DE69019141T2

DE69019141T2 - Zusammensetzung und verfahren für die behandlung gutartiger prostata-hypertrophie.

Info

Publication number: DE69019141T2
Application number: DE69019141T
Authority: DE
Inventors: Muharrem Gokcen; Terry Guy
Original assignee: Immunolytics Inc
Current assignee: Immunolytics Inc
Priority date: 1989-01-27
Filing date: 1990-01-19
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2010-01-20
Also published as: DE69019141D1; JPH04503071A; ATE121946T1; EP0456724B1; ES2072424T3; HK1003981A1; US6296847B1; DK0456724T3; WO1990008555A1; JP3054190B2; EP0456724A1; AU5045690A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung hydrolytischer Enzyme zur Verwendung bei der Behandlung der Prostatahypertropie, insbesondere die Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Gemisch aus Kollagenase, Hyaluronidase, einem nichtionischen Tensid und einem Antibiotikum enthält und durch Injektion in die Prostata verabreicht wird, um die bei gutartiger Prostatahypertropie auftretenden Obstruktionssymptome bei Säugetieren zu lindern.

Hintergrund der Erfindung

Die gutartige Prostatahypertropie (BPH) ist eines der häufigsten der bei Männern mittleren und höheren Alters auftretenden medizinischen Probleme. Die durch Prostatavergrößerung bedingte Harnwegsverengung wurde bereits in den Anfängen der Medizin erkannt. Die Hypertrophie der Prostatadrüse führt oft zu einer Harnwegskompression mit dem Ergebnis einer Verengung bzw. Obstruktion der Harnwege und der Entwicklung von Symptomen wie häufiges Urinieren, nächtliches Wasserlassen, Schmerzen, Unwohlsein und Scham. Hinsichtlich des Zusammenhangs von BPH mit dem Alter ist nachgewiesen worden, daß mehr als 50 % der über 50-jährigen Männer betroffen sind und daß dieser Prozentsatz auf über 75 % der über 80-jährigen Männer ansteigt. Symptome der Harnwegsverengung treten meist im Alter zwischen 65 und 70 auf, wobei etwa 65 % der Männer dieser Altersgruppe eine Prostatavergrößerung haben. Durch die ständige Zunahme der Lebenserwartung nimmt das Durchschnittsalter der Bevölkerung in den Vereinigten Staaten zu. Daher wird auch die Anzahl der Männer, bei denen die Entwicklung klinischer Symptome von BPH zu erwarten ist, zunehmen.
Derzeigt gibt es keine wirksame nichtchirurgische Behandlung von BPH. Patienten, die unter den Obstruktionssymptomen dieser Krankheit leiden, haben normalerweise nur die Wahl zwischen zwei Alternativen: entweder weiter mit den Symptomen zurechtkommen oder einen chirurgischen Eingriff vornehmen lassen. Es ist festgestellt worden, daß das Auftreten einer BPH, die einen chirurgischen Eingriff erforderlich macht, mit dem Alter allmählich auf einen Maximalwert von 11 pro tausend bei über 80-jährigen Männern ansteigt. In den Vereinigten Staaten unterziehen sich jedes Jahr mehr als 350.000 Patienten einer Operation zur Entfernung von Prostatagewebe. Es ist errechnet worden, daß die Wahrscheinlichkeit, daß eine Prostatektomie wegen einer gutartigen Erkrankung erforderlich wird, bei einem 40-jährigen Mann, der 80 Jahre alt wird, etwa 10 Prozent beträgt.
An BPH leiden oft ältere Männer, von denen viele weitere gesundheitliche Störungen haben, die das Risiko eines chirurgischen Eingriffs erhöhen. Chirurgische Eingriffe zur Entfernung von Prostatagewebe sind unter anderem mit folgenden Risiken verbunden: Tod durch Narkose, Blutungen, Lungenembolie, Harnblasenperforation, Inkontinenz, Infektionen, Harnröhren- oder Harnblasenhalsstriktur, Zurückbleiben von Prostatateilchen, retrograde Ejakulation und Impotenz. Daher ist bei einer beachtlichen Anzahl von Patienten, deren Symptome schwerwiegend genug sind, um einen chirurgischen Eingriff zu rechtfertigen, ein hohes Operationsrisiko gegeben und eine Prostatektomie nicht möglich. An Bedarf, Wichtigkeit und Wert einer alternativen, nichtchirurgischen Behandlungsmethode für Männer mit hohem Operationsrisiko besteht kein Zweifel.
Bei einer alternativen, nichtchirurgischen Behandlungsmethode sind Einsparungen in vielen Bereichen zu erwarten, z.B. Operationskosten, Krankenhausaufenthalt nach der Operation, Transfusionen, Antibiotika, Krankenbesuche, erneute Krankenhausaufenthalte wegen Komplikationen und andere sozio-ökonomische Kosten im Zusammenhang mit der Genesung und dem Genesungsurlaub. Die psychologischen Implikationen der BPH bei alternden Männern durch Verlust der Harnblasenkontrolle sind beachtlich. Eine alternative, nichtchirurgische Therapieform würde hinsichtlich Häufigkeit des Harnlassens, Unannehmlichkeiten, Scham und Verlust der persönlichen Würde die Lebensqualität vieler alternder Männer verbessern. BPH ist eine Krankheit, durch die der Gesellschaft hohe Kosten entstehen. Entwicklung und Durchführung einer alternativen, nichtchirurgischen Therapie der BPH brächten wesentliche Vorteile in medizinischer, ökonomischer und psychosozialer Hinsicht.
Somit besteht eindeutig Bedarf an einer sicheren, wirksamen, nichtchirurgischen Behandlung der Prostatahypertrophie. Außerdem besteht Bedarf an einer Behandlung, die für den Patienten mit wenigen Risiken verbunden und relativ kostengünstig ist und die ambulant und ohne Vollnarkose durchgeführt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymzusammensetzung und die Verwendung einer Enzymzsammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Prostatahypertrophie. Die Enzymzusammensetzung löst Prostatagewebe enzymatisch auf, um die mit der Prostatahypertrophie verbundenen Obstruktionssymptome zu mildern.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die als Medikament für die Behandlung der Prostatahypertrophie bei lebenden Säugetieren geeignet ist und eine therapeutisch wirksame Menge an hydrolytischen Enzymen - vorzugsweise zwei oder mehr hydrolytischen Enzymen - und ein nichtionisches Tensid in einer wirksamen Konzentration enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, die zur Verwendung als Medikament zur Behandlung der Prostatahypertrophie bei lebenden Säugern geeignet ist, enthaltend eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und mindestens einem Enzym, wie Hyaluronidase, Elastase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, DNase I, Bromelain, Clostripain, Thermolysin, Neuraminidase, Phospholipase, Cholesterinesterase, Dispase, Subtilisin, Papain, Chymopapain, Plasminogenaktivator, Plasmin, Streptokinase, Urokinase, Fibrinolysin, Serrathiopeptidase, Pankreatin, Amylase, Lysozym, Kathepsin-G, und die (polymorphonukleare) PMN-Leukozyten-Serinproteasen, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung durch direkte intraprostatische Injektion geeignet ist und die Konzentration von Kollagenase und Enzym(en) wirksam ist, die Auflösung und Rückbildung von hypertrophiertem lebendem Prostatagewebe zu bewirken, um die mit Prostatahypertrophie zusammenhängenden obstruktiven Symptome zu lindern. Bevorzugter umfassen die hydrolytischen Enzyme Kollagenase und eine Hyaluronidase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, Elastase, Dnase I, Dispase, oder Plasmin. Bevorzugter umfassen die hydrolytischen Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase.
Die vorliegende Zusammensetzung ist vorzugsweise geeignet zur Verabreichung durch direkte intraprostatische Injektion einer therapeutisch wirksamen Dosiseinheit der Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise Kollagenase und Hyaluronidase in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Träger und vorzugsweise außerdem ein Tensid und ein Antibiotikum enthält. Der wäßrige Träger ist vorzugsweise steril, pyrogenfrei, gepuffert und isotonisch.
Die Komponenten der Zusammensetzung können allein nacheinander oder vorzugsweise miteinander kombiniert in form einer flüssigen, injizierbaren pharmazeutischen Dosiseinheit verabreicht werden. Die verabreichte Dosis der Zusammensetzung kann vom Kliniker in einem breiten Bereich variiert werden. Die bevorzugte Dosis zur Erzielung des gewünschten therapeutischen Effekts kann je nach Alter des Patienten, Art und Schwere der Erkrankung, Potenz der Zusammensetzung und Verabreichungsweg variiert werden.
Bevorzugt ist die Verabreichung mittels transurethraler, intraprostatischer (intraläsionaler) Injektion. Alternativ kann die Prostatainjektion auf transperineal oder transrektalem Weg erfolgen. Für die erfindungsgemäße Behandlung erfolgt die intraprostatische Injektion sicherer und wirksamer Mengen der bevorzugten Zusammensetzung, um die Auflösung und die Rückbildung von verengendem Prostatagewebe zu bewirken. Die Injektionen können nach täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Injektionsprotokollen erfolgen, bis das angestrebte therapeutische Ergebnis erreicht ist.
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die intraprostatische Injektion zur Behandlung der Prostatahypertrophie bei lebenden Säugern, die eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und eine therapeutisch wirksame Konzentration von Hyaluronidase enthält, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung mittels direkter intraprostatischer Injektion geeignet ist und die Konzentration von Kollagenase und Hyaluronidase wirksam ist, um die Auflösung und Rückbildung von hypertrophiertem lebendem Prostatagewebe zu bewirken.
Die Erfindung schließt ferner die Verwendung einer Zusammenstzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Prostatahypertrophie bei lebenden Säugern ein, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und eine therapeutisch wirksame Konzentration von Hyaluronidase enthält und die Konzentration von Kollagenase und Hyaluronidase wirksam ist, die Auflösung und Rückbildung von hypertrophiertem lebendem Prostatagewebe zu bewirken.
Die Erfindung betrifft ferner eine Packung mit sterilen Ampullen, die mindestens eine separate injizierbare Dosiseinheit einer Zusammensetzung enthält, die eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase, Hyaluronidase und einem nichtionischen Tensid enthält, die sämtlich in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Träger vorliegen, der für die Injektion in lebende Säuger geeignet ist.
Die Begriffe "wirksame Menge" oder "wirksame Konzentration" zur Bezeichnung der Konzentrationen von Bestandteilen der vorliegenden Erfindung bezeichnet die Menge des Bestandteils, die in Kombination mit den übrigen Bestandteilen die gewünschte Wachstumshemmung, Gewebeveränderung und Größenreduzierung der Prostata bei einem bestimmten Patienten bewirkt. Die Größenreduzierung des einengenden Prostatagewebes und die sich daraus ergebende Linderung der Symptome der Harnwegsverengerung zeigen den Therapieerfolg an. Die objektive Bewertung der Therapiewirkungen erfolgt mittels Standardverfahren, einschließlich Uroflowmetrie, Untersuchung durch die Harnröhre, oder transrektaler Sonographie, in Verbindung mit einer Bewertungstabelle für Obstruktionssymptome.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

BPH - Einführung in das Problem

Die Entwicklung einer BPH ist eine bei Männern mit zunehmendem Alter auftretende Erscheinung. Die Prostata wiegt bei Geburt wenige Gramm und erfährt in der Pubertät ein androgenstimuliertes Wachstum, bei dem sie in der zweiten Lebensdekade die adulte Größe von 20 g erreicht. Typischerweise behält die Prostata etwa 25 Jahre lang ihr Gewicht und ihre Gewebseigenschaften bei. In der fünften Lebensdekade erfolgt bei den meisten Männern ein zweiter Wachstumsschub. Diese zweite Wachstumsphase nimmt ihren Ausgang im periurethralen Bereich der Drüse als lokale Zellproliferation. Wachstum und Vergrößerung können so lange andauern, daß die normale Drüse komprimiert wird, eine starke Vergrößerung der Drüse erfolgt und eine Harnwegs- und/oder Rektumsobstruktion eintritt.
Es wird angenommen, daß die BPH in innenliegenden Prostatakanälen und Drüsen, die innerhalb oder angrenzend an die Harnröhrenwandung liegen, ihren Ausgang nimmt. Die anfänglichen Läsionen bestehen gewöhnlich aus einer sehr kleinen Masse aus losem Bindegewebsgerüst, das keine Drüsenanlagen besitzt. Bei Entwicklung und Größerwerden des Knötchens entsteht vorwiegend Drüsengewebe. Sobald der hyperplastische Prozeß eingeleitet ist, nehmen alle Elemente (Bindegewebe, Muskelgewebe und Drüsengewebe) der normalen Prostata in unterschiedlichem Grad am fortschreitenden Wachstum teil. Bei Ermittlung der relativen Anteile dieser Gewebe bei BPH-Patienten hat sich gezeigt, daß die Menge des fibromuskulären Gewebes weit größer ist als die Menge des Drüsenoder Epithelgewebes. Das fibromuskuläre Gewebe bildet etwa 45 % des Volumens der normalen Prostata, hingegen etwa 60 % der hypertrophierten Drüse.
Die Hypertrophie von Bindegewebs- und Drüsen/(Epithel)-Anteilen kann allein oder zusammen erfolgen. Die unterschiedliche Reaktion zeigt sich in der Art der Knötchen und ihren Entwicklungsphasen. Die Drüsen in den hyperplastischen Knötchen schein die Fähigkeit zu haben zu knospen und neue Kanäle und Acini auszubilden. Bindegewebsknötchen werden nur selten groß, während bei klinisch signifikanten Wucherungen gewöhnlich ein hoher Drüsenanteil gegeben ist. Bei Prostatavergrößerung ist häufig von einer Vergrößerung eines drüsigen Organs die Rede, jedoch bilden auch glatte Muskeln einen wichtigen Anteil. Die Prostatakapsel hat einen sogar noch höheren Anteil an Muskelgewebe.
Das Hauptsymptom einer gutartigen Vergrößerung der Prostata ist die Harnwegsverengerung. Die Harnwegsverengerung ergibt sich durch Kompression oder Elongation der Harnröhre. Die benigne knotige Hyperplasie allein kann eine Harnwegsverengerung durch physische Verengerung der Harnröhre oder durch Einwirkung auf den Muskel oder die Nerven, die den Harnröhrensphinkter versorgen, bewirken. Der genaue Ort der Hyperplasie entscheidet über Geschwindigkeit und Intensität der Obstruktionssymptome. Ein kleines Knötchen an einer strategischen Stelle kann eine stärkere Obstruktion bewirken als größere, mehr seitlich gelegene Hypertrophien, die innerhalb der Prostatakapsei verbleiben. Ein häufiges Symptom bei BPH ist Blutharnen, weil die Prostatahypertrophie ein Gefäßwachstum darstellt, bei dem Venen auf der Harnröhrenoberfläche erweitert sind. Weitere störende Symptome sind u.a. häufigeres Wasserlassen und ein fast ohne Vorankündigung auftretender starker Harndrang, der zum Wasserlassen zwingt. Die schwerwiegendste Komplikation der Prostatahypertrophie ist die Auswirkung der Obstruktion auf die oberen Harnwege. Die Obstruktion kann zur Wassersackniere, zu schweren Nierenschäden und zu Urämie, die tödlichen Ausgang haben kann, führen.

Behandlungsmethoden für BPH

Vor der operativen Prostatektomie bestand die Haupttherapieform bei BPH in der Harnableitung über Katheter, entweder wiederkehrend oder kontinuierlich, mit antiseptischer Spülung des Katheters. Indikationen für einen Dauerkatheter waren: ein Alter des Mannes von mehr als 50 Jahren, Nierenerkrankungen, Blasenatonie, Prostata beliebiger Größe, die Möglichkeit der Katheterisierung ohne Schwierigkeiten oder Komplikationen, mehr als vier Unzen Restharn, Herzschwäche, Gefäßerkrankung, und Symptome von häufigem Harnlassen, Schmerz, Tenesmus, Brennen, Nebenhodenentzündung und Blutharnen. Vielen Patienten mit geringen Obstruktionssymptomen wurde geraten, sich mit ihren leichten Behinderungen abzufinden.
Die Prostatektomie ist das gängige Verfahren zur Beseitigung BPH-bedingter Blasenhalsobstruktion. Ziel der operativen Behandlung ist es, die Auswirkungen der Harnwegsobstruktion, beispielsweise Nierenversagen, Steinbildung und Infektionen, rückgängig zu machen und zu beseitigen. Daneben ist es wünschenswert, die Lebensqualität des Patienten zu verbessern, indem es ihm ermöglicht wird, sich in normalen Abständen zu entleeren und dies unter Kontrolle zu haben sowie eine normale Sexualfunktion zu haben. Indikationen für die operative Prostatektomie sind: Alter des Mannes unter 70 Jahren, normale Nierenfunktion, weitgehend gesunde Blase, deutliche, bei rektaler Untersuchung feststellbare Vergrößerung der Prostata, deutliche Harnwegsverengerung, mehr als vier Unzen Restharn und Symptome von häufigem Harnlassen, Schmerz, Tenesmus, Brennen, Anfälle von Harnröhrenfieber, Nebenhodenentzündung und Blutharnen. Wenn ein Patient eine so starke Blasenhalsobstruktion hat, daß schwerwiegende Symptome auftreten, und wenn der Patient ein geringes Operationsrisiko darstellt, ist normalerweise die Entfernung des obstruierenden Prostatagewebes auf suprapubischem, retropubischem, perinealem oder transurethralem Weg angezeigt.
Bei der Prostatektomie werden üblicherweise die hypertrophierten Knötchen ausgeschält, wobei die komprimierte äußere Prostata, die sogenannte "chirurgische Kapsel" zurückgelassen wird. Bei zwei der üblichen Operationsmethoden zur Entfernung von hyperplastischem Prostatagewebe wird ein suprapubischer Schnitt gemacht. Die suprapubische Prostatektomie beinhaltet die Entfernung der knötchenförmigen Hyperplasie durch die Blase. Bei retropubischer Prostatektomie muß auf der dem Bauch zugewandten Seite der Prostatakapsei ein Einschnitt gemacht werden, mit nachfolgender Entfernung der behindernden Knötchen. Bei einem anderen Verfahren, der perinealen Prostatektomie, wird ein perinealer Schnitt gemacht und das Knötchen durch einen Schnitt auf der Rückseite der Prostatakapsel entfernt. Bei der derzeit am häufigsten verwendeten Operationsmethode wird ein endoskopisches Instrument durch die Harnröhre eingeführt, um hyperplastisches oder obstruierendes Gewebe Stückchen für Stückchen zu entfernen (transurethrale Resektion - TUR). Gängige Techniken unter Einsatz des Rückfluß-Resektoskops erlauben die kontinuierliche Resektion von Prostatagewebe. Sporadisch sind mehrere weitere Operationsmethoden zum Einsatz gekommen, die offenbar zur Linderung der BPH- bedingten Blasenhalsobstruktion geführt haben.
Die Mortalitätsrate bei der offenen chirurgischen Prostatektomie ist bei den verschiedenen Techniken weitgehend vergleichbar und liegt bei etwa 1 %. Das Risiko eines tödlichen Ausgangs ist bei TUR-Patienten geringer. Patienten mit erkanntem Nierenversagen gelten als Risikopatienten bei der Prostatektomie.
Männer über 80 tragen ein höheres Risiko, wobei die Sterblichkeitsrate bei TUR auf 3,5 % steigt. Daneben bestehen für den Patienten Infektionsrisiken, so das Risiko einer normalen Infektion der Operationswunde, einer Harnwegsinfektion und der Bakteriämie. für Patienten mit sehr großen Prostataadenomen besteht das größte Risiko einer Transfusion sowohl bei transurethraler als auch bei offener chirurgischer Prostataentfernung. Die verschiedenen Risiken der Bluttransfusion, darunter das Risiko der Krankheitsübertragung, sind bekannt.
Patienten, die sich einer radikalen retropubischen Prostatektomie unterziehen, können u.a. folgende Komplikationen auftreten: lange Operationsdauer (1 bis 6 Stunden); Blutverluste (50 bis 7.000 ml); Transfusionen (0 bis 20 Einheiten); Rektumsverletzungen mit Kolostomie, Beckenabszeß, Thrombose tiefliegender Venen, Lungenembolie; und schwere bis vollständige Harninkontinenz. Zu den weniger schwerwiegenden Komplikationen gehören Blasenhalsverkürzungen, zeitweise Harnverhaltung, Harnröhrenverengungen, Blasen- oder Harnröhrenrisse, Nebenhodenentzündungen, Prostata/Harnwegs-Verengungen, Harnröhrenfisteln und verringerte Sexualfunktion.
Zu den belegten Risiken der TUR gehören Inkontinenz, Harnröhrenverengung, Blasenhalsverkürzungen und Störungen der Sexualfunktion. Wer sich dieser Art der chirurgischen Entfernung von Prostatagewebe unterzieht, trägt gewisse Risiken, darunter das Risiko der postoperativen Streßinkontinenz und der Absorption von Spülungsflüssigkeit. Weitere Risiken sind Blasenperforationen, Infektionen und Blutungen, die eine Transfusion erforderlich machen. Der durchschnittliche Blutverlust bei transurethraler Prostataresektion liegt bei 10 ml pro Gramm entfernten Gewebes. Zu den Komplikationen, mit denen bei transurethraler Resektion gerechnet werden muß, gehören: Blasenspasmen; Blutungen; Blasen- oder Prostatakapsel-Perforationen; Beschädigungen des Harnröhrenschließmuskels; und Verletzungen durch Verbrennungen infolge mangelhafter Erdung der Instrumente. Zu den im Zusammenhang mit der TUR auftretenden postoperativen Komplikationen gehören: Blutungen; TUR-Syndrom; Katheterfunktionsstörungen; Harnröhrenverengungen; Blasenhalsverkürzungen; Harnwegsinfektionen; Schock; Thrombose tiefliegender Venen; Lungenembolie; und Funktionsstörungen des cardiovaskulären Systems, des gastrointestinalen Systems und des Zentralnervensystems. Eine unzureichende Heilung am Blasenhals oder Narbenbildung entlang der Urethra können zu einer Verengung der Harnröhrenlichtung durch Bildung von Strikturen oder Verwachsungen führen. Einige Strikturen sind leicht und mit nur geringer Beeinträchtigung des Patienten zu behandeln, während andere wiederholt chirurgische Eingriffe erforderlich machen können.
Chirurgische Methoden zur Entfernung der Prostata erfordern oft eine Operationsdauer von 1 bis 3 Stunden und einen anschließenden einwöchigen Krankenhausaufenthalt. Durch Komplikationen kann sich der Krankenhausaufenthalt auf zwei oder mehr Wochen verlängern. Etwa 10 bis 15 % der Patienten, die sich einer Prostatektomie unterziehen, benötigen weitere chirurgische Eingriffe zur Behandlung von Strikturen, was langfristige finanzielle Belastungen mit sich bringt. Die Rezidivhäufigkeit von BPH nach Prostatektomie, die eine erneute chirurgische Entfernung erforderlich macht, liegt zwischen 0,3 % bei der perinealen Prostatektomie und 7 % nach der TUR. Die größere Häufigkeit bei TUR ist ein deutlicher Hinweis auf bei dieser Methode unvollständig entferntes hyperplastisches Gewebe. Zu den postoperativen Komplikationen gehören die vollständige Inkontinenz oder eine derart schwere Drang- oder Streßinkontinenz, daß ein Hilfsmittel verwendet werden muß, um die soziale Akzeptanz zu behalten. Die Notwendigkeit, zur Harnkontrolle ein Hilfsmittel oder eine Prothese zu verwenden, ist eine unerwünschte Nebenwirkung der chirurgischen Prostatektomie. Wer sich gegen einen chirurgischen Eingriff entscheidet, muß weiter mit Schmerzen und Unannehmlichkeiten leben und wird mit einiger Wahrscheinlichkeit in Zukunft ernstere Symptome einer prostatabedingten Obstruktion entwickeln.
Die derzeitigen Therapieansätze zur Linderung der klinischen Symptome der BPH konzentrieren sich auf die operative Entfernung des obstruierenden Gewebes. In letzter Zeit ist die Kombination von Laser-Photokoagulations- und -verdampfungstechniken mit Hämatoporphyrin-Photosensibilisierungstechniken als Zusatzbehandlung zu operativen TUR-Techniken beschrieben worden. Zu den bei Einsatz der Lasertherapie auftretenden Problemen gehören Schwierigkeiten beim Zugang zur Prostata und die unterschiedliche Lasereindringtiefe. Die Prostata ist mit endoskopischen Instrumenten nur zum Teil zugänglich, so daß die Behandlung des Hinterlappens besonders schwierig ist.
Eine andere, nichtoperative Therapieform bei BPH-Patienten mit hohem Risiko kann die lokale Tiefenhyperthermie mit Mikrowellen sein. Die Hyperthermie des Prostatagewebes mittels Mikrowellen kann durch einen transrektalen oder einen transurethralen Applikator erreicht werden. Die Schwierigkeit bei dieser Therapieform besteht darin, daß es nicht möglich ist, das Prostatagewebe gleichmäßig und sicher zu erwärmen. Eine Erwärmung des normalen Gewebes ist unvermeidlich, weil hochenergetische Feldstärken erforderlich sind, um den Zugang zum Prostatagewebe zu erreichen.
Die BPH entwickelt sich bei Männern mit zunehmendem Alter, und es wird angenommen, daß sie das Ergebnis einer sich in Abhängigkeit von Hormonspiegeln und Wechselwirkungen ändernden Zellumgebung ist. Die derzeitigen Kenntnisse legen es nahe, daß die BPH ein hormoninduziertes und -gesteuertes adenomatöses Wachstum ist. Das jüngste Verständnis der der Pathogenese der BPH zugrundeliegenden hormonellen Mechanismen hat den Anstoß zu endokrinotherapeutischen Behandlungsansätzen bei dieser Erkrankung gegeben. Bei diesen hormonellen Mechanismen scheint das Testosteron ein Prohormon zu sein, und das Dihydrotestosteron scheint das aktive Hormon für die Prostatawucherung zu sein. Es scheint, daß das prostatische Bindegewebe einen induzierenden Mechanismus besitzt, der den Vorgang der Prostatahyperplasie auslöst, der abhängig ist von einer komplexen Wechselwirkung zwischen Hormonen, Bindegewebe und Epithel.
Es ist bekannt, daß die Kastration die BPH wirksam verhindert. Sowohl eine vergrößerte als auch die normale Prostata atrophiert nach einer Hodenexstirpation und wird zu einer kleinen, festen, fibrösen Masse, die nur noch Reste von Drüsengängen und -tubuli aufweist. Dieses Verfahren wurde zwar um die Jahrhundertwende angewendet, jedoch zugunsten der Exzision des obstruierenden Gewebes aufgegeben. Die meisten Ansätze, die Prostatavergrößerung in den Griff zu bekommen, konzentrierten sich auf die Verabreichung von Steroidhormonen und basieren auf der Vorstellung, daß die Kastration durch die Entfernung der Hauptquelle für die Androgenstimulation zu einer Symptomverbesserung und einer Reduzierung der Prostatagröße führt. Spezielle Antiandrogentherapien haben auf die Hemmung des Prostatawachstums durch Verhinderung des Auftretens obstruktionsbedingter Harnwegssymptome oder durch Auslösung der Prostatarückbildung, wodurch die Obstruktionssymptome gemildert wurden, abgezielt.
Die Bemühungen zur Ausschaltung der Androgenstimulation der Prostata haben zu verschiedenen Ansätzen, einschließlich der Unterdrückung des luteinisierenden Hormons (LH) durch Östrogentherapie und der Antiandrogentherapie, geführt. Die Östrogentherapie der BPH basiert auf der Tatsache, daß Östrogene bei geeigneter Dosierung den Pegel des zirkulierenden Testosterons senken. Medizinische Therapieformen zur BPH-Behandlung sehen auch die Verwendung von Antiandrogenen vor, die die Prostatawucherung hemmen, jedoch keine schädlichen Nebenwirkungen haben. Es ist gezeigt worden, daß Antiandrogene kompetitiv die Bindung von Dihydrotestosteron an Zellrezeptoren hemmen und die Testosteronkonzentration beim Mann auf Kastratenwerte reduzieren. Sobald jedoch die Antiandrogene abgesetzt werden, kommt es wieder zur Hyperplasie. Daher müssen sich die Patienten bei dieser Therapieform auf eine lebenslange Medikation mit den unerwünschten Nebenwirkungen der Antiandrogentherapie einstellen. Allgemein belegte Nebenwirkungen dieser Therapie sind unter anderem Brustvergrößerung, Empfindlichkeit der Brustwarzen, Libidoverlust, Impotenz und Akne.
Testosteron ist ein Prohormon, das in der Prostata durch Einwirkung der 5-α- Reductase in Dihydrotestosteron umgewandelt wird. Daher ist das Enzym 5-α- Reductase als Ziel für die Einwirkung von Suizidinhibitoren vorgeschlagen worden, um den Dihydrotestosteronspiegel zu senken. Es ist gezeigt worden, daß dies mittelbar die benigne Prostatawucherung auslöst. Es ist gezeigt worden, daß Steroid-Diazoketone einzigartige Analoge der natürlichen Substrate für das Enzym 5-α-Reductase sind und die katalytische Wirkung des Enzyms durch Bildung kovalenter Bindungen durch Diazoalkylierung im oder beim aktiven Zentrum hemmen bzw. inhibieren.
Ketoconazol ist ein Imidazolderivat, das sich als wirksamer Inhibitor der Testosteronproduktion in den Gonaden und den Nebennieren erwiesen hat. Ketoconazol scheint die LH-Sekretion der Hypophyse nicht zu beeinträchtigen, jedoch hemmt es die Cholesterinsynthese, führt zu klinischen Reduzierungen der Androgenspiegel der Gonaden und der Nebennieren und ist schwach toxisch. Die durch Verabreichung von Ketoconazol bewirkten hormonellen Veränderungen sind dosisabhängig und vollständig reversibel. Das Medikament hat sich unter klinischen Bedingungen als nützlich erwiesen, bei denen die Hemmung der Steroidproduktion der Gonaden oder der Nebennieren von Vorteil sein kann. Es ist nachgewiesen worden, daß Ketoconazol ein wirksamer Inhibitor der Testosteronsynthese ist und in der Behandlung der BPH von therapeutischem Wert sein kann. Zu den möglichen Nebenwirkungen der Ketoconazoltherapie gehören verminderte Libido, Impotenz, Gynäkomastie und Keimdrüsenunterfunktion.
Ornithindecarboxylase ist ein Enzym, das an der Biosynthese der Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin beteiligt ist. Es wird angenommen, daß diese Polyamine an beschleunigtem Zellwachstum und beschleunigter Zellteilung beteiligt sind. In der Prostata und anderen schnellwuchernden Drüsen werden erhöhte Werte dieser Polyamine festgestellt. Nach Synthese wirksamer Suizidinhibitoren der Ornithindecarboxylase, beispielsweise DL-α-difluormethylornithin (DFMO), wurde ein deutlich reduzierter Ornithindecarboxylasepegel in der Prostata mit anschließender Verringerung von Putrescin und Spermidin nachgewiesen. Bei Tieren hat die Verabreichung des Suizidinhibitors von Ornithindecarboxylase, DFMO, zur Hemmung der Prostatawucherung geführt. Außerdem hemmt DFMO in der Gewebekultur die DNS-Synthese und verlangsamt die Wucherung menschlicher Prostata-Adenomzellen. Diese Verbindung kann bei der Behandlung von Prostata-Adenomen Anwendung finden.
Bei weiteren nicht-operativen Therapieansätzen zur Behandlung der BPH sind hochwirksame LHRH-(LH releasing hormone)-Agonisten eingesetzt worden, die die testikuläre Testosteronproduktion durch Hemmung der Gonadotropinfreisetzung der Hypophyse blockieren. Der Haupteffekt der LHRH-Agonisten beim Menschen ist die Reduktion des Testosteronpegels im Serum. Es ist gezeigt worden, daß Leuprolid- und Nafarelinacetat beim Mann den Androgen- und den Ostrogenwert im Kreislauf innerhalb drei Wochen auf Kastratenwerte reduzieren. Bei kontinuierlicher Verabreichung in therapeutischen Dosen desensibilisieren diese Verbindungen die Hypophyse und blockieren die freisetzung geschlechtlicher Steroidhormone. Es ist gezeigt worden, daß das mit hochwirksamen LHRH-Agonisten erreichte Maß der Testosteronsuppression bei der Behandlung der obstruierenden gutartigen Prostatahypertropie wirkungsvoll ist. Zu den Nachteilen dieser Therapieform gehört die Notwendigkeit der Medikation auf unbegrenzte Zeit, da die Androgensuppression reversibel ist und sich danach erneut Gewebehyperplasien bilden. Außerdem können Nebenwirkungen, wie Impotenz, verringerte Libido, Hitzewallungen, und auch eine anfängliche Zunahme der Obstruktionssymptome auftreten.
Bei weiteren Ansätzen zur Verhinderung oder nicht-operativen Behandlung der BPH werden Neuropharmaka, beispielsweise α-1-Rezeptorenblocker. Prazosin, Hytrin, Phentolamin und Ketanserin sind antiadrenerge Mittel, die auf eine Entspannung des Harnröhrenschließmuskelmechanismus abzielen. Die medikamentöse Behandlung der BPH mit Alpharezeptorenblockern ist für sehr viele Patienten mit Prostatavergrößerung, bei denen ein chirurgischer Eingriff als nicht notwendig angesehen wird oder verschoben werden muß, hilfreich. Zur Behandlung der BPH sind verschiedene Alpharezeptorenblocker eingesetzt worden, darunter die Verbindungen Phenoxybenzamin (potentiell mutagen), Prazosin (Minipres), Phentolamin (Regitine), Nicergolin (Sermion), Terazosin (Hytrin) und Thymoxamin. Nebenwirkungen treten bei etwa 30 % der wegen BPH mit Phenoxybenzamin behandelten Patienten auf, darunter Hypotonie, Schwindel, Ohnmacht, Tachykardie, Mattigkeit und retrograde oder fehlende Ejakulation. Bei etwa 10 % aller behandelten Fälle sind die Nebenwirkungen nicht akzeptabel, so daß die Behandlung abgebrochen werden muß. Prazosin und Hytrin scheinen weniger Nebenwirkungen hervorzurufen. Die Möglichkeit zerebraler Hypotonie oder Ischämie scheint eine Kontraindikation für diese Mittel darzustellen. Schnellwirkende intravenöse Blocker, wie Phentolamin, sind besonders bei älteren Personen mit Vorsicht anzuwenden. Nicergolin jedoch wird als günstig für den Gehirnkreislauf angesehen.
Pharmakologisch nachgewiesen ist, daß die Prostatagröße beim Tier durch Absenkung des Cholesterinspiegels reduziert werden kann. Es ist gezeigt worden, daß Polyenmakrolide hochwirksame Mittel zur Senkung des Cholesterinspiegels sind. Die Gruppe der Polyenmakrolide hat spezifische physiko-chemische Affinität zu Sterinen und sterinhaltigen Zellmembranen. Der hohe Cholesteringehalt der Prostata kann als pharmakologischer Angriffspunkt für lipidlösliche oder in Lipid dispergierende Reagenzien, wie es die Polyenmakrolide sind, dienen. Die BPH wird mit steigendem Cholesteringehalt und der Absetzung von Cholesterinplaque in der Lichtung der Acini in Verbindung gebracht und kann der Grund für die im Prostatagewebe festgestellten relativ hohen Polyenmakrolidkonzentrationen (lipidlöslich) sein. Bei Toxizitätsstudien am Tier wurde festgestellt, daß Polyenmakrolide den Testosteronspiegel im Serum senken, die Hodenfunktion hemmen und Veränderungen im Prostatagewebe herbeiführen. Es ist nachgewiesen worden, daß die Polyenmakrolidantibiotika Candicidin und Amphotericin B eine deutliche Verringerung der Größe der Prostatadrüse bewirken, jedoch haben Klinikversuche beim Menschen keine Verringerung der Anzahl derjenigen Patienten ergeben, bei denen wegen BPH- bedingten Obstruktionssymptomen ein chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Probucol und Nystatin senken den Cholesterinspiegel im Blut, haben jedoch keine Schrumpfung der Prostata bewirkt.
Es sind verschiedene Ansätze zur nichtoperativen Behandlung der Obstruktionssymptome bei BPH verfolgt worden, einschließlich der Phenolinjektion. Die Phenolinjektionstherapie beruht auf dem Konzept der chemischen Nekrotisierung des Prostatagewebes und der nachfolgenden Schrumpfung des obstruierenden Gewebes. Die Therapie sieht die intraprostatische Injektion einer Lösung von 2 % flüssigem Phenol, 2 % Eisessig und 4 % Glycerin vor. Die Injektion erfolgt mittels Lumbalpunktionsnadel, die perineal angesetzt und durch digitale rektale Palpation in die Prostata geführt wird. Berichten über erfolgreiche Behandlungen stehen Komplikationen gegenüber, wie Blutungen, Impotenz, Symptomverschlimmerung und Injektionsschmerzen oder -beschwerden, die einige Stunden bis mehrere Tage anhalten. Die Injektionstherapie mit Phenol scheint eine ungeeignete Behandlung für BPH zu sein, da sie keine entscheidende Auswirkung auf die Größe der Prostata oder den Harnfluß hat.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die einzige realistische und effektive Behandlung zur Beseitigung der Harnwegsobstruktion, die bekannt ist, die chirurgische Behandlung ist. In den vergangenen 40 Jahren sind viele Versuche zur medikamentösen Behandlung dieser Erkrankung unternommen worden. Die Bewertung der Ergebnisse dieser Versuche wurde durch die Tatsache kompliziert, daß Patienten mit BPH-Symptomen allein nach der diagnostischen Untersuchung mit Instrumenten eine zeitweilige Besserung oder ein Nachlassen der Entleerungssymptome erleben. Allem Anschein nach hatten die verschiedenen alternativen, nichtoperativen Therapien mit Östrogenen, Antiandrogenen und Rezeptorenblockern nur begrenzten klinischen Erfolg, weil es keinen zwingenden Beweis ihrer Wirksamkeit gibt. Die Wirksamkeit dieser Therapien wechselt mit der Bewertungsmethode, Art und Dauer der Therapie und der Art der jeweiligen BPH. Keine der derzeit verfügbaren medikamentösen Behandlungsformen für BPH-Patienten bietet sich als Langzeittherapiealternative zur Operation an.
Verglichen mit den derzeit zur Erreichung derselben Ziele eingesetzten Operationstechniken vermindert die vorliegende Erfindung die Morbidität und erhöht die Lebensqualität. Die direkte Injektion in die Prostata ist im allgemeinen ein sicheres, einfaches und wirksames Mittel zur Einführung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen unmittelbar in die vergrößerte Prostata. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist sicher und hochwirksam zur Auflösung und Rückbildung von Bindegewebs-, Epithel- und fibromuskulären Anteilen des Prostatagewebes.

