,2-5 : 0,2-5, vorzugsweise etwa 0,5-2 : 0,5-2 : 0,5-2 aufweisen. Günstigerweise sind die verschiedenen Additive äquimolekular. Natriumazid würde vor allem als Katalase-Inhibitor, jedoch auch als Konservierungsmittel vorhanden sein und ist im allgemeinen, falls es vorhanden ist, in einer geringen Menge, im allgemeinen von etwa 1 x 10&supmin;&sup4; bis 0,1 Gew.-% der nassen oder trockenen Formulierung vorhanden.
• Die Formulierung kann viele verschiedene Formen haben. Die Formulierung kann dem Assaymedium während des Assays beigegeben werden. Alternativ dazu kann die Formulierung durch ein festes Substrat absorbiert werden, sodaß sie sich bei der Zugabe des Assaymediums zum Substrat ins Assaymedium auflöst. Die Konzentration der verschiedenen wesentlichen Komponenten im Assaymedium reicht im allgemeinen von etwa 0,0001 bis 0,5, üblichererweise von etwa 0,001 bis 0,1 M. Beim Imprägnieren eines saugfähigen Substrats reicht die zum Imprägnieren des saugfähigen Substrats verwendete Lösung im allgemeinen von etwa 0,005 bis 0,1, üblichererweise von etwa 0,01 bis 0,05 M für jede Komponente. Das Azid reicht im allgemeinen von etwa 0,005 bis 0,1%. Die Zusammensetzungen werden im allgemeinen bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 (üblicherweise etwa 7) mit einem herkömmlichen Puffer wie z.B. Phosphat bei einer Konzentration gepuffert, die im allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 bis 0,75 M liegt.
• Die vorliegenden Zusammensetzungen werden insbesondere bei diagnostischen Assays angewendet, die eine Oxidase als Reagens verwenden, worin die Reaktion der Oxidase Wasserstoffperoxid erzeugen soll. Verschiedene Enzyme können verwendet werden, z.B. Glukoseoxidase, Cholesterinoxidase, Harnsäureoxidase, Alkoholoxidase, Xanthinoxidase u.dgl. Diese Enzyme werden in herkömmlicher Weise und in herkömmlichen Mengen gemäß dem jeweiligen Assay verwendet.
• Wenn die stabilisierende Formulierung auf einen saugfähigen Träger aufgebracht wird, können verschiedene Träger verwendet werden, z.B. Zellulose-Träger wie Papier, Zelluloseacetat, Zellulosenitrat, Glasfasern od.dgl. Insbesondere kann der saugfähige Träger als Reaktionskissen dienen, wobei auch andere Reagentien an das Kissen gebunden sind, insbesondere das Enzym, das die Bildung von Wasserstoffperoxid bewirkt.
• Ein Beispiel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Reaktionskissens, wobei Plasma zur Einleitung des Assays auf das Kissen aufgebracht wird. An das Reaktionskissen ist die Oxidase gebunden, z.B. für einen Glukoseassay Glukoseoxidase, für einen Cholesterinassay Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase sowie ein Gemisch von Detergentien, die vorliegende Formulierung und ein Gemisch von Enzymstabilisatoren. Insbesondere werden die Detergentien insgesamt etwa 0,10 bis 10 Gew.-%, der auf das Kissen aufgebrachten Lösung ausmachen und ein Gemisch nichtion ischer und anion ischer Detergentien sein. Die Enzymstabilisatoren können verschiedene Additive enthalten, z.B. Zucker zu etwa 0,1 bis 20 Trockengewicht-%, Proteine, Gummiararabikum, nicht-ionische Detergentien, wobei die Gesamtmenge der Enzymstabilisatoren im allgemeinen von etwa 0,5 bis 10, üblichererweise von etwa 1 bis 5 Gew.-%, der Lösung beträgt. Die Enzymmenge variiert je nach Assay und liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 bis 500 Einheiten/ml.
