DE68924098T2

DE68924098T2 - Verfahren und Gerät mit Anwendung kovalent immobilisierter Farbstoffe.

Info

Publication number: DE68924098T2
Application number: DE68924098T
Authority: DE
Inventors: Gradimir George Georgevich; Neal Arthur Siegel
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-05-03
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2009-05-04
Also published as: ES2079363T3; EP0345460B1; DE68924098D1; US5541115A; EP0345460A2; JPH0232257A; EP0345460A3

Description

Hintergrund der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen, die eine farbige Farbstoffverbindung verwenden, die kovalent an eine Trägermatrix gebunden ist. Insbesondere wird die farbige Farbstoffverbindung durch Kupplung einer ersten und zweiten Komponente eines Zwei-Komponenten-Farbstoffsystems gebildet, dessen zweite Komponente kovalent auf der Matrix immobilisiert ist. Bei Zugabe der ersten Farbstoffkomponente bildet sich ein farbiges kovalentes Addukt, das kovalent an der Matrix immobilisiert ist. Die Herstellungsverfahren, die Verwendungsverfahren und die Vorrichtungen selbst, haben bei Teststreifen, die in der diagnostischen Medizin verwendet werden, eine besondere Nützlichkeit, wobei die farbigen Farbstoffverbindungen beständig an der Matrix gebunden sind und nicht verlaufen oder ausfärben.
In der Technik ist eine Anzahl von Verfahren bekannt, um einen Farbstoff an eine Matrix zu binden. Die Textilindustrie bindet Farbstoffe an Textilien, indem sie Beizstoffe verwendet, die alleine oder zusammen mit einem Farbstoff auf der Oberfläche oder auf den Fasern der Textilie absorbiert oder adsorbiert oder anderswie eingelagert werden und sich dort verfestigen. Da die Beiz- und Farbstoffe nicht kovalent an die Textilie gebunden sind, neigen sie beim Waschen zum Ausfärben, was ein Verblassen und eine Entfärbung hervorruft.
Andere Verfahren zur Immobilisierung von Farbstoffverbindungen umfassen die Bereitstellung eines Farbstoffmoleküls mit einer hydrophoben Seitenkette höheren Alkylgehalts, die sich in ein hydrophobes Substrat einfügt oder in einen hydrophoben Träger, und die über hydrophil/hydrophobe Wechselwirkungen immobilisiert wird. Siehe z.B. Bloom et al., US-Patent 3 443 939.
Nichtsdestotrotz waren farbige Farbstoffverbindungen, die in analytischen Testvorrichtungen verwendet werden, bisher nur unzufriedenstellend gebunden. Typischerweise wird eine gefärbte Verbindung aufgrund ihrer Unlöslichkeit in Bezug auf die Assaylösung immobilisiert, was ihre Ausfällung auf der Matrix ohne kovalente Bindung hervorruft. Bei anderen Systemen wird die erzeugte Farbe auf der Matrix absorbiert, die Matrix getränkt, imprägniert oder die Farbe wird auf die Trägermatrix aufgezogen. Patente, die diese Lösungsansätze veranschaulichen umfassen US-4 069 016, US-4 548 905 und US-4 038 031. Insbesondere US-4 069 016 betrifft ein Konkurrenzassay, bei dem ein nachweisbarer Ligand durch Bilirubin von einer festen Phase verdrängt wird, was eine Anzeige dafür ergibt, wieviel Bilirubin in einer Probe vorhanden ist.
Zuletzt wurde ein eingeschränkter Erfolg dadurch erreicht, daß lokal ausgefällte Färbung nur an der Oberfläche einer festen Phase mittels eines Signal-erzeugenden Enzymsystems erzeugt wurde, das auf dem Träger immobilisiert war. Siehe z.B. US-4 435 504.
Ebenfalls von Interesse als technischer Hintergrund bezüglich der vorliegenden Erfindung ist die EP-A-0 101 799, die eine analytische Vorrichtung zum Nachweis von Glycosepegeln offenbart, die aus einem Träger besteht, der mit einem Paar von Verbindungen imprägniert ist, die in Gegenwart eines Analyten unser Bildung eines Chromogens kuppeln. Keine dieser Komponenten ist chemisch an den Träger gebunden, vielmehr werden sie mehr oder minder durch einen überhalb von ihnen angetrockneten Film festgehalten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und Verfahren und Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, bei denen die farbige Indikatorverbindung kovalent auf dem Träger immobilisiert ist, und nicht ausfärben oder von diesem weggewaschen werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung.