Anatomie und Histologie der menschlichen Prostata

Die menschliche Prostata ist ein kompaktes Organ aus Muskeln und Drüsen, das an der Basis der Blase liegt und die Harnröhre umgibt. Die ausgewachsene Drüse ist etwa kastaniengroß, wiegt etwa 20 g und ähnelt einem abgestumpften Kegel. Die Prostata hat an der Basis einen Durchmesser von etwa 4,5 cm bei einer Länge von 3,5 cm, und sie verjüngt sich auf einen Durchmesser von 2,5 cm am Vorderabschnitt des Kegels. Die Harnröhre verläuft in etwa durch die Mitte der Prostata von deren Basis bis zum Scheitel und ist der anatomische Schlüsselbezugspunkt zur Beschreibung der verschiedenen Prostatabereiche.
Die menschliche Prostata ist von fester Konsistenz und von einer vorstehenden, fibroelastischen Struktur aus Bindegewebe und glatten Muskelfasern umgeben, die als Kapsel bezeichnet wird. Ausgehend von der Kapselhülle reichen in Abständen voneinander getrennte Scheidewände in die Drüse hinein und unterteilen sie in Lappen. Die Umfangsfläche der Kapsel setzt sich hauptsächlich aus Fibroblasten, Kollagen und elastischen Fasern zusammen. Die Scheidewände weisen zahlreiche glatte Muskelzellen auf.
Die Prostata setzt sich aus einer großen Anzahl von Drüsen zusammen, die mit getrennten Gängen in die Harnröhre münden und in ein Stroma eingebettet, das ein faseriges Bindegewebe aus einem Gemisch aus kollagenen Fasern und glatten Muskelfasern ist. Die Prostatadrüse wird von den Ejakulationskanälen, die durch die Prostata hindurch verlaufen, unvollständig in 3 bis 5 Lappen unterteilt. Jeder Lappen ist seinerseits unvollständig in Läppchen unterteilt. Die Prostata ist aus 30 bis 50 Läppchen zusammengesetzt, die mit 15 bis 30 Kanälen direkt in die prostatische Harnröhre münden. Der Drüsenbereich zwischen der Harnröhre und den Ejakulationskanälen ist aus kleinen mukösen und mittelgroßen submukösen Drüsen zusammengesetzt, während die übrige Prostata größere und stärker verzweigte Drüsen enthält.
Die menschliche Prostata ist eine tubuloalveoläre Drüse mit Epithel, glatten Muskeln, elastischem Gewebe und kollagenem Stroma, die so angeordnet sind, daß das Sekret gespeichert und bei Bedarf über die Prostatagänge in die Harnröhre abgegeben werden kann. Die menschliche Prostata setzt sich aus Alveoli und Gängen zusammen, die jeweils mit großen, säulenförmigen oder würfelförmigen Epithelzellen ausgekleidet sind. Das Drüsenepithel ist sehr unterschiedlich und reicht von einfach säulenförmig oder pseudegeschichtet zu würfelförmig. Die Epithelzellen sitzen auf einer Bindegewebsschicht, die reich an Kapillaren, kollagenen und elastischen Fasern ist. Die Drüsenausführungsgänge sind mit einfachem oder pseudogeschichtetem Säulenepithel ausgekleidet, das an der Mündung der Gänge in die Harnröhre mit Obergangsepithel durchsetzt ist. Die größeren Gänge und die Harnröhre sind von einem dichten Netz elastischer Fasern umgeben.
Die Alveoli und die Gänge sind in ein Stroma aus fibromuskulärem Bindegewebe eingebettet. Das Stroma besteht aus kollagenem und elastischem Gewebe und weist um die Gänge und Acini herum sowie zwischen den Drüsenläppchen viele glatte Muskelfasern auf. Das mit zahlreichen Gefäßen durchsetzte Stroma bildet ziemlich gut abgesetzte Scheidewände, die strahlenförmig von der Urethra abgehen und um diese herum einen dicken Ring aus Muskelgewebe bilden, der als Harnröhrensphinkter bekannt ist. An der Umfangsfläche der Drüse ist das Stroma verdichtet und bildet eine Kapsel aus ringförmigen Fasern aus kollagenem Gewebe, elastischem Gewebe und glatten Muskeln.
In der Kapsel und im Stroma sind Blutgefäße, Lymphgefäße, Nerven und Ganglien vorhanden. Die Arteria vesicalis inferior, ein Ast der Arteria iliaca interna, gewährleistet die Hauptversorgung der Prostata mit arteriellem Blut. Der vordere Abschnitt der Arteria iliaca interna versorgt die Prostata mit zusätzlichen Gefäßen, im allgemeinen über Aste der Arteria rectalis media und der Arteria pudenda interna. Die Prostata wird über das Beckengeflecht (Plexus pelvicus) (vegatativ) mit Nerven versorgt und empfängt Signale sowohl vom sympathischen als auch vom parasympathischen System des vegetativen Nervensystems.
Die menschliche Prostata ist anatomisch heterogen und setzt sich aus vier morphologisch unterschiedlichen Bereichen zusammen, von denen nur einer als anfällig für BPH gilt. Diese Bereiche sind bei äußerlicher Untersuchung nicht zu unterscheiden, und sind bei makroskopischer Sektion nicht leicht und nicht zuverlässig voneinander zu trennen. Innerhalb der Prostata sind vier Zonen identifiziert worden, die von morphologischer, funktioneller und pathologischer Bedeutung sind: das vordere fibromuskuläre Stroma, die Peripheriezone, die Zentralzone und die periurethrale Zone.
Die BPH nimmt fast ausschließlich von dem kleinen Bereich der Prostata ihren Ausgang, der unmittelbar die prostatische Harnröhre und den Sphinkter vor der Prostata umgibt. Die BPH ist eine knotige, regionale Wucherung, die durch eine ungleichmäßige Mischung von Drüsen- und Stromagewebe bedingt ist. Das hyperplastische Gewebe liegt normalerweise mittig im periurethralen Bereich der vergrößerten Drüse. Diese anatomische Lage bedingt die mit der BPH einhergehenden Harnwegsobstruktionssymptome und erklärt die schwerwiegenden Symptome, die häufig auch bei nur geringer Prostatavergrößerung beobachtet werden. Die grobe Anatomie der meisten Prostatahyperplasien beim Menschen ergibt eine gewundene, knotige Wucherung, bei der normales und anomales Gewebe relativ deutlich voneinander getrennt sind. Unter dem Mikroskop ist zu erkennen, daß alle Drüsen- und Stromaelemente der normalen Prostata in jeweils unterschiedlichem Grad an der Hyperplasie beteiligt sind.
Es wird angenommen, daß die Pathogenese der BPH auf die Nähe des Drüsengewebes zum Sphinkterstroma zurückgeführt werden könnte. An der Knötchenbildung könnten embryonalartige induzierende Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Gewebearten beteiligt sein. Die früheste Stufe der BPH-Knötchenbildung ist beschrieben worden als winzige Masse von lockerem, embryonalartigem Stroma ohne alle Drüsenanteile. Später bilden dem Mesenchymknoten benachbarte Drüsen Aste aus, die in die Stromamasse eindringen und Epithelanteile hinzufügen. Knötchen dieser Art werden am häufigsten in der periurethralen Zone gefunden. In der Zentralzone jedoch scheint die Mehrzahl der kleinen Knötchen im Anfangsstadium vorwiegend drüsig zu sein. Außerdem liegen die Drüsen in einem normal aussehenden Stroma, dessen Masse nicht vermehrt ist und das keine Mesenchymmerkmale zeigt.
Die BPH-Wucherung hat Neoplasmacharakter, wobei die Läsionen in Form von Knötchen auftreten, die mehrere Ursprungsorte innerhalb des periurethralen Bereiches haben und unbegrenzt wachsen. Die Knötchen setzen sich aus drei in unterschiedlichen Anteilen vorhandenen Gewebetypen zusammen und sind keine diffuse Hyperplasie oder Hypertrophie bereits zuvor bestehender Prostatadrüsen. Die frühen Läsionen sind Fibromyome, die ihren Ursprung wahrscheinlich in einer Wucherung von glattem Muskel- und Bindegewebe haben, die die periurethralen Drüsen und Gänge umgeben. Diese ersten Knötchen können in ihrem Aufbau unterschiedlich sein, nämlich rein fibromuskuläres Gewebe mit wenig oder gar keinen Epithelanteilen bis zuadenomen, bei denen reichlich Epithelanteile vorhanden sind und das ursprüngliche umgebende fibromuskuläre Stroma ziemlich auffällig ist.
Mit zunehmendem Alter erfährt die menschliche Prostata zwei klinisch bedeutsame Veränderungen, nämlich die gutartige (benigne) Prostatahypertrophie und die Bildung eines invasiven Karzinoms. Die BPH beim Menschen besteht im Wachstum zahlreicher fibroadenomatöser Knötchen, die das umgebende gesunde Prostatagewebe komprimieren. Die Knötchen treten im inneren Bereich der Prostata auf, umgeben und verformen die Harnröhre und komprimieren den äußeren Drüsenbereich, so daß die falsche oder chirurgische Kapsel entsteht. Die benigne Prostatavergrößerung scheint in einer Gruppe innenliegender (periurethraler) Drüsen aufzutreten. Während sich die Hyperplasie in der inneren Drüsengruppe entwickelt, beginnt die äußere Drüsengruppe zu atrophieren. Prostatakarzinome entwickeln sich gehäuft in den äußeren atrophierten Drüsen, seltener aus gutartigen hyperplastischen Drüsen. Wenn Tumoren in den inneren Drüsen vorzuliegen scheinen, ergeben mehrfache Schnitte für gewöhnlich, daß diese Wucherungen Auswüchse größerer Tumoren der äußeren Drüsen sind. Das Prostatakarzinom ist eng mit seniler Atrophie verbunden und entsteht wahrscheinlich aus Epithelzellen, die zuvor atrophiert haben. Die komprimierten atrophierten Drüsen außerhalb der wachsenden Hypertrophieknötchen sind die häufigsten Ursprungsorte des Prostatakarzinoms.
Häufig sind die Prostatadrüsen älterer Männer sowohl von BPH als auch von Krebs betroffen. Je nach Alter wird bei 2 bis 60 % der Patienten, die wegen benigner Prostatavergrößerung eine TUR vornehmen lassen, bei histologischer Untersuchung des entfernten Gewebes ein unerkanntes Prostatakarzinom gefunden. Viele nichtmetastasierende Prostatakarzinome sind nämlich relativ symptomfrei.

Biochemie der menschlichen Prostata

Die Prostata ist eine sekretorische Drüse, deren komplexe und einzigartige Produkte am Befruchtungsvorgang beteiligt sind. Die Sekrete stellen auch einen Schutz vor bakteriellen Harnwegsinfektionen dar. Die Prostatasekrete sind ein Produkt des Drüsenepithels, wobei der Sekretionsvorgang als sowohl apokrin als auch merokrin zu bezeichnen ist.
Mit zunehmendem Alter wird die menschliche Prostata größer und verändert ihre Struktur und ihre Sekretionstätigkeit, sie scheint jedoch trotz verringerten Androgenspiegels im Kreislauf hormonell nicht unterversorgt zu sein. Sowohl die testikulären als auch die Nebennierenandrogene scheinen das Prostatawachstum zu fördern. Hypophysenhormone und cyclisches AMP könnten bei der Entwicklung der strukturellen oder funktionellen Veränderungen, die mit der malignen Veränderung von Prostatagewebe einhergehen, eine Rolle spielen.
Die gutartige Prostatavergrößerung ist eine Erkrankung des fortgeschritteneren Alters. Die anfänglichen Läsionen bei BPH treten im Stromagewebe der Prostata auf und gewinnen die Oberhand über die Epithelanteile. Das fibromuskuläre Stroma der Prostata ist reich an Kollagen und Proteoglykanen. Die Prostatagröße könnte durch ein Rückkopplungssystem geregelt werden, das zu einem Gleichgewicht zwischen Kollagenproduktion und Kollagenabbau durch von den Epithelzellen abgesonderte kollagenolytische Enzyme führt. Es wird angenommen, daß die Synthese von Prostatakollagen von der Androgenstimulierung abhängig ist, wobei die Fibroblasten des Stroma durch Androgene zur Bildung neuen Kollagens angeregt werden. Diese neugebildeten Kollagenfasern liefern das Netz für neues Epithelwachstum und neue Epithelvermehrung, die von Anheftungsmöglichkeiten abhängig sind. Wenn das Ausmaß des androgenstimulierten Stromawachstums den Kollagenabbau durch Kollagenase übersteigt, entwickelt sich eine Prostatahypertrophie, die zu einer Vergrößerung der Prostata führt.
Kollagen ist der wichtigste fibröse Bestandteil des extrazellulären Bindegewebes der Prostata. Kollagenfasern bilden ein chemisch und physikalisch stabiles Netz bzw. eine Matrix von stützendem Bindegewebe für die Prostata und erfüllen zahlreiche Funktionen. Kollagen fungiert biologisch als strukturbildende und stützende Komponente der extrazellulären Matrix und als Substrat für die Zellanhaftung. Kollagen beeinflußt die Zellvermehrung und -differenzierung. Kollagen ist außerdem Bestandteil beim Aufbau zellulärer Basalmembranen und des Zytoskeletts. Durch die Tripelhelixstruktur seines Moleküls erhält das Kollagen hohe Beständigkeit gegen den proteolytischen Abbau.
Kollagen setzt sich aus Fibrillen aneinandergelagerter Tropokollagenmoleküle zusammen. Jedes Tropokollagenmolekül umfaßt drei Ketten, die zu einer Tripelhelix verdrillt sind. Tropokollagenmoleküle lagern sich unter Bildung von Vernetzungen aneinander, die sich stetig weiterentwickeln, was dazu führt, daß das Kollagen mit zunehmendem Alter unlöslicher und lysebeständiger wird. Der zunehmende Hydroxyprolingehalt des Kollagens liefert einen Mechanismus für die beim Alterwerden wachsende Steifigkeit der Kollagenstruktur.
Das Bindegewebe der Prostata besteht hauptsächlich aus Kollagen des Typs I und III, dessen Fasern den Hauptteil des interzellulären Kollagens ausmachen. Kollagen des Typs IV und V ist hauptsächlich in den Basalmembranen von Zellen anzutreffen. Die unterschiedlichen Kollagentypen zeigen unterschiedliche Proteinaseempfindlichkeit, die anscheinend durch Unterschiede in der primären Aminosäuresequenz des Tropokollagens, in der Art der kovalent gebundenen Kohlehydrate und in Art und Grad intermolekulärer Vernetzungen bedingt ist. Die Proteolysebeständigkeit des Kollagens wird seiner eng verdrillten Tripelhelixstruktur zugeschrieben. Die Helix ist so verdrillt, daß Peptidbrücken, die benachbarte Aminosäuren verbinden, tief im Inneren des Moleküls zu liegen kommen. Ergebnis davon ist, daß der Tripelhelixbereich gegen den Angriff einer starken allgemeinen Protease, wie Pepsin, sehr beständig ist.
Die anfängliche proteolytische Wirkung von Kollagenase auf Kollagen scheint in der Hydrolyse des Tripelhelixbereichs des Moleküls zu bestehen, wobei alle drei Ketten gespalten werden. Es kommt dann zu einer zweiten Spaltung dieser Ketten, wobei viele kleinere Fragmente entstehen. Je stärker das Kollagen vernetzt ist, desto widerstandsfähiger ist das Kollagen gegenüber der Kollagenase. Der enzymatische Abbau von stark vernetztem Kollagen kann das Zusammenwirken mehrerer Enzyme erforderlich machen, nämlich von Enzymen, die die Tripelhelixstruktur denaturieren, Enzymen, die die Polypeptidketten des denaturierten Kollagens spalten, und Enzymen, die die Endregion des Kollagenmoleküls aufspalten, die der Ort der intermolekulären Vernetzung ist.
Die proteolytische Lösung von Kollagen kann durch große Mengen von kollagenverknüpften Proteglykanen gehemmt werden, die im Zusammenhang mit Kollagen stehen. Kollagentyp, Alter des Gewebes, Hydrierungsdrad und die Art dieses Proteoglykans sind die Faktoren, die die Art des proteolytischen Abbaus von Kollagen durch die verschiedenen Proteinasen bestimmen. Die proteolytische Entfernung der nichtkollagenen Matrix, die die Kollagenfasern umgibt, kann erforderlich sein, bevor die eigentliche Kollagenspaltung stattfinden kann. Die Kollagenfasern der Prostataknötchen sind in Proteoglykane eingebettet, die den Kollagenabbau durch Kollagenase hemmt. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung von Hyaluronidase in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung diese Hemmung ausschaltet.
Das Bindegewebsstroma, oder die extrazelluläre Matrix, der menschlichen Prostata setzt sich aus Kollagenen, Elastinen und den Basalmembranproteinen Fibronectin und Laminin zusammen. Die Grundsubstanz, in die diese Komponenten eingebettet sind, setzt sich aus Proteoglykanen, komplexen Polysacchariden und Glykolipiden zusammen. Die extrazelluläre Matrix der Prostata ist ganz wesentlich an der Steuerung von Zellwachstum, -differenzierung, -migration und -form beteiligt. Die Matrix ist ein stabiles Material, das unter den Epithelzellen liegt, Bindegewebszellen umgibt und das Stützgerüst bildet, an dem Zellen anhaften. Kollagene verleihen den Geweben Festigkeit, Elastine verleihen Elastizität, und Proteoglykane liefern die Kohäsionsfaktoren für die Gewebematrix.
Proteoglykane enthalten ein zentrales Protein, das kovalent an mindestens eine Glykosaminoglykankette (GAG-Kette) gebunden ist. Proteoglykane weisen ein breites Spektrum von zentralen Proteinen auf, die Glykosaminoglykane unterschiedlicher Klassen, Anzahl und Länge haben. Die Masse des Proteoglykans besteht hauptsächlich aus GAG-Ketten, die sich aus Chondroitinsulfat, Keratinsulfat und Heparinsulfat zusammensetzen. Das zentrale Protein und die GAG-Ketten interagieren mit Hyaluronsäure und binden Stränge davon. Die Verknüpfung zwischen diesen drei Molekülen ergibt eine stabile Struktur, die sich aus zwischen benachbarten Proteoglykanen eingelagerter Hyaluronsäure zusammensetzt und dem Enzym Hyaluronidase zugänglich ist.
Bindegewebsstromazellen der Prostata umfassen glatte Muskelzellen, Fibroblasten und primitive Mesenchym- oder Endothelzellen. Die Zellkollagenbindung wird von spezifischen Glykoproteinen vermittelt, die für die Adhäsion, das Wachstum, die Differenzierung und die Transformation von Zellen wichtig sind. Die extrazelluläre Matrix der Prostata enthält eine Anzahl hochmolekularer Glykoproteine, einschließlich Fibronectin und Laminin. Fibronectin wird hauptsächlich von Fibroblasten, Mesenchymzellen und glatten Muskelzellen gebildet und heftet sich fest an Kollagen, Heparin und DNS. Fibronectin scheint die Bindung glatter Muskelzellen an Kollagen des Typs I und III zu fördern. Glatte Muskelzellen heften sich vorzugsweise an Kollagen des Typs V und scheinen sich unmittelbar an Kollagen des Typs V zu heften, ohne daß zusätzlich anheftende Glykoproteine erforderlich wären. Laminin wird von Epithelzellen synthetisiert, die sich vorzugsweise an Kollagen des Typs IV anheften. Laminin ist das Basalmembran-Glykoprotein, das das Anheften dieser Zellen an Kollagen vermittelt. Die Basalmembran ist eine komplexe Struktur, die Kollagen des Typs IV, Glykosaminoglykane, komplexe Polysaccharide und Glykolipide enthält. Die Basalmembran der Zelle bildet die Schnittstelle mit dem Stroma.
Es gibt eine große Anzahl von Kollagenen, Glykoproteinen und Proteoglykanen, die Bindegewebe bilden. Das Stroma und das Bindegewebe der extrazellulären Matrix der Prostata enthalten ein komplexes Netz aus Glykosaminoglykanen und komplexen Polysacchariden, wozu Dermatansulfat (40 %), Glykosaminoglykan, Heparin (20 %), Chondroitin (16 %) und Hyaluronsäure (20 %) gehören. Mit zunehmendem Alter stellen sich ein allmählicher Verlust an löslicher Hyaluronsäure und die Umwandlung von Chondroitin-4-Sulfat in Chondroitin-6-Sulfat ein.

Enzyme der erfindungsgemäßen Zusammensetzung

Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Gemisch hydrolytischer Enzyme enthält, die zum Abbau oder zur Auflösung von Prostatagewebe verwendet werden können und die Obstruktionssymptome bei Prostatahypertrophie lindern. Es ist festgestellt worden, daß eine bevorzugte Ausführungsform eine wirksame Menge von Kollagenase zusammen mit mindestens einem Enzym enthält, das Hyaluronidase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, Elastase, DNase I, Dispase und Plasmin ist. Die Verwendung von Kollagenase zusammen mit Hyaluronidase ist besonders bevorzugt.