• Im Falle des Cholesterinassays als beispielhaft für andere Assays weist die Tränklösung etwa 2 bis 100 Einheiten/ml der zwei Enzyme Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase auf. Die Detergentien sind insgesamt in einer Menge von etwa 0,1 bis 5 Gew.-% des Mediums vorhanden, während im Falle von Gemischen das Gewicht der nicht-ionischen Detergentien von etwa 10 bis 90, üblichererweise etwa 25 bis 75 Gew.-% des gesamten Detergentien-Gemisches betragen kann. Die Menge der Bindemittel liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,2 bis 10, üblichererweise von etwa 1 bis 5 Gew.-% des Mediums. Ein Konservierungsmittel oder Wasserstoff- Bindemittel kann in einer Menge von etwa 1 bis 20, üblichererweise von etwa 2 bis 10 Gew.-%, vorhanden sein. Die verbleibenden Additive sind im allgemeinen in einer Gesamtmenge von weniger als etwa 10 Gew.-%, üblichererweise von weniger als etwa 5 Gew.-%, vorhanden. Der Rest der Zusammensetzung kann Wasser, nicht-reagierende Ingredientien, Exzipienten, Streckmittel u.dgl. sein.
• Nach dem Absorbierenlassen der Lösung durch das Reaktionskissen kann die Lösung getrocknet und dann der geeigneten Verwendung zugeführt werden. Bei der Durchführung des Assays wird das Plasma auf das Reaktionskissen aufgebracht, um durch dieses absorbiert zu werden, wodurch sich Wasserstoffperoxid bildet. Jedes beliebige Verfahren zur Bestimmung des Wasserstoffperoxids kann angewendet werden, wobei üblicherweise Meerrettich-Peroxidase und ein Chromogen verwendet werden, und das Chromogen ein nachweisbares Signal, üblicherweise Lichtabsorption, erzeugen kann.
• Ein Assay kann durch Tränken eines Probenkissens durchgeführt werden, das als Brücke zwischen zwei saugfähigen Elementen dient. Ein erstes saugfähiges Element dient dazu, die als Vehikel dienende Lösung aufzunehmen, die je nach Assay Reaktionskomponenten aufweisen kann oder nicht. Das erste saugfähige Element überträgt das Fluid auf das Probenkissen. Das zweite saugfähige Element nimmt die als Vehikel dienende Flüssigkeit vom Probenkissen auf und dient als Brücke zur Übertragung des beförderten Fluids vom Probenkissen zum Assay-Meßbereich. Die Probe wird, wenn die Probe zum Kissen übertragen wird, durch ein Trennmittel, üblicherweise einen inerten nicht-porösen Film, der die Übertragung vom Probenkissen zu den saugfähigen Elementen abblockt, am Reagieren mit den zwei saugfähigen Elementen gehindert. Die durch das Probenkissen aufgenommene und im Assaymedibm vorhandene Probenmenge kann durch das Vorsehen einer Fluid-Übertragung über die das Kissen sättigende Menge hinaus durch ein nicht-benetzbares Sieb in eine absorbierende Schicht gesteuert werden. Nach dem Aufbringen der Probe auf dem Probenkissen und einer 1- bis 30-minütigen Inkubation werden das poröse, nichtbenetzbare Material und die absorbierende Schicht entfernt, wodurch sich beim Assay die Probe lediglich auf dem Probenkissen befindet.
• Die Erfindung liefert auch Zusammensetzungen, die Stannat, Nitroprussid, Tartrat und wahlweise ein Azid umfassen. Das Stannat und Tartrat können als Natrium- und/oder Kaliumsalze bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung kann als Pulver oder Assaylösung bereitgestellt oder ein saugfähiger Träger damit getränkt sein.
• Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.
VERSUCHSTEIL
• Das trockene Reagenskissen enthält: REAGENS: Cholesterinesterase Natriumcholat Nonidet PL 40 Mega -8 NaK Tartrat Nitroprussid Na Stannat Na Azid Gummiarabikum Gelatine Gantrez Saccharose Enzyme Detergentien Additive Enzym-Stabilisatoren TABELLE 1 H&sub2;O&sub2;-STABILITÄT IN PROBLEMATISCHEM¹ PATIENTENSERUM MIT UND OHNE STABILISATOREN² ARBEITSVORSCHRIFT: 10 ul H&sub2;O&sub2; (3,26 bis 4,63 mM) wurde zu 10 ul Patientenserum hinzugefügt und 20 Minuten in einem 12 x 75 mm-Reagenzglas inkubiert. 1 ml Meerrettich-Peroxidase (HRP) (25 ug/ml) und 4 cl 1-Naphthol-Substrat-Lösung (200 ug/ml) werden hinzugefügt und die Endpunkt-Farbe nach 10 Minuten gemessen. Auf diese Weise mißt man die H&sub2;O&sub2;-Restmenge. Sauerstoffperoxid-Gewinnung (%) Patienten-Serum # Ohne Stabilisatoren Mit Stabilisatoren² Vergleich³ Pool #1 Probe
• 1. Problematische Serumproben ergaben die niedrigsten H&sub2;O&sub2;-Restmengenwerte der 40 bewerteten Proben.