Unter einem Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Festphasenmatrix, die zur kovalenten Bindung der farbigen Farbstoffverbindung befähigt ist, wobei die Farbstoffverbindung aus einer ersten und einer zweiten Komponente gebildet wird. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte: a) Aktivierung der reaktiven Gruppen wenigstens auf der Matrix oder wenigstens der zweiten Farbstoffkomponente; b) kovalentes Binden der zweiten Farbstoffkomponente an die Matrix über die aktivierten reaktiven Gruppen, wobei eine Matrix-gebundene zweite Farbstoffkomponente gebildet wird, und c) In-Kontakt-Bringen der Matrix-gebundenen zweiten Farbstoffkomponente mit der ersten Farbstoffkomponente unter Bildung eines farbigen kovalenten Adduktes, das auf der Matrix kovalent immobilisiert verbleibt. Die zweite Farbstoffkomponente kann jedwede Verbindung sein, die kovalent auf einem Träger immobilisiert werden kann, und die zur kovalenten Bindung mit einer ersten Farbstoffkomponente unter Bildung eines farbigen Produktes fähig ist.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung umfaßt eine Assayvorrichtung zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Testprobe eine verbesserte feste Phase, an die eine zweite Komponente eines Farbstoffsystems kovalent gebunden ist, wobei die zweite Komponente zur kovalenten Kupplung des Analyten oder zur Kupplung der ersten Farbstoffkomponente proportional zur Menge an Analyt unter Ausbildung einer farbigen Farbstoffverbindung, die auf der festen Phase proportional zur Menge an Analyt kovalent immobilisiert ist, befähigt ist. Bei einem solchen Assay muß der Analyt zur Bildung einer farbigen Verbindung befähigt sein, wenn er an die zweite Komponente gebunden ist.
Alternativ kann eine erste Farbstoffkomponente, die in einer Menge, die zur Menge an vorhandenem Analyt proportional ist, erzeugt oder bindungsfähig gemacht wird, durch die zweite Komponente unter Ausbildung eines farbigen kovalenten Adduktes, das zum Analyt proportional ist, gekuppelt werden.
Unter einem weiteren Aspekt, umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Testprobe, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, eine Festphasenmatrix, an der eine zweite Komponente eines Zwei-Komponenten-Farbstoffsystems kovalent gebunden ist, mit einer flüssigen Phase in Kontakt zu bringen, die eine erste Komponente eines Farbstoffsystems enthält, wobei die Menge der ersten Komponente zur Menge an Analyt, der in der Testprobe vorhanden ist, proportional ist oder gleich dieser ist, wobei die erste und zweite Komponente kovalent unter Bildung einer immobilisierten farbigen Farbstoffverbindung binden, und b) Bestimmen der Menge an farbiger Farbstoffverbindung, die kovalent an dem Träger gebunden ist, als Maß für den Analyt in der Probe Wie bei der Assayvorrichtung kann die erste Farbstoffkomponente, die an die zweite Farbstoffkomponente, welche kovalent an den Träger kovalent gebunden ist, bindet, entweder der Analyt selbst oder eine erste Farbstoffkomponente sein, die proportional zur Menge an vorhandenem Analyt zur Bindung an den Träger befähigt worden ist. Der Analyt kann ein spezifisch interessierender Analyt wie Glucose sein, oder er kann eine Markierung sein, die eine Analytkonzentration anzeigt wie ein Peroxid, das von einem Enzymsystem (z.B. Meerrettichperoxidase) gebildet wird, das an ein den Analyten spezifisch bindendes Glied konjugiert ist.
"Farbig", wie hierin verwendet, bedeutet von der Matrix unterscheidbar. Vorzugsweise sind die Farbstoffkomponenten farblose Chromogene oder Farbstoffvorläufer und werden bei der Zusammenkupplung farbig. Es ist jedoch möglich, daß die Komponenten anfänglich eine intrinsische Farbe haben und unter Bildung eines farblosen oder farbigen unterscheidbaren Adduktes kuppeln.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Fig. 1 ist eine Auftragung der Farbbalkenhöhe gegen die Bilirubinkonzentration, die sich aus der Verwendung eines Teststreifens gemäß der Erfindung ergibt.
Fig. 2 ist eine Auftragung der Rf-Werte der Farbbalkenhöhe gegen die Cholesterolkonzentration.

Eingehende Beschreibung.