A. Kollagenase

Es wird angenommen, daß bakterielle Kollagenase (beispielsweise von Clostridium hystolyticum, EC 3.4.24.3) Kollagen durch Hydrolyse an mehreren Stellen entlang der Tripelhelix zu kleinen Peptiden abbaut. Kollagenase von Clostridium hystolyticum ist im Handel erhältlich, und es sind gereinigte Präparate erhältlich, die frei sind von Bakterien, Sporen, Pilzen, Hefen, Mykoplasmen und Viren. Clostridium hystolyticum wird unter geeigneten Bedingungen kultiviert und ist bevorzugt.
Kollagenase ist ein Metalloenzym, das in seinem aktiven Zentrum Zn²&spplus; enthält. Die von Clostridium hystolyticum gewonnene Kollagenase hat ein Molekulargewicht von etwa 105.000. Kollagen hat keine freien Sulfhydrylgruppen (SH- Gruppen) oder Disulfidbindungen. Kollagenase hat einen isoelektrischen Punkt von 8,6. Ca²&spplus;-Ionen sind erforderlich, um das Enzym an das Kollagensubstrat zu binden und ihm die für die volle katalytische Aktivität erforderliche Konformation zu verleihen. Alle Metalle außer Ca²&spplus; inhibieren Kollagenase, Zn²&spplus; jedoch ist in begrenzten Konzentrationen von entscheidender Bedeutung.
Kollagenase wird irreversibel gehemmt durch Cystein und reversibel gehemmt durch EDTA, die essentielles Ca²&spplus; bindet. Cystein scheint als Chelatbildner für Zink zu fungieren, welches das sich im aktiven Zentrum des Enzyms befindende Metallion ist. Es ist nachgewiesen worden, daß Histidin die Aktivität von Kollagenase hemmt. Ferner ist nachgewiesen worden, daß Kollagenasen durch verschiedene Metallchelatbildner, wie o-Phenanthrolin und 8-Hydroxychinolin. Spezifische Antiseren scheinen Kollagenase nicht zu hemmen; normales Serum hemmt die Aktivität von Kollagenase kaum oder überhaupt nicht. Im allgemeinen werden bakterielle Kollagenasen durch die natürlich vorkommenden Inhibitoren gewebespezifischer Kollagenasen, wie α-1-Antitrypsin und α-2-Makroglobulin, nicht gehemmt. Der für die Kollagenaseaktivität optimale pH-Wert liegt im Bereich von 6 bis 8. Niedrige pH-Werte inaktivieren das Enzym irreversibel; mit Essigsäure kann die Kollagenaseaktivität sofort gestoppt werden. Außerdem hat sich herausgestellt, daß Kortisonpräparate die Kollagenaseaktivität erhöhen, und von den meisten untersuchten Antibiotika wurde nachgewiesen, daß sie mit Kollagenase kompatibel sind.
Kollagenase spaltet die in Bindegewebe vorhandenen Tripelhelix-Kollagenfasern, wobei sich Fragmente mit einem Gewicht von etwa 600 bis 700 Dalton ergeben. Kollagenase hat eine Spezifität für die Aminosäuresequenz -Pro-X- Gly-Pro-Y, wobei die Spaltung zwischen X und Gly erfolgt. Pro kann durch Hydroxyprolin ersetzt sein, X ist meist neutral, und Y ist unspezifisch. Die Enzymspezifität beruht auf dem wiederholten Vorkommen dieser Sequenzen im Kollagen und dem praktischen Fehlen dieser Sequenzen in anderen Proteinen.
Zusätzlich zu dem hohen Grad an Spezifität, den Kollagenase für Kollagen hat, ist das Enzym in Gegenwart von Ca²&spplus;-Ionen außerordentlich stabil und kann ohne Aktivitätseinbuße lyophilisiert und entwässert bei 4 ºC 5 Jahre lang gelagert werden. Enzymlösungen, die bei -20 ºC hergestellt, portioniert und gelagert werden, bleiben 6 Monate lang stabil, vorausgesetzt sie werden mit einer Mindesthäufigkeit aufgetaut und erneut eingefroren. Kollagenase ist hervorragend stabil bei 4 ºC und 22 ºC, wird jedoch bei Temperaturen über 56 ºC vollständig inaktiviert.
Bei der im Handel erhältlichen Kollagenase gibt es bei den einzelnen Chargen Unterschiede in Enzymaktivität und Reinheit, so daß einige Partien bei der Auflösung von Prostatagewebe wirksamer sind als andere. Handelsübliche Präparate bakterieller Kollagenase enthalten oft geringe Mengen verunreinigender Proteasen, Peptidasen, Mucopolysaccharasen, und Glykosidasen, darunter Clostripain, Trypsin und eine caseinaseähnliche Aminopeptidase. Clostripain ist das häufigste verunreinigende Enzym in rohen Kollagenasepräparaten und enthält eine essentielle SH-Gruppe; es wird durch Cystein inaktiviert und durch sulfhydrylbindende Substanzen gehemmt. Clostripain hat trypsinähnliche Spezifität. Rohe Kollagenasepräparate mit geringen Mengen verunreinigender Enzyme, wie Trypsin und Clostripain, sind oft wirksamer als hochaufgereinigte Kollagenasepräparate, wodurch nahegelegt wird, daß ein mögliches Zusammenwirken von mehreren Enzymen oder Proteasen die Auflösung von Prostatagewebe unterstützt.
Rohe Kollagenasepräparate sind bei der Spaltung von Prostatagewebe esonders hilfreich, wenn sie mit anderen Enzymen, beispielsweise Hyaluronidase, Elastase und Trypsin, kombiniert werden. Nur Kollagenase spaltet die Kollagenbestandteile von Bindegewebsstroma, wodurch der weitere proteolytische Angriff anderer abbauender Enzyme, wie Trypsin, ermöglicht wird. Die extrazelluläre Matrix, die die Zellen zusammenhält, ist ein komplexes Gemisch von Proteinen, Glykoproteinen, Lipiden, Glykolipiden und Mucopolysacchariden. Die Behandlung von Prostatagewebe mit Lösungen von roher bakterieller Kollagenase kombiniert mit Hyaluronidase führt durch das breite Spektrum proteolytischer Aktivitäten, die in derartigen Gemischen gegeben sind, zu einem ausgedehnten Abbau der extrazellulären Matrix der Prostata.
Die Vorteile der Verwendung von Kollagenase zur Auflösung von Prostatagewebe werden teilweise auf deren hohe Spezifität zurückgeführt. Kollagenase kann längere Zeit in höheren Konzentrationen inkubiert werden und eine ausgedehntere Spaltung von kollagenreichen Geweben und Organen bewirken als andere proteolytische Enzyme. Anders als beispielsweise bei dem allgemein wirkenden proteolytischen Enzym Trypsin ist bei Kollagenase keine strenge Kontrolle von Konzentration und Spaltungsdauer erforderlich. Dank ihrer starken zellablösenden Wirkung sind bakterielle Kollagenasen zur Spaltung der kollagenreichen BPH-Knötchen bevorzugt.
Kollagenase spaltet durch Hydrolyse die Stromakollagene I, II, III und die Basalmembrankollagene Typ IV und V. Neben dem Stromakollagen ist die Basalmembran einer der Orte der Kollagenaseaktivität, wenn Prostatagewebe der Kollagenaseeinwirkung ausgesetzt wird. Als Ergebnis davon lösen sich Epithelzellen von den darunterliegenden Stromateilen ab. Es kann beobachtet werden, daß Stromazellen (Fibroblasten) unter Einwirkung von Kollagenase vom Epithel ablösen. Die Zellen sind teilweise im Abbau begriffen, was einen Verlust an Lebensfähigkeit anzeigt. Nicht angegriffene Zellen haben eine saubere Außenhaut. Durch Kollagenaseeinwirkung wird das Kollagen der Lamina propria und des verbleibenden Stroma angegriffen. Kollagenase ist sehr wirkungsvoll bei der Aufspaltung von Stroma- und Drüsenanteilen in einzelne Zellen. Das Drüsengewebe wird weitgehendend von jedem stützenden Stroma abgelöst, wobei die Drüsenstruktur selbst aufbricht, einhergehend mit der interstitiellen Auflösung von Kollagenfaserbündeln. Kollagenase hemmt das Wachstum von Fibroblasten und wirkt bis zu einem gewissen Grad zytotoxisch auf Fibroblasten.
Die aus Clostridium hystolyticum gewonnene bakterielle Kollagenase ist leicht erhältlich und hat vielfältige Anwendung in Labor und Klinik gefunden. Zu den frühen Einsatzgebieten von Kollagenase gehörten Zellablösungstechniken für die Zellkultur, wobei sich gegenüber anderen Enzymen Vorteile beim Gewebeabbau zeigten. Der medizinische Einsatz von Kollagenase ist bekannt, jedoch war er bisher auf örtliche Anwendungen zur Wundtoilette bei Verbrennungen oder Geschwüren, zur Lyse von Bandscheiben und in der Augenchirurgie beschränkt. Die klinische Anwendung von Kollagenase hat in Zentren für die Behandung von Verbrennungen breite Akzeptanz gefunden. Kollagenase hat sich zusammen mit Antibiotika als wirksam bei der Wundtoilette von Verbrennungen und als wundheilungsfördernd, oft ohne Keloidbildung, erwiesen. Kollagenase kann bei der Verhinderung oder der Heilung von Keloiden hilfreich sein. Kollagenase ist in äußerlich anzuwendenden Salben zur Behandlung von Hautgeschwüren verarbeitet worden. Die enzymatische Wundtoilette mit Kollagenase ist klinisch bei nekrotischen Zuständen infolge heißer oder kalter Kauterisation der Zervix eingesetzt worden. Direkte Kollagenaseinjektionen sind eingesetzt worden zur Lyse von Bandscheiben, zur Behandlung der Penisinduration (Peyronie-Krankheit) und als Zusatzmittel bei Kryoprostatektomie zur Entfernung von zurückgebliebenem Kryoschorf.
Kollagenase wirkt als Antigen, jedoch wurde bei äußerlicher Anwendung bei Patienten, die lange Zeit mit Salben auf Kollagenbasis behandelt wurden, keine Auslösung einer Immunreaktion beobachtet. Es ist nachgewiesen worden, daß bakterielle Kollagenasen nicht toxisch sind, obwohl von Clostridium hystolyticum bekannt ist, daß es hochtoxische Endotoxine bildet. Bei Clostridienkollagenase kann vor der Injektion beim Menschen eine Aufreinigung und Endotoxinentfernung erforderlich sein.
Bei Versuchstieren hat sich gezeigt, daß intravenöse Kollagenaseinjektionen ein sehr geringes Risiko bilden. Bei Mäusen wurde für Rohkollagenase eine i.v. LD-50 von 300 mg/kg Körpergewicht nachgewiesen. Orale Lösungen von Kollagenase in Wasser haben sich in Dosen bis zu 8.000 mg/kg Körpergewicht als nichttoxisch erwiesen. Bei Ratten wurde für Kollagenase eine akute i.v. LD-50 von 1272 U/kg nachgewiesen.

B. Hyaluronidase

Hyaluronidase (Hyaluronat-4-glykanhydrolase) ist ein Enzym, das Hyaluronsäure spaltet und aus Mikroorganismen und Säugerhoden isoliert worden ist. Hyaluronidase aus Schafshoden, EC 2.1.1.35, ist bevorzugt. Enzyme mit ähnlichen Eigenschaften wie die testikuläre Hyaluronidase sind in Schlangen- und Bienengift sowie in menschlichem Gewebe und Serum gefunden worden. Hyaluronidase katalysiert den Abbau von Hyaluronsäure (eines sauren Mucopolysaccharids) in Disaccharide, Tetrasaccharide oder ein Gemisch davon. Das Enzym ist ein Glykoprotein, das Chondroitinsulfat A und C hydrolysiert, wodurch hauptsächlich Tetrasaccharide freigesetzt werden. Die Freisetzung von Monosacchariden ist untypisch.
Hyaluronidaseaktivität ist in einem breiten Spektrum von Mikroorganismen und in Säugergeweben und -körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Die Hyaluronidaseaktivität ist zeitlinear, und Enzyme aus unterschiedlichen Gewebequellen können unterschiedliche pH-Optima zeigen. Heparin, Schwermetalle und Polyanionen hemmen Hyaluronidase, während Polykationen Hyaluronidase eher aktivieren.
Testikuläre Hyaluronidase bewirkt die ungeordnete Hydrolyse von 1,4-Verknüpfungen zwischen 2-Acetamido-2-deoxy-b-D-glukose und D-Glukuronatresten der Hyaluronsäure. Zu den Inhibitoren der Hyaluronidaseaktivität gehören: Heparin, Chondroitinsulfat B, Heparinsulfat, Polystyrolsulfonat (kompetitive Inhibitoren), Gallensalze, Farbstoffe, Sulfattenside, Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, Mn²&spplus;, Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, Mg²&spplus; und bestimmte Antikörper. Die testikuläre Hyaluronidase hat ein Molekulargewicht von 55.000 Dalton und benötigen unbedingt Kationen. K&spplus;- und Na&spplus;-Kationen haben eine stärkere Wirkung als Ca²&spplus;-Ionen. Bei Messung bei 280 nm hat eine 1-prozentige Lösung von Hyaluronidase einen Extinktionskoeffizienten von 8. Der optimale pH-Wert für Hyaluronidase liegt zwischen 4,5 und 6, und sie wird mit NaCl stabilisiert.
Hyaluronidase aus Schafshoden bleibt bei Lagerung bei 4 ºC in gefriergetrocknetem Zustand 1 bis 2 Jahre stabil; bei 4 ºC bleibt sie auch in 0,02 M Phosphatpuffer einige Tage stabil. Hyaluronidasepräparate sollten eine Aktivität von mehr als 1000 Einheiten (Units) pro mg Protein zeigen. Bei Erwärmung des Enzyms auf 42 ºC während 60 Minuten wird keine Aktivitätseinbuße beobachtet; nach Erwärmung auf 48 ºC während 30 Minuten wird eine Aktivitätseinbuße von 50 % festgestellt, und nach Erwärmung des Enzyms auf 100 ºC während 5 Minuten wird eine Aktivitätseinbuße von 80 % festgestellt.
Hyaluronidase scheint die Durchlässigkeit der Grundsubstanz von Bindegewebe durch direkte enzymatische Verflüssigung zu erhöhen. Hyaluronidase eignet sich für die Spaltung von Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat in Bindegewebe. Hyaluronidase ist pharmakologisch nicht toxisch, erhöht die Osmose und wird durch Steroide gehemmt.
Hyaluronidase ist ein Enzym aus Säugerhoden. Das Enzym wurde bisher in der Humanmedizin zur Verstärkung der Wirkung von Lokalanästhetika verwendet. Hyaluronidase hydrolysiert den Hyaluronsäureanteil des Bindegewebes, wobei Glykosaminoglykane entstehen. Das Enzym erleichtert die Absorption injizierter Flüssigkeiten und die Resorption von Exsudaten. Hyaluronidase ist zur Begünstigung der Absorption relativ großer subkutan oder intramuskulär applizierter Injektionsvolumina eingesetzt worden. Hyaluronidase ist auch in der Chirurgie äußerlich angewendt worden, um die Ablösung übermäßig stark anhaftender Strukturen durch Schwächung des faserigen Bindegewebes zu unterstützen. Es ist nachgewiesen worden, daß Hyaluronidase das Ausmaß eines Myokardinfarkts verringert, wenn es innerhalb von 8 Stunden nach Auftreten eines Herzanfalls beim Menschen durch intravenöse Injektion einer Menge von jeweils 500 NF-Einheiten Hyaluronidase pro kg Körpergewicht alle 6 Stunden während 48 Stunden verabreicht wird.
Beim Tier führt die intravenöse Injektion von 75.000 internationalen Einheiten Hyaluronidase zu keinen signifikanten Anderungen von Blutdruck, Atmung, Körpertemperatur und Nierenfunktion. Hyaluronidase sollte nicht in Bereichen einer bekannten Infektion injiziert werden. Eine Überempfindlichkeit gegenüber Hyaluronidase ist nicht bekannt. Bei wiederholter Injektion kann Hyaluronidase eine Immunantwort auslösen und zur Bildung spezifischer Antikörper führen, die das Enzym inaktivieren oder sich unter Hervorrufung von Degenerationserscheinungen in den Hoden ansammeln können.
Die Kombination von Hyaluronidase und Kollagenase ergibt eine bevorzugte erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung. Kollagenase aus Clostridium hystolyticum ist bevorzugt; Hyaluronidase aus Schafshoden ist ebenfalls bevorzugt.

C. Weitere Enzyme

Trypsin, beispielsweise EC 3.4.21.4, stammt aus der Bauchspeicheldrüse und wird in inaktiver Form oder als Enzymvorstufe gebildet. Die inaktive Vorstufe von Trypsin wird Trypsinogen genannt und durch geringe Mengen anderer proteolytischer Enzymen aktiviert. Trypsin ist eine Serinprotease, die bei natürlichen und synthetischen Substraten Peptidbrücken hauptsächlich zwischen Lysinund Argininaminosäureresten spaltet. Trysin baut die Proteine der Zellmembran ab, leitet die Zellablösung durch Membranschädigung ein und wird durch eine Vielzahl von Proteinaseinhibitoren gehemmt.
Trypsin zersetzt das kollagene Bindegewebe von Organen nur langsam, da das Enzym geringe oder gar keine Aktivität gegenüber der interzellulären Grundsubstanz zeigt. Typsin kann einen begrenzten Abbau terminaler Bereiche des Kollagenmoleküls fördern, es kann jedoch den Tripelhelixbereich nicht abbauen, der mehr als 95 % des Kollagenmoleküls ausmacht. Daher sind Gewebe, die reich an vernetztem Kollagen sind, nur schwer allein mit Trypsin abzubauen.
Trypsin ist als Therapeutikum zur Wundversorgung, bei nekrotisierenden Geschwüren, Abszessen, Vereiterungen und Fisteln eingesetzt worden. Durch das Vorhandensein von Trypsininhibitoren im Serum wird durch geringe Enzymkonzentrationen lebendes Gewebe normalerweise nicht angegriffen. Das Enzym ist als Salbe sowie als nasser oder trockener Umschlag verwendet worden. Trypsin in Pulverform kann auf Wunden gestreut oder in kleinen Gelatinekapseln in Hohlräume oder Fisteln eingeführt werden. Trypsinlösungen sind als Aerosol zur Auflösung von Sputum bei Bronchialerkrankungen verwendet worden. Ölige Suspensionen von Trypsin sind intramuskulär als entzündungshemmendes Mittel sowie bei der Behandlung von Bronchialasthma, Bronchitis und Thrombophlebitis injiziert worden.
Chymotrypsin, beispielsweise EC 3.4.21.1, stammt aus der Bauchspeicheldrüse und wird als Chymotrypsinogen genannte inaktive Vorstufe gebildet. Die Aktivierung von Chymotrypsinogen kann autolytisch oder durch Einwirkung von Trypsin oder anderer Proteasen erfolgen. Der Aktivierungsmechanismus ist komplex. Chymotrypsin wird durch α-1-Antitrypsin und α-2-Makroglobulin gehemmt. Ein breites Spektrum von Molekülen, einschließlich synthetischer Ester und Amide kann als Substrat für Chymotrypsin fungieren. Die natürlichen Substrate für die Chymotrypsinhydrolyse zeigen bevorzugt die Spaltung von Peptidbindungen an der b-Position der Carbonylgruppe der aromatischen Aminosäuren L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Phenylalanin.
Chymotrypsin ist sowohl oral als auch parenteral zur Verhütung oder Behandlung lokaler und systemischer Entzündungen sowie zur Auflösung von Blutinfiltrationen und Ergüssen eingesetzt worden. Es gibt Belege dafür, daß die Therapie mit diesem proteolytischen Enzym wirksam ist zur Verringerung von Enzündungen, die eine Vielzahl von Ursachen haben können, darunter Brüche, Operationstrauma, Sportverletzungen, unfallbedingtes Weichteiltrauma, Bandschei benverl etzungen und Kataraktoperati onen.
Wärmedenaturiertes Chymotrypsin ist weniger toxisch als das native Enzym. Chymotrypsin wirkt weniger toxisch, wenn es schnell injiziert wird. Es ist von gelegentlichen anaphylaktischen Reaktionen auf Chymotrypsin berichtet worden, und bei Patienten mit Allergievorgeschichte wird ein Haut- oder Kratztest empfohlen.
Pronase, beispielsweise EC 3.4.24.4, ist ein eingetragenes Warenzeichen von Calbiochem/Behring, La Jolla, CA. Pronase ist ein unspezifisches Gemisch mehrerer proteolytischer Enzyme, die von Streptomyces griseus K-1 stammen, einschließlich der neutralen und alkalischen Proteasen, Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen. Die neutralen Proteinasen hydrolysieren Peptidbindungen, die die Aminogruppe von Leucin, Phenylalanin und Tyrosin enthalten. Aktivität und Spezifität der alkalischen Proteasen sind ähnlich wie beim Pankreastrypsin. Aminopeptidase und Carboxypeptidase sind Metalloenzyme, die durch EDTA gehemmt werden. Pronase spaltet Glykoproteine und setzt Glykopeptide bei einem optimalen pH-Wert von etwa 7,5 frei. Pronase ist eine Breitbandprotease, die fast jedes Protein in freie Aminosäuren spaltet.
Die Pankreaselastase, beispielsweise EC 3.4.21.36, ist eine Endopeptidase, die natives Elastin, das elastische, faserige Protein von Bindegewebe, jedoch weder natives Kollagen noch natives Keratin spaltet. Elastase wird durch NaCl und KCl sowie die Proteinaseinhibitoren Elastatinal, α-1-Antitrypsin und α-2- Makroglobulin gehemmt.
Elastasen sind Endopeptidasen (Proteinasen), die Elastin durch proteolytische Spaltung auflösen können. Elastasen kommen in Bauchspeicheldrüse, neutrophilen Zellen, Blutplättchen, Makrophagen, Milz, Aorta, Haut, Schlangengiften und in einigen Mikroorganismen vor. Elastasen aus Makrophagen und Mikroorganismen sind Metalloenzyme; alle anderen Elastasen sind Serinproteasen. Proelastase ist eine inaktive Elastasevorstufe, die durch Trypsin oder Enterokinase aktiviert wird.
Elastase zeigt eine breite Spezifität und kann außer Elastin noch viele andere Proteine spalten. Diese breite Spezifität ergänzt die Aktivität anderer Proteasen, wie Trypsin und Chymotrypsin. Die breite Substratspezifität begünstigt auch die Fähigkeit des Enzyms, Elastin, das ein stark quervernetztes faseriges Protein ist, zu spalten. Trypsin und Chymotrypsin haben eine so schmale Spezifität, daß sie allein nicht in der Lage sind, ausreichend viele Peptidbindungen zu spalten, um die Netzstruktur von Elastin aufzulösen.
Elastase ist eine Serinprotease mit spezifischer hydrolysierender Wirkung auf Elastin zusätzlich zu ihrer unspezifischen hydrolysierenden Wirkung auf verschiedene Amide und Ester. Elastase katalysiert die Hydrolyse von Peptiden (insbesondere an Bindungsstellen neutraler Aminosäurereste), darunter Elastin, denaturiertes Kollagen, fibrin, Albumin, Hämoglobin und Casein. Elastase kann eine Reihe von Bindegewebsbestandteilen spalten, darunter Proteglykane, Fibronectin und Kollagen des Typs III. Elastasen spalten auch fibrinogen und Histone. Durch die breite Substratspezifität und seine Aktivität bei physiologischen pH-Werten hat das Enzym ein hohes Potential, extrazelluläre Schäden zu bewirken.
Dispase, beispielsweise EC 3.4.24.4, eignet sich für die Gewebezersetzung für Zellkulturzwecke. Dispase ist mild (schädigt bei einstündiger Inkubation Zellmembranen nicht) und stabil gegenüber Temperatur, pH-Wert und Einwirkung von Serumbestandteilen. Dispase hat ähnliche Eigenschaften und Substratspezifität wie Thermolysin. Dispase ist zur Zersetzung vieler Arten von Gewebe, darunter Schilddrüsen- und Pankreasgewebe sowie Endothelzellen von Blutgefäßen, verwendet worden.
Desoxyribonuclease, Dnase I, EC 3.1.21.1, ist eine aus der Bauchspeicheldrüse von Rindern gewonnene Endonuclease. Dnase hydrolysiert native, hochpolymere DNA und denaturierte DNA. Dnase hydrolysiert RNA nicht. DNase I greift vorzugsweise die Verknüpfungen zwischen benachbarten Purin- und Pyrimidinnucleotiden an. DNase 1 spaltet die Phosphodiesterbindungen an Pyrimidinnucleotiden und wirkt auf einsträngige DNA, doppelsträngige DNA und Chromatin. Auch wenn Histone die Tendenz haben, die Aktivität von DNase zu hemmen, kann mit der Zeit die gesamte Chromatin-DNA gespalten werden. DNase wird durch Actinomycin D, Ethidiumbromid und EDTA gehemmt. Fluorid-, Citrat-, Arsenat-, Borat- und Selenitionen hemmen die DNase-Aktivität durch ihre fähigkeit, essentielles Mg²&spplus; zu entfernen.
Plasmin, beispielsweise EC 3.4.21.7, ist ein proteolytisches Enzym, das Fibrin abbaut und aus Plasminogen entsteht, wenn dieses durch Streptokinase aktiviert wird. Plasmin wirkt fibrinolytisch und ist in der Thrombosebehandlung, als Zusatzmittel bei der Antikoagulationstherapie und zusammen mit Dnase bei der Wundversorgung eingesetzt worden. Ein Plasminogenaktivator ist eine neutrale Protease, die bei Entzündungsreaktionen von mononuklearen Phagozyten abgesondert wird. Es wird angenommen, daß der Plasminogenaktivator den extrazellulären Proteinabbau durch Makrophagen in Gegenwart von Plasminogen vermittelt.

Tenside

Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung enthält vorzugsweise auch ein nichtionisches Tensid zur Unterstützung der Auflösung und Lyse von Prostatagewebe. Nichtionische Tenside, beispielsweise Alkylphenylpolyoxyethylen- Tenside, haben sich als besonders nützlich erwiesen. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Tensid ist Triton X-100, Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein im Handel erhältliches Octylphenylpolyoxyethylenoxid von Rohm and Haas, Philadelphia, PA.
Lipide sind ein wichtiger Bestandteil von Prostatafluid und -zellen. Phospholipide, Cholesterin und Cephalin stellen den Hauptanteil der Lipide in Prostatasekreten. Die Drüsen- oder Epithelzellen der Prostata sind zuständig für die Synthese eines Großteils des Cholesterins und der Phospholipide, die in Prostatasekreten enthalten sind. Bei BPH ist der Cholesterinwert im Prostatafluid erhöht. Bei Behandlung von Prostatagewebe mit einem milden Tensid werden die Phospholipide von Zellmembranen gelöst und das Cholesterin im Prostatafluid emulgiert. Nichtionische Alkylphenylpolyoxyethylen-Tenside haben sich als besonders wirksam zur Unterstützung der enzymatischen Hydrolyse und Auflösung von Prostatagewebe erwiesen.
Nichtionische Tenside sind Moleküle, die zum Teil hydrophob und zum Teil hydrophil sind, so daß sich ein Mittel ergibt, das die Auflösung von Membranlipiden bewirkt. Die Auflösung von Membranen geht im allgemeinen stufenweise vor sich: Das Tensid wird an die Membran gebunden, die Membran wird aufgelöst, und die Membran wird zu Lipid-Tensid-Protein-Micellen, Lipid- Tensid-Micellen und Protein-Tensid-Micellen solubilisiert. Das Herauslösen von Membranproteinen kann auf jeder der genannten Stufen erfolgen. Einige Proteine werden selektiv herausgelöst, bevor die Membran zusammenbricht und werden hauptsächlich als Protein-Tensid-Komplexe gefunden. Die Tensidwirkung kann durch verschiedene faktoren beeinflußt werden, darunter pH-Wert, Temperatur, Ionenkonzentration und Tensidkonzentration.
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) ist ein nicht-ionisches Tensid aus mit 8 bis 10 Mol Ethylenoxid kondensiertem Octylphenol, dessen chemische Formel C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub2;O(C&sub2;H&sub4;O)n sein soll, wobei n = 8-10. Die Verbindung ist eine leicht trübe, viskose Flüssigkeit, mit Wasser mischbar und hat eine spezifische Dichte von 1,07. Triton X-100 setzt sich aus extrem hydrophoben Molekülen (mit kurzen Polyoxyethylenketten) zusammen, die sich fest an die hydrophoben Bereiche von Proteinen binden. Triton X-100 hat eine Phenylgruppe, die UV-Licht im Bereich von 260 bis 280 nm stark absorbiert. Triton X-100 wird als weitgehend reines, zähflüssiges Tensid geliefert, das zur Verringerung der Verunreinigung durch Peroxid gereinigt worden ist. Die Viskosität nimmt mit abnehmender Temperatur zu, und die Handhabung wird bei weniger als 20 ºC schwierig.
Triton X-100, ein Polyoxyethylenderivat, bricht die Lipiddoppelschicht von Zellmembranen auf und trennt die Lipide von den Membranproteinen. Nichtionische Tenside, wie beispielsweise Triton X-100, verdrängen die Lipide, die sich normalerweise an die hydrophoben Membranproteine anlagern. Die Solubilisierung ist sanft, so daß Strukturuntereinheiten der Membranproteine erhalten bleiben und die Enzymaktivität oder -funktion erhalten bleibt. Das Tensid spaltet im allgemeinen Protein-Protein-Bindungen nicht.
Nichtionische Tenside haben eine Reihe biologischer Anwendungen gefunden und sich als hilfreich bei der Aufrechterhaltung der Funktion perfundierter Organe über begrenzte Zeit erwiesen. Außerdem hat sich gezeigt, daß diese Verbindungen in Gewebekulturen das Zellwachstum fördern, Emulsionen zur intravenösen Verabreichung stabilisieren, die Lagerfähigkeit von Blut verlängern und im extrakorporalen Kreislauffettembolie und Hämolyse verhindern.
Triton X-100 und NP-40 sind milde nichtionische Tenside, die sich als wirksam bei Solubilisierung und Herauslösung lipidhaltiger Kern- und Zellmembranen erwiesen haben. Für Triton X-100 ist bei einem Wirkverhältnis von etwa 2:1 (Tensid : Phospholipid) die vollständige Solubilisierung von Lecithin-Doppelschichten gezeigt worden. für die Herauslösung von Membranproteinen (Bildung von lipidfreien Tensid-Protein-Micellen) können mehr als 10 mg Triton X-100/mg Membranlipid erforderlich sein.
Mit Gewebezersetzungstechniken, bei denen Gewebe in 0,25 % Triton X-100 (in 0,01 M CaCl&sub2;) bzw. 0,05 % Triton X-100 (in 0,05 M Tris; pH=7,5, enthaltend 0,15 M NaCl und 0,01 M CaCl&sub2;) homogenisiert wurden, wurden hochaktive Gewebekollagenasen und PMN-Leukozytenkollagenasen gewonnen. Die Kollagenasegewinnung aus Gewebe wird deutlich verbessert, wenn das Tensid Brij 35 (Polyoxyethylenlaurylether) während des gesamten Reinigungsverfahrens beigegeben ist.
Die Toxizitätswerte von Triton X-100 besagen, daß bei Einnahme ein geringes bis mittleres Risiko besteht, das zu Ohnmacht und Erbrechen führen kann. Das Tensid kann bei empfindlicher Haut eine schwache Reizwirkung haben und bei direktem Kontakt schwerwiegende Augenreizungen hervorrufen, die sich durch Symptome, wie Enzündung, Tränen und möglicherweise einen Hornhautschaden, zeigen. Die LD 50 von Triton X-100 beträgt bei Ratten bei oraler Verabreichung 1800 mg/kg. Die dermale LD 50 bei Kaninchen liegt bei über 3000 mg/kg.
Triton X-100 hat ähnliche Eigenschaften wie eine Reihe anderer Alkylphenylpolyoxyethylen-Tenside, beispielsweise Triton X-114. Viele der nichtionischen Tenside sind Polyoxyethylen- oder Polyoxypropylenderivate und mit verschiedenen Molekulargewichten und unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften erhältlich.
Geeignete milde nichtionische Tenside, die sich als wirksam zur Solubilisierung und Extraktion lipidhaltiger Kern- und Zellmembranen erwiesen haben, sind unter anderem die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Fettsäureestern von Sorbit und Sorbitanhydrid. Diese Tenside sind im Handel als Tween Series (Atlas Chemical) erhältlich; bei ihnen liegt das Molverhältnis von Ethylenoxid zu Alkohol im Bereich von etwa 15:1 bis 25:1, und die Fettsäurekomponente besteht in Laurat, Stearat oder Oleat (C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub0;).
Weitere nichtionische Tenside, die für die erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet werden können, sind zum Beispiel die Ethylenoxidester von C&sub6;-C&sub1;&sub2;- Alkylphenolen, beispielsweise Nonylphenoxypolyoxyethylenether. Besonders nützlich sind die durch Kondensation von 8 bis 12 Mol Ethylenoxid mit Nonylphenol gewonnenen Ester. Im Handel erhältliche Tenside dieser Art sind unter anderem die Igepal CO Series (GAF Corp.).
Weitere brauchbare nichtionische Tenside sind beispielsweise die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Polyoxyalkylenbase, wie Propylenoxid kondensiert mit Propylenglykol. Zu den Verbindungen dieser Art gehören die im Handel erhältlichen Tenside Pluronic F-127, Pluronic PX und Pluronic L-62 (Wyandotte Corp.).
Weitere brauchbare nichtionische Tenside sind beispielsweise die Kondensationsprodukte von C&sub8;-C&sub2;&sub2;-Alkylalkoholen, die 2 bis 50 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol enthalten. Tenside dieser Art sind beispielsweise die Kondensationsprodukte von C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub0; Fettsäure-Alkylalkohole, die 3 bis 45 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol enthalten. Diese Verbindungen sind im Handel als Poly-Tergent SLF Series (Olin Chemicals) oder Tergitol Series (Union Carbide) erhältlich.
Triton X-100 ist ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das als Emulgator, Netzmittel und Tensid wirkt. Weitere Beispiele für handelsübliche nichtionische Tenside auf Polyoxyalkylenbasis sind: Tritonor X-114 (Rohm & Haas), Tween 20/80 (Atlas Chemical), Genapol X-080/100/150, C-100 (Hoechst AG), Thesit (Destin-Werk GmbH), Brij 35, Lubrol PX (ICI Americas), Pluronic F-127 (Wyandotte Chemicals Corp.), Nonidet P-20/40 (Shell Oil Corp.), Igepal CO-630/710 (GAF), Surfonic N-95 (Jefferson), Tergitol NP-27 (Union Carbide).
Tenside werden der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Volumen-% zugesetzt. Stärker bevorzugt ist eine Tensidkonzentration der Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 5 Volumen-%.