• 2. Stabilisatoren sind 25 mM Natriumkaliumtartrat, 25 mM Natriumstannat, 25 mm Natriumnitroprussid und 0,01 0/0 Natriumazid
• 3. Der Vergleich erfolgte durch Hinzufügen von 10 ul Serum, dann 10 ul H&sub2;O&sub2; zu 1 ml HRP-Substratlösung. Die beste erwartete H&sub2;O&sub2;-Restmenge beträgt 92,5%. Alle untersuchten Proben ergaben bei Vorhandensein der Stabilisatoren Zahlen, die diesem Wert sehr nahe kamen. TABELLE 2 STREIFENASSAY-MIGRATIONSHÖHEN-STABILlTÄT MIT AUF EINEM ENZYMREAGENS-KISSEN CO-IMMOBILISIERTEN STABILISATOREN ARBEITSVORSCHRIFT: 10 ul Serumprobe #4 wurde auf jeden von 5 Assaystreifen* aufgebracht und 1, 2, 5, 10 und 15 Minuten inkubiert. Die Migrationshöhe wurde gemessen und aufgezeichnet. Die unten angeführten Daten zeigen, daß die Migrationshöhe selbst bei dieser problematischen Serumprobe zumindest 15 Minuten lang stabil ist. Zeit (min) Migrations-Höhe (mm) * Ein Probenstreifen wird wie folgt gebildet. Die Trägerschicht besteht aus einem starren Stützmaterial aus Polystyrol in einer Dicke von 0,25 mm (0,01 inch). Das 3M 443 doppelseitige Klebeband wird als ein erster 10 mm-Streifen angeordnet, der an einem Ende beginnt; daran schließt sich ein Zwischenraum von 2,5 mm, eine zweite Klebband-Schicht mit einer Breite von 5 mm und daran anschließend ein Zwischenraum von 2,5 mm. Der Rest des Trägers wird mit einem 3M 415 doppelseitigen Klebeband über eine Breite von 80 mm abgedeckt. Ein 3 mm-Loch wird 15 mm vom Ende durch den Träger gestanzt, um die Probeneinbringungs-Öffnung zu bilden.
• Der Meß- oder Quantifizierungsbereich wird durch das Auflegen eines Blattes Whatman 31ET Chromatographie-Papier mit einer Breite von 70 mm und einer beliebigen zweckmäßigen Länge gebildet, sodaß die Streifen schließlich aus einem größeren laminierten Blatt ausgeschnitten werden können.
• Zur Aufbringung des Farbstoffs am Meßbereich wird eine Stamm lösung gebildet. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von modifiziertem N,N-Dimethylanilin, das N-[(ω-1,2-Ethylendiaminbutylcarboxamido],N-methylanilin. Das Dimethylanilin (DMA)- Derivat wird mit dem Papier unter Verwendung von Carbonyldiimidazol gekuppelt. Das Papier wird durch Tränken des Papiers in 0,20 M Carbonyldiimidazol in Methylenchlorid und anschließendes Tränken des Papiers in 1,5 mg/ml DMA-Derivat in Methylenchlorid aktiviert.