Gemäß der Erfindung wird eine Festphasenmatrix, die zur kovalenten Immobilisierung einer farbigen Farbstoffverbindung befähigt ist, wobei die Farbstoffverbindung aus einer ersten und einer zweiten Komponente gebildet wird, mittels folgenden Schritten hergestellt: a) Aktivierung von reaktiven Gruppen, wenigstens auf der Matrix oder der zweiten Farbstoffkomponente, und b) kovalentes Binden der zweiten Farbstoffkomponente an die Matrix über die aktivierten reaktiven Gruppen, wobei eine Matrix-gebundene zweite Farbstoffkomponente ausgebildet wird. Die Matrix-gebundene zweite Farbstoffkomponente ist dann zur Kupplung mit der ersten Farbstoffkomponente unter Bildung eines farbigen kovalenten Adduktes fähig, das auf der Matrix kovalent immobilisiert verbleibt.
Typischerweise umfassen die reaktiven Gruppen auf der Matrix oder der zweiten Farbstoffkomponente Aminogruppen oder vorzugsweise Hydroxylgruppen. Die Hydroxylgruppen werden durch Reaktion mit organischen Sulfonylchloriden der Formel R-SO&sub2;-Cl unter Bildung des korrespondierenden Sulfonatesters auf die von Nilsson et al. in Biochem. and Biophys. Res. Comm., 102, 449-451 (1981) vorgestellte Weise aktiviert. R kann in diesem Fall eine Methyl-, Ethyl-, Phenyl- oder Toluyl-Gruppe sein, obwohl die funktionellen Gruppen, die mit Elektronen-ziehenden Halogengruppen substituiert sind, mehr bevorzugt werden. Besonders bevorzugt sind Trifluormethansulfonylchlorid, 2,2,2- Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) und p- Nitrobenzolsulfonylchlorid.
Alternativ können die reaktiven Hydroxylgruppen durch Reaktion mit Perjodat aktiviert werden, wie dies von Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 15, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", S. 109, Elsevier Publishers, N.Y. (1985), beschrieben ist. Obwohl die Perjodataktivierung bevorzugt wird, sind andere Verfahren der Aktivierung oder Derivatisierung der Matrix einschließlich der Verwendung von Spacern oder verbindenden Gruppen dem Fachmann bekannt und werden hier nicht erneut aufgeführt.
Die Matrizen sind in den Testproben unlöslich und umfassen Zellulose, Agarose, kreuzvernetzte Dextrane, Papier, Diolsilica und Glycerinpropyl-beschichtetes Glas. Diolsilica ist von E. Merck & Co., Westdeutschland, als LiChrosorb-Diol erhältlich, und auf diese Art und Weise behandeltes Glas ist im Handel von Pierce Chemicals Co., Rockford, Illinois, als Glycophase-glas erhältlich. Papier ist eine bevorzugte Matrix. Zusätzlich kann die Festphasenmatrix auf einem Träger oder einem Rückhalt aufgezogen sein oder nicht. Obwohl die Matrix und der Träger ein und derselbe (z.B. Papier) sein können, umfaßt der Ausdruck "Träger", wie er hierin verwendet wird, eine Matrix und ist fit dieser gleichbedeutend.
Sobald der Träger aktiviert ist, wird die zweite Farbstoffkomponente kovalent an ihn gebunden. Die zweite Farbstoffkomponente kann jedwede Verbindung sein, die kovalent an dem Träger immobilisiert werden kann, und die zur kovalenten Kupplung mit einem Analyten oder einer ersten Farbstoffkomponente unter Bildung eines farbigen Produktes fähig ist. Zur kovalenten Immobilisierung der zweiten Farbstoffkomponente an mit organischem Sulfonylchlorid aktivierte Träger sollte die Farbstoffkomponente nukleophile Gruppen, z.B. Sulfhydryl- oder Aminogruppen, enthalten. Für die kovalente Immobilisierung an Perjodat-aktivierten Trägern, muß die Farbstoffkomponente eine Aminogruppe enthalten. Diese Reaktionen verlaufen gemäß gut bekannten Verfahren.
Bevorzugte zweite Farbstoffkomponenten umfassen paraunsubstituierte phenolische Verbindungen, para-unsubstituierte aromatische Aminverbindungen und para-halogenierte phenolische oder aromatische Aminverbindungen. Bei einer ersten Ausführungsform ist die ain meisten bevorzugte zweite Farbstoffkomponente 5-Amino-2-naphthalinsulfonsäure, die mit oxidiertem 4-Aminoantipyrin oder dessen Analoga kuppelt und ein kovalentes Addukt bildet. Das Aminoantipyrin (oder dessen Analoga) wird/werden über die herkömmliche enzymatische Kaskade unter Verwendung eines Oxidaseenzyms, das mit einem Peroxidaseenzym gekoppelt ist, auf in der Technik gut bekannte Weise oxidiert.
Eine zweite Ausführungsform verwendet ein Diazoniumsalz als die bevorzugte zweite Farbstoffkomponente, die den Analyten Bilirubin direkt unter Bildung einer farbigen Farbstoffverbindung abfängt, die kovalent an die Matrix gebunden ist. Ein bevorzugtes Diazoniumsalz ist diazotiertes p- Aminoanilin, das an einen Perjodat-aktivierten Träger gebunden ist.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung umfaßt eine Assayvorrichtung zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe eine verbesserte Festphase, an der eine zweite Komponente eines Farbstoffsystems kovalent gebunden ist, wobei die zweite Komponente zur kovalenten Kupplung des Analyten oder einer ersten Farbstoffkomponente, in zur Menge an Analyt proportionalem Ausmaß angepaßt ist, um eine farbige Farbstoffverbindung auszubilden, die proortional zur Menge an Analyt kovalent an der Festphase immobilisiert ist. Bei einem solchen Assay kann die zweite Farbstoffkomponente entweder direkt mit dem Analyten selbst unter Bindung einer farbigen Verbindung oder mit einer ersten Farbstoffkomponente kuppeln, die in einer Menge erzeugt oder bindungsfähig gemacht wird, die zur Menge an vorhandenem Analyt proportional ist.