Antibiotika

Die direkte Injektion in die Prostata ist im allgemeinen ein sicherer, einfacher und wirksamer Weg, die erfindungsgemäße Zusammensetzung direkt in den vergrößerten Prostatakörper einzubringen, um die Solubilisierung und Rückbildung obstruierenden Prostatagewebes zu erreichen. Durch direkte Injektion in die Prostata wird eine mögliche metabolische Inaktivierung der Enzymanteile der Zusammensetzung vermieden und die Zusammensetzung gleichzeitig unmittelbar an den gewünschten Wirkort gebracht. Die intraprostatischen Injektionstechniken können jedoch mit dem Risiko einer bakteriellen Infektion verbunden sein, die zu Komplikationen, wie fieber nach der Injektion und dem Auftreten von Bakterien in Urin und Blut führen kann.
Prostatainfektionen sind im allgemeinen auf einen der verbreiteten gramnegativen Erreger von Harnwegserkrankungen zurückzuführen, wobei die Therapie von der Antibiotikaempfindlichkeit des infizierenden Bakterienstammes bestimmt wird. Zu den Verursacherorganismen der bakteriellen Prostatitis gehören: Escherichia coli; Spezies Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia; und andere weniger verbreitete gramnegative Organismen. Die meisten Prostatainfektionen werden durch einen einzigen Krankheitserreger ausgelöst, gelegentlich kommen jedoch auch Infektionen vor, an denen zwei oder mehr Bakterienstämme beteiligt sind. Die häufigste Ursache der bakteriellen Prostatitis sind gramnegative coliforme Bakterien.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung sollte bevorzugt ein antibakterielles Mittel enthalten, um das mit der gewählten Injektionsmethode verbundene Risiko einer bakteriellen Infektion auszuschalten oder zu verringern. Die verwendeten Antibiotika sollten angemessenen Schutz vor den verbreiteten Bakterienstämmen der Erreger von Harnwegserkrankungen bieten, z.B. vor Escherichia coli, Streptococcus faecalis, spp. Proteus/Pseudomonas und dem koagulasepositiven Staphylococcus. Das gewählte Antibiotikum sollte die Enzymaktivität der Zusammensetzung nicht wesentlich hemmen.
Im Handel erhältliches Gentamicinsulfat (Garamicin ) von Schering Corp. (Kenilworth, NJ) und im Handel erhältliches Trimethoprim/Sulfamethoxazol (Septra ) von Burroughs Wellcome (Research Triangle Park, NC) weisen das geeignete Aktivitätsspektrum gegen die Harnwegsinfektionen verursachenden Bakterien auf, ohne dabei die Aktivität von Kollagenase und Hyaluronidase zu beeinträchtigen oder zu hemmen, und sind daher bevorzugt. Garamicin ist ein wasserlösliches Aminoglykosid, das gegen ein breites Spektrum gramnegativer und grampositiver Bakterien wirkt, darunter gegen Escherichia coli, Proteus (indolpositiv und indolnegativ), Pseudomonas aeruginosa, Arten der Klebsiella/Enterobacter/Serratia-Gruppe, Citrobacter und Staphylococcus (einschl ießlich penicillin- und methicillinresistener Stämme). Septra ist angezeigt zur Behandlung von Harnwegsinfektionen durch darauf ansprechende Stämme folgender Organismen: Escherichia coli, Klebsiella-Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris und Proteus morganii.
Gentamicin hat sich als zweckmäßig zur Prophylaxe bakterieller Infektionen bei Prostatektomie-Patienten erwiesen. Zur Vorbeugung gegen eine nach der Operation auftretende Bakteriurie am wirksamsten war eine einmalige, zwei Stunden vor der Operation intramuskulär verabreichte Dosis Gentamicin (3 bis 5 mg/kg). Die Therapie mit einer Einmaldosis ist billiger, macht etwaige Probleme mit Superinfektionen, resistenten Stämmen und Toxizität weniger wahrscheinlich. Außerdem ist gezeigt worden, daß im Gegensatz zur Langzeitbehandlung die Kurzzeitprophylaxe die normale Darmflora nicht verändert. Andere prophylaktisch in einer Einzeldosis vor der Operation verabreichte Antibiotika können gleich wirksam sein.
Trimethoprim ist eine fettlösliche Base mit beschränkter Bindung an Plasmaproteine; typischerweise zeigt Prostatagewebe Serumwerte von 2:1 bis 3:1. Trimethoprim/Sulfamethoxazol (TMP/SMX) bildet therapeutische Konzentrationen im Urin und in den Prostatasekreten mit einem geeigneten antibakteriellen Wirksamkeitsspektrum. Die empfohlene Therapie mit TMP/SMX sieht Dosen von 160 mg TMP und 800 mg SMX oral zweimal täglich während 30 Tagen vor. Bei Unverträglichkeit von TMP/SMX (Allergien) wird die Gentamicintherapie empfohlen.
Im allgemeinen ist das Antibiotikum in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,15 bis 150 ug/ml enthalten. Das bevorzugte Antibiotikum - Gentamicinsulfat - ist in der Zusammensetzung in einer Konzentration von 1,5 bis 150 ug/ml und vorzugsweise von 10 bis 25 ug/ml enthalten. Bei Patienten, die gegen Aminoglykoside im allgemeinen und Gentamicin im besonderen allergisch sind, kann das Kombinationspräparat Trimethoprim/Sulfamethoxazol Gentamicin als bevorzugtes Antibiotikum in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ersetzen. Trimethoprim ist vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 10 ug/ml und stärker bevorzugt in einer Konzentration von 5 bis 10 ug/ml enthalten. Sulfamethoxazol ist vorzugsweise in einer Konzentration von 30 bis 105 ug/ml und stärker bevorzugt in einer Konzentration von 50 bis 105 ug/ml enthalten.
Im allgemeinen beseitigen Antibiotika die Symptome einer akuten Prostatainfektion sofort. Allerdings ist kein Antibiotikum gegen alle mikrobiellen Erreger von Harnwegsinfektionen wirksam. Jedes hat ein Wirkungsspektrum gegen eine oder mehrere Spezies. Die besten Therapeutika zur Behandlung bakterieller Prostatitis sind von hoher Fettlöslichkeit, besitzen eine basische pKa, binden sich nur minimal an Plasmaproteine und wirken bakterizid gegen die verbreiteten gramnegativen Erreger von Harnwegserkrankungen.
Viele Antibiotika sind nur von begrenztem Wert zur Behandlung chronischer Prostatainfektionen. Ihre relative Unwirksamkeit kann teilweise durch das schlechte Vordringen der meisten Antibiotika zur Prostata bedingt sein, weil der vornehmlich niedrige pH-Wert der Prostata die Löslichkeit dieser Mittel beeinträchtigt. Berichte über bemerkenswerte erfolge bei der Heilung der bakteriellen Prostatitis jedoch beziehen sich auf die direkte Injektion von Antibiotika in die Prostata. Fast alle Fälle chronischer bakterieller Prostatitis können durch direkte Injektion geheilt werden, wenn die Injektionen regelmäßig wiederholt werden.
Zu den verschiedenen Antibiotika, die sich als wirksam gegen die verbreiteten Erreger von Harnwegsinfektionen erwiesen haben, gehören: Gentamicin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol, Nitrofurantoin, Nalidixinsäure, Tobramycin, Amikacin und Netilmicinsulfat. Das Mittel der Wahl zur Behandlung der bakteriellen Prostatitis ist derzeit das Kombinationspräparat Trimethoprim/Sulfamethoxazol. Jüngste Studien haben ergeben, daß eine Einmaldosis Gentamicin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol odr Netilmicinsulfat zur Prävention von nach Operationen auftretenden bakteriellen Harnwegsinfektionen ebenso wirksam ist wie eine längere Behandlung.
Die bevorzugten Antibiotika der erfindungsgemäßen Zusammensetzung - Gentamicin oder Trimethoprim/Sulfamethoxazol - können ausgewählt werden aus den Gruppen von Antibiotika, die ein geeignetes Wirkungsspektrum gegen die verbreiteten Bakterienstämme der Erreger von Harnwegsinfektionen aufweisen, beispielsweise Penicilline (Penicillin G, Penicillin V, Benzathin-Penicillin); Aminopenicilline (Ampicillin, Amoxicillin); Carboxypenicilline (Carbenicillin, Piperacillin, Mezlocillin); penicillinaseresistente Penicilline (Methicillin, Oxacillin, Nafcillin); Cephalosporine (Cephalexin, Cephalothin, Cefotaxim, Cephazolin); Aminoglykoside (Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin, Sisomicin); Tetracycline (Doxycyclin, Minocyclin, Tetracyclin), Polymyxine (Polymyxin B und E); Sulfonamide (Sulfisoxazol, Sulfasuxidin); Fluorchinolone (Ciprofloxacin, Norfloxacin); basische Makrolide (Erythromycin, Oleandomycin); Lincomycin; Clindamycin; Chloramphenicol; Nitrofurantoin; und Nalidixinsäure.

Verabreichungsart

Die Erfindung offenbart eine wäßrige, parenterale Zusammensetzung, die in einer der bevorzugten Ausführungsformen eine therapeutisch wirksame Menge der Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase, das Tensid Triton X-100 und das Antibiotikum Gentamicin enthält. Die Zusammensetzung ist geeignet zur Verabreichung durch direkte intraprostatische Injektion und enthält eine therapeutisch wirksame Menge der offenbarten Zusammensetzung und lindert die mit BPH einhergehenden Obstruktionssymptome. Die intraprostatischen Injektionen werden mit einer langen, dünnen Nadel vorgenommen, die unter digitaler rektaler Kontrolle und/oder unter Ultraschallkontrolle in die Prostata eingeführt wird. Die Injektionen werden normalerweise mit örtlicher Betäubung vorgenommen. Die Injektionslösung kann mit Lidocain verdünnt werden. Während der Injektion kann die Nadel häufig verlagert werden, um eine bestmögliche Verteilung der Zusammensetzung zu erreichen. Es gibt mehrere Injektionswege für die Einführug der offenbarten Zusammensetzung in die Prostata.
Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die transurethrale intraprostatische (intraläsionale) Injektion. Unmittelbar vor der transurethralen Verabreichung wird eine Katheterisierung vorgenommen. Die typischerweise injizierte Menge der Zusammensetzung liegt zwischen 1 und 20 cm³/Lappen. Um die auflösende Wirkung der injizierten Zusammensetzung zu optimieren, kann es wünschenswert sein, den von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitt mit einem aufblasbaren Ballon zu weiten. Der durch das Zystoskop eingeführte Ballon wirkt dem sofortigen Ausfließen der injizierten Enzymlösung durch das in die Urethra entleerende poröse Gangsystem entgegen. Das Aufblasen des Ballons kann auch ein physikalisches Mittel sein, die Einengung durch die Prostata zu lindern und die Umformung des aufweichenden, sich auflösenden Prostatagewebes zu unterstützen. Der Vorteil dieses Injektionswegs liegt darin, daß die krankhaft veränderten Knötchenbereiche durch das Zystoskop unmittelbar besichtigt werden können und daß eine hohe Konzentration der Zusammensetzung ohne das Risiko einer metabolitischen Inaktivierung an den gewünschten Wirkort gebracht werden kann. Während der direkten Injektion in die Prostata empfindet der Patient typischerweise nur minimalen Schmerz und minimal es Unbehagen, vergleichbar der Empfindung bei intramuskulären Injektionen.
Alternativ kann die Prostatainjektion transperineal oder transrektal erfolgen. Bei transperinealem Injektionsweg wird eine Aspirations-Biopsienadel (22 g x 20 cm) unter Ultraschallkontrolle und/oder digitaler Tastkontrolle durch das Perineum in die Prostata eingeführt. Typischerweise werden ebenfalls 1 bis 20 cm³ der offenbarten Zusammensetzung in jeden Seitenlappen der Prostata injiziert. Die Injektionen werden normalerweise bei örtlicher Betäubung vorgenommen. Während der Injektion wird die Nadel häufig verlagert, um eine bestmögliche Verteilung der Zusammensetzung zu ereichen. Die Position der Nadel kann über Ultraschall geführt werden, während eine ständige digitale Kontrolle durch das Rektum vorgenommen wird. Im Hinblick auf eine Reduzierung des Komplikationsrisikos durch bakterielle Infektion nach der Injektion kann der transperineale Injektionsweg günstiger sein als der transurethrale und der transrektale Injektionsweg.
Zur Reduzierung des Risikos einer bakteriellen Infektion bei transperinealer intraprostatischer Injektion werden aseptische Injektionstechniken empfohlen, die dem Fachmann bekannt sind. Für einen geeigneten antibakteriellen Schutz vor der Injektion steht eine große Auswahl bakterizider Standardpräparate, wie Phiso-Hex , Betadine , Povidoneiod oder Chlorhexidin, zum Auftragen auf die Haut des Perineum zur Verfügung. Bei sterilem Urin, angemessener Hautvorbereitung und steriler Technik sollte es bei der gesamten Prozedur nur in wenigen Fällen zu Komplikationen durch eine Infektion kommen.
Bei transrektalem Injektionsweg erfolgt die Injektion in die Prostata, nachdem die Nadel unter digitaler rektaler Kontrolle durch die Rektumwand eingeführt worden ist. Bei transrektaler Injektion wird eine leicht gebogene, flexible Aspirations-Biopsienadel (22 g x 20 cm) verwendet. Bei Verwendung einer Franzen-Nadelführung (Precision Dynamics, San Fernando, CA) kann die Nadel sicher unter Ultraschall- und/oder Tastkontrolle in eine vermutete Läsion eingeführt werden. Die sterilisierte Prostatanadelführung wird auf den behandschuhten Zeigefinger aufgesetzt. Über die Nadelführung wird ein Fingerling gestülpt. Zeigefinger und Nadelführung werden in das Rektum eingeführt, und vermutete Prostataläsionen werden abgetastet. Die Nadel wird durch die Führung eingeführt und in das Gewebe geschoben. Etwa 1 bis 20 cm³ der Lösung können in die seitlichen Lappen der Prostata injiziert werden. Um ausreichend viel Material zu injizieren, kann die Nadel drei- bis viermal zurück- und vorbewegt werden. Vor der Injektion kann ein anaestisierendes Gel aufgetragen werden, um den Schmerz beim Einstechen der Nadel zu verringern.
Bei der Injektion schwillt der Prostatalappen an, vergrößert sich und bläht sich. Das am Injektionsort durch die Venen gedrückte injizierte Fluid kann in einem großen Bereich zu mit Mikroinfarkten einhergehenden Venenkrämpfen führen. Unmittelbar nach der Injektion kann es eine Zeitlang zu akutem Harnverhalten kommen. Das in die Prostata injizierte Fluid füllt die Drüsenalveoli an der Injektionsstelle und kann durch die Wände benachbarter Alveoli durchbrechen und über die Alveolargänge in den von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitt gelangen. Bis zu einem Drittel oder der Hälfte des injizierten fluids kann schließlich in den von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitt gelangen.
Eine Bolusinjektion von mehr als 5 cm³ der Zusammensetzung in den Prostatakörper in situ kann zu einer reflektorischen Kontraktion glatter Muskeln führen, was eine rasche Entleerung der therapeutischen Enzymlösung durch die porösen Gänge weg vom Zielgewebe in die Harnröhre bewirkt. Der Injektionsdruck kann an der Injektionsstelle einen Riß im Prostatagewebe bewirken. Das injizierte Fluid kann in die Alveolargänge der Drüse gelangen und die Drüse vollständig füllen. Wenn die Drüse gefüllt ist, nimmt die Flüssigkeit den Weg des geringsten Widerstands und fließt in die Harnröhre.
Injektionsflüssigkeit kann in den Blutkreislauf der Prostata gelangen und verstreute kleine Infarktbereiche verursachen. Eine enzyminduzierte Thrombophlebitis kann zu weitverteilten hämorrhagischen Infarkten führen. Wie bei Versuchen gezeigt, kann etwa 1/5 der in die Prostata injizierten Flüssigkeit in den allgemeinen Blutkreislauf gelangen, was mit der Ausscheidung von Methylenblau über die Nieren verbunden ist. Die subkapsulären und die periurethralen Bereiche der Prostata sind gefäßreicher und können den Fluß der Flüssigkeit in den Blutstrom verstärken. Die Injektion von chinesischer Tusche mit Kohlenstoffteilchen in die Prostata ergab keine mit bloßem Auge oder unter dem Mikroskop sichtbaren Teilchen in den Beckenlymphgefäßen. Prostatainjektionsflüssigkeit kann durch die Nadeleinstichstelle auch die Oberfläche der Prostata und das die Prostata umgebende Gewebe erreichen. Unmittelbar nach der intraprostatischen Injektion von röntgenstrahlundurchlässigen Mikroemulsionen von Bariumsulfat gemachte Röntgenaufnahmen haben unterhalb der Prostatakapsel einen Flüssigkeitsaustritt mit Abfluß in die Blase gezeigt. Gelegentlich ist auch ein Austritt der Flüssigkeit aus der Kapsel beobachtet worden.
Der Prostatalappen, in den die Injektion erfolgt ist, nekrotisiert hauptsächlich durch die Einwirkung der Enzyme der injizierten Zusammensetzung und zum Teil aufgrund der Scherkraft der unter Druck injizierten Flüssigkeit. Ein Teil der flüssigkeit, die durch die Nadeleinstichstelle zurückfließt, kann zur Thrombose von oberflächlichen Gefäßen und zu Verklebungen mit benachbartem Eingeweide führen. Die Menge der zurückfließenden Flüssigkeit ist abhängig vom örtlichen Druck und nimmt oft mit dem Injektionsdruck zu. Injektionsflüssigkeit, die durch die periurethralen Venen fließt, kann Venenentzündungen und -thrombosen auslösen, die ihrerseits zu Nekrose und zu Schorfbildung am Harnröhrenepithel führen können.
Um den gesamten Umfang des von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitts herum ist eine urethrale und periurethrale Solubilisierung zu erwarten, was zur Freilegung des Harnröhrenepithels führen kann. Gewebspathologische Veränderungen im Zusammenhang mit einer Injektion gewebeauflösender Enzyme schließen Veränderungen durch den Flüssigkeitsaustritt durch Drüsengänge hindurch ein, wobei die Gänge und die umgebenden Alveoli geschädigt werden. Die durch die Nadeleinstichstelle zurückfließende Flüssigkeit kann Kapselgefäße und fibromuskuläres Stroma glatter Muskeln, die sich an dieser Stelle befinden, schädigen.
Die direkte lokale Injektion in die Prostata führt ohne das Risiko einer metabolischen Inaktivierung zu einer hohen Konzentration therapeutischer Enzyme im Kern des Problems. Während akuter Infektionsphasen jedoch sind wegen der Gefahr einer generalisierten Infektion und einer Sepsis intraprostatische Injektionen nicht zu empfehlen. Nach der Injektion kann einige Wochen lang Blut im Urin und im Sperma auftreten.
Je nach dem jeweils behandelten Patienten kann die therapeutisch wirksame verabreichte Dosis der Zusammensetzung im Bereich zwischen 1 und 20 cm³ liegen und 160 bis 160.000 U/ml Hyaluronidase, 250 bis 250.000 U/ml Kollagenase, 0,1 bis 10 % Triton X-100 und 1,5 bis 150 ug/ml Gentamicin enthalten. In diesen Dosisbereichen sind Mengen der verschiedenen Bestandteile der Zusammensetzung gegeben, die als therapeutisch wirksam zur Linderung der mit benigner Prostatahypertrophie einhergehenden Obstruktionssymptome angesehen werden. Die Dosis der Zusammensetzung kann jedoch in Abhängigkeit von Alter des Patienten, Art und Schwere der Erkrankung, Potenz der Zusammensetzung und Verabreichungsweg unterschiedlich sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sieht die Behandlungsform die intraprostatische Injektion sicherer und wirksamer Mengen der bevorzugten Zusammensetzung vor, um die Solubilisierung und Rückbildung des obstruierenden Prostatagewebes zu bewirken. Die Injektionen können nach täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Injektionsprotokollen verabreicht werden, bis der gewünschte Therapieerfolg erreicht ist.

Andere Verabreichungsarten

Wenn Probleme auftreten, die die therapeutischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung einschränken oder behindern, können andere Darreichungsformen verwendet werden. Beispielsweise kann die Wirksamkeit einer Enzymtherapie durch die kurze Halbwertszeit von außen verabreichter Enzyme im Kreislauf, durch die Entwicklung einer Immunantwort auf Fremdprotein, durch Inhibierung durch Antiproteinaseeffektoren (α-1-Antitrypsin, α-2-Makroglobulin) oder durch die Unmöglichkeit, die Enzyme unmittelbar in die pathologisch veränderten Knötchenbereiche einzubringen, eingeschränkt werden.
Es kann eine Reihe unterschiedlicher Trägersystem verwendet werden, um die Enzymzusammensetzung an den gewünschten Ort in der Prostata zu bringen. Im allgemeinen sollte ein geeigneter Träger das Therapeutikum ohne Spezifitätsoder Reaktivitätseinbuße zum Ziel bringen. Der Träger ist vorzugsweise in der Lage, Verknüpfungen mit den therapeutischen Enzymen herzustellen und als Komplex erhalten zu bleiben, bis die Darreichung abgeschlossen ist. Vorzugsweise vermeidet der Träger die Auslösung der Immunabwehr, die zum Abbau oder zur Inaktivierung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung führt.
Die Zusammensetzung kann als Depotpräparat verabreicht werden, so daß eine kontinuierliche Abgabe ermöglicht, der Zugang zum Allgemeinkreislauf verhindert und die prostataspezifische Lokalisierung der Zusammensetzung erhöht werden. Das Depotpräparat ist als Implantat mit langsamer Freisetzung, in Mikroverkapselung oder an ein biologisch abbaubares Polymer oder ein prostataspezifisches Immunglobulin gebunden verfügbar.
Die Verwendung von Antikörpern als Trägersystem für die Enzymzusammensetzung kann wünschenswert sein. Die Verwendung von Antikörpern als Trägersystem für den Transport der Arzneiwirkstoffe zu bestimmten Geweben nutzt die einzigartige fähigkeit von Antikörpern, Zielantigene zu erkennen und sich daran zu binden. Außerdem können Antikörper, die Arzneiwirkstoffe tragen, wirksamer in Gewebe eingebracht werden, die an sich schon gefäßreich sind oder eine Neubildung von Gefäßen erfahren. Außerdem können Cocktails von Immunkörper- Enzym-Konjugaten, die unterschiedliche Zelltypen mit unterschiedlicher Spezifität erkennen, hilfreich sein.
Es können gewebespezifische monoklonale Antikörper hergestellt werden, die die anzusteuernden Antigen-Zielzellen besser definieren. Die Lokalisierungseigenschaften können durch Verwendung von F(ab)- oder F(ab')²-Fragmenten verbessert werden. Antikörper, die das F(c)-Fragment enthalten, bleiben eher über einen längeren Zeitraum spezifisch lokalisiert als F(ab)- oder F(ab')²- Fragmente, die einen beschleunigten Clearance-Mechanismus zeigen. Die jüngste Entwicklung monoklonaler Antikörper aus einer Mensch-Maus-Chimäre könnten in der Therapie eingesetzt werden und Vorteile gegenüber herkömmlichen monoklonalen Antikörpern von Mäusen oder Ratten. Mensch-Maus-Antikörper haben ein breites Spektrum und einen hohen Grad an Spezifität. Die Auslösung einer Immunantwort ist bei Chimärenantikörpern, die dem Menschen injiziert werden, weniger wahrscheinlich als bei herkömmlichen monoklonalen Antikörpern der Maus. Herstellung und Einsatz menschlicher monoklonaler Antikörper als Träger kann das Ausmaß der Immunantwort des Empfängers auf Fremdeiweiß weiter reduzieren. Die Antiglobulinantwort kann auch durch Faktoren, wie Art der Antikörperherstellung, Dosierung und Injektionsweg, beeinflußt werden.
Ziel der immungerichteten Enzymtherapie ist es, eine wirksame Konzentration von Enzymen an einen gewebespezifischen Wirkort zu bringen, die Toxizität gegenüber benachbarten gesunden Geweben zu verringern und damit den therapeutischen Index zu vergrößern. Enzyme können an monoklonale Antikörper gekuppelt werden, die das Enzym kovalent binden, jedoch die katalytische Aktivität des Enzyms nicht beeinträchtigen. An gewebespezifische monoklonale Antikörper gekuppelte Enzyme können bei Beibehaltung ihrer proteolytischen Aktivität einen höheren Grad spezifischer Lokalisierung im Zielgewebe erreichen als native Enzyme.
Andere Konzepte zur spezifischen Lokalisierung sehen Vorstufen-Antikörper- Konjugate (Trypsinogen) oder Enzym-Antikörper-Konjugate (Kollagenase, Hyaluronidase, Elastase, DNase) vor, die sowohl die Enzym- als auch die Antikörperaktivität behalten. Enzyme können in Lipoproteine, Erythrozytenstroma, Polymilchsäure und andere biologisch abbaubare Membranen oder synthetische Mikrokapseln, die prostataspezifische Antikörper enthalten verkapselt werden, um spezifische Ziel suche, Lokalisierung und Aktivität der auflösenden Proteasen im Prostatagewebe zu verbessern und aufrechtzuerhalten.
Die Verabreichung von Kollagenase und Hyalurondiase kann immunologische Folgen haben, da wiederholte Injektionen zur Entwicklung von Antikörpertitern mit dem damit verbundenen Anaphylaxierisiko oder zu anderen weniger schwerwiegenden Überempfindlichkeitsreaktionen führen können. Außerdem kann die Gegenwart spezifischer Antikörper für Kollagenase oder Hyaluronidase die Enzymaktivität hemmen. Immunprobleme könnten auftreten, wenn das aktive Enzym vom Immunsystem des Empfängers als fremd erkannt wird. Es können Antikörper gegen die Enzyme gebildet werden, die die Enzyme inaktivieren oder ausfällen. Die Verwendung menschlicher Enzyme oder von gentechnisch hergestellten Enzymen können diese möglichen Immunkomplikationen minimieren.
Strategien zur Umgehung des Immunsystems sehen den Einschluß von Enzympräparaten in biologisch abbaubare Vesikel vor, die die Enzymaktivität schützen, jedoch die spezifische Einbringung erleichtern. Das zielgerichtete Einbringen in bestimmte pathologisch veränderte Zellbereiche kann durch Anhängen gewebespezifischer Proteine (monoklonaler Antikörper) an diese Vesikel erreicht werden. Enzyme können auch in Liposomen oder sonstigen biologisch abbaubaren Mikrokapseln verkapselt und anschließlich an gewebespezifische monoklonale Antikörper zum Zweck spezifischer Lokalisierung angehängt werden.
Liposomen sind kleine Kugeln aus zwei konzentrischen Phospholipidschichten, die eine wäßrige Phase enthalten und sich als geeignete Trägersysteme erwiesen haben. Die derzeitigen Techniken zur Herstellung von Liposomen erlauben den Einschluß einer Reihe von Arzneistoffen, Hormonen oder Enzymen in beide Phasen. Monoklonale Antikörper können in die äußere Schicht von Liposomen eingebracht werden und liefern die erhöhte Einbringungsspezifität des im Liposom enthaltenen Therapeutikums.
Der Einschluß von Enzymen in synthetischen Mikrokapseln oder biologisch abbaubaren Vesikeln kann ein wertvolles Verfahren zur spezifischen Einbringung bei gleichzeitigem Schutz der Enzyme vor physiologischer Inaktivierung und Verhinderung von Immunkomplikationen sein. Für den Einschluß von Enzymen stehen verschiedene Membranverkapselungstechniken zur Verfügung, zum Beispiel: Erythrocytenstroma, synthetische Polymer-Mikrokapseln und Lipidvesikel (Liposomen) aus Cholesterin, Lecithin und Phosphatidsäure. Die Verwendung der empfängereigenen Erythrocyten zur Einbringung aktiver Enzyme kann mögliche Immunprobleme und physiologische Probleme verhindern, die sich bei Verabreichung der Enzyme in synthetischen Trägern (Liposomen, Mikrokapseln) ergeben.
Die kovalente Bindung von Polyethylenglykol (PEG) an Enzyme macht diese Proteine nicht-immunisierend, kann ihre Halbwertszeit im Kreislauf verlängern, ein Mittel sein, der Hemmung durch natürlich vorkommende Enzyminhibitoren zu entgehen, und zu einer verbesserten Enzymaktivität bei verringerter Autolyse führen. Das Anhängen von PEG an Proteine ist einfach und ergibt homogene Reaktionsprodukte, die durch Ultrafiltration gereinigt werden können.

