AT506095A1

AT506095A1 - Verwendung von proteasen

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Publication number: AT506095A1
Application number: AT0196207A
Authority: AT
Original assignee: Volopharm Gmbh
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2007-12-03
Publication date: 2009-06-15
Also published as: MX2010005629A; PL2559439T3; RU2485971C2; WO2009070818A1; EP2224948A1; RU2010127336A; CA2705986A1; JP2011505385A; EP2559439A1; ES2528348T3; DK2559439T3; CA2705986C; US20100254968A1; US8231870B2; EP2559439B1

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medikament zur Behandlung der benignen grostatahyperplasie.

Angiogenese ist definiert als die Bildung neuer Blutgefäße durch Auswachsen von Endothelzellen aus bereits bestehenden Gefäßen. Während dieses Prozesses bauen die Endothelzellen die darunter liegende Basalmembran ab, vermehren sich, wandern in benachbartes Gewebe und setzen sich zu Röhrchen zusammen. Schließlich werden die Verbindungen von Röhrchen zu Röhrchen hergestellt, und der Blutstrom wird etabliert. Die Fähigkeit von reifen Geweben, sich an verändernde Bedürfnisse anzupassen, erfordert sowohl lösliche Faktoren, wie den Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF) und vaskulär-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Zell-Zell- sowie Zell-Matrix-Interaktionen.

Die Angiogenese trägt zur Entstehung und Progression einer Vielfalt physiologischer (Embryogenese, Wundheilung) und pathologischer - Neoangiogenese - (Krebs, Hyperplasie) Zustände bei. Unter physiologischen Bedingungen (Angiogenese) teilen sich bei erwachsenen Säugern die Endothelzellen alle paar Jahre, während der Prozess bei pathologischen Zuständen (Neoangiogenese), wie benigner Prostatahyperplasie, Mastopathie, rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, Endometriose, Psoriasis, Krebs oder okularer Neovaskularisation, lokal beträchtlich verstärkt ist. VEGF wurde ursprünglich als Faktor beschrieben, der eine beträchtliche Gefäß-Undichtigkeit bewirkte und vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) genannt. Wegen seines mitogenen Effekts in Endothelzellen wurde VPF später zu vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) umbenannt. VEGF erhöht die Permeabilität des Mikrogefäßbetts und fördert somit das Austreten von Fluid und Protein aus Blutgefäßen. Dies führt zur Bildung von Ödemen, Wundflüssigkeit und Seromen (z.B. nach einer Operation), Ergüssen (z.B. bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen) und Aszites (z.B. bei Krebs). VEGF ist 10.000 Mal stärker als Histamin bei der Induktion der vaskulären Permeabilität.

Weiters ist VEGF einer der stärksten Stimulatoren der Endothel-Zellproliferation. Schließlich stimuliert er die Bildung von Kapillaren aus Endothelzellen und fördert so eine Kaskade von Ereignissen, die für die Angiogenese und die Neoangiogenese notwendig sind.

Es gibt zunehmende Hinweise dafür, dass anti-angiogene Arz-

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·« ·· • · · • ♦ · · · • · ♦ · ♦ ·· ·· ···· - 2 - neimittel zukünftige Therapien für Krankheiten, wie Krebs, rheumatoide Arthritis, Psoriasis und okulare Neovaskularisation und andere verbessern werden. In vivo-Versuche zeigten, dass Hypoxid (z.B. in Regionen in der Nähe von Tumor-Nekrosen) die Expression von sowohl VEGF- als auch VEGF-Rezeptoren (VEGFR-1) in verschiedenen Zelltypen induzieren kann. Hypoxie bewirkt die Expression von Hypoxie-induzierbarem Faktor-1 (HIF-1). Danach sammeln sich HIF-i-Komplexe im Zellkern an, binden an die HIF-l-Bindungsstel-le der DNA und setzen die Transkription von VEGF-mRNA in Gang bzw. regulieren sie nach oben, was eine angiogene Umschaltung („angiogenic switch") auslöst, die benachbarte Blutgefäße veranlassen kann, in das hypoxische Gewebe einzusprossen. Weiters kann die VEGF-Expression durch verschiedene proinflammatorische Cytokine induziert/nach oben reguliert werden, wie in verschiedenen Modellen einer chronischen Entzündung, wie Psoriasis oder rheumatoide Arthritis, nachgewiesen wurde.

In jüngster Zeit wurden mehrere therapeutische Ansätze unter Verwendung von VEGF-Rezeptor-Blockern oder Antikörpern gegen VEGF für die Behandlung von Krankheiten vorgeschlagen, bei welchen eine verstärkte Angiogenese eine Rolle spielt, vor allem Krebs, aber auch für Krankheiten, bei welchen eine Angiogenese im Auge eine Rolle spielt, wie Makuladegeneration oder benigne Prostatahyperplasie.

Benigne Prostatahyperplasie (BPH) bezeichnet die Vergrößerung der Prostata bei Männern im mittleren Alter und bei älteren Männern. Wenn sie groß genug sind, komprimieren die Knötchen den Harnkanal und bewirken so eine teilweise - oder manchmal eine praktisch vollständige - Obstruktion der Harnröhre, was den normalen Harnfluss inhibiert.

Dies führt zu Symptomen einer Miktionsverzögerung („urinary hesitancy"), häufigem Harnlassen, einem erhöhten Risiko für Harnwegsinfektionen und einem Harnverhalten. Außerdem können die Level des Prostata-spezifischen Antigens bei diesen Patienten wegen des vergrößerten Organvolumens und der Entzündung infolge von Harnwegsinfektionen erhöht sein. BPH wird nicht als prämaligne Läsion angesehen. BPH stellt für ältere Männer wegen der negativen Auswirkungen auf die Lebensqualität ein beträchtliches Gesundheitsproblem dar. Die Drüse kann in schweren Fällen bis zum Zehnfachen der normalen adulten Größe erreichen. Doch geht das Wachstum der

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3 adulten Prostata, das BPH begleitet, relativ langsam vor sich, und es dauert oft Jahrzehnte, bis beim Patienten mit der Krankheit verwandte Symptome entstehen. Jedoch hat bis zum Alter von 60 Jahren bis zu 50% der männlichen Bevölkerung pathologische BPH. Verhamme et al., Eur. ürol. 2002 Okt; 42(4):323-8 beschrieben eine Inzidenz-Rate von BPH bei 3/1000 Männern pro Jahr im Alter von 45-49 Jahren, bis zu einem Maximum von 38 Fällen pro 1000 Männern pro Jahr im Alter von 75-79 Jahren; nach dem Alter von 8o Jahren blieb die Inzidenz-Rate konstant.

Derzeitige Methoden zur Behandlung von BPH sind: 1. "Aufmerksames Zuwarten" („watchful waiting") Wenn die Symptome schwach sind und die Lebensqualität eines Mannes nicht beeinträchtigen, wird häufig „aufmerksames Zuwarten" empfohlen. Individuen können auch diese Behandlungsoption wählen, wenn die Symptome nicht störend sind oder wenn sie der Meinung sind, dass eine Arzneimittel-Therapie größere Umstände darstellen könnte als die Symptome der BPH. Wenn Symptome auftreten und Beschwerden verursachen, die die Aktivitäten des täglichen Lebens beeinträchtigen, wird eine Arzneimittel-Behandlung empfohlen. 2. Arzneimittel werden verwendet, um die mit BPH verbundenen allgemeinen Harnsymptome zu erleichtern, entweder durch Verringerung der Größe der Prostata-Drüse oder durch Verlangsamen des Wachstums der Prostata (Madersbacher et al., Internist (Berl.). 2007 Apr 11). Allgemeine Klassen von Arzneimitteln, die zur Behandlung von Harnsymptomen verwendet werden, umfassen Alphablocker, wie Doxazosin (Cardura) [Nebenwirkungen: Schwindel, Schläfrigkeit, Benommenheit, Kopfschmerzen, Verstopfung, Appetitsverlust, Mundtrockenheit, Müdigkeit, verstopfte Nase, verschwommenes Sehen, Augentrockenheit oder SchlafSchwierigkeiten] oder Tamsulosin (Flomax) [Nebenwirkungen: Blutdruckabfall, der zu Synkope oder Ohnmacht führt; Schwindel, Kopfschmerzen, Nasenverstopfung und Herzklopfen] , 5-alpha-Reduktase-Hemmer, wie Finasterid (Proscar) [Nebenwirkungen: verringerte Samenmenge pro Ejakulation, verringerter Geschlechtstrieb, Impotenz] oder Du-tasterid (Avodart) [Nebenwirkungen: Empfindlichkeit der Brust, verringerter Geschlechtstrieb, Ejakulationsprobleme, vergrößerte Brust bei Männern, Nesselausschlag, Impotenz, juckende Flecken, Hautausschlag]. 3. Operation: Wenn ein Mann schwerere Symptome der BPH hat, wie rekurrierende Harnretention, rekurrierendes Blut im Harn,