Unter Verwendung der bevorzugten Festphasenmatrizen, die oben beschrieben sind, können Assayvorrichtungen zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung spezifischer Analyten in verschiedenen Testproben hergestellt werden. Allgemein sind die Testproben wäßrige Flüssigkeiten wie Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Fruchtwasser und dgl., die von einem Patienten stammen oder Laborassaylösungen. Die Ausführungsformen der Assayvorrichtungen umfassen sowohl chromatographische Streifen und Tauchstäbchen als auch bauschartige Assays.
Bei der Ausführungsform als chromatographischer Streifen wird die Menge des Analyten als Funktion der Länge des auf dem Streifen ausgebildeten Farbbalkens bestimmt. Insbesondere wird der Analyt oder die erste Farbstoffkomponente, der/die in der flüssigen Phase vorhanden ist, durch die Lösungsmittelfront über die Matrix oder durch sie hindurch hinweg vorwärts bewegt, wobei die zweite Farbstoffkomponente an der Matrix kovalent immobilisiert worden ist. Sowie die flüssige Phase fortschreitet, kuppelt der Analyt oder die erste Farbstoffkomponente in dem Ausmaß ihrer Anwesenheit in der Testprobe mit der zweiten Farbstoffkomponente, die auf dem Träger immobilisiert ist. Wenn der Analyt oder die erste Farbstoffkomponente erschöpft ist, tritt keine weitere Kupplung oder Farbbildung mehr auf. Da die Lösungsmittelfront mit der Zeit fortschreitet, steht die Länge des Farbbalkens zu der Menge an vorhandenem Analyten in Bezug. Die gebildete Farbe ist daher auf dem Träger beständig immobilisiert und läuft nicht aus oder wird nicht weggewaschen. Am Streifenrand angebrachte Untereilungen können zur Korrelation von Länge und Analytkonzentration verwendet werden.
Bei Tauchstäbchen oder bauschartigen Analysevorrichtungen wird die flüssige Phase vorwiegend mit der festen Phase in Kontakt gebracht und wandert nicht über diese hinweg. Demgemäß wird die Menge an vorhandenem Analyt als Funktion der ausgebildeten Farbmenge auf der festen Phase bestimmt. Intensität, Fluoreszenz und Farbton sind einige Beispiele für in der Technik bekannte Verfahren zur Bestimmung der Menge der gebildeten Färbung.
In einigen Fällen, z.B. beim Bilirubin, bildet sich die Färbung direkt beim In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit der flüssigen Phase, die die Testprobe enthält. In anderen Fällen enthält die flüssige Phase ebenfalls ein Reagenzmittel zur Erzeugung einer ersten Farbstoffkomponente oder ein Mittel zur Erzeugung ihrer kovalenten Kupplungsfähigkeit mit der zweiten Farbstoffkomponente, wobei die Menge der ersten Farbstoffkomponente, die erzeugt oder kupplungsfähig gemacht wird, zur Menge an Analyt proportional ist. Ein Beispiel für ein solches Reagenzmittel ist ein Oxidase-Peroxidase-Enzymsystem, das verwendet werden kann, um eine erste Farbstoffkomponente wie 4-Aminoantipyrin (oder dessen Analoga) zu oxidieren, um es an die zweite Farbstoffkomponente (z.B. 5-Amino-2- naphthalinsulfonsäure) bindungsfähig zu machen.
Wie zuvor angegeben, kann der Analyt selbst die erste Farbstoffkomponente sein, oder er kann eine Verbindung von biologischem Interesse wie Glucose, Chloesterol oder ein Hormon sein. Alternativ kann der Analyt hauptsächlich eine Markierung sein, die ihrerseits proportional zu der Menge an tatsächlich interessierendem Analyt erzeugt oder reaktiv gemacht wird. Ein solcher Fall tritt auf, wenn Peroxid (Analytmarkierung) zusammen mit Peroxidase zur Ausbildung einer farbigen Verbindung verwendet wird, wobei die Peroxidase an einen Antikörper konjugiert ist, und wobei der Antikörper in einer Menge vorhanden ist, die zu derjenigen eines besonderen Antigens (dem tatsächlich interessierenden Analyten) proportional ist. Demgemäß fällt es unter den Schutzumfang der Erfindung, die Assayvorrichtungen und Verfahren in Immunoassays einzusetzen, bei denen ein Antikörper oder ein Antigen, das mit einer Enzvmmarkierung markiert ist, indirekt verwendet wird, um die erste Farbstoffkomponente proportional zu der Menge an in der Probe vorhandenem Analyt bindungsfähig zu machen. Insbesondere kann ein Antikörper, der an HRPO [Meerrettichperoxidase] konjugiert ist, ein Antigen in einem Sandwich- oder in einem Konkurrenz-Immunoassay nachweisen, und die HRPO kann zusammen mit dem Peroxid eine erste Farbstoffkomponente oxidieren, um sie proportional zur Menge an Antigen bindungsfähig zu machen. Eine solche erste Farbstoffkomponente ist 4-Aminoantipyrin. Die erste Farbstoffkomponente (die bindungsfähig gemacht wurde) kann dann mit der zweiten Farbstoffkomponente, die auf dem Träger kovalent immobilisiert ist, kuppeln, wobei sich ein farbiges Produkt proportional zur Menge an in der Probe vorhandenem Antigen ausbildet.
Ein Anwendungsverfahren der Assayvorrichtungen umfaßt das In-Kontakt-Bringen der festen Phase, an die die zweite Farbstoffkomponente kovalent gebunden ist, mit einer flüssigen Phase, die eine erste Komponente des Farbstoffsystems umfaßt, wobei die erste Farbstoffkomponente in einer Menge anwesend ist, die zu derjenigen des Analyten in der Testprobe gleich oder zu dieser proportional ist. Der Analyt kann mit der ersten Farbstoffkomponente in der flüssigen Phase gleichbedeutend sein. Nachfolgend auf diesen Kontakt bildet sich die farbige Verbindung auf der festen Phase über die kovalente Kupplung der ersten Farbstoffkomponente mit der immobilisierten zweiten Farbstoffkomponente. Daraufhin wird die Menge an Analyt als eine Funktion der Menge an farbiger Verbindung bestimmt.