Herstellung und Prüfung der Zusammensetzung

Die vorliegende Erfindung offenbart als bevorzugte Ausführungsform eine wäßrige Zusammensetzung, die eine sichere und therapeutisch wirksame Konzentration der hydrolytischen Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase, das Tensid Triton X-100 und das Antibiotikum Gentamicin enthält, zur direkten Injektion in die hyperplastischen Knötchen, die sich bei gutartiger Prostatahypertrophie bilden. Bevorzugt ist die Herstellung der offenbarten Zusammensetzung als relativ konzentrierte Lösung hydrolytischer Enzyme mit relativ kleinem Volumen. Kleine Mengen sicherer und wirksamer Konzentrationen hydrolytischer Enzyme sind leichter zu applizieren und bauen die pathologischen BPH-Läsionen mit der Zeit wirksamer ab als große Mengen relativ stark verdünnter Lösungen.
Bevorzugt ist die Bereitstellung der beanspruchten Zusammensetzung in form einer Dosiseinheit, die für die intraprostatische Injektion geeignet ist. Die Zusammensetzung kann dem Patienten als injizierbare Dosis einer Lösung oder Suspension der Inhaltsstoffe in einem physiologisch verträglichen flüssigen Verdünnungsmittel, beispielsweise pyrogenfreier Salzlösung, verabreicht werden. Beispielsweise können Ampullen mit einem Lyophilisat der Zusammensetzung so hergestellt werden, daß eine sterile Teilmenge der Zusammensetzung gebildet und als pharmazeutisch akzeptable wäßrige Lösung zur Injektion in lebende Säuger abgezogen werden kann. Die für die therapeutische Wirkung der Zusammensetzung bei BPH-Patienten erforderliche Dosis kann zwischen 1 und 20 cm³ liegen. Eine bevorzugte Dosiseinheit enthält 250 bis 250.000 U/ml Kollagenase, 160 bis 160.000 U/ml Hyaluronidase (U = units), 0,1 bis 10 % nicht-ionisches Tensid und 0,15 bis 150 ug/ml Antibiotikum; am stärksten bevorzugt ist eine Dosiseinheit, die 2.500 bis 25.000 U/ml Kollagenase und 1.600 bis 16.000 U/ml Hyaluronidase, 0,5 bis 5 % nicht-ionisches Tensid und 15 bis 150 ug/ml Antibiotikum enthält.
Es wurden erfindungsgemäße Zusammensetzungen hergestellt. Kollagenase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Hyaluronidase (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) wurden als Lyophilisate bezogen und mit citratgepufferter Salzlösung, die 20 mM CaCl&sub2; enthielt, in der gewünschten Konzentration rekonstituiert. Aus Clostridium hystolyticum gewonnene Kollagenase wurde chromatigraphisch gereinigt und enthielt eine geringe Menge von Verunreinigungen durch die Enzyme Clostripain, Trypsin und Caseinase. Aus Schafshoden gewonnene Hyaluronidase wurde ebenfalls chromatographisch gereinigt. Die gesamte Enzymaktivität wurde in internationalen Einheiten pro mg ausgedrückt.
Die Enzyme sind stabil, wenn sie in Lyophilisatform bei 4 ºC gelagert werden. Das Eindringen von Feuchtigkeit in die lyophilisierten Enzyme sollte jedoch verhindert werden. Beispielsweise sollten kalte Ampullen mit lyophilisierten Enzymen vor dem Öffnen erst auf Zimmertemperatur erwärmt werden. Rekonstituierte verdünnte Enzymlösungen sollten bei 4 ºC lichtgeschützt gelagert werden; sie sollten bei der Arbeit am Arbeitstisch in ein Eisbad gegeben werden.
Frisch destilliertes, demineralisiertes, steriles Wasser ist zur Rekonstitution von Enzymen und zur Herstellung von Puffern für Injektionslösungen bevorzugt. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird als Pufferlösung 0,05 M citratgepufferte Salzlösung (CBS, pH=6,7) verwendet, die eine geeignete Menge (vorzugsweise 0,01 M bis 0,05 M, mehr bevorzugt 0,02 M bis 0,05 M) Cal-ciumionen zur Aktivierung der Kollagenase enthält. Es wird bestätigt, daß jede geeignete Pufferlösung, wie beispielsweise Ringer-Lösung oder Tris-gepufferte Ringer-Lösung, verwendet werden kann. Der Puffer sollte jedoch ausreichend viele Calciumionen zur Aktivierung der Kollagenase, aber keine Calciumchelatbildner, wie EDTA, oder sonstige Inhibitoren von Enzymaktivität, wie Cystein, enthalten.
Der bevorzugte Puffer sollte einen physiologischen pH-Wert im Bereich von etwa 6,5 bis 7,5 haben, wobei ein pH-Wert von 6,7 bis 7,0 bevorzugt ist. Die Konzentration von Salz, z.B. Natriumchlorid, liegt bevorzugt bei etwa 0,1 M bis 0,2 M, wobei etwa 0,15 M bis 0,2 M am meisten bevorzugt ist.
Ein Ansatz von 0,05 M CBS + 20 mM CaCl&sub2; (pH=6,7) setzt sich aus 550 mg Natriumcitrat, 190 mg NaOH und 876 mg NaCl, gelöst in 100 ml sterilem pyrogenfreiem, entmineralisiertem H&sub2;O. Die Lösung wurde mit 3 ml 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 6,7 eingestellt, und es wurden 294 mg CaCl&sub2; zugegeben. Zur Erreichung geeigneter fertiger Konzentrationen wurden das Tensid Triton X-100 (Malinckrodt, Paris, Kentucky) und das Antibiotikum Gentamicin (Sigma Chemical Co.) zugegeben. Triton X-100 hat eine Dichte von 1,082 g/ml bei 20 ºC (924 ul/g bei 20 ºC). Gentamicin wird zur Erreichung einer Endkonzentration von 150 ug/ml zugegeben, indem 1,5 ml einer sterilen Lösung (10 mg/ml) (15 mg) des Antibiotikums zu 100 ml des Gemischs hinzugegeben werden.
Die sich ergebende Lösung wird mit üblichen Techniken gereinigt und sterilisiert. Eine Lösung (5 ml) der Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase (0,1 bis 10 %) in citratgepufferter Salzlösung (pH=6,7), die Triton X-100 (0,1 bis 10 %), das Antibiotikum Gentamicin (1,5 bis 150 g/ml) und CaCl&sub2; (20 mM) enthält, wird in pyrogenfreiem Wasser hergestellt und über eine 1-ml-Säule (Detoxi-Gel ) geleitet, um mögliche Endotoxine zu entfernen. Der letzte Schritt bei der Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung besteht im Hindurchleiten der Zusammensetzung durch ein zertifiziertes steriles, nichtpyrogenes Polysulfonmikrofilter mit einer Porengröße von 0,2 um. Aus Polysulfonen bestehende Filtermembranen mit geringer Proteinbindung haben eine deutlich geringere Proteinabsorption als vergleichbare Filtermembranen aus Celluloseacetat/-nitrat. Die Filtration durch ein steriles 0,2-mm-filter bietet Schutz vor Kontamination mit Mikroorganismen. Außerdem minimiert die Filtration die Risiken der Patienten durch unlösliche Teilchen oder Mikroaggregate.
Die Rekonstitution und Herstellung von pharmazeutisch verträglichen Lösungen zur parenteralen Anwendung beim Menschen wird routinemäßig in Krankenhausapotheken vorgenommen. Lösungen von Kollagenase/Hyaluronidase/Triton X- 100/Gentamicin (CHTG) in 0,05 M citratgepufferter Salzlösung, die 20 mM CaCl&sub2; enthält (CBSCa 6,7), mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 10 %, bleiben 2 Wochen stabil, wenn sie bei 4 ºC gelagert werden, und bleiben hochwirksam zur Auflösung von Prostatagewebe beim Menschen und beim Hund. Es wird angenommen, daß die Toxizität der Zusammensetzung nicht größer ist als die Toxizität der Einzelkomponenten, die bekannt ist.
Kollagenase (EC 3.4.24.3) aus Clostridium hystolyticum wurde von der Sigma Chemical Company bezogen (Typ XI, Produkt-Nr. C-7657, Chargennummern: 96F- 6801 und 96F-6838; Typ XI-S, Produkt-Nr. C-4785, Chargen-Nr. 17F-6814). Von Charge zu Charge wurden Schwankungen der Enzymaktivität für Kollagenase U/mg und der Anteile an verunreinigenden Enzymen festgestellt, die in folgendem Bereich lagen: 1910 bis 2450 U/mg Kollagenase, 0,86 bis 1,4 U/mg Clostripain, 40 bis 85 U/mg Caseinase und 0,05 bis 0,52 U/mg Trypsin.
Eine Einheit Kollagenaseaktivität ist definiert als die Menge Kollagenase, die in fünf Stunden bei pH=7,4 bei 37 ºC in Gegenwart von Calciumionen Peptide aus nativem Kollagen freisetzt, die bei Ninhydrin-farbreaktion 1 Mikromol L-Leucin entsprechen. Ein Einheit Clostripain hydrolysiert 1 Mikromol N-α-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) pro Minute bei pH=7,6 und 25 ºC in Gegenwart von 2,5 mM Dithiothreitol. Eine Einheit Caseinase (unspezifische Protease> hydrolysiert Casein in fünf Stunden bei pH=7,5 und 37 ºC bis zu einer Farbe, die 1 Mikromol (181 ug) L-Tyrosin entspricht (farbreaktion mit folin-Ciocalteu-Reagens). Eine Einheit Trypsin hydrolysiert pro Minute bei ph=7,6 und 37 ºC 1 Mikromol N-α-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE).

A. Kollagenase-Test

Die Verfahren zur Quantifizierung des Kollagenabbaus durch Kollagenase basieren im allgemeinen auf der Erfassung bestimmter Abbauprodukte des Kollagens oder auf der Messung des Verschwindens verschiedener Arten makromolekularen Kollagens. Azocoll (eingetragenes Warenzeichen von Calbiochem Corp., La Jolla, CA) ist ein im Handel erhältlicher Komplex von Kollagenpartikeln und Azofarbstoff. Der Komplex ist stabil, jedoch wird bei Behandlung mit einem proteolytischen Enzym der Farbstoff in löslicher Form freigesetzt. Das nicht umgesetzte Azocoll kann dann abfiltriert und der Farbstoff im Filtrat kolorimetrisch bei 520 nm gemessen werden. Azocoll ist in zwei Partikelgrößen erhältlich, wobei die größere Größe (50 bis 100) gegenüber der kleineren (100 bis 250) bevorzugt wird, weil das kleinere Material weniger Farbe abgibt. Azocoll ist ein ausgezeichnetes Substrat zur Messung der Kollagenaseaktivität, weil die Aktivität proportional zur Zeit und zur Enzymkonzentration ist. Der freigesetzte Farbstoff kann mit einem Kolorimeter im sichtbaren Bereich gemessen werden, während für das Wunsch-Substrat ein UV-Spektralphotometer erforderlich ist. Der Azocoll -Test erlaubt die rasche Bestimmung der Enzymreaktion durch Trennung von Enzym und Substrat in einem Schritt mittels Filtration durch 1,2- bis 5-um-Membranen.
Um die Enzymaktivität in Kollagenaselösungen quantitativ reproduzierbar zu bestimmen, wird eine Lösung von 10 mg/ml Azocoll in 0,05 M CBSCa 6,7 hergestellt. Der Test besteht in der Zugabe von 1-ml-Teilmengen der Azocoll - Suspension in 13 x 100 Teströhrchen. Die kollagenasehaltige Testlösung (100 ul) wird in die Teströhrchen gegeben und untergemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 ul 0,2 M EDTA (7,44 g/100 ml demineralisiertem H&sub2;O) abgebrochen. Das gesamte Reaktionsgemisch wird dann durch ein 1,2-Mikron-Acrodisc -Spritzenfilter (Gelman, Ann Arbor, MI) in Kunststoff-Spektralphotometerküvetten filtriert, und es wird die dekadische Extinktion der Lösung bei 520 nm bestimmt und gegen 1 ml CBSCa 6,7 abgeglichen, die 100 ul 0,2 M EDTA enthält. Der Test ist hinsichtlich der Kollagenasekonzentration relativ linear und eignet sich für Lösungen zwischen 0,01 und 1 %. Kollagenaselösungen, die 1 % Triton X-100 enthalten, wirken sich nicht auf die Extinktionsspitze des Azocoll bei 520 nm aus und steigern die Kollagenaseaktivität um das Zweifache. Bei Kontrolltests zeigt Triton X-100 keine Aktivität gegenüber Azocoll .
Es ist noch eine andere, empfindlichere Methode zur Bestimmung der Kollagenaseaktivität entwickelt worden, bei der ein synthetisches chromogenes Substrat p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-L-Prolyl-L-Leucyl-Glycyl-L-Prolyl-D-Arginin (PZC-PLGPA) hydrolysiert wird, wobei das gelbe Produkt p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-L-Pro-L-Leu freigesetzt und spektralphotometrisch bei 320 nm bestimmt wird. Ein anderer Test zur Messung der Kollagenaseaktivität verwendet das synthetische chromogene Substrat PZC-PLGPA (Wunsch). Das Reagens wird hergestellt durch Auflösung von 5 mg PZC-PLGPA in 1 ml Methanol, gefolgt von der Zugabe von 4 ml CBSCa 6,7. Die Methode eignet sich zur Bestimmung der Kollagenaseaktivität in Lösungen mit einer Kollagenasekonzentration zwischen 1 und 0,01 %.
Der Wunsch-Kollagenasetest wird durchgeführt, indem in ein 12 x 75 Reagenzglas 1 ml PZC-PLGPA und eine Probe von 100 ul einer Kollagenaselösung gegeben und unter Rühren 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert werden. Dann wird unter Rühren eine Probe von 100 ul 0,2 M EDTA zugegeben (EDTA kann durch 6 N HCl ersetzt werden). Ein Alignot von 500 ul wird abgenommen und in ein 13 x 100 Reagenzglas gegeben, das 1 ml CBSCa 6,7 und 5 ml Ethylacetat enthält. Das Gemisch wird 15 Sekunden lang verwirbelt, ein Alignot der organischen Phase wird in Reagenzgläser gegeben, die 350 mg NaSO&sub4; enthalten. Die Extinktion wird bei 320 nm abgelesen und gegen Luft in einer Glasküvetten abgeglichen.
Kollagenase wird häufig sowohl in Wunsch-Einheiten als auch in Mandl-Einheiten gemessen. Zwischen diesen beiden Einheiten gibt es keinen brauchbaren Umrechnungsfaktor, weil die Mandl-Einheit auf wechselnden Konzentrationen verunreinigender Proteasen zurückzuführende wechselnde Aktivitäten berücksichtigt. Typische Umrechnungsfaktoren sind etwa 1 Wunsch U/mg zu 1800 Mandl U/mg.

B. Hyaluronidase-Test

Hyaluronidase (EC 3.2.1.35) aus Schafshoden wurde von der Boehringer Mannheim Corp. gekauft (Produkt Nr. 106500, Chargen-Nrs. 10372425 und 10691020-20). Eine Einheit der Enzymaktivität ist als die Enzymmenge definiert, die bei 37 ºC und pH=4 ein Mikromol N-Acetyl-glukosamin pro Minute freisetzt. Zwei Millieinheiten (mu) Hyaluronidase (15 NF-Einheiten) setzen bei 37 ºC und pH=4,0 in einer Minute ein Mikromol terminaler N-Acetyl-glukosamin-Reste frei. Die "National Formulary"-Einheiten basieren auf der Verminderung der Trübung einer Lösung eines Hyaluronsäure/Albumin-Gemisches, die spektrophotometrisch bei 600 nm gemessen wird. Es wurde gezeigt, daß die Hyaluronidaseaktivität durch Metallionen wie beispielsweise Fe²&spplus; und Cu²&spplus; (beide davon sind starke Inhibitoren bei 0,5 mM) und von CN inhibiert wird.
Die derzeitigen Verfahren für die Analyse der Hyaluronidaseaktivität umfassen die spektrophotometrische Stimmung von reduzierenden Zuckern, die bei enzymatischer Hydrolyse gebildet werden. Hyaluronidase katalysiert den Abbau von Hyaluronsäure bei Freisetzung von Acetylglukosamin-Resten, die mit einem kolorimetrischen Test gemessen werden kann. Bei dem Test wird N-Acetylglukosamin (NAGA) in alkalischer Lösung in einen Anhydrozucker umgewandelt. Der Anhydrozucker wird dann mit 4-Dimethylaminobenzaldehyd bei saurem pH-Wert unter Bildung eines gefärbten Furanderivats umgesetzt. Die Menge des pro Zeiteinheit freigesetzten Acetylglukosamins stellt ein Maß für die Hyaluronidaseaktivität dar.
Das Substrat Hyaluronsäure ist in wässrigen Puffern nicht leicht löslich. Lösungen von Hyaluronsäure sollten mindestens einem Tag vor dem Test hergestellt, bei 4 ºC gelagert und unmittelbar vor Gebrauch gemischt werden. Die Menge des freigesetzten NAGA wird gemessen durch Überführen des NAGA-Zuckers in sein Furanderivat, indem man die Azidität der Lösung anhebt, und durch Umsetzen dieses Furanderivats mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) unter Bildung eines gefärbten Komplexes, der skektrophotometrisch bei 585 nm gemessen wird.
Hyaluronidase wird bevorzugt bei 37 ºC bestimmt. Hyaluronsäure- und NAGA- Lösungen sollten wöchentlich frisch hergestellt werden. Die p-Dimethylaminobenzaldehydlösung ist ein Monat lang stabil. Hyaluronidaselösungen können begrenzte Zeit bei 4 ºC gelagert werden, das Enzym ist jedoch sehr stabil, wenn man es lyophilisiert bei -20 ºC aufbewart. Die Erfassungsgrenze der Methode für die Bestimmung der Hyaluronidaseaktivität beträgt weniger als 2 mU (entsprechend 15 NF-Einheiten) pro mg Protein. Veränderungen der Ionenstärke des Puffers, des pH-Werts oder der Probenmenge können den End-pH-Wert des abschließenden Farbtests auf Acetylglukosamin verändern, der nur in alkalischer Lösung abläuft. Hyaluronsäure ist nicht sehr stabil, neigt zum Quellen und muß gründlich gemischt werden. Chondroitin-6-sulfat kann Hyaluronsäure als Substrat ersetzen, nicht jedoch Chondroitin-4-sulfat.

Zubereitung der Ausgangsreagenzien für den Hyaluronidase-Test

NAGA: eine Lösung mit 1 mg/ml wird duch Lösen von 10 mg NAGA in 10 ml CBSCa 6,7 hergestellt.
Standard A: 1 ml NAGA-Stammlösung wird zu 49 ml CBSCa 6,7 (20 ug/ml) gegeben.
Standard B: 500 ul NAGA-Stammlösung werden zu 49,5 ml CBSCA 6,7 (10 ug/ml) gegeben.
0,8 M K&sub2;B&sub4;O&sub7;: 48,88 g K&sub2;B&sub4;O&sub7; werden 200 ml entionisiertem H&sub2;O gegeben, zum Lösen erwärmt und dann der pH-Wert mit 5 N KOH oder 6 N HCl auf 9,1 eingestellt.
DMAB: 1 g DMAB werden zu 10 ml Essigsäure/Chlorwasserstoffsäure (8,75 ml Essigsäure + 1,25 ml HCl) gegeben. Die Lösung wird unmittelbar vor Verwendung mit Essigsäure im Verhältnis 1:10 verdünnt.
Hyaluronsäure: 62,5 mg Hyaluronsäure werden zu 50 ml CBSCa 6,7 gegeben. Die Lösung sollte 24 Stunden vor dem Test zubereitet und bei 4 ºC gelagert werden.
Hyluronidase: es werden Lösungen mit 1 %, 0,1 % und 0,01 % (G/V) in 0,05 M CBSCa 6,7 zubereitet, die Enyzmaktivitäten im Bereich von 1200 bis 2100 U/mg aufweisen.
Alle Lösungen sind bei Lagerung beim 4 ºC eine Woche stabil.
Der Test auf die Hyaluronidaseaktivität wird durchgeführt, indem man 200 ul Hyaluronsäure (1,25 mg/ml) und 50 ul Hyaluronidase (1 %, 0,1 %, 0,01 %) in 13 x 10 Reagenzgläser gibt. Das Gemisch wird 10 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert und unter laufenden Leitungswasser gekühlt. Zum Gemisch werden 50 ul Tetraborat (pH=9,1, 0,8 M K&sub2;B&sub4;O&sub7;) gegeben. Die Lösungen werden 3 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erwärmt, mit laufendem Leitungswasser gekühlt, und es werden anschließend 1,5 ml DMAB (1:10) zugegeben, wonach 20 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert und erneut unter laufendem Leitungswasser gekühlt wird. Aliquote werden in Spektrophotometerküvetten aus Kunststoff überführt und unmittelbar die optische Dichte bei 585 nm bestimmt (innerhalb von weniger als 10 Minuten).
Die Reagenz-Nullösung besteht aus:
250 ul CBSCA 6,7
50 ul K&sub2;B&sub4;O&sub7;
3 Minuten lang kochen und abkühlen
Die Reagenzgläser mit NAGA-Standard enthaltn:
250 ul STDS A oder B
50 ul K&sub2;B&sub4;O&sub7;
3 Minuten lang kochen und abkühlen
1,5 ml DMAB (1:10)
20 Minuten lang bei 37 ºC und abkühlen
Die Proben-Nulllösung besteht aus:
250 ul Hyaluronsäure
50 ul CBSCa 6,7
3 Minuten lang kochen und abkühlen
1,5 ml DMAB (1:10)
20 Minuten bei 37 ºC und abkühlen
1,5 ml DMAB (1:10)
20 Minuten bei 37 ºC und abkühlen
Die Nullösung mit NAGA- Standard besteht aus:
250 ul NAGA STD A oder B
50 ul CBSCa 6,7
3 Minuten lang kochen und abkühlen
1,5 ml DMAB (1:10)
20 Minuten bei 37 ºC und abkühlen
Das Ausmaß der Farbentwicklung des Komplexes aus NAGA und DMAB hängt von der Alkalinität der Boratlösung ab. Unterhalb des pH-Werts von 9,0 läßt die Farbentwicklung für eine gegebenen Menge NAGA schnell nach. Es wurde gezeigt, daß hohe Konzentration an Normal-Humanserum die Entwicklung des gefärbten NAGA/DMAB-Komplexes stören. Die Farbentwicklung im Test hängt ab von der Bildung einer Zwischenverbindung (Glukoxazolin) durch Erwärmen des Acetylhexosamins mit Alkali und der anschließenden Reaktion dieser Zwischenverbindung mit DMAB in saurer Lösung, was zur Entwicklung eines rötlich-purpur gefärbten Komplexes führt.
Die Aktivitätstests wurden für Kollagenase und Hyaluronidase durchgeführt, um die Kompatibilität der unterschiedlichen Antibiotika mit der Enzymaktivität zu bestimmen. Es wurden Lösungen unterschiedlicher Antibiotika mit Konzentrationen hergestellt, die Peak-Serum, Gewebe und Urinwerte bei klinisch vorkommenden Dosierungen bei Kuren wiederspiegeln, und zu 1 und 0,1-prozentigen Lösungen von CHT gegeben. Die Antibiotika Gentamicin und Trimethoprim/- Sulfamethoxazol (TMP/SMX) zeigten bei allen untersuchten Konzentrationen keine Inhibierung der Enzymaktivität. Nitrofurantoin, Tobramycin und Amikacin zeigten eine leichte Inhibierung der Kollagenaseaktivität, wobei Nalidixinsäure die größte Kollagenaseinhibierung zeigte. Amikacin und Nalidixinsäure inhibierten die Hyaluronidaseaktivität stark. Daneben zeigte ein Scannen von Lösungen der Antibiotika bei 520 und 585 nm (Testwellenlängen der Kollagenase- bzw. Hyaluronidaseaktivität) geringe oder keine Störung: TMP/SMX weniger als 0,03 Extinktions-Einheiten, Gentamicin weniger als 0,01 Extinktions- Einheiten.

C. Entfernung von Endotoxinen

Endotoxine sind pyrogene Lipopolysaccharidkomponenten von grammnegativen Bakterien. Es wurde gezeigt, daß Endotoxine bei Konzentrationen von lediglich nm/ml im Menschen und im Tier in wirksamer Weise biologische Wirkungen hervorrufen. Bei biochemischen Zubereitungen für in-vivo-Zwecke ist es also wesentlich, die Konzentration an Endotoxinen niedrig zu halten.
Die Gabe bzw. Verabreichung von mit Endotoxinen (Pyorgene oder Fiebererzeuger) kontaminierten Endotoxinen an Patienten kann zu Komplikationen führen, wie beispielsweise Lymphozytenmigration, Komplementfixation, Freisetzung von Histaminen und Veränderungen in der Gefäßpermeabilität. Diese Komplikationen können in Abhängigkeit vom Allgemeinzustand des Patienten und vom Ausmaß der injizierten Endotoxine lebensbedrohend sein. Es wurde gezeigt, daß Endotoxine in der Lage sind, die Membranrezeptoren zu binden, die lysosomale Aktivität zu aktivieren, die mitochondrischen Funktionen zu beeinträchtigen, Prostaglandine zu stimulieren, als Mitogene zu wirken, Zytotoxizität von Makrophagen zu induzieren, immunologische Antworten zu stimulieren, die hormonellen Wirkungen zu verändern, Zellen zu transformieren und die Wirkungen von Lymphokinen zu imitieren.
Die Beseitigung der Kontamination mit Endotoxinen in wässringen physiologischen Lösungen kann schwierig sein. Ultrafiltrationverfahren eignen sich für Lösungen, die nur kleine Moleküle enthalten, nicht jedoch zum Entfernen von Pyrogenen aus Lösungen von Proteinen oder anderen Makromolekülen. Detoxi- Gel (ein eingetragenes Warenzeichen von Piece Chemical Co., Rockford, IL) enthält eine immobilisierten Liganden (Histamin), der eine besondere Spezifität zum Binden und Entfernen von Pyrogenen aus Proteinlösungen aufweist und eine Kapazität zum Binden von Endotoxinen von 2 mg/ml hat. Die Kontamination mit Endotoxinen wird gewöhnlich in Endotoxin-Einheiten (EU) gemessen. Eine EU/ml repräsentiert eine Endotoxinkonzentration von ungefähr 0,1 EU/ml. Vollständiges Entfernen aller kontaminierenden Pyrogene ist mit den besten Verfahren, die die Kontamination mit Endotoxinen auf sichere Werte herabsetzen, praktisch nicht möglich. Typische sichere oder pyrogenfreie pharmazeutisch verträgliche Zubereitungen von Proteinlösungen enthalten weniger als 1,0 EU/ml. Bei Einsatz von Detoxi-Gel wurden 7500 EU/ml an reinem Pyrogen in einem Durchlauf über eine 1 ml Detoxi-Gel-Säule (5 ml eingesetzte Endotoxinlösung) auf weniger als 1,0 herabgesetzt, was zu einer Ausbeute der Endotoxinentfernung von mehr als 99 % führte.
Detoxi-Gel -Säulen sind im Handel erhältlich, wobei das vorgepackte Gelbett durch zwei poröse Scheiben geschützt wird, die die Säulen vor dem Austrocknen schützen, wenn man sie kurzzeitig unbeaufsichtigt läßt. Zusätzlich stellen die Scheiben sicher, daß die Menge der auf die Säule gegebenen Lösung immer gleich derjenigen ist, die die Säule verläßt, womit quantitative Messungen erleichtert werden. Die Säulen werden dann auf Zimmertemperatur gebracht. Die Säulen werden für die Chromatographie vorbereitet, indem man die obere Kappe abnimmt und anschließend die untere Kappe entfernt (um zu verhindern, daß Luftblasen in das Gelbett eindringen), die Säule dann in einen senkrechten Halter setzt und die Flüssigkeit in den Säulen vollständig abläßt. Die Säulen werden dann in 0,05 M citratgepufferter Kochsalzlösung (pH=6,7) equilibriert, die 20 mM CaCl&sub2; enthalten, und zwar mit 10 Säulenvolumina und einer Flußgeschwindigkeit von 5 bis 15 ml/h. Es wird empfohlen, daß Pufferlösungen oder Proben in bekannten Volumina auf die Säule gegeben werden, damit man beim Lauf der sequentiellen Fraktionen durch die Säule genau einheitliche Volumina erhält. Der Durchlauf von 5 ml einer 1-prozentigen Lösung von CHT durch eine Detoxi-Gel -Säule mit 1 ml zur Endotoxinentfernung und die Sterilfiltration mit 0,22 um führt zu einer 10-prozentigen Verminderung der Enzymaktivität.