·· ·· ·· · ···· »··· ······· · · • · · · · · · · · • · · · ······ · ····· ·«·· ·· ·· ···· « · ·* - 4 - rekurrierende Harnwegsinfektionen oder Blasensteine, dann sollte die Arzneimitteltherapie nicht begonnen werden. Diese Symptome zeigen an, dass eine Operation höchstwahrscheinlich notwendig ist, um das Problem zu korrigieren. Zusätzliche Risiken inkludieren Infektionen, Blasen-perforation, Thrombose der tiefen Venen und vollständige Inkontinenz.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Medikamente zur Behandlung oder Prävention der benignen Prostatahyperplasie vorzusehen, mit welchen die Nachteile der gewöhnlich verwendeten Therapieformen und Medikamente überwunden werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Protease zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention der benignen Prostatahyperplasie/-hypertro-phie.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass insbesondere ein Medikament, das eine Kombination von mindestens einer Protease aufweist, welche vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen-, Nicht-Säugetier- und Mikroben-Proteasen, bei Verabreichung an ein Individuum eine signifikante Verringerung (mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, am meisten bevorzugt mindestens 80%, insbesondere mindestens 90%, im Vergleich zur VEGF-Menge des Individuums vor der Verabreichung des Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung) des Le-vels des VEGF und somit eine Verringerung der Angiogenese ermöglicht. Daher kann die mindestens eine, vorzugsweise eine Kombination von mindestens zwei (mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs) Proteasen verwendet werden, um eine benigne Prostatahyperplasie bei einem Individuum zu verhindern und/oder zu behandeln.

Die Prostata ist Androgen-abhängig insofern als sie Testosteron für ihr normales Wachstum, ihre Entwicklung, Differenzierung und Funktion benötigt und ein Androgen-Mangel die Größe der Prostata verringert. Anti-Androgen-Therapien zur Verhinderung des Prostata-Überwachstums haben nur eine begrenzte Wirkung, und daher wird vorgeschlagen, dass die Steroide das Wachstum der Prostata eher zulassen können als verursachen. Es gibt Hinweise, dass das Prostatawachstum unter der unmittelbaren Steuerung spezifischer Wachstumsfaktoren stehen könnte, wie VEGF und TGF-beta, und nur indirekt durch Androgene moduliert sein könnte.

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Die BPH ist durch Hyperplasie von Prostata-Stroma- und Epithel-Zellen und eine vermehrte Dichte der Mikrogefäße gekennzeichnet (Stefanou et al. In Vivo. 2004 Mar-Apr; 18(2):155-60). Androgene stimulieren den Beginn der Hypertrophie der Zellen in der Prostata. Hypertrophie kann im Laufe der Zeit zu einer regionalen Hypoxie führen, welche die Expression von Hypoxie-Faktoren (HIF-1 und HIF-2) induziert. HIF stimuliert die Synthese von VEGF in den Epithelzellen der Prostata (Walsh et al. Prosta-tic Dis. 2002;5 (2):119-22). Die verstärkte Expression von VEGF kann die Angiogenese induzieren und folglich zur klinischen Progression von BPH führen, was in der Bildung großer, ziemlich einzelner Knötchen im periurethralen Bereich der Prostata resultiert. Eine Unterbrechung dieses Kontinuums könnte eine Hyperplasie verringern.

Das Targeting von VEGF stellt daher einen potentiellen direkten therapeutischen Ansatz für die Regulierung einer abnormen Vergrößerung der Prostata und möglicherweise auch für die Verbesserung der mit der benignen Prostata-Hyperplasie verbundenen Symptome dar. Die VEGF-Serumkonzentration ist bei BPH im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöht, jedoch signifikant geringer im Vergleich zu Patienten mit Prostata-Krebs (Trapeznikova et al., Vestn Ross Akad Med Nauk. 2005;(5):14-6).

Die Angiogenese ist bei BPH erhöht, ist stärker bei Prostata-Krebs und korreliert mit der VEGF-Konzentration (Stefanou et al. In Vivo. 2004 Mar-Apr.18/2):155-60). Anti-VEGF verringert die Angiogenese in der Prostata von kastrierten, mit Testosteron behandelten Ratten (Lissbrant et al. Prostate. 2004 Jan 1;58/1): 57-65).

Gemäß der vorliegenden Erfindung definieren die Ausdrücke „benigne Prostatahypertrophie" und „benigne Prostatahyperplasie" dieselbe Krankheit und können somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung austauschbar verwendet werden.

Die Verabreichung von Proteasen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Nicht-Säugetieren ist besonders geeignet, weil diese Proteasen keine signifikante Toxizität aufweisen, wenn sie mit Menschen- oder Tierzellen, insbesondere Endothelzellen, in Kontakt gebracht werden. Selbst eine Kombination von Proteasen, wie hierin geoffenbart, ist für Tier odet Mensch nicht toxisch, sondern wirkt auf die Angiogenese.

Interessanterweise kpnnte gezeigt werden, dass Proteasen mit

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• · · · · · · ♦♦ ♦· ···· · · - 6 - Säuger- (d.h. humanem) Ursprung die Angiogenese nicht inhibieren oder verhindern können. Daher kann die alleinige Verabreichung solcher Proteasen an ein Individuum nicht zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Neoangiogenese verbunden sind, verwendet werden.

Der Ausdruck „Medikament", wie hierin definiert, inkludiert nicht nur pharmazeutische Produkte, sondern auch Nahrungsergänzungsmittel.

Wie hierin verwendet, sollen „Pflanzen-Proteasen" und „Tier-Proteasen" Proteasen sein, die von Natur aus in Pflanzen oder Tieren (Nicht-Säugetieren) Vorkommen und aus diesen extrahiert oder aus diesen erhalten werden. „Pflanzen-Proteasen" und „Tier-Proteasen" sind auch rekombinante Proteasen, deren codierende DNA (z.B. als cDNA) von einer Pflanze bzw. einem Tier (die bzw. das die DNA natürlicherweise im Genom hat) abstammt oder erhalten wurde und in passende Vektoren kloniert und in einer proka-ryontischen (z.B. Bakterien-) oder eukaryontischen (z.B. Insektenzelle, Säugerzelle) Zellkultur exprimiert wurde. „Mikroben-Proteasen", wie hierin verwendet, sind Proteasen, die von Natur aus in Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen (z.B. Hefe, Schimmelpilze) Vorkommen. Diese Proteasen können jedoch auch aus anderen Zellen oder Organismen isoliert werden, vorausgesetzt, dass diese Zellen und Organismen die DNA der Mi-kroben-Protease in sich tragen und diese Protease rekombinant erzeugen können.