BEISPIEL 1 (TRÄGERAKTIVIERTUNG).

AKTIVIERUNG VON PAPIER MIT 2,2,2- TRIFLUORETHANSULFONYLCHLORID (TRESYLCHLORID)

Bei einer typischen Vorgehensweise werden 10g (naß) vom Typ 541er Papier, Marke Whatman, nacheinander mit 100ml der folgenden Lösungen gewaschen: 30:70 und 70:30 Aceton:Wasser (Volumenanteile), zweimal mit Aceton und dreimal mit trockenem Aceton (getrocknet mit 4Å Molekularsieb über Nacht, unter Verwendung von 25g/l Aceton). Das Papier wird dann in ein trockenes Becherglas überführt, das 3ml trockenes Aceton und 150ul trockenes Pyridin (über Molekularsieb getrocknet) enthält. Während des Schütteins werden 100ul Tresylchlorid (Fluka AG, Buchs, Schweiz) tropfenweise zugegeben. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Papier zweimal mit 100ml jeder der folgenden Lösungen gewaschen: Aceton 30:70, 50:50 und 70:30 an 5mM HC1:Aceton (Volumenanteile), und 1mM HC1. Das aktivierte Papier wird bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.
Die Menge an eingeführten Tresylgruppen wurde durch Elementaranalyse auf Schwefel an einer Probe gefriergetrockneten Papiers durchgeführt, das wie oben behandelt worden war. Die Analyse zeigte 150umol Tresylgruppen pro Gramm trockenen Papiers an.

B. AKTIVIERUNG EINES HYDROXYLGRUPPEN-TRAGENDEN TRÄGERS (PAPIER) MIT PERJODAT

Zu einer Lösung von 10g Natriumperjodat in 200ml destilliertem Wasser bei Raumtemperatur wurden 10g Schleicher und Schuell 410er-Filterpapier hinzugegeben. Das Papier und die Lösung wurden auf einem Rotationsschüttler 3 Stunden lang geschüttelt. Anschließend wurde die Perjodatlösung abdekandiert und 200ml destillierten Wassers wurden hinzugegeben. Nach 15 Minuten wurde das Wasser abdekandiert und weitere 200ml frisch destilliertes Wasser wurden hinzugegeben. Dieser letzte Schritte wurde zwei zusätzliche Male wiederholt, um ein aktiviertes Papier, das für den Kupplungsvorgang vorbereitet war, zu erzeugen.

BEISPIEL 2

A. KUPPLUNG VON 5-AMINO-2-NAPHTHALINSULFONSÄURE AN PAPIER

In 100ml 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wurden 0,59 5-Amino-2-naphthalinsulfonsäure (ANS) und 0,759 umkristallisiertes Natriumcyanoborhydrid gelöst. Diese Lösung wurde dann in ein Gefäß gegeben, das das aktivierte Papier nach Beispiel 2 enthielt. Die kombinierte Lösung und das Papier wurden über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Wahlweise kann man die Zeit steigern oder mindern, was jeweils zu mehr oder weniger Bindung führt. Nach der Inkubation wurde die ANS-Lösung von dem Farbstoff-gekuppelten Papier (ANS-Papier) abgegossen und das ANS-Papier wurde einmal mit 200ml destilliertem Wasser gespült. Das ANS-Papier wurde dann mit 200ml frischem destilliertem Wasser alle 30 Minuten gewaschen, bis die ANS-Konzentration unter 5ug/ml fiel. Die Bögen wurden vor der Verwendung lufttrocknen lassen.