D. Endotoxin-Test

Das Herstellen einer pyrogenfreien injizierbaren Lösung von Kollagen/Hyalurondase/Triton X-100/Gentamicin (CHTG) erfordert das Messen in einem zugelassenen Limulus Amebocyt Lysat (LAL)-Testsystem. Bakterielle Endotoxine sind wärmestabile Lipopolysaccharid-Komponenten der Zellwand von grammnegativen Bakterien. Endotoxine sind in der Lage, eine große Vielzahl biologischer Wirkungen hervorzurufen, wie beispielsweise Fieber, Hypotonie und Tod. Der LAL-Test wurde in der pharmazeutischen Industrie zum Erfassen von Kontaminationen mit Endotoxinen in Fluiden eingesetzt, die zur parenteralen Verwendung bestimmt sind. Der LAL-Test ist quantitativ und kann auch noch Endotoxin- Konzentrationen erfassen, die beim Menschen zu niedrig sind, um Fieber auszulösen. Die Ergebnisse des LAL-Tests stellen einen Mittel zum Identifizieren von Defekten in pharmazeutischen Zubereitungen dar, bevor die Endotoxinwerte klinisch signifikant werden.
Im Handel erhältliche Testpackungen für die Kontamination mit Endotoxinen wurden von Whittaker M.A. Bioproducts (Walkersville, MD) entwickelt und setzen das in-vitro-Testverfahren Limulus Amebocyte Lysate (LAL) ein. Der LAL-Test verwendet ein synthetisches chromogenes Substrat, welches in Anwesenheit von LAL und Endotoxin eine gelbe Farbe erzeugt, die mit der Endotoxinkonzentration linear zusammenhängt. Die Korrelation zwischen der Extinktion bei 405 nm und der Endotoxinkonzentration ist im Bereich von 0,1 bis 1 EU/ml linear. Die Endotoxinkonzentration einer unbekannten Probe wird aus den Extinktionswerten von Lösungen berechnet, die bekannte Mengen eines Endotoxinstandards enthalten.
Ergebnisse mit dem LAL-Test erhält man durch kolorimetrische Messung von Proteinen, die mit dem Lysat ausgefällt wurden. Synthetische Peptidsubstrate, die mit einem Chromophor verknüpft sind, bleiben in Abwesenheit von Endotoxin farblos, wogegen sie sich in Anwesenheit von Endotoxinen gelb färben. Der Test ergibt quantitative Ergebnisse mit einer Empfindlichkeit bis hin zum ng/ml-Bereich und wurde gegen den Bureau of Biologics Endotoxin Reference Standard der FDA in Endotoxin-Einheiten (EU) standardisiert. Störungen können durch trypsinähnliche Enzyme verursacht werden und führen zu falsch positiven Werten. Material, von dem man weiß, daß es Proteine oder Inhibitoren von Enzymaktivität denaturiert, kann zu falsch negativen Ergebnissen führen. Alle Zubereitungen und der Test selbst sollten unter Einsatz von pyrogenfreiem Wasser und Laborausrüstung aus Kunststoff durchgeführt werden.
Der chromogene LAL-Test ist ein quantitiver und im Handel erhältlicher Test für die Bestimmung der Konzentration von grammnegativen bakteriellen Endotoxinen. Eine Testprobe wird mit dem in der Testpackung vorhandenen LAL vermischt und 10 Minuaten bei 37 ºC inkubiert. Dann wird mit der LAL-Probe eine chromogene Substratlösung vermischt und weitere 3 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Die Reaktion wird mit 0,25-prozentiger Essigsäure abgebrochen. Wenn in der Probe Endotoxine vorhanden sind, erscheint eine gelbe Farbe. Die Extinktion der Probe wird spektophotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Extinktion ist direkt proportional der Menge der vorhandenen Endotoxine, wobei die Konzentration der vorhandenen Endotoxine aus einer Standardkurve berechnet wird. Vier Endotoxinstandards, die den gewünschten Konzentrationsbereich abdecken, sollten zusammen mit einer Nullösung gemessen werden (jeweils mit Doppelbestimmungen). Der Korrelationskoeffizient zwischen der mittleren Extinktion der Standards gegen ihre jeweiligen Endotoxinkonzentrationen sollte größer als 0,98 sein. Die Reproduzierbarkeit von Wiederholungsmessungen an Proben sollte im Gebiet von 0,4 EU/ml zu Variationskoeffizienten von weniger als 10 % führen.
Wenn man die erste Inkubation auf 30 Minuten ausdehnt, ist es möglich, Endotoxinkonzentrationen zwischen 0,01 und 0,1 EU/ml zu messen. Es ist wichtig, daß die Linearität des Tests bei dieser höheren Empfindlichkeit bestimmt wird und daß verdünnte Standards mitlaufen, die die gewünschten niederen Konzentrationen der zu messenden Endotoxine abdecken. Alle Materialien, die mit den Proben oder mit dem Testmaterial in Berührung kommen, müssen pyrogenfrei sein. Glasgegenstände können pyrogenfrei gemacht werden, indem man sie 4 Stunden lang auf 180 ºC erhitzt. Es muß aseptisch gearbeitet werden. Die Vorschriften in bezug auf die Zeit und auf die Inkubationstemperatur müssen während des gesamten Tests strikt eingehalten werden.

E. In-vivo-Verfahren

Der Zweck der Behandlung von BPH besteht darin, die Harnabflußstörung zu lindern. Die Verkleinerung des verlegenden Prostatagewebes und die nachfolgende Linderung der Symptome der Harnabflußstörung zeigen an, wie erfolgreich die Therapie ist. Wesentlich für die Rolle, die dabei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und dem erfindungsgemäßen Verfahren zukommt, ist die Methodik, die bei der Beurteilung der Therapie eingesetzt wird. Die objektive Beurteilung der Therapiewirkungen können mit Standardverfahren gemessen werden, wie beispielsweise mit der Uroflowmetrie, mit transurethralen Untersuchungen oder transrektalen Ultrasonographie in Verbindung mit einem Beurteilungsblatt für die Störungssymptome.
Zur Beurteilung der Rolle der vorliegenden Erfindung bei der Linderung der Störungssymptome von BPH sind genaue Mittel zum Quantifizieren der Prostatagröße und zur Bestimmung des größten Harnausflusses erforderlich. Die Beurteilung der Antwort auf die Behandlung von BPH sollte auf objektiven Kriterien aufbauen. Es hat sich gezeigt, daß die derzeitigen Techniken und Verfahren zur Prostataabbilung bei der urodynamischen Analyse für die Beurteilung der therapeutischen Behandlung von BPH ausreichend sind.
Im Hinblick auf die Vielzahl des klinischen Verlaufs von BPH im allgemeinen und innerhalb des einzelnen Patienten im besonderen, besteht die Notwendigkeit, für erweiterte Basisuntersuchungen vor und nach der Therapie. Die anfängliche Untersuchung des Patienten sollte einschließen: Krankengeschichte, körperlicher Zustand, Auflistung der Symptome, Zystoskopie, vollständige Blutzählung und vollständiges biochemisches Profil, Messung des Restharns und Geschwindigkeit des Harnausflusses. Die Prostatagröße kann mit der dreidimensionalen transrektalen Ultrasonographie bestimmt werden. Nach einer Reihe von Injektionen muß eine Nachfolgeuntersuchung durchgeführt werden. Die prosttherapeutische Nachfolgeuntersuchung an Patienten, die auf Prostatahypertrophie behandelt wurden, umfaßt: körperliche Untersuchung, Zystoskopie, Laborstudien und Abbildungsverfahren. Patienten, von denen angenommen werden kann, daß sie von der Therapie profitieren, sind solche, bei denen sich sowohl im Hinblick auf die Spitzenwerte der Harnabflußgeschwindigkeiten als auch auf das Symptombild Verbesserungen ergeben.
Eine Übereinkunft zum Abschätzen der Prostatagröße bei der körperlichen Untersuchung verwendet eine Bewertungsskala, die von normal bis 4+ reicht. Eine normale Drüse hat etwa die Größe einer Roßkastanie, wiegt etwa 10 g und ist bei rektalen Untersuchung minimal wahrnehmbar. Eine auf 1+ vergrößerte Prostata hat in etwa die Größe einer Pflaume, wiegt etwa 25 g und besetzt etwas weniger als ein Viertel des rektalen Volumens. Eine auf 3+ vergrößerte Prostata erreicht die Größe eine Orange und ein Gewicht von etwa 75 g und füllt etwa drei Viertel des rektalen Durchmessers. Eine Drüse mit 4+ kann die Größe einer kleinen Grapefruit erreichen und mehr als 100 g wiegen und so viel des rektalen Volumens ausfüllen, daß eine angemessene Untersuchung schwierig ist.
Jüngste Fortschritte bei Geräten und Arbeitsverfahren für die Ultraschallabbildung haben sich bei der Diagnose, dem Staging und der Behandlung von Krankheiten, die die Prostata und die Blase betreffen, als nützlich erwiesen. Es wurde gezeigt, daß die dreidimensionalen Abbildungsverfahren unter Einsatz von Geräten zur transrektalen oder transurethralen Ultraschallabtastung sehr genaue und wertvolle Ergebnisse bei der Beurteilung der lokalen Antwort der Prostata auf eine Behandlung ergeben. Sonografische Studien der Blasenentleerung ergeben mehr klinisch brauchbare Information als herkömmliche Studien, die augenblicklich eingesetzt werden. Zusätzlich verbessert der Einsatz der transrektalen Ultrasonografie die Genauigkeit von Prostatainjektionen, weil es durch die Überwachung durch Ultraschall möglich ist, die Nadel direkt in den gewünschten Bereich zu setzen. Die transrektale Ultrasonografie der Prostata ermöglicht eine Darstellung der vorderen Bereiche der Prostata, die nicht digital abgetastet werden können. Ebenso können die Anatomie im Inneren der Prostata, die Unversehrtheit der Kapsel sowie die Samenbläschen dargestellt werden. Außerdem ist die Ultraschallabbildung der Prostata in klinischer Hinsicht wichtig bei Patienten mit abtastbaren Knoten und bietet ein Verfahren zur objektiven Überwachung der Antwort auf die Therapie und zur Identifizierung der lokalen Rückbildung von hyperplastischem Gewebe.
Bei Darstellung mit Ultraschall erscheint BPH als eine diffuse Vergrößerung, wobei die Prostatakapsel gut definiert, jedoch dicker ist als man es bei der normalen Drüse findet. Der hyperplastische Teil der Drüse ist zusammengesetzt aus vielen feinen homogenen Echos, von denen angenommen wird, daß sie kleine Adenoma darstellen, die im Fasergewerbe zwischen den Komponenten der Drüse angeordnet sind. Das Kollagen des Prostatastromas ist der Hauptfaktor, der die Echogenizität der Drüse bestimmt. Eine enzymatische Solubilisierung des Kollagens des Prostatastromas erzeugt Nekroseherde an und um die Injektionsstelle herum, was zu einem Ultraschallbild mit Hypoecho führt. Die Rückbildung der Prostatagröße kann zwischen Abtastungen beobachtet werden, die vor und nach der Injektion stattfinden. Echoveränderungen nach der Injektion können zurückzuführen sein auf Gewebe, welches in unterschiedlichem Umfang solubilisiert wird, Expansion von Drüsengewebe, welches vorher schwammartig komprimiert war, Blutklumpen und Granulationsgewebe.
Prostataverkalkungen erscheinen bei der Ultraschalluntersuchung als herdartig dichte, sehr echogene Bereiche, die Schallschatten erzeugen. Bei chronischer Prostatitis zeigt das Ultraschallmuster unregelmäßig verteilte heterogene Dichte, die sich oftmals seitlich von der Urethra erstreckt und die Prostatakapsel verzerren oder unklar machen kann. In bezug auf den Ultraschall erscheint die maligne Prostata asymmetrisch vergrößert und zeigt Bereiche mit erhöhter, verminderter oder gemischter Echogenizität. Das Vorhandensein von lokalisierten Karzinomen im Frühstadium wird angezeigt durch lokalisierte dichte Gebiete ohne kapsuläre Verzerrung und kann leicht mit Prostatakalkulus verwechselt werden.
Die Verwendung der transrektalen Ultrasonografie bei der Bestimmung des Prostatavolumens hat sich als zuverlässiges Verfahren erwiesen, und es wurde gezeigt, daß sie auf 5 % des tatsächlichen Prostatagewichtes genau ist. Die Dichte der Prostata liegt in der Nähe von 1,0, und das Prostatavolumen in Kubikzentimetern wird deshalb als gleich seinem Volumen in Gramm angesehen. Das Prostatagewicht kann unter Verwendung der einfachen Gleichung berechnet werden: Gewicht = 0,5 (D1 x D2 x D3), wobei D1, D2 und D3 den Durchmesser der Prostata in den drei Dimensionen darstellen. Die Zuverlässigkeit dieser Technik von Tag zu Tag wird mit etwa 95 % angegeben.
Andere einsetzbare Abbildungsverfahren sind beispielsweise Pyelogramme des Harntraktes, die Computertomographie und die Verfahren der Bilderzeugung mit magnetischer Resonanz. Intravenöse Pyelogramme sind bei der Beurteilung der Prostatagröße von begrenztem Wert. Die Computertomographie ist in der Lage, den periprostatischen Bereich und die Größe der Lymphknoten widerzugeben. Intraprostatische Details sind jedoch schlecht, wobei Massen nur wenig visualisiert werden. Die Erfassung von vergrößerten Knoten ist äußerst empfindlich; Knoten mit normaler Größe können jedoch mikroskopische Karzinome enthalten. Die Abbildung mit magnetischer Resonanz zeigt - wie der transrektale Ultraschall - die intraprostatische Anatomie. Die Technik ist beim Anzeigen von pelviner Adenopathie, periprostatischer Invasion und Beteiligung der Samenbläschen so genau und empfindlich wie der transrektale Ultraschall oder die Computertomographie.
In-vivo-Säugetiermodellsysteme zur Beurteilung der Enzymtherapie sollten Daten bezüglich der wirksamen Dosierung wie auch einer Information über potentielle toxische oder immunologische Nebeneffekte erbringen. Von den Versuchstieren wird der Hund als das am meisten geeignete Modell zum Studium von BPH am Menschen betrachtet. Die große Prostata des Hundes wie auch das spontane Auftreten von BPH bei älteren Hunden ergeben Analogien zum Humansystem. Trotz morphologischer und biochemischer Unterschiede bildet die Prostata des Hundes ein geeignetes experimentelles Modell zur Beurteilung der Wirkung der Enzyminjektionstherapie. Die ethischen und technischen Beschränkungen von Humanexperimenten machen die Entwicklung des tierischen Modellsystems wesentlich zum Überbrücken der Lücke zwischen in-vitro-Studien im Labor und dem klinischen Versuch am Menschen.
Aufgrund von Beschränkungen beim Extrapolieren von Daten aus Tierexperimenten auf die Verhältnisse beim Menschen sollte die letzte Erprobung eines jeden biologischen therapeutischen Mittels am Menschen erfolgen. Die Ergebnisse bei der Linderung von Harnabflußstörungen sekundär zur BPH durch die im Moment gebräuchlichen chirugischen Verfahren sind gut. Damit nichtchirugische Verfahren akzeptabel sind, müssen sie ebenso wirksame Ergebnisse erzielen und von unerwünschten Nebenwirkungen frei sein. Richtig aufgebaute klinische Untersuchungen sind wesentlich und bei einer älteren Population schwierig durchzuführen aufgrund von Beschränkungen bei der Beobachtung des Krankheitsverlaufs und der Therapieantwort über längere Zeit. Klinische Studien zur Beurteilung der Therapie müssen Doppelblindmessungen mit Plazeboeinsatz einschließen, die mindestens drei Jahre nach der Behandlung andauern. Die Wirkungen der Behandlung können je nach Anteil der stromalen und epithelialen Komponenten oder der Dosis und der Dauer der Behandlung unterschiedlich sein.
Um Kandidaten für eine Behandlung mit dem nichtchirugischen Injektionsverfahren objektiver auszuwählen und die Wirkungen der offenbarten Zusammensetzungen genauer zu überwachen, sollten die Kriterien, nach denen Männer mit BPH als Kandidaten für die Enzyminjektionstherapie qualifiziert werden, mäßige bis schwere Symptome mit Spitzenwerten der Harnflußgeschwindigkeit von weniger 15 ml/Sekunde umfassen. Auszuschließende Patienten sind solche mit vorheriger Prostatektomie, akuter Harnverhaltung, Infektionen, neurogener Blase, Harnröhrenverengung, Karzinomen der Prostata und anderen lebensbedrohenden Krankheiten.
Klinische Studien mit menschlichen Probanden können eine oder mehrere der folgenden Parameter umfassen, um die optimale Therapie bei der Behandlung von BPH zu erstellen. Die in frage kommende Patientenpopulation, die quantitative Obstruktionssymptome aufgrund von BPH zeigt, wird gescreent, und geeignete Kandidaten für die Enzymtherapie werden ausgewählt. Ausgewählte Patienten werden einem Hauttest auf allergische Reaktionen unterzogen, indem man 0,1 ml einer pharmazeutisch akzeptablen Enzymlösung intradermal spritzt. Es werden intraläsionale Prostatainjektionen mit unterschiedlichen Enzymkonzentrationen durchgeführt, und diese können in wöchentlichen oder monatlichen Intervallen wiederholt werden, bis die gewünschte Verminderung im Prostatagewebe erreicht ist. Geeignete und wirksame Mengen der Enzymlösung können durch Studien festgelegt werden, bei denen man folgendes variiert: Die Konzentration oder die Aktivität der eingesetzten Enzyme, das Volumen der Injektion, die Lage und die Natur des zu solubilisierenden Gewebes und die Anzahl der Injektionen, die zum Abbau der Obstruktionssymptome erforderlich ist. Die experimentelle Therapie sollte dann abgebrochen werden, wenn die gewünschte Verkleinerung des Prostatagewebes erreicht worden ist, oder wenn zwischen den Behandlungen keine weitere Verbesserung der Symptome beobachtet wird. Pro Behandlung können geeignete Mengen (1-20 ml mit Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 %) einer pharmazeutisch akzeptablen bzw. verträglichen Enzymlösung gespritzt werden. faktoren, die die weitere Kollagenolyse tendenziell begrenzen, sind beispielsweise die subkapsuläre Abwehr und der Verlust an enzymatischer Aktivität nach 24 h. Es sollte festgehalten werden, daß die wirksame und optimale Enzymlösung nach Maßgabe des Typs der zu solubilisierenden prostatischen Schädigung unterschiedlich sein kann. Die Gesamtzahl der Behandlungen kann in Abhängigkeit vom Ausmaß der prostatischen Obstruktion von 1-10 variieren. Es ist damit zu rechnen, daß der Verlauf der Gewebereparatur hämorrhagische Infarkte, Entzündungen, Bildung von akkuten und chronischen fasern von Granulationsgewebe führt, gefolgt von extrazellulärer Matrixbildung und Remodellierung.

F. In-vitro-Verfahren

In-vitro-Versuche wurden mit einer Reihe von hydrolytischen und proteolytischen Enzymen durchgeführt, die bei physiologischen pH-Werten aktiv sind, um zu bestimmen, welche Enzyme bei der Solubilisierung von Prostatagewebe am wirksamsten sind. Die ursprünglich untersuchten Enzyme beinhalteten: Kollagenase, Hyaluronidase, Elastase, Pronase, DNase I, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Chymopapain, Subtilisin und Dispase. Diese ursprünglichen Studien umfaßten die enzymatische Solubilisierung in vitro von Stückchen aus Prostatagewebe, welches vom Meerschweinchen, vom Hund und vom Menschen erhalten waren.
Weitere in-vitro-Studien umfaßten das Injizieren und die nachfolgende enzymatische Solubilisierung von Prostatagewebe an im Handel erhältlichen, chirugisch entfernten, Ganzorganproben von Meerschweinchen- und Hundeprostaten. Die Lösungen der hydrolytischen Enzyme wurde auch in Human-Prostatagewebe von Personen gespritzt, die BPH zeigten (sie wurden erhalten von Autopsien, den Leichen von Organspendern oder von Patienten mit Prostatatektomie). Das Ausmaß der Solubilisierung von Prostatagewebe, welches mit den unterschiedlichen Enzymen erreicht wurde, wurde mit normaler Hellfeld-Epifluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie untersucht. In-vitro-Tests unter Einsatz von synthetischen chromogenen Substraten wurden entwickelt, um die Wirkungen unterschiedlicher Puffer, Tenside, Antibiotika, Aktivatoren und Inhibitoren auf die Enzymaktivität zu vergleichen und zu untersuchen.
Es wurden Verfahren zum Herstellen von gefrorenen 8 um Gewebeschnitten entwickelt, die mit Hematoxylin und Eosin gefärbt waren, um die mikroskopischen histologischen Veränderungen im Prostatagewebe zu vergleichen und zu beurteilen, die durch die intraprostatische Injektion von unterschiedlichen Lösungen hydrolytischer Enzyme verursacht wurde. für die histologische Untersuchung wurde die Prostata hintereinander in Schnitte von etwa 0,5 cm unterteilt. Es ist wichtig, daß diese Schnitte den mittleren Bereich der Prostata überqueren und Teile der Urethra umfassen. Alle Schnitte sollten die Harnröhrenschleimhaut und den Außenrand der Prostatakapsel umfassen. Die Gewebeschnitte wurden bei -20 ºC gefroren, in die vorgekühlte Spannvorrichtung eines Kryostaten eingespannt und in einem Kryostaten bei -40 ºC dünne gefrorene Schnitte von 8 um hergestellt. Die dünnen Schnitte wurden mit Tauwasser an Objektträger angeheftet, unmittelbar mit 95-prozentigem Ethanol fixiert, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und mit Permount (fisher, Pittsburgh, PA) abgedeckt. Alternativ können die Gewebeschnitte unmittelbar in 4- bis 10-prozentigem formal in (pH = 7,2) fixiert, in Paraffin eingebettet, nacheinander dünn geschnitten, befestigt und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt werden. Man erhält alle 100 um einen dünnen Gewebeschnitt, wobei für jede Prostata eine Gesamtzahl von mindestens 20 dünnen Schnitten mikroskopisch untersucht wurde.
Prostatagewebe wurde mit einem Skalpell geschnitten und für die Dünnschnitte in einem Kryostaten gefroren. Die Gewebeschnitte können bei -20 ºC gefroren oder bei -80 ºC schnellgefroren werden, indem man sie in Trockeneis/Aceton- Lösungen eintaucht. Wenn die Dünnschnitte später hergestellt werden sollen, kann man das Gewebe in einem verschlossenen Behälter einige Tage lang bei -20 ºC lagern. Vor dem Dünnschneiden wurden die gefrorenen Gewebeschnitte auf die Schneidetemperatur gebracht (-30 bis -40 ºC), indem sie mindestens eine Stunde lang in den Kryostaten gebracht wurden. Die Objektträger wurden durch Eintauchen in 70- bis 97-prozentiges Ethanol gereinigt. In einem Kryostaten wurden gefrorene Dünnschnitte hergestellt, die für das färben mit H & E geeignet waren (6 bis 8 um dick). Die Qualität der Dünnschnitte wird beeinflußt von der Schneidetemperatur, dem Winkel und der Schärfe der Messerklinge und von der umgebenden Luftfeuchtigkeit. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, neigt das Gewebe zum Brechen und Zerplatzen. Wenn die Temperatur zu hoch ist, ringeln sich die Schnitte und bleiben an der Messerklinge hängen. Eine niedrige Luftfeuchtigkeit scheint das Ringein der Schnitte an der Messerklinge zu verhindern, was zu weniger Verzerrung der Gewebemorphologie führt. Wenn sich die Gewebeschnitte von der Messerklinge ablösen, können sie mit Hilfe einer kleinen Bürste aus Kamelhaar auf den Objektträger gebracht werden. Wenn man die sauberen Objektträger bei Zimmertemperatur aufbewahrt, hilft dies auch beim Abnehmen der Gewebeschnitte von der Messerklinge und beim Schmelzen des Schnitts auf dem Objektträger. Die präparierten Objektträger wurden unmittelbar bei 22 ºC in 95-prozentigem Ethanol fixiert und der Vorschrift für das H & E-färben von gefrorenen Schnitten unterworfen.
Das färben der gefrorenen Schnitte mit Hematoxylin und Eosin (H & E) wurde wie folgt ausgeführt, wobei Lösungen von Harris-Hematoxylin (James Phillips Co., Minneapolis, MN) Lerner Eosin Y (Baxter, McGaw Park IL), 1-prozentiges Lithiumcarbonat (Sigma) und Americlear (Baxter) verwendet wurden. Die gefrorenen Gewebeschnitte (8 um) wurden 1 bis 30 Minuten lang in 95-prozentigem Ethanol fixiert. Die Objektträger wurden gemäß den folgenden Schritten behandelt:
Spülen in entionisiertem H&sub2;O, 30 Sekunden lang;
Färben in Hematoxylin, 1 Minute lang;
Waschen in warmem H&sub2;O, 15 Sekunden lang;
Eintauchen in verdünntes Li&sub2;CO&sub3;, 2-4 mal tauchen (50 ul 1 % Li&sub2;CO&sub3; in 50 ml entionisiertem H&sub2;O);
Waschen in entionisiertem H&sub2;O, 15 Sekunden lang;
Eintauchen in Eosin Y, 10 mal Tauchen;
Eintauchen in 70-prozentigem Ethanol, 5 mal Tauchen;
Eintauchen in 95-prozentigem Ethanol, 5 mal Tauchen;
Eintauchen in 100-prozentigem Ethanol, 10 mal Tauchen;
erneut Eintauchen in 100-prozentigem Ethanol, 10 mal Tauchen;
Eintauchen in Americlear, 10 mal Tauchen;
erneut Eintauchen in Americlear, 10 mal Tauchen; und
unmittelbar mit Permount abdecken
Zur Bewertung der Sicherheit und der Wirkung der beschriebenen Zusammensetzung und der Verabreichungsmethode zur Solubilisierung von Prostatagewebe beim Tiermodell des Hundes wurden in-vivo-Studien durchgeführt. Das Ausmaß der Auflösung, der Regression und der Involution des Prostatagewebes durch die intraprostatische Injektion der Zusammensetzung in vivo wurde durch Ultraschallabtastung der Prostata in vivo und in vitro und durch makroskopische und mikroskopische Untersuchung von Nekropsiegewebe beurteilt. Histopathologische Bewertung der Wirkungen der injizierten Zusammensetzung umfaßten die Untersuchung der Prostata, der Urethra, der Blase, der Hoden, der Nieren, der Leber, des Herzens und der Lungen. Zusätzlich wurde in Gewebe in der Nähe der Injektionsstelle nach Anzeichen von Strikturen, fisteln, Verklebungen und Granuloma gesucht.
Nach einer Reihe von intraprostatischen Injektionen der Zusammensetzung in vivo gemäß einem anerkannten GLP-Protokoll für in-vivo-Studien an Hunden wurde das Tier mit einer Überdosis an Natriumpentobarbital getötet. Die Prostata wurde entlang der Mittellinie eingeschnitten, entfernt, von Gewebstrümmern befreit und gewogen. Beim Entfernen wurde die Prostata in einen Behälter mit normaler Kochsalzlösung gegeben und dann mit Ultraschall abgetastet. Die Ultraschallbilder der Prostata wurden auf Film aufgezeichnet. Die Ultraschallabtastungen wurden so durchgeführt, daß die Ultraschallbefunde und die histologischen Befunde gleicher Bereiche so genau wie möglich verglichen werden konnte. Nach dem Abtasten wurde die gesamte Prostata in serielle Schnitte von 0,5 cm aufgeteilt, fotografiert und für die mikroskopische histopathologische Untersuchung vorbereitet. Es wurde darauf geachtet, daß für den Vergleich mit den Ultrasonogrammen die korrekte anatomische Orientierung beibehalten wurde. Wenn die Prostata in vitro abgetastet wurde, gab es kein störendes Gewebe zwischen dem Schallgeber und dem Zielgewebe, wodurch eine optimale Ultraschallabbildung entstand. Die Ultraschallmuster der Prostataabtastungen in vivo waren nicht identisch mit den in vitro erhaltenen Mustern, und zwar aufgrund der Blutzirkulation und des dazwischen liegenden Gewebes. Es wurden jedoch Vergleiche angestellt und zwischen den Ultraschallabtastungen in vivo und in vitro gute Korrelation gefunden.

Beispiel 1

Gefrorene Meerschweinchenprostata wurde in 0,05 M CBSC 6,7, die 20 mM CaCl&sub2; enthielt, getaucht und bei 37 ºC 30 Minuten lang aufgetaut. Die Organe wurden in 500-mg-Portionen aufgeteilt und während unterschiedlicher Zeitabschnitte, die zwischen 1 und 3 Stunden lagen, in CBSCa 6,7, die Konzentrationen von 1 %, 0,1 % und 0,01 % Kollagenase enthielt, bei 37 ºC inkubiert. Zweistündige Behandlung von Meerschweinchenprostata mit 1-prozentiger und 0,1-prozentiger Kollagenaselösung (24.500 und 2.450 U/ml) ergab die vollständige Auflösung aller Gewebebestandteile. Die 0,01-prozentige Lösung (245 U/ml) ergab die unvollständige Auflösung von Gewebe, wobei von allen Gewebebestandteilen Teile intakt blieben.
Die Inkubation von Meerschweinchenprostatagewebestückchen mit 1-prozentiger, 0,1-prozentiger und 0,01-prozentiger Hyaluronidaselösung (16.000 U/ml, 1.600 U/ml und 160 U/ml) ergab die Auflösung der Drüsenacini, wobei die Gefäße und die Gänge relativ intakt blieben. Die Muskelbündel schienen auseinanderzufallen und auszufasern. Die Inkubation von Meerschweinchenprostatagewebestückchen mit 1-prozentiger, 0,1-prozentiger und 0,01-prozentiger Triton -X-100-Lösung ergab die Auflösung von Drüsenbestandteilen und ein Auseinanderfallen und Ausfasern von Muskelbündeln. Die fluidhaltigen Zellbruchstücke bestanden aus anscheinend gelösten und ungeordneten Klumpen von Drüsengewebe ohne Anzeichen von Gefäß-, Gang- oder Muskelbündelresten. Die 1-prozentige und die 0,1-prozentige Lösung von Triton X-100 waren in Kombination mit Kollagenase und Hyaluronidase nützlich. Lösungen von Triton X-100 ergeben bei Meerschweinchenprostatagewebe einen ähnlichen Auflösungsgrad wie Hyaluronidase und Elastase. Die relative Reihenfolge der Enzymaktivität gegenüber Meerschweinchenprostatagewebe ist wie folgt: Kollagenase > Pronase > Hyaluronidase = Triton X-100 = Elastase.