Es ist besonders bevorzugt, das Medikament der vorliegenden Erfindung zur Prävention und/oder Behandlung von Individuen zu verwenden, welche an Krankheiten leiden, die durch hohe VEGF-Le-vel verursacht sind und mit einer Angiogenese verbunden sind, wobei diese Krankheiten nicht hauptsächlich oder vollständig mit einer erhöhten Proliferationsaktivität verbunden sind. Die mindestens eine Pflanzen-Protease ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bromelain, Papain oder Ficin. Die vorzugsweise gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Pflanzen-Proteasen sind voranstehend angeführt.

Diese Proteasen können durch rekombinante Expression in einem Wirt oder durch Extraktion aus einer Pflanze, die die Proteasen von Natur aus erzeugt, erhalten werden, wobei der Extrakt selbst direkt verwendet werden kann,um das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Extraktionsmethoden der

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Proteasen sind auch dem Gebiet wohlbekannt.

Bromelain: Ananas hatten eine lange Tradition als medizinische Pflanze unter den Ureinwohnern von Süd- und Mittelamerika. Bromelain wurde in Europa erstmals im Jahr 1957 als therapeutisches Ergängzungsmittel eingeführt und wird vor allem bei der Behandlung von Ödemen und Entzündungen verwendet (Übersicht von Maurer. Cell Mol Life Sei 58 (9):1234-1245, 2001.

Papain: kann als rohes, getrocknetes Material erzeugt werden, indem man Milchsaft von der Frucht des Papaya-Baums sammelt. Der Milchsaft wird nach dem Anritzen des Halses der Frucht gesammelt, wonach er entweder auf der Frucht trocknen oder in einen Behälter tropfen kann. Dieser Milchsaft wird dann weiter getrocknet. Er wird jetzt als getrocknetes, rohes Material klassifiziert. Ein Reinigungsschritt ist notwendig, um verunreinigende Substanzen zu entfernen. Diese Reinigung besteht in der Solubilisierung und Extraktion des aktiven Papain-Enzyms.

Ficin: Der Milchsaft von einigen Ficus (Moraceae)-Arten wurde traditionellerweise in Mittel- und Südamerika als Wurmmittel verwendet. Es wurde angenommen, dass die anthelmintische Wirkung auf eine proteolytische Fraktion, die Ficin genannt wird, zurückzuführen ist.

Pflanzen-Proteasen: Bromelain, Papain, Ficin

Bakterien-Proteasen: Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die aus Bakterien isolierte Protease ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Brinase (aus Aspergillus oryzae), Nattokinase (Bacillus subtilis Natto), Pronase (Streptomyces griseus), Seaprose-S (Aspergillus melleus), Serrapeptase (Bacillus Serratia E 15), Sfericase (Bacillus sphaericus) und Subtilisin (Bacillus subtilis).

Mikroben-Proteasen können ebenso mittels rekomb.inanter Techniken erhalten werden, oder sie können direkt aus Mikroben-Kul-turen isoliert werden, welche die Mikroorganismen aufweisen, die diese Proteasen erzeugen. Beispielsweise wird Nattokinase aus Natto, einem traditionellen, aus fermentierten Sojabohnen hergestellten japanischen Nahrungsmittelprodukt erhalten, oder aus Kulturen, die Organismen einer speziellen Bacillus subtilis-Sub-spezies (Bacillus subtilis var. Natto) aufweisen, welche diese Protease erzeugen können.

Serrapeptase, auch als Serrapeptidase oder Serratiopeptidase bekannt, die aus dem Mikroorganismus Serratia E 15 erhalten

NACHGEREICHT ···· ···· • ♦ ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · · · • · · · ··· • · · · · · ·· ·· Μ·· · - 8 - wird, welcher in der Darmwand der Seidenraupe lebt, wird benützt, um die Verdauung und die Auflösung seiner Insektenpuppe zu unterstützen. Dieses Enzym kann als Ergänzung zur natürlichen Behandlung von Schmerzen und Entzündung verwendet werden und ist in Teilen Asiens und Europas in klinischer Verwendung. Serrapep-tase wird als Alternative zu nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID, „non-steroidal anti-inflammatory drugs") verwendet, die allgemein zur Behandlung von Arthritis und Entzündungen verwendet werden. Die Tier-(Nicht-Säugetier)-Protease wird vorzugsweise aus dem Antarktischen Krill (Crustaceae) Euphasia superba, Krillenzym und Lumbrokinase aus dem Regenwurm isoliert.

Diese Proteasen können rekombinant mit Methoden, die auf dem Gebiet bekannt sind, erzeugt oder direkt aus den jeweiligen Tieren erhalten werden. Besonders bevorzugte Medikamente umfassen Bromelain und/oder Papain als Pflanzen-Proteasen und gegebenenfalls Nattokinase als Mikroben-Protease. Das bevorzugte Verhältnis zwischen diesen Proteasen in einem Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der folgenden Tabelle zu finden:

Bromelain Papain Nattokinase 100.00% 0.00% 0.00% 75.00% 25.00% 0.00% 16.67% 16.67% 66.67% 25.00% 25.00% 50.00% 0.00% 75.00% 25.00% 75.00% 0.00% 25.00% 25.00% 0.00% 75.00% 16.67% 66.67% 16.67% 50.00% 0.00% 50.00% 0.00% 100.00% 0.00% 0.00% 50.00% 50.00% 0.00% 25.00% 75.00% 33.33% 33.33% 33.33% 25.00% 75.00% 0.00% 0.00% 0.00% 100.00% 50.00% 25.00% 25.00%

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung ist die mindestens eine Pflanzen-, Tier-

NACHGEREICHT ·· · ···· ···* ·« ·· ······· · · • · · · ··· · φ • · · · · ···· φ * ····· ···· ·· ·· ···· · φ φφ - 9 - und/oder Mikroben-Protease im Medikament in einer Menge von 5 bis 100%, vorzugsweise von 10 bis 90% Gew./Gew., vorzugsweise von 20 bis 80% Gew./Gew., mehr bevorzugt von 30 bis 70%

Gew./Gew. enthalten. Die mindestens eine Planzen-, Tier-und/oder Mikroben-Protease wird einem Individuum vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 2 bis 50 mg/kg, mehr bevorzugt 5 bis 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Das Medikament kann vorzugsweise weiters mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel und/oder Exzipienten, vorzugsweise ein Bindemittel, einen Füllstoff, ein Zerfallsmittel, ein Gleitmittel, ein Konservierungsmittel und/oder einen Überzug umfassen.

Je nach der pharmazeutischen Formulierung des Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene andere Substanzen, wie Exzipienten, Überzüge usw. verwendet werden.

Weiters kann das Medikament der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zur enteralen (oralen, rektalen), topischen oder parenteralen Verabreichung geeignet sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Medikament in einer pharmazeutischen Form vor, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tropfen, Spray, Tabletten, vorzugsweise löslichen Tabletten, Brausetabletten, Magen(saft)-resistenten Tabletten und Sublingualtabletten, Kapseln, vorzugsweise Magen(saft)-resistenten Kapseln, Pulvern, Granula, oralen Flüssigkeiten, oralen Tropfen, Salben, Lotionen, Emulsionen, Hydrogels, Suppositorien, Pessare, Infusionen und Injektionen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Medikament zur oralen Verabreichung geeignet. Diese Art der Verabreichung ist nicht-invasiv und ermöglicht daher eine wiederholte Verabreichung des Medikaments (ohne den Patienten zu verletzen), wie sich etwa 50 Jahre lang gezeigt hat (Ransberger. Erfahrungsheilkunde 1:14-17, 1971).