• Nach der kovalenten Befestigung des Dimethylanilin-Analogs wird das Papier in eine 0,5 mg/m 1-Lösung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) getaucht, obwoh eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 2 mg/ml geeignet ist. Überschüssige Lösung wird vorsichtig abgewischt, indem man mit dem Papier über die Kante einer Schale wischt; anschließend wird das Papier in einem Umluftofen bei 50ºC über einen Zeitraum von etwa 25 Minuten getrocknet. Das Papier wird fest auf eine doppelseitige Klebebandschicht im Meßbereich laminiert, der sich von einem Ende des Trägers ausgehend erstreckt. Am gegenüberliegenden Ende werden die überbrückenden Streifen am Träger befestigt. Der erste am Ende beginnende Streifen ist 13 mm lang, an einem Ende entlang des Klebebands befestigt und überlappt das Probenkissen um etwa 1 mm. Der zweite Streifen ist 14 mm lang und überlappt das Probenkissen um etwa 1 mm. Außerdem wird der zweite Streifen über den zweiten Klebebande-Streifen gelegt, der sich vom Probenkissen zum Meßbereich erstreckt, während er sowohl den Meßbereich als auch das Probenkissen um etwa 1 mm überlappt.
• Das Probenkissen besteht geeigneterweise aus Zellulosechromatographie-Papier, doch Glasfaserpapier, eine synthetische Membran oder ein anderes zweckmäßiges Material können auch verwendet werden. Die Größe des Kissens beträgt üblicherweise 5 mm x 5 mm.
• Sobald das Blatt zusammengesetzt ist, kann das Blatt in 5 mm-Streifen geschnitten werden, um die endgültige Vorrichtung zu bilden. Der Streifen kann nun im Assay verwendet werden.
• Das Immobilisierungsreagens für das enzymatische Umwandlungskissen enthält eine der folgenden Formulierungen. FORMULIERUNG FÜR DAS UMWANDLUNGSKISSEN Formulierung# 1: M Natrium-Phosphatpuffer pH % Saccharose % Nonidet P-40 % Natriumcholat M NaK Tartrat M Na Nitroprussid M Na Stannat % Na Azid u/ml Cholesterinesterase u/ml Cholesterinoxldase Insgesamt Formulierung #2: % Gummiarabikum % Gelatine % Gantre; AN-149 % Saccharose % Nonidet P-40 % Natriumcholat % Mega-8 M NaK Tartrat (Sigma) mM M Na Nitroprussid (Sigma) M Na Stannat (Alfa) % Na Azid (Sigma) u/mL Cholesterinesterase u/mL Cholesterinoxldase 1M Natriumhosphat pH Insgesamt
• Aus den obigen Ergebnissen geht klar hervor, daß die vorliegende Zusammensetzung die Stabilisierung von Wasserstoffperoxid bewirkt, um die Quantifizierung des Wasserstoffperoxids in Gegenwart von Blutkomponenten zu ermöglichen. Auf diese Weise kann man Assays entweder in der flüssigen Phase oder auf einem saugfähigen Träger durchführen, wobei die Menge des in bezug auf einen Analyten gebildeten Wasserstoffperoxids quantifiziert werden kann. Die Zusammensetzung beeinträchtigt nicht die anderen Aspekte des Assays, und ermöglicht so ein genaues und einfaches Verfahren zur Bestimmung einer Vielzahl verschiedener Analyten.

Claims (10)

1. Assayverfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einem Asssay zur Bestimmung eines Analyten in einer Blutprobe, worin Wasserstoffperoxid in einer in Beziehung zur Menge des im Assaymedium vorhandenen Analyten stehenden Menge gebildet wird, dadurch gekennzeichnete daß eine Zusammensetzung, die Stannat, Nitroprussid und einen hydroxyliertes Carboxylat-Chelatbildner enthält, zur Stabilisierung des Wasserstoffperoxids verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Enzym, das Wasserstoffperoxid erzeugt, im Assay verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Enzym Cholesterinoxidase, Glukoseoxidase, Harnsäureoxidase, Alkoholoxidase oder Xanthinoxidase ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung einen Katalase-Inhibitor enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Analyt Cholesterin, Glukose oder Alkohol ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Chelatbildner Tartrat enthält.

7. Zusammensetzung, die Stannat, Nitroprussid und Tartrat enthält.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, die Stannat, Nitroprussid und Tartrat in Molverhältnissen von Stannat, Nitroprussid und Tartrat von etwa 0,2-5 : 0,2-5 : 0,2-5 enthält.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, die auf einem saugfähigen Träger imprägniert ist.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, die weiters Detergentien und Enzymstabilisatoren enthält.