Beispiel 2

Prostatagewebestückchen vom Hund mit einem Gewicht von 500 mg, die in 1- prozentiger, 0,1-prozentiger und 0,01-prozentiger Kollagenaselösung bei 37 ºC inkubiert wurden, waren nach einer Stunde zu 84 bzw. 60 bzw. 19 Gewichts-% aufgelöst. Nach 2 Stunden bei 37 ºC waren 97,5 % bzw. 80 % bzw. 51 % des Gewebes aufgelöst. Glatte und quergestreifte Muskeln und die Wände verschiedener Gefäße und Gänge schienen relativ intakt geblieben zu sein. Die 1- prozentige Lösung ergab die vollständige Auflösung aller Gewebebestandteile, während bei der 0,1-prozentigen Lösung eine geringe Menge an glatten und quergestreiften Muskeln, Blutgefäßen und Gängen in der Lösung zurückblieb. Bei der Inkubation von Prostatagewebestückchen des Hundes mit 0,1-prozentiger Kollagenase bei 37 ºC ergab sich nach zwei Stunden keine Auflösung von Blasengewebe, Urethra, Übergangsepithel, glatter und quergestreifter Muskeln.
Die histologische Untersuchung der mit Kollagenase behandelten Prostatagewebestückchen vom Hund zeigte, daß ein Großteil des Stroma- und des Drüsengewebes aufgelöst und die Muskelbündel auseinandergefallen und ungeordnet waren. Kollagenbündel waren vollständig aufgelöst, während Gefäße und Gänge relativ intakt geblieben waren. In den Bereichen aufgelösten Gewebes fehlten Fibroblastkerne, und das Drüsenepithel war aufgelöst und in Klumpen von Zell- und Kernbruchstücken zerfallen.
Gefrorene Prostata vom Hund wurde in 0,05 M CBSCa 6,7 getaucht und während 30 Minuten bei 37 ºC aufgetaut. Das Organ wurde gereinigt und in 500-mg-Stückchen zerteilt. Hyaluronidaselösungen in CBSCa pH=6,7 (1 %, 0,1 % und 0,01 % entsprechend 16.000 U/ml, 1.600 U/ml und 160 U/ml) wurden frisch hergestellt. Die Hundeprostatagewebestückchen wurden gewoben und unter Rühren bei 37 ºC in Hyaluronidaselösungen in 0,05 M CBSCa 6,7 inkubiert. Nach 1 und 2 Stunden Inkubation bei 37 ºC wurden die Gewebestückchen herausgenommen und gewogen. Die unterschiedlichen Hyalurondiaselösungen ergaben einen relativ geringen Grad von Gewebeauflösung bei allen Bestandteilen der Hundeprostata. Das Hundeprostatagewebe widerstand der auflösenden Wirkung von Hyaluronidase weitaus besser als die Meerschweinchenprostata. Muskelbündel erschienen ausgefasert und mit aufgerollten Enden. Drüsenepithelzellen waren aufgelöst und schienen zu zerfließen. Blutgefäße und Gänge blieben intakt und ihr umgebendes Stroma organisiert.
Aufgrund der stark unterschiedlichen Selektivität, die Kollagenase und Hyaluronidase hinsichtlich der Substrataktivität zeigten, wurden verschiedene Kombinationslösungen dieser Enzyme auf ihre fähigkeit hin untersucht, Hundeprostatagewebe aufzulösen. In 0,05 M CBSCa pH=6,7 waren Kollagenase und Hyaluronidase miteinander kompatibel, und bei Zugabe von Hyaluronidase zu Kollagenaselösungen wurde eine deutliche Zunahme der Kollagenaseaktivität beobachtet. Kombinierte Kollagenase/Hyaluronidase-Lösungen erhöhten der Grad der Auflösung und erleichterten das Diffundieren der Lösung in Hundeprostatagewebe. Der höhere Grad an Prostatagewebeauflösung bei einer Kombination von Kollagenase und Hyaluronidase kann darauf zurückzuführen sein, daß Kollagen wegen der Depolymerisation der Mucopolysaccharide in der Grundsubstanz durch Hyaluronidase für Kollagenase leichter zugänglich ist. Die Aktivität dieser beiden Enzyme kann durch die Gegenwart von Tensiden und/oder durch Stimulation mit Schallwellen niedriger Frequenz weiter gesteigert werden.
Prostatagewebestückchen vom Hund, die mit Lösungen von Triton X-100 behandelt wurden, schienen nach 4-stündiger Inkubation bei 37 ºC relativ unempfindlich für das Tensid zu sein. In Kombination mit Kollagenase jedoch erhöhte Triton X-100 den Grad der Gewebeauflösung deutlich, da das Tensid die Exposition des Basalmembrankollagens gegenüber der auflösenden Wirkung von Kollagenase unterstützt.
Von den Hydrolasen höherer Spezifität sind Kollagenase und Hyaluronidase bei der Auflösung von Hundeprostatagewebe wirksamer als Elastase. Von den unspezifischen Proteasen war Pronase wirksamer als Dispase. Die relative Wirksamkeit der verschiedenen Enzymlösungen bei der Auflösung von Hundeprostatagewebestückchen ergab folgende Aktivitätsabstufung: Kollagenase > Hyaluronidase = Triton X-100 = Elastase > Pronase > Dispase.

Beispiel 3

Gefrorene Hundeprostata wurde in 0,05 M CBSCa 6,7 eingetaucht und während dreißig Minuten bei 37 ºC aufgetaut. Eine 0,1-prozentige Kollagenaselösung (2450 U/ml) wurde durch Auflösung von 10 mg Kollagenase in 10 ml CBSCa 6,7 frisch hergestellt. Die aufgetaute Prostata wurde in 50 ml CBSCa 6,7 suspendiert und mit 1 cm³ der Lösung an drei verschiedenen Stellen mit einer 22-g- Nadel mit einer Geschwindigkeit von 1 cm³/5 min injiziert. Die injizierte Prostata wurde 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Das Organ wurde aus dem Wasserbad herausgenommen, untersucht und seziert. Bei makroskopischer Untersuchung der injizierten Stellen zeigten sich einwärts gewölbte asymmetrische Bereiche, die sich anders als das nicht injizierte Gewebe bei Betastung weich und schwammig anfühlten. Bei der Sektion zeigten sich die Injektionsbereiche als kleine Taschen von Nekroseherden mit einem Durchmesser von etwa 1 cm, die mit zahlreichen Zellbruchstücken gefüllt waren. Das Organ schien stark muskelhaltig bei einem relativ geringen Anteil an Drüsenacini und Stützstroma. Gewebeauflösung war in großen Bereichen zu erkennen. Von gefrorenem Gewebe wurden zur mikroskopischen und histologischen Untersuchung eine Reihe von 8-um-Schnitten hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Bei histologischer Untersuchung von Hundeprostata, in die Kollagenase injiziert woorden war, zeigten sich Bereiche mit nicht abgebauten glatten und quergestreiften Muskeln, Gängen und Blutgefäßen.

Beispiel 4

Zusammensetzungen, die Kollagenase, Hyaluronidase und Triton X-100 enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Prostatagewebe vom Hund und vom Meerschweinchen aufzubrechen, abzubauen und aufzulösen. Die Eignung der Enzymkombination in Bezug auf Stabilität und Aufrechterhaltung der Aktivität der einzelnen Komponenten wurde mittels empfindlicher Farbtests der Enzymaktivität quantifiziert.
Gefrorene Prostata vom Hund und vom Meerschweinchen wurde in 0,05 M CBSCa 6,7 gegeben und während 30 Minuten bei 37 ºC aufgetaut. Es wurde eine 1-prozentige Lösung von Kollagenase/Hyaluronidase/Triton X-100 (CHT) hergestellt durch Auflösung von 26 mg Kollagenase (24.500 U/mg), 20 mg Hyaluronidase (1.600 U/mg) und 20 ul Triton X-100 in 2 ml CBSCa 6,7. In die Hundeprostata wurden mit einer 22-g-Nadel 2 cm³ injiziert. In die Meerschweinchenprostata wurden mit einer 25-g-Nadel 0,5 cm³ injiziert. Nach Injektion wurden die Prostaten bei 37 ºC drei Stunden lang in Reißverschlußbeuteln inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit waren die injizierten Bereiche der Hundeprostata leicht nch innen gewölbt, sehr weich und schwammig und enthielten eine große Menge Nekrosefluid. Bei makroskopischer Untersuchung der Meerschweinchenprostata nach Inkubation zeigte sich keine erkennbare äußere Gestalt, und alle anatomischen Merkmale waren verschwunden.
Die Gewebe wurden dann in Reißverschlußbeutel aus Polypropylen eingesiegelt und vier Minuten lang in eine Trockeneis/Aceton-Lösung (-80 ºC) getaucht und bei -20 ºC gelagert. Die gefrorenen, enzymbehandelten Gewebe wurden mit einem Mikrotom in Würfel geschnitten, und es wurden in einem Kryostat bei -40 ºC 8- um-Gefrierschnitte hergestellt. Die gefrorenen 8-um-Gewebeschnitte wurden auf einem warmen Objektträger geschmolzen, in 95-prozentigem Ethanol fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Außerdem wurden gefärbte Schnitte von gesundem Hunde- und Meerschweinchen-Prostatagewebe hergestellt.
Bei Hundeprostata, in die 1 cm³ einer 1-prozentigen Lösung von CHT injiziert worden war, zeigte sich die Auflösung von Stromakollagen und Drüsenacini und Auseinanderfallen, Ausfasern und Organisationsverlust bei den glatten und quergestreiften Muskelfaserbündeln. Fibroblastenkerne fehlten. Gefäße und Gänge blieben relativ intakt. Bei Meerschweinchenprostata, in die 1-prozentige CHT-Lösungen injiziert worden waren, zeigten sich die Schrumpfung und eine fast vollständige Auflösung von Kollagenbündeln und Drüsenacini. Glatte und quergestreifte Muskelfaserbündel waren auseinandergefallen und ausgefasert. Das Gangendothel schien aufgelöst. Enzymbehandelte Bereiche zeigten in Auflösung begriffenes Kollagen und glatte Muskelfaserbündel mit hochgradigem Organisationsverlust und ohne Kerne. Die Kerne des Drüsenaciniepithels waren hochgradig fragmentiert oder fehlten ganz, wodurch sich eine große Menge von Nekrosefluid und Zellbruchstücken ergab.

Beispiel 5

Biopsiepositiven Patienten nach TUR wurden Stückchen hypertrophierten menschlichen Prostatagewebes entnommen. Die Stückchen wurden in einen Probenbecher eingesiegelt und für den Transport ins Labor bei 4 ºC gelagert. Die untersuchten Gewebe wurden entweder sofort verwendet oder zur späteren Verwendung bei -20 ºC gelagert. Gefrorenes Gewebe wurde eingetaucht in 0,05 M citratgepufferte Salzlösung, die 20 mM Ca²&spplus; enthielt (pH=6,7), bei 37 ºC aufgetaut.
Gewebeproben von hypertrophierter Prostata, die bei der Prostatektomie gewonnen wurden, wurden in große Würfel (200 bis 500 mg) geschnitten und mit mehreren Kollagenasezubereitungen bei 37 ºC inkubiert. Die Fragmente wurden während 1 bis 5 Stunden leicht gerührt. Die Fragmente wurden in Stundenabständen entnommen, gewogen und in die Enzymlösung zurückgegeben. Es wurde die Wirkung von 0,1-prozentiger und 1-prozentiger CHT-Lösung auf menschliches Prostatagewebe bewertet und festgestellt, daß die Lösungen sehr wirksam sind zur Spaltung, zum Abbau und zur Auflösung von Stroma- und Epithelgewebe. Die Stückchen wurden vollständig zerlegt, wobei sich eine Suspension einzelner Stroma- und Drüsenzellen ergab. Nach dem Aufschluß waren die abgelösten Epithelzellen unter dem Phasenkontrastmikroskop immer noch als stäbchenförmige Zellen mit rundem Kern an einem Zellende und mit vielen Protoplasmakörnchen zu erkennen.
Bei der TUR gewonnene Stückchen von menschlichem Prostatagewebe wurden in einen lichtdichten Probenbecher gegeben, bei 4 ºC gelagert und ins Labor gebracht und bei -20 ºC eingefroren. Das Prostatagewebe wurde von einem 70- jährigen Mann (CAM) bei einer Biopsie zur Diagnose auf BPH und Adenokarzinom gewonnen. Bei makroskopischer Untersuchung schien die Probe aus drei verschiedenen Geweben zu bestehen, nämlich aus drüsigem, fibromuskulärem und knotigem Gewebe. Die gefrorenen Gewebestückchen der verschiedenen Gewebearten (drüsig, fibromuskulär und knotig) wurden in 0,05 M CBSCa 6,7 getaucht und während 30 Minuten bei 37 ºC aufgetaut. 1 %ige und 0,1 %ige CHT-Lösungen in 0,05 M CBSCa 6,7 wurden frisch hergestellt, indem 38 mg Kollagenase, 30 mg Hyaluronidase und 30 ul Triton X-100 in 3 ml des Puffers aufgelöst wurden. Die Lösung ergab ein Präparat mit 24.500 U/ml Kollagenase, 16.000 U/ml Hyaluronidase und 1 % Triton X-100. Die 0,1 %ige CHT-Lösung wurde durch Verdünnung der vorhandenen 1 %igen Lösung im Verhältnis 1:10 (300 ul 1 %ige CHT in 2,7 ml CBSCa 6,7) hergestellt. Die 0,1 %ige CHT-Lösung enthielt 2.450 U/ml Kollagenase, 1.600 U/ml Hyaluronidase und 0,1 % Triton X-100. Die Gewebestückchen wurden gewogen und in 1 %iger sowie in 0,1 %iger CHT-Lösung (500 ul/Stückchen) bei 37 ºC unter Rühren inkubiert. Die enzymbehandelten Gewebestückchen wurden nach 1 Stunde und nach 2 Stunden Inkubation herausgenommen und gewogen.
Je nach Gewebetyp wurde bei den mit CHT-Lösungen behandelten Prostatastückchen eine unterschiedliche Löslichkeit beobachtet. Drüsengewebe und das dazugehörige kollagene Stroma waren nach 2 Stunden vollständig aufgelöst. fibromuskuläres Gewebe war nach zwei Stunden unvollständig aufgelöst, jedoch war das Gewebe ziemlich weich, schwammig und amorph, was ein Anzeichen für die endgültige, wenn auch unvollständige Zersetzung des Gewebes war. Die fibromuskulären Bündel dagegen blieben relativ intakt. Bei mikroskopischer Untersuchung der nach 1- und 2-stündigem Aufschluß entstandenen Flüssigkeit, die auf Objektträgern an der Luft getrocknet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurde, zeigten sich vollständig aufgelöstes Drüsengewebe, frei dahintreibende Klumpen aufgelöster Drüsenacini, Reste verschiedener Gefäße und Gänge und andere Zellbruchstücke. Objektträger mit der nach 2-stündigem Aufschluß entstandenen Flüssigkeit zeigten die vollständige Auflösung aller drüsigen Anteile, wobei noch geringe Reste von Gefäßen und Gängen sichtbar waren. Elastische Fasern waren vorhanden. 1 %ige CHT-Lösungen ergaben eine vollständigere Zerstörung von Zellen und Stroma, während 0,1 %ige CHT-Lösungen zur unvollständigen Auflösung der verschiedenen Gewebeanteile führten, wobei Blutklümpchen und Konkremente unlöslich blieben.
Bei lichtmikroskopischer Untersuchung der nach der Behandlung von BPH-Gewebe mit Kollagenase gewonnenen Epithelklumpen waren stark fragmentierte Drüsenacini zu erkennen. In den Epithelklumpen der Zellbruchstücke wurden keine Stromaanteile gefunden. Die Untersuchung von Stroma ergab kompakte fibromuskuläre Bündel mit deutlichen Lücken in der Matrix, wo zuvor das Drüsenepithel gewesen war. Es waren fast keine Epithelzellen übriggeblieben, und eine deutliche Schädigung von Fibroblasten und glatten Muskelzellen war erkennbar. Es wurden jedoch einige wenige intakte Fibroblasten mit Kern gefunden. Fibromuskuläres Gewebe, das nach 2 Stunden in 1 %iger CHT-Lösung bei 37 ºC nicht aufgelöst war, enthielt eine große Anzahl elastischer Fasern. Die Muskelfaserbündel waren ausgefasert, durcheinandergeraten und im Anfangsstadium der Auflösung. Muskelgewebe war ungeordnet, und es waren Reste von Gefäßen und Gängen zu erkennen.
Lösungen von Kollagenase/Hyaluronidase/Triton X-100 mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 % waren hochwirksam zur Auflösung von Stückchen hypertrophierten menschlichen Prostatagewebes, die bei TUR gewonnen wurden. Die knotigen fibromuskulären Bereiche waren mit CHT-Lösungen nicht so leicht aufzulösen wie Drüsen- oder Epithelgewebe. Im Lauf der Zeit waren jedoch alle Anteile von Stroma- und Epithelgewebe aufgelöst. Nach Injektion wurden Knötchen weich und verkleinerten sich. Es wurden dauerhafte, mit H und E gefärbte 8-um-Gewebeschnitte hergestellt, die die gewebeaufschließende, -abbauende und -auflösende Wirkung von 0,1 %igen und 1 %igen CHT-Lösungen auf Stückchen von menschlichem Prostatagewebe mit Adenokarzinom und BPH zeigen.

Beispiel 6

Stückchen von menschlichem Prostatagewebe wurden bei TUR gewonnen, in 500-mg- Portionen unterteilt und 30 Minuten in citratgepufferter Salzlösung eingeweicht. In hyperplastische knotige Bereiche wurden 0,1 bis 1 cm³ 0,1 %iger und 1 %iger Lösungen der Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase, die Triton X- 100 und Gentamicin enthielten (CHTG), jeweils in citratgepufferter calciumhaltiger Salzlösung bei pH=6,7, injiziert. Nach Injektion wurde das Gewebe bei 37 ºC für die Dauer von 1 bis 5 Stunden in einem Glasgefäß inkubiert. Gewebeproben wurden zusammen mit Proben von Prostatazellsuspensionen, die das Ergebnis des enzymatischen Aufschlusses waren, eingefroren, im Kryostat in 8-um-Schnitte geschnitten, in 95 %igem Ethanol fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
In Stückchen menschlichen Prostatagewebes, das fibromuskuläre Knötchen enthielt, wurden 0,3 cm³ einer 1 %igen und einer 0,1 %igen CHTG-Lösung mit einer 25-g-Nadel injiziert und die Stückchen dann drei Stunden bei 37 ºC inkubiert. Die ersten 0,1 cm³, die injiziert wurden, führten zum Anschwellen des Knötchens, und die restlichen 0,2 cm³ hatten die Neigung, aus den angeschnittenen Oberflächen des Knötchens auszutreten. Die behandelten Stückchen wurden bei -20 ºC eingefroren und zur Herstellung von Schnitten und Gewebeanfärbung mit Hämatoxylin und Eosin aufbewahrt. Nach drei Stunden bei 37 ºC erschienen die fibromuskulären Knötchen, in die die Injektion vorgenommen worden war, bei makroskopischer Untersuchung weich, amorph und um die Injektionsstelle herum zurückgebildet. Diese Untersuchungen zeigten, daß 1 %ige CHTG-Lösungen zur Auflösung von menschlichem Prostatagewebe wirksamer sind als 0,1 %ige Lösungen. Das adenomatöse (drüsige) Gewebe hat auf die auflösende Wirkung des proteolytischen Gemischs stärker angesprochen als rein fibromuskul äres Gewebe.
Die histologische Untersuchung der Knötchen, in die injiziert worden war, ergab Taschen von Nekroseherden mit einem Durchmesser von etwa 1 cm. Die die Injektionsstelle unmittelbar umgebenden Bereiche der Nekroseherde waren nur schwer von den allgemeinen, diffusen Bereichen der Gewebeauflösung und -desintegration zu unterscheiden. Die Bereiche mit vollständiger Auflösung bildeten eine allmähliche Übergangslinie zu den Bereichen weniger vollständiger Gewebezersetzung.
Eine eindeutige Kollagenolyse erfolgte bei den Knötchen, in die injiziert worden war, in einem Radius von 0,5 bis 1,5 cm um die Injektionsstelle herum. In behandeltem Gewebe verschwanden Kollagenfaserbündel, wobei das gelöste Kollagen sich schwach färbte und luftleer erschien. In den Bereichen, in denen das Kollagen vollständig aufgelöst worden war, blieben elastische Fasern erhalten. 1 %ige CHTG-Lösungen waren hochwirksam bei der vollständigen Auflösung von Drüsengewebe, kollagenem Stroma und der Grundstubstanz des menschlichen Prostatagewebes. Die Lösung war weniger wirksam bei den Anteilen glatter Muskeln, jedoch wurde ein Organisationsverlust bei den Muskeln und eine Auflösung von Muskelfaserbündeln beobachtet.
Prostataknötchen, in die injiziert worden war, zeigten insgesamt eine beträchtliche Abnahme von Größe und Gewicht. Unter dem Mikroskop zeigten die behandelten Knötchen im Vergleich zu dem dichten, kompakten Kollagen bei unbehandelten Gewebe in weiten Bereichen ein Ausfasern und einen Zerfall von Kollagenfaserbündeln. Das Gemisch von Kollagenase und Hyaluronidase bewirkte in vitro eine ausgedehnte Auflösung von Epithel- und Stromaanteilen des Prostatagewebes. Das Ausmaß der enzymatischen Gewebeauflösung stand in Zusammenhang mit der eingesetzten Dosis. Die menschliche Prostata ist schwammig, ziemlich porös und aus vielen Drüsen und Gängen zusammengesetzt, die die ziemlich rasche Ableitung injizierter Enzymlösungen über die Harnröhre stark begünstigen. Der Grad der Solubilisierung von Prostatagewebe wird durch die verabreichbare Dosismenge begrenzt. Bei Erhöhung der Hyaluronidasedosis nehmen Diffusion und Ausbreitung des Gemischs von der Einbringungsstelle aus zu. Die verstärkte Diffusion steht in Zusammenhang mit dem Abbau der Mucopolysaccharid-Grundsubstanz, die das Kollagen im Bindegewebe einbettet, unterliegt jedoch nicht der Wirkung von Kollagenase.
In Stückchen menschlichen Prostatagewebes, die bei TUR gewonnen wurden und hyperplastische Knötchen benignen hypertrophierten und malignen adenomatösen Gewebes enthielten, wurden unterschiedliche Konzentrationen hydrolytischer Enzyme injiziert. Wirksame Konzentrationen von Hyaluronidase und Kollagenase ergaben einen makroskopisch sichtbaren Bereich der Auflösung von Prostatagewebe um die Injektionsstelle herum. Der Durchmesser der Auflösung oder Nekrose war nicht größer als der Durchmesser der Luftblase, die sich bei Injektion bildete. Geringere Enzymdosen ergaben eine mikroskopisch erkennbare Solubilisierung, wobei die Bereiche der mikroskopisch kleinen Nekroseherde in etwa die Größe der anfänglichen Injektionsblase hatten.
Die Enzyme Kollagenase und Hyaluronidase haben sich bei Verabreichung in wirksamer Menge durch intraprostatische Injektion in vitro als wirksam zur Auflösung von Prostatagewebe erwiesen. Auflösungsbereiche blieben auf das subkapsuläre Gewebe und auf dessen unmittelbre Umgebung innerhalb des Lappens, in den die Injektion vorgenommen worden war, beschränkt. Überall im Drüsengewebe zeigten sich verstreute Nekrosebereiche. Der Prozentsatz an aufgelöstem Gewebe war anscheinend direkt dosisbezogen, da bei Erhöhung der Hyaluronidasedosis eine Vergrößerung des Lyseradius erreicht wurde.