Das Medikament der vorliegenden Erfindung kann speziell zur Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert sein, einschließlich jener, die für Folgendes geeignet sind: (1) orale Verabreichung, z.B, „Drenches" (wässrige oder nichtwässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Bolusse, Pulver, Granula, Pasten zum Aufträgen auf die Zunge; (2) parenterale Verabreichung, z.B. durch subkutane, intramusku-

NACHGEREICHT ···· ···· ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · · • ·· · ·___ ····· · · ·· ·· ·· ···· · · «· - 10 - läre oder intravenöse Injektion, wie z.B. eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, z.B. als Creme, Salbe oder Spray auf die Haut aufgetragen; oder (4) intrarektal, z.B. als Pessar, Creme oder Schaum.

Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabel" wird hierin verwendet, um sich auf jene Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu beziehen, die im Rahmen des vernünftigen medizinischen Urteils zur Verwendung in Kontakt mit Gewebe von Mensch und Tier geeignet sind, ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Reaktion oder anderes Problem oder Komplikation, entsprechend einem vernünftigen Nutzen/Risi-ko-Verhältnis.

Zu den Beispielen für Materialien, die als pharmazeutisch akzeptable Träger dienen können, zählen: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate, wie Natriumcarboxymethylcellu-lose, Ethylcellulose und Cellulose-Acetat; (4) pulverisierter Tragant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talkum; (8) Exzipienten, wie Kakaobutter und Suppositorien-Wachse; (9) öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; (10) Glykcole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol; (12) Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphat-Pufferlösungen; und (21) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden._

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Benetzungsmittel, Emulgatoren und Gleitmittel, wie Natriumlau-rylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbstoffe, Freisetzungsmittel, Überzugsmittel, Süssungsmittel, Geschmacksstoffe und Parfümierungsmittel, Konservierungsmittel und Antioxidantien können ebenfalls im Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden sein.

Zu den Beispielen für pharmazeutisch akzeptable Antioxidantien zählen: (1) wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit u. dgl.; (2) öllösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Lecithin, Propylgal-lat, Alpha-Tocopherol u. dgl.; und (3) Metall-Chelatbildner, wie Zitronensäure, Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure u. dgl.

Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung inkludieren jene, die zur oralen, nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), rektalen und/oder parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können praktischerweise in Einheitsdosis-Form präsentiert werden und können mit allen Methoden, die auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannt sind, hergestellt werden. Die Menge des aktiven Ingrediens, die mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer Einzeldosis-Form vereinigt werden kann, hängt vom behandelten Wirt und von der bestimmten Verabreichungsart ab. Die Menge des aktiven Ingre- diens, die mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer Einzeldosis-Form vereinigt werden kann, ist im Allgemeinen jene Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung erzeugt.

Die Verfahren zur Herstellung der Medikamente und Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung inkludieren den Schritt des In-Verbindung-Bringens einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit dem Träger und gegebenenfalls einem oder mehreren zusätzlichen Ingredienzien. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und inniges In-Verbindung-Bringen einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern, oder mit beiden, und, sofern notwendig, nachfolgendes Formen des Produkts hergestellt. Formulierungen der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet

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sind, können in Form von Kapseln, Cachets, Pillen, Tabletten, Lutschtabletten (unter Verwendung einer mit Geschmack versehenen Basis, üblicherweise Saccharose und Gummiarabicum oder Tragant), Pulver, Granula oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit, oder als flüssige Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-öl-Emulsion, oder als Sirup, oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Gummiarabicum) vorliegen, die jeweils eine vorbestimmte Menge einer Protease-Kombination der vorliegenden Erfindung als aktive Ingredienzien enthalten.

Die Proteasen der vorliegenden Erfindung können auch als Bolus, Electuarium oder Paste verabreicht werden. In festen Dosierungsformen der Erfindung zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granula u. dgl.), ist das aktive Ingrediens mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, und/oder einem von Folgendem gemischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel, wie z.B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummiarabicum; (3) Befeuchtungsmittel, wie Glycerin; (4) Zerfallsmittel, wie Agaragar, Calciumcarbonat, Kartoffeloder Tapiocastärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerer, wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumverbindungen; (7) Benetzungsmittel, wie z.B. Cetylalkohol und Glycerinmonos-tearat; (8) Absorptionsmittel, wie Kaolin und Bentonit-Tonerde („bento-nite clay"); (9) Gleitmittel, wie Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Mischungen davon ; und (10) Farbstoffe.

Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch Puffermittel aufweisen. Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch als Füllstoffe in weich- und hart-gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden,

NACHGEREICHT ···· IM« • · • · · • ·· ·· Μ ·· · • · · · t · · • · · · · # · • · · ) · ··· • · · · · · Μ ·· ···· · - 13 - wobei solche Exziepienten, wie Lactose oder Milchzucker, sowie Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht u. dgl. benützt werden.

Eine Tablette kann durch Kompression oder Formung, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Ingredienzien erzeugt werden. Komprimierte Tabletten können unter Verwendung eines Bindemittels (z.B. Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellu-lose), eines Gleitmittels, inerter Verdünnungsmittel, eines Konservierungsmittels, eines Zerfallsstoffs (z.B. Natriumstärke-glycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), eines grenzflächenaktiven Mittels oder Dispergierungsmittels hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen einer Mischung der pulverförmigen, mit inerten flüssigen

Verdünnungsmitteln angefeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine geformt werden. Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granula, können gegebenenfalls geritzt sein oder mit Überzügen und Schalen, wie enterischen Überzügen und anderen Überzügen, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen wohlbekannt sind, hergestellt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass sie eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des darin enthaltenen aktiven Ingrediens vorsehen, z.B. unter Verwendung von Hydroxypropylmethylcelluose in verschiedenen Proportionen, um das gewünschte Freisetzungsprofil vorzusehen, anderen Polymer-Matrizen, Liposomen und/oder Mikrokügelchen. Sie können sterilisiert werden, beispielsweise mittels Filterung durch einen Bak-terien-zurückhaltenden Filter oder durch Einarbeiten von Sterilisationsmitteln in der Form steriler fester Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder in irgendeinem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor Verwendung gelöst werden können. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls auch Trübungsmittel enthalten und aus einer Zusammensetzung sein, dass sie das (die) aktive(n) Ingrediens (Ingredienzien) nur - oder bevorzugt - in einem bestimmten Abschnitt des Magen-Darm-Trakts oder gegebenenfalls auf verzögerte Weise abgeben.

Zu den Beispielen für das Einbetten von Zusammensetzungen, die verwendet werden können, zählen polymere Substanzen und Wachse. Die Proteasen können auch in mikroverkapselter Form vorliegen, falls geeignet, mit einem oder mehreren der zuvor be-

NACHGEREICHT schriebenen Exzipienten. Zu den flüssigen Dosierungsformen.zur oralen Verabreichung der Verbindungen der Erfindung zählen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zum aktiven Ingrediens können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die allgemein auf dem Gebiet verwendet werden, enthalten, wie z.B. Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgierungsmittel, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus-und Sesamöl), Glycerin, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen davon. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Adjuvantien, wie Benetzungsmittel, Emulgierungs- und Suspendierungsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe und Konservierungsmittel umfassen.

Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspendierungsmittel, wie z.B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit- und -sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agaragar und Tragant und Mischungen davon enthalten.

Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zur rektalen Verabreichung können als Suppositorien vorliegen, welche durch Mischen der Proteasen der Erfindung mit einem oder mehreren geeigneten, irritationsfreien Exzipienten oder Trägern hergestellt werden können, welche z.B. Kakaobutter, Polyethylenglykol, ein Suppositorienwachs oder ein Salicylat umfassen, und welches bei Raumtemperatur fest, jedoch bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Hohlraum des Rektums schmilzt und die aktive Verbindung freisetzt. Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur rektalen Verabreichung geeignet sind, umfassen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gels, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen, die Träger enthalten, deren Eignung auf dem Gebiet bekannt ist.