B. AKTIVIERUNG UND KUPPLUNG VON 5-AMINO-2-NAPHTHALINSULFONSÄURE AN GLASFASERFILTER

Ein Glasfaserfilter (Schleicher und Schuell #29) wurde über Nacht in 6M Salpetersäure gewaschen. Danach wurde es mit deionisiertem Wasser gespült und luftgetrocknet. Der Glasfaserfilter wurde dann in eine 10%ige Lösung von 3- Glycidoxypropyltrimethoxysilan gelegt, die mit 10mM Citrat, pH 5,0, gepuffert war und 30 Minuten lang bei 50ºC inkubiert. Das resultierende Glycophase-Glasfilter wurde dann in Aceton, Aceton/Wasser-Mischungen und zuletzt in Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Filter in 1%iger NaIO&sub4; inkubiert, um Aldehyde zu erzeugen. Das Filter wurde dann mit Wasser gewaschen, bis das Perjodat im wesentlichen entfernt war. Das Filter wurde dann über Nacht in einer Lösung inkubiert, die 1% (Volumenanteile) Lösung von 5-Amino-2-naphthalinsulfonsäure, 100mM NaCNBH&sub3; und 100mM Natriumphosphat, pH 7,4, umfaßte. Nach der Inkubation wurde das Produkt erschöpfend mit Wasser gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und es wurde für die weitere Lagerung luftgetrocknet.

BEISPIEL 3

KUPPLUNG VON p-AMINOANILIN AN EINEN TRÄGER UND DIAZOTIERUNG.

Zellulosefilterpapiere (Whatman #1 und S&S 410) wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln in 1%iger (Gewicht/Volumen) NaIO&sub4;-Lösung oxidiert. Die Papiere wurden dann in Wasser gewaschen, um überschüssiges Perjodat zu entfernen. Die Papiere wurden dann 2,5 Tage bei Raumtemperatur in 100mM p- Aminoanilin, 20mM Natriumphosphat bei pH 7,4 und 100mM NaCNBH&sub3; zur Derivatisierung der Papiere inkubiert. Ungefähr 10 Volumenanteile an Lösung wurden pro Papiergewichtsanteil eingesetzt. Die Papiere wurden dann viele Male zunächst mit PBS und dann mit Wasser gewaschen. Die verfügbaren Amine wurden durch Inkubation der Papiere 10 Minuten lang auf Eis in 6%iger (Gewicht/Volumen wäßriger Lösung) Hexafluorphosphorsäure und 50mM Natriumnitrit diazotiert. Die diazotierten Papiere wurden in Wasser gewaschen, luftgetrocknet und an einem dunklen, kalten und trockenen Ort aufbewahrt.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON STANDARDLÖSUNGEN

1. 0-5 M Phosphatpuffer pH 7,4

Eine 0,5M Na&sub2;HPO&sub4;-Lösung wird mit einer 0,5M NaH&sub2;PO&sub4;- Lösung titriert, bis sich ein pH von 7,4 einstellt.

2. Glucose-Stammlösungen

zu 100ml 0,1M Phosphatpuffer, pH 7,4 (100ml 0,5M Phosphatpuffer, pH 7,4, auf 500ml mit destilliertem Wasser verdünnt), wurden 1000mg Glucose hinzugefügt, was eine 1000mg/dl Glucose-Stammlösung ergab. Diese Lösung wurde wiederholt um einen Faktor 2 verdünnt, was Glucoselösungen mit 500mg/dl, 250mg/dl, 125mg/dl und 63mg/dl ergab.
3. Enzymlösungen

a. Glukoseoxidaselösung

Zu 10ml 0,1M (1,95g/100ml Deionat) MES (2[N- Morpholino]ethansulfonsäure), die mit 0,1N NaOH auf pH 5, 6 eingestellt worden war, wurden 1000 Einheiten Glucoseoxidase, 30mg 4-Aminoantipyrin und 5 Einheiten Mutarotase hinzugegeben. Die Mischung wurde leicht umgewälzt, um eine Auflösung zu erzielen.

b. Peroxidaselösung

Zu 10ml 0,1M MES, bereitet aus 1,959 2[N- Morpholino]ethansulfonsäure, die in 100ml Deionat gelöst waren, wurden 300 Einheiten Meerrettichperoxidase hinzugegeben.

BEISPIEL 5

HERSTELLUNG VON DIAGNOSTISCHEN TESTSTREIFEN FÜR GLUCOSE UNTER VERWENDUNG VON ANS-PAPIER

A. VERFAHREN 1

Zu einem 20-ul-Tropfen, der 1000mg/dl Glucose-Standardlösung wurde 1ul Glucoseoxidaselösung und 1ul Peroxidaselösung hinzugegeben. Die Lösungen wurden 5 Minuten lang vermischt. In die Lösung wurde der untere Rand eines schmalen Streifens des 5-ANS-Farbstoff-gekuppelten Papiers (aus Beispiel 2A) eingetaucht, der klein genug geschnitten war, daß die Lösung entlang seiner ganzen Länge aufsteigen wurde. Dieses Verfahren wurde für jede Standard-Glucoselösung wiederholt.