Beispiel 7

Zur Bewertung der Sicherheit und der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wurden Injektionen der Zusammensetzung in vivo gemäß einem genehmigten GLP-Protokoll am Tiermodell Hund vorgenommen. Das Ausmaß der Nekrotisierung von Prostatagewebe wurde durch Ultraschalluntersuchung in vivo und in vitro sowie durch makroskopische und mikroskopische Untersuchung von bei Obduktion gewonnenem Gewebe ermittelt. Die gewebspathologische Untersuchung der Wirkungen der Testzusammensetzung umfaßte die Untersuchung von Prostata, Harnröhre, Blase, Hoden, Nieren, Leber, Herz und Lunge. Zusätzlich wurden die dem Injektionsstelle benachbarten Gewebe auf Strikturen, Fisteln, Verklebungen und Granulome untersucht.
In die Untersuchungsprotokolle wurde aufgenommen: die Vorgeschichte und die Körperdaten des Tieres (ungefähres Alter, Gewicht, Rasse); Datum der durchgeführten Maßnahmen; Aufstellung des klinischen fortschritts und von Abwehrreaktinen; Ergebnisse der Laboruntersuchungen; verabreichte Medikamente (Datum, Dosis und Verabreichungspfad); Ultraschallbilder; Prostatagewicht; Protokolle der Obduktion und der gewebspathologischen Untersuchung sowie Dias. Es wurden Aufstellungen des klinischen Fortschritts des Tieres geführt, in denen insbesondere Auftreten, Ausmaß und Dauer von Hämaturie, Hämospermie, Harnwegsinfekten, Harnverhaltung und die verabreichten Medikamente während der gesamten Dauer der Protokollerstellung festgehalten wurden. Harnverhaltung wurde durch Überwachung von Flüssigkeitsaufnahme und -abgabe sowie durch analytische Bestimmung von Blutharnstoffwert, Kreatinin und Elektrolytkonzentration ermittelt.
Zur Herstellung einer zur parenteralen Verabreichung geeigneten Lösung der offenbarten Zusammensetzung wurden mit frisch destilliertem, entmineralisiertem, sterilem, pyrogenfreiem Wasser (Gibco, Grand Island, NY) 100 ml 0,05 M citratgepufferte Salzlösung, die 20 mM CaCl&sub2; enthielt (pH=6,7, CBSCA) hergestellt. Es wurden 1 ml Triton X-100 und 1,5 ml einer sterilen 10-mg/ml- Lösung von Gentamicinsulfat (Sigma) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 Vol-% Triton X-100 und 150 mg/ml Gentamicin (CBSCA-TG) zu erhalten.
In CBSCA-TG wurden Lyophilisate von Kollagenase (Typ XI-S, Sigma) und Hyaluronidase (106-500, Boehringer Mannheim) rekonstituiert, um eine Endenzymkonzentration von twa 01 % (2.450 U/ml Kollagenase und 1.600 U/ml Hyaluronidase) zu erhalten. Kollagenase (50 mg, Chargen-Nr. 17F-6814, 1.970 U/mg) und Hyaluronidase (40 mg, Chargen-Nr. 10372425-19, 1.600 U/mg) wurden zu 4 ml CBSCA-TG hinzugegeben, wobei sich eine etwa 1 %ige Vorratslösung von Kollagenase (24.500 U/ml) und Hyaluronidase (16.000 U/ml) (CHTG) ergab. Eine 0,1 %ige Einsatz-CHTG-Lösung wurde durch Verdünnen der 1 %igen CHTG-Vorratslösung im Verhältnis 1:10 hergestellt. Eine Teilmenge 1 %iger CHTG (700 11) wurde verdünnt und mit 6,3 ml CBSCA-TG vermischt. Die sich ergebende 0,1 %ige CHTG-Lösung enthielt eine Endkonzentration von etwa 2.450 U/ml Kollagenase, 1.600 U/ml Hyaluronidase, 1 % Triton X-100 (Vol-%) und 150 lg/ml Gentamicinsulfat.
Zur Endotoxinentfernung wurde eine 1-ml-Detoxi-Gel -Säule (Pierce) bei Zimmertemperatur mit CBSCA-TG equilibriert, indem 10 Säulenvolumina des Puffers mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 10 ml/h durch die Säule hindurchgeleitet wurden. 7 ml der 0,1 %igen CHTG-Lösung wurden in die Säule gegeben und unter aseptischen Bedingungen mit einer fließgeschwindigkeit von etwa 6 bis 8 ml/h in ein steriles, pyrogenfreies Reagenzglas aus Kunststoff eluiert. 6 ml des pyrogenfreien Eluats (0,1 %ige CHTG) wurden aufgefangen und sterilfiltriert, indem die Lösung durch ein geprüftes steriles, pyrogenfreies Einmal-Polysulfon-Spritzenfilter (0,2 lm) in ein steriles, pyrogenfreies Reagenzglas aus Kunststoff geleitet wurde. Eine Teilmenge von 1 ml der sterilgefilteren, pyrogenfreien 1 %igen CHTG-Lösung wurde aseptisch zur Prüfung auf Endotoxine und Enzymaktivität entnommen. Präparate von 0,1 %iger CHTG, die weniger als 1,0 EU/ml (LAL-Pyrogen-farbtest - Whittaker) und eine Enzymaktivität für Kollagenase mit einer optischen Dichte größer 1,0 bei 520 nm (Azocoll -Test) und für Hyaluronidase mit einer optischen Dichte größer 0,2 bei 585 nm (NAGA-Test) zeigten, wurden routinemäßig für parenterale Injektionen in vivo freigegeben.
Ein willkürlich ausgewählter, 33 kg schwerer, ausgewachsener Hunderüde kam vorbereitet und Herzwurm-negativ (Dirofilaria-immitis-negativ) an. Durch physische Untersuchung, Herstellung eines vollständigen Blutbilds, Serumdiagnostik, Harnuntersuchung und quantitative Harnkultur wurde die Gesundheit des Versuchstiers bestätigt. Vor der experimentellen Injektion der Testzusammensetzung wurde das Tier 24 Stunden lang nicht gefüttert. Zwei Stunden vor der intraprostatischen Injektion der Zusammensetzung wurden dem Tier prophylaktisch Gentamicin (1 bis 3 mg/kg) intramuskulär gespritzt und ein Klistier mit warmem Wasser verabfolgt.
Der Versuchshund (8HC55) erhielt eine Basisnarkose mit einer Kombination von Atropinsulfat (0,04 mg/kg) und Acetylpromazinmaleat (0,1 mg/kg), die intramuskulär verabreicht wurde. Die Narkose wurde mit 4,8 ml intravenös verabreichtem Oxymorphin (1,5 mg/ml) bewirkt. Unmittelbar vor der Injektion der Testzusammensetzung wurde eine transabdominale Basisuntersuchung der Prostata mittels Ultraschall vorgenommen und auffilm aufgezeichnet. Der von der Prostata umgebene Harnröhrenabschnitt wurde mit einem französischen 5-7- Ballonkatheter (Swan Ganz Catheter, Edwards Laboratories, Santa Ana, CA) katheterisiert. Die Ballonspitze des Katheters wurde unter Ultraschallkontrolle zentral im von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitt plaziert und mit Salzlösung entfaltet, um den sofortigen Abfluß der injizierten Testzusammensetzung durch die Harnröhre zu verhindern.
Die transrektale intraprostatische Injektion der Testzusammensetzung wurde unter Ultraschallkontrolle mittels einer leicht gebogenen, flexiblen Aspirations-Biopsienadel (22 g x 20 cm) in Verbindung mit einer Franzen-Nadelführung (Precision Dynamics, San Fernando, CA) vorgenommen. Nadelführung und behandschuhter Zeigeführer wurden in das Rektum eingeführt. Die Prostata wurde digital betastet, während die Nadel durch die Führung eingeführt und in die Prostata vorgeschoben wurde. Etwa 2,5 ml der Zusammensetzung (0,1 %ige CHTG) wurden in den rechten Prostatalappen injiziert, wobei der linke Lappen als Vergleichsmaßstab diente.
Nach der Injektion wurden die Lebenszeichen auf Symptome einer toxischen, allergischen oder sonstigen Abwehrreaktion überwacht. Das Swan-Ganz-Katheter wurde 2 Stunden nach der Injektion entfernt, wobei eine geringe Menge blutig gefärbter Flüssigkeit beobachtet wurde. Das Tier machte gute Fortschritte und zeigte keine Anzeichen oder Symptome einer Abwehrreaktion. Der klinische Verlauf bei dem Tier war während der gesamten achttägigen Beobachtung unkompliziert und ereignislos. Am Tag nach der Injektion wurden eine transabdominale Ultraschalluntersuchung der Prostata vorgenommen sowie Blut- und Urinproben entnommen. Am letzten Tag der Beobachtung wurden eine weitere transabdominale Ultraschalluntersuchung in vivo vorgenommen und weitere Blut- und Urinproben zur Kontrolle, Analyse und Kultur entnommen.
Acht Tage nach der Injektion wurde das Tier mit einer intravenösen Überdosis vo Natriumpentobarbital getötet und sofort obduziert. Die Prostata wurde mit einem Mittel schnitt freigelegt, herausgenommen, von einem Übermaß an Zellbruchstücken befreit und gewogen. Die herausgeschnittene Prostata wurde in einen Behälter mit Salzlösung gelegt und in vitro mittels Ultraschall untersucht. Nach der Untersuchung wurde die gesamte Prostata in etwa 0,5 cm dicke Querschnitte geschnitten, fotografiert und für die gewebspathologische Untersuchung unter dem Mikroskop vorbereitet. Die Querschnitte der Prostata enthielten die Harnröhrenschleimhaut und den Außenrand der Prostata. Die Gewebeschnitte wurden sofort in 10 %igem neutralem, phosphatgepuffertem Formal in fixiert und in Paraffin eingebettet, und es wurden Dünnschnitte von 6 um auf Objektträger aufgebracht und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Dann wurden die fixierten und gefärbten Gewebeschnitte unter dem Hellfeld-Lichtmikroskop auf Infarkte, Blutungen, Nekrose, Kollagenauflösung und Strukturveränderungen untersucht. Es wurde darauf geachtet, die anatomisch korrekte Ausrichtung zu erhalten, um mit dem Ultraschallbild vergleichen zu können.
Bei der Autopsie hatte der Versuchshund (8HC55) ein Körpergewicht von 27 kg. Repräsentative Proben von Blase, Urethra, Hoden, Nieren, Leber, Herz und Lunge wurden entnommen und in 10 %igem neutralem, gepuffertem Formal in fixiert. Die Gewebe wurde in Paraffin eingebettet, und es wurden 6 um dicke Dünnschnitte gemacht, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und unter dem Mikroskop untersucht. Es wurde nach Schäden an lebenswichtigen Organen (Herz, Lunge, Leber, Nieren), Nachbargewebe (Blase, Urethra, Hoden), Freilegung des Epithels am von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitt, Strikturen, Fisteln, Verklebungen und Granulomen an oder in der Nähe der Injektionsstelle gesucht.
Die makroskopische Untersuchung des Unterbauchraums ergab eine elliptische blutende Läsion, die auf den rechten Prostatalappen beschränkt war. Die ventrale Oberseite des rechten Prostatalappens war dunkelrot und etwa von der Mitte bis zum schwanzwärts gerichteten Prostataende verdickt. Die Prostatadrüse maß 3,0 x 3,4 x 2,2 cm und wog 17,4 g. Das Gewichtsverhältnis Organ/- Körper betrug 0,65 g/kg. Der Beckenabschnitt der Harnröhre, die Blase, die Hoden, die Nieren, die Harnleiter, die Leber, das Herz und die Lunge erschienen makroskopisch normal. Es fanden sich keine Anzeichen für injektions- /enzymbedingte Läsionen in den Beckenlymphknoten. Eine periurethrale Blutung war zu sehen.
Die Prostataquerschnitte zeigten einen dunkel roten Blutungsbereich mit einem Durchmesser von 1 cm im unteren rechten Quadranten der Drüse von der Mitte bis zum schwanzwärts gerichteten Ende des rechten Lappens. Die blutende Läsion schien auf die versuchsweise Injektion der Testzusammensetzung zurückzuführen sein. Unter dem Mikroskop war der Nekrosebereich an der Enzyminjektionsstelle hauptsächlich im mittleren Prostataquerschnitt lokalisiert und betraf mehrere benachbarte Läppchen im ventromedianen Bereich des rechten Lappens. Es zeigte sich ein Zerfall der Lappenstruktur mit Nekrose der Alveolarwände und großen Ablagerungen von Fibrin und Erythrozyten. Im Nekrosebereich fehlten bemerkenswerterweise Entzündungszellen. Das Prostatastroma in der Nähe akuter Nekrosebereiche zeigte Blutungsherde, Kollagenzerfall, Degeneration und Nekrose glatter Muskeln und eine Wucherung von Fibroblasten.
An Prostataläppchen im Bereich der Injektionsstelle waren sowohl Epithel- als auch Stromaveränderungen zu sehen. Mit kubischen Epithelzellen ausgekleidete Alveoli enthielten vielfach flockiges oder homogenes Sekretmaterial. Das Zwischenlappenstroma und die Trabeculae waren blaß und durch Erythrozyten und Lücken getrennt. Der innere Bereich der Prostata angrenzend an den Scheitel der nekrotisierten Prostataläppchen zeigte Blutungen im Stroma und zerplatzte periurethrale Drüsen. Das Epithel des von der Prostata umgebenen Harnröhrenabschnitts war intakt, obwohl die Lichtung der Harnröhre durch den Entzündungsprozeß verändert erschien.
Degenerative Veränderungen wurden auch an Bündeln quergestreifter Prostatamuskelfasern festgestellt, darunter Nekrose, Myelose, Vakuolenbildung im Zytoplasma, faseratrophie und Proliferation von Sarkolemm-Zellkernen. Im Stroma zwischen quergestreiften Muskelfaserbündeln wurden Blutungen und fibrinoide Arteriitis (ein Gefäß) festgestellt. Die Wände einiger Kapselarterien waren teilweise durch fibrinoide Veränderungen ersetzt. Ferner wurden perivenöse Fibrinoidablagerungen festgestellt. Der Querschnitt aus dem Bereich vor der Injektionsstelle schien einen enzymatisch abgebauten Raum mit unregelmäßiger Umfangslinie aufzuweisen. Der Querschnitt aus dem von der Injektionsstelle aus unmittelbar schwanzwärts gerichteten Bereich zeigte einen Blutungsherd im periurethralen Stroma, jedoch keine Parenchymveränderungen.
Im adipösen Gewebe um die Urethra herum an deren Übergangsstelle zur Prostatadrüse waren Blutungen und Fibrinablagerungen zu sehen. Die Außenwand des quergestreiften Harnröhrenmuskels zeigte degenerative Veränderungen vergleichbar mit den oben beschriebenen. Der größte Teil der Urethra mit Ausnahme von Muskelfasern in der Peripherie der Tunica muscularis und des periurethralen adipösen Gewebes war normal. Es wurden lokale Veränderungen im periurethralen Fett, beispielsweise Blutungen, Fibrinablagerungen und fibrinoide Arteriitis (eine Arterie) festgestellt. Benachbarte quergestreifte Muskelfasern waren degeneriert.
Kein anomaler gewebspathologischer Befund im Zusammenhang mit der Injektion der Testenzymzusammensetzung wurde festgestellt bei Harnblase, Hoden, Samenkanälchen, Nieren, Leber, Herz und Lunge. Auf die Versuchsinjektion der Enzymzusammensetzung zurückgeführte Prostataveränderungen fanden sich hauptsächlich im Korpus im ventralen Abschnitt des mittleren Drittels des rechten Lappens. Es wurden Zerstörungen im inneren Bereich der Prostata, nicht jedoch in dem von der Prostata umgebenen Harnröhrenbereich festgestellt. Strikturen, Fisteln, Verklebungen und Granulome an oder in der Umgebung der Injektionsstelle wurden nicht gefunden. Die mikroskopischen Veränderungen der Prostata bestanden hauptsächlich in blutiger Nekrose, von der Stroma- und Epithelzellen betroffen waren, wobei die Läppchenstruktur zerfiel, Kollagen fragmentiert wurde und glatte Muskeln degenerierten und nekrotisieren.

Beispiel 8

Zur weiteren Bewertung von Sicherheit und Wirksamkeit der offenbarten Zusammensetzung wurden Langzeitstudien (60 Tage) am Tiermodell Hund anhand eines genehmigten GLP-Protokolls durchgeführt. Die Wirkungen der intraprostatischen Injektion der Zusammensetzung in vivo wurden durch Laboranalyse von Blut- und Urinproben, durch Ultraschalluntersuchungen in vivo und in vitro sowie durch die makroskopische und die mikroskopische Untersuchung von Autopsiegewebe bewertet.
Bei Eintreffen wurde ein willkürlich ausgewählter, 28 kg schwerer, vorbereiteter, ausgewachsener Hunderüde (8IC76) ärztlich untersucht. Die Gesundheit des Versuchstiers wurde durch Laboruntersuchungen, darunter voll ständiges Blutbild, Serumuntersuchungen, Harnuntersuchungen und quantitative Harnkultur, bestätigt. Die Injektionszusammensetzung wurde wie oben beschrieben hergestellt und enthielt 2.400 U/ml Kollagenase, 1.600 U/ml Hyaluronidase, 1 Vol-% Triton X-100, 150 ug/ml Gentamicin und 20 mM CaCl&sub2; in 0,05 M citratgepufferter Salzlösung (pH=6,7). Pyrogenentfernung und Sterilfiltration ergaben ein Präparat (Injektionszusammensetzung "G"), das beim LAL-Pyrogenfarbtest einen Endotoxingehalt von 0,29 EU/ml aufwies. 24 Stunden vor der operativ unterstützten direkten intraprostatischen Injektion der offenbarten Enzymzusammensetzung wurde das Labortier nicht mehr gefüttert.
Am Tag 1 des Protokolls erhielt das Tier zwei Stunden vor der intraprostatischen Injektion der Zusammensetzung prophylaktisch eine intramuskuläre Injektion von Gentamicin (1 bis 3 mg/kg) und ein Klistier mit warmem Wasser. Es wurde kein Harnkatheter gesetzt. Das Tier wurde narkotisiert, durch Laparatomie wurde die bauchzugewandte Seite der Prostatakapsel freigelegt, und es wurden etwa 3,5 cm³ der Injektionszusammensetzung "G" (mit einer 22 g/1,5"-Nadel) direkt in den rechten Prostatalappen injiziert (wobei ein Z- förmiger Nadelpfad entstand). Der linke Prostatalappen diente dem Vergleich.
Nach der Injektion wurden die Lebenszeichen auf Anzeichen toxischer, allergischer oder sonstiger Abwehrreaktionen überwacht. Die Genesung des Tiers verlief normal, und es wurden keine Anzeichen oder Symptome einer Abwehrreaktion auf die Injektionszusammensetzung beobachtet. Der klinische Verlauf war komplikationslos, da das Tier während der gesamten Dauer des 60-Tage- Protokolls klinisch unauffällig blieb. Am Tag nach der Injektion wurden eine transabdominale Ultraschalluntersuchung der Prostata durchgeführt sowie Blutund Urinproben genommen. Bei der Urinuntersuchung am Tag 2 des Protokolls wurde Blut im Urin gefunden. Die Laboruntersuchungen an den Tagen 7, 15, 29 und 58, darunter voll ständiges Blutbild, Urinuntersuchungen, Urinkulturen und Serumprofile, blieben sämtlich im Bereich normaler Werte. Die Urinuntersuchung am Tag 58 ergab einige Spermatozoen. Zusätzlich wurden an den Tagen 7, 15, 29, 43 und 50 des Protokolls nichtinvasive transabdominale Ultraschalluntersuchungen der Prostata in vivo vorgenommen und auf Film aufgezeichnet.
Während der gesamten Dauer der Auswertung wurde der rechte Prostatalappen asymmetrisch ausgehöhlt, wobei die Größe der Prostata sich insgesamt zu verringern schien. Dementsprechend bildeten sich mit der Zeit auch die Ausmaße der enzyminduzierten nekrotischen Läsion zurück. Die direkte intraprostatische Injektion der Enzymzusammensetzung bewirkte insgesamt eine Größenabnahme und die asymmetrische Schrumpfung des rechten Prostatalappens an und in der Nähe der Injektionsstelle. Die enzyminduzierte Läsion, Rückbildung und Schrumpfung des rechten Prostatalappens erschien auf dem Sonogramm als Aushöhlung und makroskopisch als Einbuchtung oder eingefallener Bereich.
Die "blinde" Durchsicht der transabdominal in vivo im Verlauf des Protokolls für den Hund 81C76 gewonnenen Sonogramme (in denen Hypoechobereiche Bereiche von Gewebsnekrose, Blutung und Ödeme anzeigen) brachte folgende Ergebnisse:
An Tag 7 maß die Prostata 3 x 3 cm und zeigte symmetrische Lappen. Im rechten Lappen wurde vom vorderen Ventralabschnitt bis zum mittleren Dorsalabschnitt des Lappens ein auffallender Hypoechobereich mit den Maßen 2,5 x 1,5 cm gefunden.
An Tag 15 maß die Prostata 3 x 3 cm, zeigte symmetrische Lappen und Bereiche mit unregelmäßig verteilten Hypoechozentren mit den Maßen 1,5 x 1,5 cm am vorderen Ventralabschnitt des rechten Lappens.
An Tag 29 maß die Prostata 3 x 2,5 cm, hatte asymmetrische Lappen und zeigte ein Hypoecho-Koaleszenzzentrum mit den Maßen 1,5 x 1,5 cm am vorderen Ventralabschnitt des rechten Lappens.
An Tag 43 maß die Prostata 3 x 2,5 cm, wobei der rechte ventrale Lappen eine leichte Aushöhlung und ein einheitlicheres Hypoecho-Koaleszenzzentrum zeigte. Die Hypoecholäsion maß 1,25 x 1,25 cm.
An Tag 58 maß die Prostata 3 x 2,5 cm, wobei der rechte ventrale Lappen leicht asymmetrisch (weniger rund) und ausgehöhlt erschien. Hypoechobereiche, die Nekroseläsionen, Blutungen oder Ödeme anzeigen, wurden nicht gefunden.
Am letzten Tag des Protokolls - 58 Tage nach der Injektion - wurde das Tier mit einer intravenös verabreichten Überdosis Natriumpentobarbital getötet und sofort autopsiert. Die herausgenommene Prostata wurde in einen Behälter mit Salzlösung gegeben und in vitro mittels Ultraschall untersucht. Die In-vitro- Ultraschalluntersuchung der injektionsbehandelten Prostata ergab eine Prostatagröße von 3 x 2,75 cm und einen Hypoechobereich von 1,5 x 1,25 cm im ventralen und im mittleren Bereich des rechten Prostatalappens. Die rechte ventrale Oberseite des rechten Lappens erschien leicht eingebuchtet. Während des gesamten Protokolls schien die Größe des rechten Prostatalappens insgesamt abzunehmen.
Nach der Ultraschalluntersuchung wurde die gesamte Prostata in etwa 0,5 cm dicke Querschnitte geschnitten, photographiert und zur gewebspathologischen Untersuchung unter dem Mikroskop vorbereitet. Es wurde darauf geachtet, die anatomisch richtige Ausrichtung beizubehalten, um einen Vergleich mit den Sonogrammen herstellen zu können. Die Querschnitte der Prostata umfaßten auch die Harnröhrenschleimhaut und den Außenrand der Prostata. Die Gewebeschnitte wurden in Formal in fixiert und in Paraffin eingebettet, und es wurden Dünnschnitte hergestellt, auf Objektträger gebracht und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Dann wurden die fixierten und gefärbten Prostatagewebeschnitte unter dem Hellfeld-Lichtmikroskop untersucht.
Bei der Autopsie hatte der Versuchshund 8IC76 ein Körpergewicht von 27 kg. Die Operationsstelle in der Leistengegend war gut ausgeheilt. Es wurden repräsentative Proben von Prostata, Blase, Harnröhre, Hoden, Nieren, Leber, Herrz und Lunge entnommen und für die gewebspathologische Untersuchung vorbereitet. Zusätzlich wurden die an die Injektionsstelle angrenzenden Gewebe auf Anzeichen von Strikturen, Fisteln, Verklebungen und Granulomen untersucht.
Bei der makroskopischen pathologischen Untersuchung des Unterbauchraums zeigte sich eine kleine Prostatadrüse, die keine Verklebungen zwischen der Kapsel und dem dem Rücken zugewandten rektogenitalen Bereich aufwies. Der rechte Prostatalappen zeigte an der vorderen seitlichen Oberseite eine Einbuchtung bzw. einen eingefallenen Bereich mit einem Durchmesser von etwa 1,3 cm. Diese Läsion war etwa 1 cm von dem dem Schädel zugewandten Ende der Prostatadrüse entfernt. Die Prostatadrüse wog 18,74 g und maß 3,5 x 3,2 x 2,4 cm. Das Gewichtsverhältnis Organ/Körper betrug 0,70 g/kg. Querschnitte der Prostata zeigten einen 1,2 cm tiefen, dunkelgelben, dreieckigen Bereich, dessen Scheitel gegen den periurethralen Prostataabschnitt gerichtet war. Dieser Bereich zeigte sich in der zweiten, 0,5 cm dicken Querschnittsscheibe der Prostata in der Mitte zwischen der bauchzugewandten und der rückenzugewandten Oberfläche des rechten Lappens. Andere Scheiben der Prostata waren in Farbe und Textur weitgehend normal. Weitere Anomalien wurden im urogenitalen Bereich nicht festgestellt. Im Brustraum wurden kein wesentlichen Läsionen gefunden, die auf die Versuchsinjektion hätten zurückgeführt werden können. Der eingesunkene Bereich am rechten Prostatalappen schien auf die Versuchsinjektion der Zusammensetzung zurückzuführen sein.
Das gewebspathologische Bild der Prostata war von Läppchen zu Läppchen und vom rechten zum linken Lappen unterschiedlich, wodurch die Interpretation der Injektionswirkungen erschwert wurde. An der vermuteten Injektionsstelle war ein Prostataläppchen fast gänzlich atrophiert. Das zeigte sich durch Atrophierung der Prostataalveoli und -gänge mit entsprechender Vermehrung des fibromuskulären Stromas im Läppchen. Die das atrophierte Läppchen und mehrere benachbarte Läppchen bedeckende Prostatakapsel war verdickt und fibrotisch.
Kapsel und atrophiertes Läppchen waren mit einer geringen Population von Makrophagen (viele pigmentiert), Plasmazellen und Lymphozyten infiltriert. In der Lichtung einiger Drüsen wurden ein paar Ansammlungen von hyperplastischem Epithel mit oder ohne Stromakerne gefunden. In dem an das atrophierte Prostataläppchen angrenzenden Bereich waren die die Harnröhre umgebenden Prostatadrüsen und -gänge weitgehend durch Stroma ersetzt. Ein dem atrophierten Läppchen benachbartes Prostataläppchen zeigte ebenfalls einen lokal ausgedehnten Bereich interstitieller Fibrose, allerdings eine weniger schwerwiegende Drüsenatrophie. Es hatte also den Anschein, als ob die Injektionsstelle im rechten Prostatalappen sich auf mehrere benachbarte Prostataläppchen ausgewirkt hätte. Allerdings wies auch der linke Prostatalappen Läppchen mit Herden interstitieller Fibrose sowie interstitieller Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen auf. Das Harnröhrengewebe innerhalb der Prostata war nicht wesentlich verändert. Die Prostataläsionen, die auf die Enzyminjektion zurückgeführt wurden, waren in einem oder zwei Läppchen des Prostatagewebes im rechten Prostatalappen lokalisiert. Diese Läsionen waren durch Atrophie der Alveoli, interstitielle Fibrose und wenige Zellen einer chronischen Entzündung gekennzeichnet. In diesem Bereich war auch eine Kapselfibrose zu erkennen.
Der wesentliche gewebspathologische Befund bei den anderen untersuchten Geweben war eine einzelne Anhäufung von Lymphozyten und Plasmazellen (in geringem Ausmaß) unterhalb des Übergangsepithels des Beckenabschnitts der Harnröhre. Mehrere Venen des subserösen Gewebes der Harnblase waren von Infiltraten mit Lymphozyten, Plasmazellen und einigen wenigen Eosinophilen umgeben. In den Hoden wurde keine Läsionen gefunden.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedene spezielle, bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben.

Claims

1. Zusammensetzung zum Behandeln von Prostata-Hypertrophie in lebenden Säugern, enthaltend:

eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und eine therapeutisch wirksame Konzentration von Hyaluronidase und eine wirksame Konzentration eines nichtionischen Tensids;

wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung durch direkte intraprostatische Injektion geeignet ist; und die Konzentration von Kollagenase und Hyaluronidase wirksam ist, die Auflösung und Rückbildung von hypertrophiertem, lebenden Prostata-Gewebe zu bewirken.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Kollagenase mit einer Konzentration von 250 bis 250 000 U/ml und die Hyaluronidase mit einer Konzentration von 160 bis 160 000 U/ml vorhanden ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Kollagenase mit einer Konzentration von 2 500 bis 25 000 U/ml und die Hyaluronidase mit einer Konzentration von 1 600 bis 16 000 U/ml vorhanden ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Tensid ein Ethylenoxidester von C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub0;-Fettsäuren oder ein beliebieger Ethylenoxidester von C&sub8;-C&sub2;&sub2;- Alkylalkoholen ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das nichtionische Tensid entweder Octylphenylpolyoxyethylenoxid oder Octylphenoxypolyethoxyethanol ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das nichtionische Tensid mit einer Konzentration von 0,1 bis 10 Vol-% vorhanden ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das nichtionische Tensid mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 Vol-% vorhanden ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiter enthaltend ein Antibiotikum, welches ein Aminoglykosid, Sulfonamid, Penicillin, Zephalosporin, basisches Makrolid, Tetracyclin, Polymyxin, Fluorochinolon, Lincomycin, Clindamycin, Chloramphenikol, Nitrofurantoin oder Nalidixinsäure ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Antibiotikum Gentamicinsulfat ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Antibiotikum mit einer Konzentration von 1,5 bis 150 ug/ml vorhanden ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiter enthaltend eine pharmazeutisch verträgliche wäßrige Trägerlösung, die einen physiologischen pH-Wert aufweist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der wäßrige Träger ein steriler, pyrogenfreier, gepufferter, isotonischer, wäßriger Träger ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der wäßrige Träger eine citratgepufferte Kochsalzlösung, eine Tris-gepufferte Kochsalzlösung oder Ringer-Kochsalzlösung ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der wäßrige Träger eine Calciumionen enthaltende, citratgepufferte Kochsalzlösung umfaßt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der wäßrige Träger 0,02 bis 0,1 M Natriumcitrat, 0,1 bis 0,2 M Natriumchlorid, 0,01 bis 0,05 M Calciumchlorid umfaßt und einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 aufweist.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der wäßrige Träger 0,05 bis 0,1 M Natriumcitrat, 0,15 bis 0,1 M Natriumchlorid, 0,02 bis 0,05 M Calciumchlorid umfaßt und einen pH-Wert von 6,7 bis 7,0 aufweist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung eine sterile, pyrogenfreie Lösung von 2 500 bis 25 000 U/ml Kollagenase, 1 600 bis 16 000 U/ml Hyaluronidase, 0,5 bis 5 Vol-% eines nichtionischen Tensids und 1,5 bis 150 ug/ml eines Antibiotikums umfaßt;

wobei die Zusammensetzung in einem gepufferten, isotonischen, wäßrigen Träger zur Verfügung gestellt wird, der 0,05 bis 0,1 M Natriumcitrat, 0,15 bis 0,2 M Natriumchlorid, 0,02 bis 0,05 M Calciumchlorid umfaßt und einen pH-Wert von 6,7 bis 7,0 aufweist.

18. Zum Behandeln von Prostata-Hypertrophie in einem lebenden Säuger geeignete Zusammensetzung, aufweisend eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und mindestens eines Enzyms (b), welches eine Hyaluronidase, Elastase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, DNase I, Bromelain, Clostripain, Thermolysin, Neuraminidase, Phospholipase, Cholesterolesterase, Dispase, Subtilisin, Papain, Chymopapain, Plasminogen- Aktivator, Plasmin, Streptokinase, Urokinase, Fibrinolysin, Serrathiopeptidase, Pankreatin, Amylase, Lysozym, Kathepsin-G oder eine PMN- Leukozyten-Serinprotease ist;

wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung durch direkte intraprostatische Injektion geeignet ist; und die Konzentration an Kollagenase und Enzym (b) wirksam ist, die Auflösung und Rückbildung von hypertrophiertem, lebenden Prostatagewebe zu bewirken, um die mit Prostata-Hypertrophie zusammenhängenden obstruktiven Symptome zu lindern;

wobei die Kollagenase mit einer Konzentration von 2 500 bis 250 000 U/ml vorhanden ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung eine sterile, pyrogenfreie Lösung eines hydrolytischen Enzyms in einem wäßrigen Träger ist, der einen physiologischen pH-Wert aufweist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung außerdem eine wirksame Konzentration eines nichtionischen Tensids aufweist.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das nichtionische Tensid ein Ethylenoxidester von C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub0;-Fettsäuren oder ein Ethylenoxidester von C&sub8;- C&sub2;&sub2;-Alkylalkoholen ist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung außerdem eine wirksame Konzentration eines Antibiotikums aufweist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Enzym eine Hyaluronidase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, Elastase, Dispase, DNase I oder Plasmin ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei das Enzym Hyaluronidase ist.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die Hyaluronidase mit einer Konzentration von 1 600 bis 160 000 U/ml vorhanden ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Kollagenase mit einer Konzentration von 2 500 bis 25 000 U/ml und die Hyaluronidase mit einer Konzentration von 1 600 bis 16 000 U/ml vorhanden ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die intraprostatische Injektion intralesional erfolgt.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei der Weg der intraprostatischen Injektion ein transurethraler, transrektaler oder transperinealer Injektionsweg ist.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei die intraprostatische Injektion über den transurethralen Injektionsweg erfolgt.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung einer Einzelinjektion mit einer Dosis von 1 bis 20 ml vorgesehen ist.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung einer Einzelinjektion mit einer Dosis von 1 bis 5 ml vorgesehen ist.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung einer Reihe von täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Injektionen mit einer Dosis von 1 bis 20 ml vorgesehen ist, bis das therapeutisch gewünschte Ergebnis erhalten ist.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei die Dosis 1 bis 5 ml beträgt.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung eine Depotformulierung ist, die verzögerte Freisetzung ermöglicht, den Zugang zum Allgemein-Kreislauf verhindert oder die Prostata-spezifische Lokalisierung der Zusammensetzung erhöht.

35. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei die Depotformulierung als langsam freisetzendes Implantat vorliegt, mikroverkapselt ist oder an ein biologisch abbaubares Polymer oder ein Prostata-spezifisches Immunglobulin angehängt ist.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Zusammensetzung eine sterile, pyrogenfreie Lösung von 2 500 bis 25 000 U/ml Kollagenase, 1 600 bis 16 000 U/ml Hyaluronidase ist und weiter eine wirksame Konzentration eines nichtionischen Tensids und eine wirksame Konzentration eines Antibiotikums aufweist;

wobei die Zusammensetzung in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Träger vorliegt, der einen physiologischen pH-Wert aufweist und zur Verabreichung an lebende Säuger mit einer Dosis von 1 bis 20 ml über den transurethralen oder intraprostatischen Injektionsweg geeignet ist.

37. Packung, aufweisend sterile, versiegelte Ampullen, enthaltend mindestens eine separate injizierbare Dosiseinheit einer Zusammensetzung, aufweisend eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase, Hyaluronidase und eines nichtionischen Tensids; mindestens eine separate injizierbare Dosiseinheit, aufweisend Kollagenase mit einer Konzentration von 2 500 bis 250 000 U/ml und Hyaluronidase mit einer Konzentration von 1 600 bis 160 000 U/ml, wobei alle in einem pharmazeutisch erträglichen wäßrigen Träger vorliegen, der zur Injektion in lebende Säuger geeignet ist.

38. Packung von Anspruch 37, wobei die mindestens eine separate injizierbare Dosiseinheit 1 bis 20 ml beträgt.

39. Packung von Anspruch 37, wobei die sterilen, versiegelten Ampullen ein Lyophilisat der Zusammensetzung enthalten; wobei bei Rekonstitution mit sterilem, pyrogenfreiem Wasser mindestens eine separate injizierbare Dosiseinheit von 1 bis 20 ml der Zusammensetzung erhalten wird, die als pharmazeutisch verträgliche Lösung zur intraprostatischen Injektion in lebende Säuger aufgezogen werden kann.

40. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prostata-Hypertrophie an einem lebenden Säuger, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Konzentration von Kollagenase und eine therapeutisch wirksame Konzentration von Hyaluronidase aufweist, wobei die Konzentration der Kollagenase und der Hyaluronidase wirksam ist, die Auflösung und Rückbildung von hypertrophierten, lebenden Prostata-Gewebe zu bewirken.

41. Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Zusammensetzung weiter ein nichtionisches Tensid enthält.