Zu den Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung zählen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gels, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel. Die Proteasen können unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und mit

NACHGEREICHT • ·

15 • · · · ♦ · « • · · · · ···

jeglichen Konservierungsmitteln, Puffer oder Treibmitteln, die nötig sind, gemischt werden.

Die Salben, Pasten, Cremes und Gels können zusätzlich zu einer aktiven Verbindung dieser Erfindung Exzipienten, wie tierische oder pflanzliche Fette, öle, Wachse, Paraffin, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Mischungen davon enthalten.

Pulver und Sprays können zusätzlich zu den Proteasen dieser Erfindung Exzipienten, wie Laktose, Talkum, Siliciumdioxid-Säure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikate und Polyamidpulver oder Mischungen dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich übliche Treibmittel, wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie Butan und Propan, enthalten.

Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie eine kontrollierte Abgabe der Proteasen der vorliegenden Erfindung an den Körper vorsehen. Solche Dosierungsformen können durch Auflösen oder Dispergieren der Proteasen im geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können auch verwendet werden, um das Fließen der Proteasen über die Haut zu verstärken. Die Geschwindigkeit eines solchen Fließens kann gesteuert werden, indem entweder eine geschwindigkeitssteuernde Membran vorgesehen wird oder die Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel dispergiert wird.

Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen die Proteasen der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen sterilen, isotonischen, wässrigen oder nichtwässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, oder sterilen Pulvern, die direkt vor Verwendung zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen rekonstituiert werden können, welche Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Mittel, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigen Empfängers isotonisch machen, oder Suspendierungsmittel oder Verdickungsmittel enthalten können. Zu den Beispielen für geeignete wässrige und nicht-wässrige Träger, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, zählen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol u. dgl.) und geeignete Mi-

schungen davon, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien aufrecht erhalten werden, wie Lecitin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall von Dispersionen, und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Agentien. Diese Zusammensetzungen können auch Adjvuantien, wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgierungsmittel und Dispergierungsmittel, enthalten. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen auf die vorliegenden Zusammensetzungen kann durch das Einarbeiten verschiedener antibakterieller und antimykotischer Mittel, z.B. Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure u. dgl., gewährleistet werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid u. dgl. in den Zusammensetzungen zu inkludieren. Außerdem kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form bewirkt werden durch den Einschluss von die Absorption verzögernden Mitteln, wie Aluminiummonostearat und Gelatine. In einigen Fällen ist es zur Verlängerung der Wirkung eines Arzneimittels wünschenswert, die Absorption des Arzneimittels aus einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen.

Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension eines kristallinen oder amorphen Materials mit schlechter Wasserlöslichkeit erreicht werden. Alternativ wird die verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneimittelform erreicht durch Lösen oder Suspendieren des Arzneimittels in einem Öl-Vehikel. Injizierbare Depot-Formen werden durch Bildung mi-kroverkapselter Matrizen der vorliegenden Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polylactid-Polyglycolid, hergestellt. Je nach dem Verhältnis von Arzneimittel zu Polymer und dem Wesen des bestimmten verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung gesteuert werden. Zu den Beispielen für andere biologisch abbaubare Polymere zählen Poly(orthoester) und Poly(anhydride).

Injizierbare Depot-Formulierungen werden auch durch Einfangen des Arzneimittels in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe verträglich sind, hergestellt. Wenn die Proteasen der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutika an Menschen und Tiere verabreicht werden, können sie an sich oder als pharmazeutische Zusammensetzung gegeben werden, die beispielsweise

NACHGEREICHT • · • · · · · · · • · · · · *··· • · · · ♦ · ♦♦ ·· ···· · - 17 -0,1 bis 99,5% (mehr bevorzugt, 0,5 bis 90%) der Proteasen in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Die Präparate der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, topisch oder rektal gegeben werden. Sie werden natürlich durch Formen, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind, gegeben. Beispielsweise werden sie in Tabletten oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, Augenlotion, Salbe, Zäpfchen usw. verabreicht; Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch eine Lotion oder Salbe; und rektal durch Suppositorien. Orale und topische Verabreichungen sind bevorzugt. Die Ausdrücke „parenterale Verabreichung" und „parenteral verabreicht", wie hierin verwendet, bedeutet andere als enterale und topische Verabreichungsarten, gewöhnlich durch Injektion, und inkludiert - ohne darauf eingeschränkt zu sein - intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsulä-re, intraorbitale, intrakardiale, intradermale intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, sub-kapsuläre, subarachnodiale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.

Das Medikament der vorliegenden Erfindung kann an Menschen und an andere Tiere zur Therapie auf jedem geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, nasal, wie z.b. als Spray, rektal, parenteral, intracisternal und topisch, wie mittels Pulvern, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual.

Unabhängig vom gewählten Verabreichungsweg werden die Proteasen der vorliegenden Erfindung, die in einer zweckmäßig hy-dratisierten Form verwendet werden können, und/oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mittels dem Fachmann bekannter herkömmlicher Methoden zu pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsformen formuliert.

Die tatsächlichen Dosierungshöhen der aktiven Ingredienzien in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können variiert werden, um eine Menge des aktiven Ingrediens zu erhalten, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion für einen bestimmten Patienten, eine Zusammensetzung und eine Verabreichungsart zu erreichen, ohne dass sie für den Patienten toxisch ist. Die ausgewählte Dosierungshöhe hängt von vielerlei Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der bestimmten verwendeten Protease der vorliegenden Erfindung, dem Verab- j nachgereicht •· ·· ·· · ···· ···· » · · · · » t « # · *· ·· ···· ·

‘ ‘ * · · • · · · · ···· · I • · - 18 -reichungsweg, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsrate der bestimmten verwendeten Verbindung, der Dauer der Behandlung, anderen Arzneimitteln, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit den verwendeten Proteasen benützt werden, dem Alter, Gewicht, Zustand, der allgemeinen Gesundheit und der früheren Krankengeschichte des behandelten Patienten u. dgl. auf dem Gebiet der Medizin wohl bekannten Faktoren. Ein Arzt oder Tierarzt mit durchschnittlichem Fachwissen kann die benötigte wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung leicht bestimmen und verschreiben. Beispielsweise könnte der Arzt oder Tierarzt mit Dosen der erfindungsgemäßen Proteasen, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, in einer Höhe beginnen, die niedriger ist als jene, die erforderlich ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erreichen, und danach die Dosierung bis zum Erreichen der gewünschten Wirkung allmählich erhöhen.

Obwohl es möglich ist, dass die Proteasen der vorliegenden Erfindung alleine verabreicht werden, ist es bevorzugt, die Proteasen als pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) zu verabreichen. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament weiters mindestens ein weiteres aktives Ingrediens.

Dieses aktive Ingrediens kann irgendeines sein, das die Prävention und die Behandlung angiogener Erkrankungen mit den Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung unterstützen kann. Es ist jedoch auch möglich, aktive Ingredienzien hinzuzufügen, die andere Wirkungen als die Proteasen aufweisen.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament mindestens eine (zwei, drei oder sogar vier) Proteasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Pflanzen-Proteasen: Bromelain, Papain, Ficin,

Proteasen aus Bakterien: Nattokinase, Pronase, Serrapeptase, Sfericase und Subtilisin,

Proteasen aus Pilzen: Brinase; Seaprose-S,

Proteasen aus Crustaceae: Krillenzym,

Proteasen aus Regenwurm: Lumbrokinase.

Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht.

Fig. 1 zeigt die toxischen Auswirkungen des Enzyms der Er-

NACHGEREICHT findung auf HUVEC, wie mittels LDH-Freisetzung bestimmt.

Fig. 2 zeigt einen MTT-Test mit mit Enzym behandelten HUVEC.

Fig. 3(A) zeigt die Inhibierung der mit VEGF induzierten Röhrchenbildung durch eine Kombination aus 25% Bromelain, 50% Nattokinase und 25% Papain.