B. VERFAHREN 2

Auf ein Ende eines Streifens von 5-ANS-Farbstoffgekuppelten Papier aus Beispiel 2A, der klein genug geschnitten war, daß 20ul ihn völlig benetzen würden, wurde ungefähr 1ul Glucoseoxidaselösung aufpipettiert. Unmittelbar angrenzend daran wurde 1ul Peroxidaselösung aufpipettiert. Der Teststreifen wurde luftgetrocknet und sein unterer Rand wurde in 20ul der 1000mg/dl Standard-Glucoselösung getaucht. Als die flüssige Phase den oberen Rand erreichte, wurde der Test als vollständig erachtet. Dieses Verfahren wurde für jede Standard-Glucoselösung wiederholt.

C. ABLESEN DER ERGEBNISSE

Auf dem benetzten Streifen hatte sich aufgrund der Kupplung des oxidierten 4-Aminoantipyrins mit dem kovalent auf dem Papier gebundenem 5-ANS ein Farbbalken entwickelt. Es wurde festgestellt, daß die Höhe des Farbbalkens zu der Konzentration an Glucose in den Glucosetest-Stammlösungen proportional war, wie dies in Tabelle 1 gezeigt ist. TABELLE 1 HÖHE DES FARBBALKENS GEGEN GLUCOSEKONZENTRATION Glucose(mg/dl) Farbhöhe(cm) Stdabw Anzahl

BEISPIEL 6

HERSTELLUNG EINES DIAGNOSTISCHEN TESTSTREIFENS FÜR BILIRUBIN

A. Ein Bogen (47mm breit) von diazotiertem Papier nach Beispiel 3, wurde auf einen Plastikträger als Stütze und zur Steuerung der Verdampfung aufgebracht, indem er auf ein selbstklebendes Mikrotiterplatten-Bedeckungsplättchen aufgedrückt wurde. Ein inerter Papierstreifen (Schleicher & Schuell 410) von 1,5mm wurde an einer Kante des diazotierten Papiers angebracht und die Anordnung wurde mit einem anderen Mikrotiterplatten-Bedeckungsplättchen bedeckt, wodurch das Papier sandwichartig eingeschlossen wurde. Mehrfache Teststreifen von ungefähr 1,5mm wurden aus der Sandwich- Anordnung herausgeschnitten, wobei jeder Streifen eine diazotierte Zone und einen Saugbereich aufwies.
B. Es wurden Bilirubinlösung hergestellt, indem 60mg Bilirubin (Sigma Chemicals, St. Louis) in 2ml DMSO und 4ml 0,1M Na&sub2;CO&sub3; aufgelöst wurden, um Stammlösungen herzustellen. Es wurden ausreichende Mengen der Bilirubin-Stammlösung zu 200mM Carbonat, pH 10,5, 150mM Diphyllin und 0,2% TX-100 hinzugegeben, um Arbeitsverdünnungen von 0, 1, 3,5, 7,5, 10, 20 und 30mg Bilirubin/dl zu erzeugen.
C. Die Arbeitsverdünnungen an Bilirubin wurden mit gleichen Volumina von Normal-Human-Plasma vermischt, um die Testproben herzustellen. 20ul aus jeder der Testproben wurden in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben, und das saugende Ende eines Teststreifens wurde mit jeder Probe bei Raumtemperatur (ungefähr 20ºC) in Kontakt gebracht. Nach 5 Minuten hatte die Front den oberen Rand des Testelementes erreicht, und die Ergebnisse wurden abgelesen. Die Höhe des Farbbalkens, der sich auf dem Testelement ausgebildet- hatte, wurde gemessen und gegen die Bilirubinkonzentration unter Erhalt von Fig. 1 aufgetragen.