Fig. 3(B) zeigt die nur mit VEGF behandelte Kontrolle. Während bei der VEGF-Kontrolle ein enges Muster aus gebildeten Röhrchen sichtbar ist, zeigt die mit Enzym behandelte Probe große Flächen ohne Röhrchenbildung, was eine antiangiogene Aktivität des Enzym-Cocktails anzeigt.

Fig. 4 zeigt die VEGF-Konzentrationen im Blut von mit Ruto-zym behandelten Patienten.

Fig. 5 zeigt einen MTT-Test mit mit VEGF stimulierten HUVEC und Rutosid. Keine Inhibierung der Proliferation ist sichtbar.

Fig. 6 zeigt die toxischen Auswirkungen von Rutosid auf HUVEC, wie mittels LDH-Freisetzung bestimmt. Bei quieszenten HUVEC ist keine toxische Wirkung zu sehen, wogegen mit VEGF aktivierte HUVEC eine geringe Wirkung zeigen.

Fig. 7 (links) zeigt die Inhibierung der spontanen Röhrchenbildung bei HÜVEC. Bromelain, Ficin, Nattokinase, Papain und Serrapeptase, jedoch nicht Chymotrypsin oder Trypsin, inhibierten die Bildung von Röhrchen.

Fig. 7 (rechts) zeigt die Inhibierung der mit VEGF induzierten Röhrchenbildung bei HUVEC. Bromelain, Ficin, Nattokinase, Papain und Serrapeptase, jedoch nicht Chymotrypsin oder Trypsin, inhibierten die Bildung von Röhrchen fast im selben Ausmaß wie bei unbehandelten HUVEC. BEISPIELE:

BPH

Materialien:

Bromelain aus dem Stamm der Ananas mit einer Aktivität von 3,51 E/mg wurde von Sigma Aldrich, Österreich, erhalten. Nattokinase mit einer Aktivität von 10,000 E/ml wurde von Japan Bio Science laboratory Col, LTd, gekauft. Papain aus Carica Papaya mit einer Aktivität von >3 E/mg wurde von Sigma Aldrich, Österreich, erhalten.

Methoden:

Toxizitäts-Test

Die antiproliferative Aktivität von Bromelain, Nattokinase und Papain wurde unter Verwendung eines Lactat-

| NACHGEREICHT ·· ·· 00 • ···· 0 • · • · · • · • · • · · • • · • · · • ·· ·♦ ···# • • ··♦· # ♦ - 20 -

Dehydrogenase(LDH)-Tests beurteilt. Humane Nabelvenen-Endothel-Zellen („human umbilical vein endothelial cells", HUVEC) aus semi-konfluenten Kulturen wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet, mit einer Dichte von 2500 Zellen/Vertiefung in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät, welche zuvor mit humanem Fibronektin beschichtet worden waren. Um eine richtige Befestigung zu ermöglichen, wurden die Zellen 24 h lang in Endothelial Basal Medium 2MV (Cambrex Biochemicals), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 60 pg/ml Endothelzellwachstums-Ergänzungsmittel, hrEGF, hrFGF2, hrlGF, hrVEGF, Ascorbinsäure und Heparin, inkubiert . Nach der Befestigung wurden die Zellen durch Inkubation bei 37°C/95% Luftfeuchtigkeit in Medium 199 + 10% fötalem Kälberserum („fetal calf serum", FCS) ohne Wachstumsfaktoren ausgehungert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand durch Medium 199, enthaltend 10% FCS, VEGF und verschiedene Konzentrationen der Enzyme, ersetzt. Nach einer Inkubationsdauer von 48 Stunden wurde der Überstand geerntet, und ein LDH-Test wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers (Promega, Deutschland) durchgeführt: 50 μΐ Aliquots aus allen Vertiefungen wurden in eine frische (Enzymtest-)Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden übertragen. Der Testpuffer wurde zur Substratmischung zugegeben und sanft gemischt. 50 μΐ rekonstituierte Substratmischung wurde in jede Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. 50 μΐ Stopplösung wurden in jede Vertiefung zugegeben. Innerhalb einer Stunde wurde die optische Dichte bei 490 nm mit einer Referenz-Wellenlänge von 620 nm gemessen. Die Ergebnisse sind als % unbehandelte Kontrolle ausgedrückt .

Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Sie zeigen deutlich, dass Bromelain, Nattokinase und Papain bis zu einer Höhe von einschließlich 25 pg/ml nach zweitägiger Inkubation keine toxische Wirkung auf HUVEC aufwiesen.

Antiproliferative Aktivität

Die antiproliferative Aktivität von Bromelain, Nattokinase und Papain und ihren Mischungen wurde unter Verwendung eines 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolbromid(MTT)-Tests beurteilt. Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) aus semi-konfluenten Kulturen wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet, mit einer Dichte von 1000 Zellen/Vertiefung in zuvor mit humanem Fibronektin beschichtete Mikroplatten mit 96 Vertiefun-

NACHGEREICHT gen ausgesät. Um eine ordentliche Befestigung zu ermöglichen, wurden die Zellen 24 h lang in Endothelial Basal Medium 2MV (Cambrex Biochemicals), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 60 pg/ml Endothelzellwachstums-Ergänzungsmittel, hrEGF, hrFGF2, hrlGF, hrVEGF, Ascorbinsäure und Heparin, inkubiert. Nach der Befestigung wurden die Zellen durch Inkubation bei 37°C/95% Luftfeuchtigkeit in Medium 199 + 10% fötalem Kälberserum (FCS) ohne Wachstumsfaktoren ausgehungert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand durch Medium 199, enthaltend 10% FCS, und verschiedene Konzentrationen von Bromelain, Nattokinase oder Papain ersetzt. Die Zellen wurden weiter 48 h lang bei 37°C/95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Der MTT-Test wurde unter Verwendung eines EZ4U MTT-Kits (Biomedica, Österreich; gemäß den Instruktionen des Herstellers) durchgeführt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm mit einer Referenz-Wellenlänge von 620 nm gemessen. Die Ergebnisse sind als % unbehandelte Kontrolle oder als % Proliferation ausgedrückt, wobei 100% die Proliferation der mit VEGF behandelten Kontrolle sind.

Die Ergebnisse der Konzentration-Reaktion-Versuche sind in Fig. 2 gezeigt. Sie beweisen eine klare antiproliferative Wirkung von Bromelain, Nattokinase und Papain, wobei Bromelain und Papain 75% Wachstum bei Konzentrationen von sebst nur 25 pg/ml erreichten. Zusammengenommen mit den Ergebnissen aus dem LDH-Freisetzungstest, zeigen diese Daten auf eine klare anti-proliferative Wirkung, aber auf keine zytotoxische Aktivität von Bromelain, Nattokinase oder Papain auf HUVEC.

Anti-angiogene Aktivität

Die anti-angiogene Aktivität wurde unter Verwendung eines Röhrchenbildungs-Tests beurteilt. Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (Becton Dickinson, Wien) wurde bei einer Temperatur von 4°C aufgetaut. 50 μΐ pro Vertiefung wurden in die Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die Platte wurde 24 h lang bei 4°C belassen. Vor dem Versuch wurde die Platte 30-60 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um das Gel zu verfestigen. HUVEC wurden 24 h lang mit Medium 199, das 2% FCS enthielt, inkubiert. Die Zellen wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet und in mit Matrigel beschichtete Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/Vertiefung ausgesät. Die Arzneimittel und VEGF wurden bis zu den gewünschten Konzentrationen zugegeben.

NACHGEREICHT ·· « ···· ···· t · · · · » · · · · ·· ·· ··♦· - 22 -

Nach weiteren 6 h wurden die Vertiefungen photographiert. Die Gesamtlänge der Röhrchen wurde unter Verwendung der ImageJ Software, gemessen durch den Neuron Length Determination Plugin, bestimmt.

Ergebnisse:

Beispiel 1: Inhibierung des Wachstums von HUVEC durch Enzyme.

Die Ergebnisse der Mischungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Eine deutliche anti-proliferative Wirkung ist zu sehen.

Tabelle 1: Inhibierung des Wachstums von HUVEC durch Kombinationen von Bromelain, Nattokinase und Papain in Gegenwart von VEGF.

Bromelain Nattokinase Papain %Proliferation 0,00% 0,00% 100,00% 75,45% 75,00% 0,00% 25,00% 89,09% 16,67% 16,67% 66,67% 91,82% . 25,00% .75,00% 0,00% 94,55% 66,67% 16,67% 16,67% 96,82%

Beispiel 2: Röhrchenbildung von mit den Enzymen Bromelain, Nattokinase und Papain inkubierten HUVEC

Die Ergebnisse des Röhrchenbildungs-Tests der Mischungen sind in Fig. 3 sowie in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2: % Röhrchenbildung bei HUVEC in Gegenwart von VEGF. Die Ergebnisse sind als % Röhrchenbildung gezeigt, wobei 100% gleich der Röhrchenbildung in nur mit VEGF behandelten Proben ist.

NACHGEREICHT

Bromelain Nattokinase Papain % Röhrchenbildung 75, 00% 25,00% 0,00% 1,89% 16,67% 16,67% 66,67% 6,48% 25,00% 25,00% 50,00% 12,25% 0,00% 75,00% 25,00% 12,58% 75,00% 0,00% 25,00% 13,66% 25,00% 0,00% 75,00% 16,23% ·· ·· • ··· • · • · • · • • · • · • • · · • · • · • ···· · • · • · • • · ·· #* • · - 23 - 16,67% 66,67% 16,67% 16,35% 50,00% 0,00% 50,00% 17,27% 0,00% 50,00% 50,00% 19,99% 0,00% 25,00% 75,00% 21,74% 33,33% 33,33% 33,33% 25,86% 25,00% 75,00% 0,00% 38,43% 50,00% 25,00% 25,00% 52,22% 0, 00% 0, 00% 100,00% 60,14% 0,00% 0,00% 0, 00% 100%

Tabelle 2 zeigt die Röhrchenlänge, ausgedrückt als % Röhrchenbildung. Die Ergebnisse zeigen deutlich: 1. die Röhrchenbildung wird durch Mischungen von Bromelain, Nat-tokinase und Papain inhibiert; 2. die Kombination von Bromelain, Nattokinase und Papain hat eine stärkere Wirkung als die Arzneimittel alleine.

Fig. 3(A) zeigt die Kombination von 25% Bromelain, 50% Nattokinase und 25% Papain. (B) zeigt die mit VEGF behandelte Kontrolle. Während bei der VEGF-Kontrolle ein enges Muster aus gebildeten Röhrchen sichtbar ist (Pfeile), zeigt die mit Enzym behandelte Probe breite Flächen ohne Röhrchenbildung, was eine ' anti-angiogene Aktivität des Enzym-Cocktails anzeigt.

Beispiel 3: Röhrchenbildung von HUVEC in Gegenwart von Proteasen aus Tieren

Proteasen aus Tieren

Konzentration [pg/ml] Chymotrypsin Trypsin 0 100,00% 100,00% 2,5 112,40% 112,82% 5 95,94% 112,23% 10 81,16% 95,22% 20 131,18% 127,87% Tabelle 3: % Röhrchenbildung bei HUVEC nach Behandlung mit

Um zu testen, ob die Röhrchenbildung inhibiert wird wegen einer Zellablösung, wurde HUVEC mit'Chymotrypsin und Trypsin, zwei bei der Zellablösung weit verbreitet verwendeten proteolytischen Enzymen behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Weder Chymotrypsin noch Trypsin zeigten eine signifikante Wirkung. __ _

NACHGEREICHT ·· ·· ·· · ···♦ ··»« ·····♦· ♦ · ♦ · · · · · · · · • · · · · ···· · · «···· · · · · ·· ·· ··*· · · ·· - 24 - VEGF und Trypsin oder Chymotrypsin.

Eine signifikante Abnahme der Proliferation wurde bei humanen Nabel-Endothelzellen nach Behandlung mit Bromelain, Natto-kinase und Papain alleine oder in Kombination mit Konzentrationen im Bereich von zwischen 25 und 100 pg/ml nachgewiesen.

Eine relativ geringe Toxizität von Bromelain, Nattokinase und Papain wurde gezeigt, besonders bei den Höhen, von welchen gezeigt wurde, dass sie eine anti-proliferative Wirkung aufwei-sen. Konzentrationen von bis zu 50 pg/ml zeigten keine toxische Wirkung auf HUVEC nach zweitägiger Inkubation bei 37°C.

Beispiel 4: Einfluss der Enzymmischung auf die VEGF-Konzentration in menschlichem Blut

Bei diesem Beispiel wurde die Wirkung einer Enzymtherapie (Mischung aus Nattokinase, Bromelain, Papain) auf die Menge der VEGF-Konzentration im Blut untersucht. Es konnte gezeigt werden (siehe nachstehende Ergebnisse), dass die Enzymtherapie die erhöhte VEGF-Konzentration im menschlichen Blut signifikant verringert .

Der Versuch wurde als randomisierte, „open label", Multizentrum-Pilotstudie an 111 Patienten beiderlei Geschlechs mit Typ 2-Diabetes in zwei parallelen, vergleichbaren Gruppen durchgeführt. 54 Patienten erhielten 4 Wochen lang Rutozym™ (Nattokinase (20.000 FU/gm) 25 mg Bromelain (2450 GDU/gm) 90 mg Papain N.F. (2.400 USP Einheiten/mg). 100 mg, Marlyn Nutraceuticals, USA). Die VEGF-Konzentrationen im Plasma der Patienten wurden vor dem Ergänzen und direkt nach 4 Wochen Ergänzung getestet.

Die Patienten dienten sich mit ihren ursprünglichen Werten als Eigen-Kontrollen.

Die VEGF-Konzentrationen im Blut wurden in 4 verschiedene Gruppen unterteilt (Quartile; siehe Fig. 4): VEGF-Konzentration im Blut der Patienten vor der Therapie < 50 ng/ml; (s50= Start < 50 ng/ml; e50= Ende) slOO: VEGF-Konzentration < 100 ng/ml vor der Therapie; s200: < 200 ng/ml vor der Therapie und s300: > 200 ng VEGF vor der Therapie .

Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung eines Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung, das Proteasen aus Planzen- und/oder Mikroben-Quellen umfasst, benützt werden kann, um den VEGF-Level im Blut zu verringern und somit zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Neoangiogenese verbunden sind,

NACHGEREICHT ···· ···· • · • · • · I Φ Φ • ΦΦ ·· «· ·· « • · · · · Φ t % · · φ φ · · • · · · ΦΦΦ· φ φ φ φ φ · φφ φφ #··· · - 25 - verwendet werden kann.

Schlussfolgerung

Proteolytische Enzyme, deren Ursprung Pflanzen, Bakterien oder Pilze sind, können zur Behandlung der benignen Prostatahypertrophie bei Säugern verwendet werden, um die Progression zu verringern und die Regression des hypertrophen Prostatagewebes zu bewirken und dadurch eine Abhilfe für obstruktive Symptome, die mit dieser Erkrankung verbunden sind, zu schaffen.

Orale Enzym-Therapie verringert die erhöhte VEGF-Konzentra-tion bei Diabetes-Patienten, hat jedoch keinen Einfluss auf normale VEGF-Mengen. Proteolytische Enzyme verringern bei HUVEC eine durch VEGF induzierte Röhrchenbildung.