BEISPIEL 7

HERSTELLUNG EINES DIAGNOSTISCHEN TESTSTREIFENS FÜR CHOLESTEROL UNTER VERWENDUNG VON ANS-PAPIER

A. ANS-Papier nach Beispiel 2A, das klein genug geschnitten worden war, so daß 10ul es völlig benetzen würden, wurde mit den folgenden Lösungen imprägniert: Auf einem ersten (dem Indikator-) Bereich des Streifens wurde ungefähr 1ul einer jeden der folgenden Lösungen aufpipettiert: a) Eine 1mg/ml HRPO- Lösung und eine 2mg/ml 4-Aminoantipyrinlösung. Auf einen zweiten (Reaktions-) Bereich, angrenzend an den Indikatorbereich, wurde ungefähr 1ul einer jeden der folgenden Lösungen pipettiert: Eine 100mg/dl Cholesteroloxidaselösung und eine 10mg/dl Cholesterolesteraselösung. Ein dritter Bereich wurde mit ungefähr 1ul 5%igem Triton x-100 imprägniert, und der verbleibende Teil des Streifens wurde unbehandelt belassen. Die Streifen wurden eingefroren und vor der Verwendung gefriergetrocknet.
B. Standard-Cholesterollösungen wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, in einem Eichkit erhalten, das 100, 200 und 400mg/dl-Konzentrationen beinhaltete. Eine 300mg/dl-Konzentration wurde durch Verdünnung des 400mg/dl Standards bereitet.
C. Ungefähr 10ul einer jeden der Standard- Cholesterollösungen wurden in Mikrotiterplattenvertiefungen eingebracht. Der unbehandelte Bereich der Teststreifen wurde in die Vertiefungen eingetaucht, und die Lösungen wanderten die Streifen entlang. Es wurde wie folgt ein Rf-Wert berechnet: Die Länge des Farbbalkens geteilt durch den Abstand der Lösungmittelfront, gerechnet vom Rand (der Farbbalken wurde von der Grenze zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich bis zu seinem Ende gemessen). Die Länge des Farbbalkens war zu der Konzentration des Cholesterols in den Testlösungen proportional, wie dies in Fig. 2 gezeigt ist.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung einer farbigen Farbstoffverbindung auf einer festen Matrix, die in der Testlösung unlöslich ist, wobei die farbige Farbstoffverbindung aus einer ersten Farbstoffkomponente und einer zweiten Farbstoffkomponente gebildet wird, wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a. Aktivierung der reaktiven Gruppen entweder auf der festen Matrix oder auf der zweiten Farbstoffkomponente, oder sowohl auf der festen Matrix als auch auf der zweiten Farbstoffkomponente;

b. Kovalentes Binden der zweiten Farbstoffkomponente mittels der aktivierten reaktiven Gruppen an die feste Matrix, wobei eine matrixgebundene zweite Farbstoffkomponente gebildet wird, und

c. In-Kontakt-Bringen der matrixgebundenen zweiten Farbstoffkomponente mit der ersten Farbstoffkomponente unter Bildung eines farbigen kovalenten Adduktes, das auf der festen Matrix kovalent immobilisiert verbleibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die zweite Farbstoffkomponente aus para-unsubstituierten phenolischen Verbindungen, para-unsubstituierten aromatischen Aminverbindungen und para-halogenierten phenolischen oder aromatischen Aminverbindungen gewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die zweite Farbstoffkomponente 5-Amino-2- naphthalinsulfonsäure oder ein Diazoniumsalz ist.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die feste Matrix Teil einer Assayvorrichtung zur Bestimmung eines Analyten ist, und dadurch daß die erste Farbstoffkomponente ein Analyt ist, der zur Bildung einer farbigen Farbstoffverbindung mit der zweiten Farbstoffkomponente befähigt ist.

5. Assayvorrichtung zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, wobei der Analyt in einer flüssigen Phase löslich ist, die mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, und wobei der Analyt kolorimetrisch bestimmt wird, indem die Komponenten eines Farbstoffsystems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 unter Bildung einer farbigen Farbstoffverbindung gekuppelt werden, gekennzeichnet durch eine feste Phase mit einer an sie kovalent gebundenen zweiten Komponente des Farbstoffsystems, wobei die zweite Komponente zur kovalenten Kupplung an den Analyten oder an eine erste Farbstoffkomponente, die zur Menge an Analyt proportional ist, angepaßt ist, wenn die flüssige Phase mit der festen Phase in Kontakt gebracht wird, wobei proportional zur Menge an Analyt eine farbige Farbstoffverbindung gebildet wird, die an der festen Phase kovalent immobilisiert ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß die zweite Farbstoffkomponente aus para-unsubstituierten phenolischen Verbindungen, para-unsubstituierten aromatischen Aminverbindungen und para-halogenierten phenolischen oder aromatischen Aminverbindungen gewählt ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet daß die zweite Farbstoffkomponente 5-Amino-2- naphthalinsulfonsäure oder ein Diazoniumsalz ist.

8. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5- 7, dadurch gekennzeichnet daß die feste Phase einen chromatographischen Streifen umfaßt, und daß die flüssige Phase entlang der festen Phase von einem Ursprung zu einem Ende hin vorwärts wandert, wobei der lösliche Analyt oder die erste Farbstoffkomponente, die zur Menge an Analyt proportional ist, mit der kovalent gebundenen zweiten Farbstoffkomponente kuppelt, wobei ein Streifen aus farbiger Farbstoffkomponente gebildet wird, dessen Länge zu der Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyt proportional ist.

9. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, das die Assayvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-8 verwendet, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a. In-Kontakt-Bringen einer Festphasenmatrix, an der eine zweite Komponente eines Zwei-Komponenten-Farbstoffsystems kovalent gebunden ist, mit einer flüssigen Phase, die eine erste Komponente des Farbstoffsystems umfaßt, wobei die Menge der ersten Komponente gleich der Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyt oder zu dieser proportional ist, wobei die erste und zweite Komponente unter Bildung einer immobilisierten farbigen Farbstoffverbindung kovalent binden; und

Bestimmen der Menge an farbiger Farbstoffverbindung, die als Maß für den Analyten in der Probe kovalent an den Träger gebunden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet daß die erste Farbstoffkomponente der Analyt ist.