Die Enzym-Therapie inhibiert angiogene Wachstumsfaktoren, was zu einer verringerten Vaskularität führt, und dies ist die Basis ihrer Wirkung bei der Reduktion der benignen Prostatahypertrophie - Hyperplasie.

Beispiel 5: Mit Proteasen behandelte Prostata-Hyperplasie, ein Tiermodell

Dieses Beispiel wurde zur Untersuchung von- zwei Fragen maßgeschneidert : 1. Kann in diesem Maus-Modell die durch Kastration/Testoste-ron induzierte Hyperplasie der Prostata vermieden werden durch Proteasen aus Pflanzen, Bakterien und Tieren? 2. Ist die Wirkung von Proteasen gleich, geringer oder stärker als die Wirkung einer anti-VEGF-Behandlung?

Untersuchte Enzyme Bromelain Nattokinase Papain

Serrapeptase

Brinase

Trypsin

Gruppen (Mäuse) : 1. kastriert + Testosteron (Kontrolle) 2. kastriert + Testosteron + anti-VEGF (positive Kontrolle) 3. kastriert + Testosteron + Enzyme (6 Verum-Gruppen) 8 Gruppen ä 12 Mäusen (C57/B6) = 96 Mäuse Modell:

Kastrierte Mäuse:

Die folgende Methode ist von Wang et al. beschrieben (Wang ' .. .. JIJWU—I—WWM—

NACHGEREICHT ·· « ···· ·»·· • · · • · · • · · ·· ·· • · ♦ · • · · * i • ·«·· · · • · · · · • ·· · · ·· - 26 - XD, Differentiation, 2007 Mar; 75 (3):219-234): C57/B6-Mäuse, 10-12 Wochen alt, wurden kastriert, und zum Zeitpunkt 3 oder 14 Tage nach der Operation wurden die Mäuse für diese Gruppen getötet, und die gesamten Prostatae wurden entnommen. Die Prostatae wurden auch aus scheinbehandelten Mäusen zwecks Kontrolle entnommen. Um eine wieder wachsende Prostata zu erhalten, wurden Mäusen, die 14 Tage zuvor kastriert worden waren, Testosteron (T)-Pellets implantiert (15 mg/Pellet/Maus; Innovative Research, Sarasota, FL). 14 Tage nach der Pellet-Implantation wurden die Mäuse getötet und die Prostatae entnommen. Fünf Mäuse wurden für jede Behandlung/Zeitpunkt verwendet.

Kriterien: 1. Gewicht der Prostata:

Das Prostatagewicht-zu Körpergewicht-Verhältnis wurde nach der Tötung bestimmt. Die gesamte Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Protein-Tests gemessen (Tsai et al. (Urol. Int. 2006; 77 (3): 269-274)). 2. Mikroqefäßdichte („micro vessel densitv", MVD):

Immunhistochemie: um die Expression von CD34 zu untersuchen, um die Mikrogefäßdichte (MVD) zu berechnen.

Die MVD-Methode (von Weidner entwickelt (Breast Cancer Res. Treat. 1995; 36(2): 169-180)) wurde durch Licht-Mikroskopie unter Verwendung der eingeführten Zählmethode bewertet; CD34 wurde verwendet, um neu gebildete Mikrogefäße zu identifizieren. Le-ber-Gewebsschnitte wurden bei einer geringen Vergrößerung gescant (x 40 und x 100), um jene Flächen zu finden, die die intensivste Vaskularisierung aufwiesen („Hot Spots"). einzelne Mikrogefäße wurden in drei Feldern mit 200x Vergrößerung gezählt (20 x Objektiv-Linse und 10 x Okular-Linse; 0,7386 mm2 pro Feld). Die endgültige MVD war der aus Zählungen der 3 Felder erhaltene Mittelwert. Die MVD wurde als Mittel ± Standard-Abweichung (Gefäße pro mm2) ausgedrückt. Jede immungefärbte Endothelzelle oder Endothelzell-Cluster, die eindeütig von Hepa-tozyten und anderen Bindegewebselementen getrennt war, wurde als einzelnes und zählbares Mikrogefäß betrachtet. Die Gefäß-Lumen waren nicht notwendig, um eine Struktur als Mikrogefäß zu definieren, und die roten Blutkörperchen wurden nicht zur Definition eines Gefäß-Lumens verwendet. Die Bewertung der MVD wurde ohne Kenntnis jeglicher klinischer und pathologischer Daten durchgeführt .

NACHGEREICHT ·« ·· ·· • • · • · • · • • · « · • · • • » • · • · • • · · · • • · • · • • • · · ·· ·· ···· • • ·· - 27 -

3.. VEGF 1. Färbung der Prostata mit VEGF-Antikörpern (Pallares et al., (Histol. Histopathol. 2006 Äug.; 21 (8): 857-865)). 2. Bestimmung des VEGF im Blut der Tiere (ELISA). 4. Statistische Analyse:

Gruppen wurden mittels eines Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von einem Bonferroni-Test zwischen der unbehandelten Gruppe und den einzelnen behandelten Gruppen und zwischen der mit VEGF behandelten Gruppe und den mit Enzym behandelten Gruppen.

NACHGEREICHT

Claims

>4 * >4 * ·· ·· ♦· • ···· »«·« • « « · • · · • * • · • · • « ♦ ···· • • · • • · · ·· 28 ·· ···· • • M Patentansprüche: 1. Verwendung mindestens einer Protease zur Herstellung eines Medikaments zu Behandlung und/oder Prävention benigener Prosta-tahypertrophie/Hyperplasie.
2. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen-, Tier- und Mikroben-Pro-teasen.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Pflanzen-Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus* Bromelain, Papain oder Ficin.
4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben-Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nattokinase, Brinase, Seaprose und Subtilisin.
5. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die tierische Nicht-Säugetier-Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krillenzym und Lumbrokinase.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Pflanzen-, Tier- und/oder Mikroben-Protease im Medikament in einer Menge von 5 bis 100% Gew./Gew., vorzugsweise von 20 bis 80% Gew./Gew., mehr bevorzugt von 30 bis 70% Gew./Gew. enthalten ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Pflanzen-, Tier- und/oder Mikroben-Protease einem Individuum in einer Menge von 1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 2 bis 50 mg/kg, mehr bevorzugt 5 bis 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein Verdünnungsmittel und/oder einen Exzipienten, vorzugsweise ein Bindemittel, einen Füllstoff, ein Zerfallsmittel, ein Gleitmittel, ein Konservierungs- NACHGEREICHT ψ ψ ♦ · · ···· ···· • · · • · • · · • · ·· ··

·· 29 mittel und/oder einen Überzug aufweist.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur enteralen (oralen, rektalen) , topischen oder parenteralen Verabreichung geeignet ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament in einer pharmazeutischen Form vorgesehen ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tropfen, Spray, Tabletten, vorzugsweise löslichen Tabletten, Brausetabletten, Magen-resistenten Tabletten und Sublingualtabletten, Kapseln, vorzugsweise Magen-resistenten Kapseln, Pulvern, Granula, oralen Flüssigkeiten, oralen Tropfen, Salben, Lotionen, Emulsionen, Hydrogels, Suppositorien, Pessare, Infusionen und Injektionen.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters mindestens ein weiteres aktives Ingrediens umfasst.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine weitere aktive Ingrediens ein Flavonoid und/oder ein Antioxidans ist.
13. Verwendung nach Anspruch 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere aktive Ingrediens im Medikament in einer Menge von 5 bis 35% Gew./Gew., vorzugsweise von 10 bis 30% Gew./Gew., mehr bevorzugt von 15 bis 25% Gew./Gew. enthalten ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament mindestens eine Protease ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Brinase, Bromelain, Ficin, Lumbrokinase, Nattokinase, Papain, Pronase, Seaprose-S, Serra-peptase, Sfericase, Subtilisin aufweist. I NACHGEREICHT