DE69528311T2

DE69528311T2 - Enzym-verknüpfte Chemilumineszenzbestimmung

Info

Publication number: DE69528311T2
Application number: DE69528311T
Authority: DE
Inventors: Richard Charles Brown; Dr. Weeks
Original assignee: Molecular Light Technology Ltd; Molecular Light Technology Research Ltd
Current assignee: Gen Probe Cardiff Ltd
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-10
Publication date: 2003-05-15
Anticipated expiration: 2015-05-11
Also published as: GB9409223D0; DE69528311D1; ES2183853T3; EP0682254A1; GB2289334B; EP0682254B1; GB2289334A; US6159699A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung oder ein Ermittlungsverfahren, welches ein Enzym einsetzt, welches gekoppelt ist an ein chemilumineszentes Endpunktsignalisierungssystem für die Ermittlung und die Messung von Verbindungen von Interesse in Anordnungssystemen, welche ligande Bindungstechniken einsetzen.
Solche liganden Bindungstechniken hängen ab von der in biologischen Molekülen, wie etwa Rezeptoren, Antikörpern und Nukleinsäuren, inhärenten Fähigkeit zu binden mit einem hohen Ausmaß von Spezifizierung an ihren entsprechenden analogen Partnerligand. Aufgrund dieser Spezifizierung haben derartige Techniken eine weit verbreitete Anwendung gefunden bei der Erfassung und der Messung von vielen Einheiten, die von einfachen Chemikalien bis zu komplexen biologischen Molekülen reichen, einschließlich Peptiden, Proteinen, Kohlenwasserstoffen und Nukleinsäuren. Konsequenterweise wurde die Technik von Ligandbindung zu einem der wichtigsten Werkzeuge für die Untersuchung und Erprobung und hat somit eine universelle Anwendung gefunden.
Bei derartigen Ligandbindungssystemen tritt die spezifische Bindungsreaktion ein, wenn der Ligand der Ligandpartnerverbindung präsentiert wird. Beispiele umfassen die Antikörper-Antigenreaktion und die Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresequenzen. Ein Schlüsselmerkmal, welches allen Ligandbindungsprüfsystemen innewohnt, ist, daß es erforderlich ist, um den Fortschritt einer solchen Bindung zu überwachen und somit eine qualitative und/oder quantitative Anzeige des Ausmaßes einer solchen Bindung zu überwachen, eine Markierung vorzunehmen entweder direkt oder indirekt an mindestens einem der Ligandpartner, welche an der Ligandbindungsreaktion teilnehmen. Dieser mar kierte Ligand kann dann zum Einsatz kommen, um ein meßbares Signal zu erzeugen, über welches die Reaktion überwacht wird. Die relative Quantität des Signals, welches durch den markierten Ligand erzeugt wird, ist proportional der Quantität des markierten Liganden, der anwesend ist, und kann somit dazu dienen, die Konzentration des markierten Liganden anzuzeigen. Beispiele solcher Signalgeneratoren umfassen radioaktive Nukleide (¹²&sup5;I, ³H, ¹&sup4;C, ³²P), chemilumineszente oder fluoreszente Verbindungen (Acridiumester, Lanthanidchelate) und Enzyme (Peroxidase, Phosphatase).
Solche Markierungen werden synthetisiert durch die chemische Kopplung des Signalgenerators "Markierung" an den Liganden, so daß sie seine Bindungscharakteristika nicht stören, sondern es ermöglichen, daß seine Anwesenheit gemessen werden kann durch die entsprechende Erfassungstechnologie. Die Wahl der Signalerzeugungsmarkierungen wird beeinflußt durch Faktoren, wie etwa die Leichtigkeit und Sensitivität der Erfassung, sowie die Fähigkeit, leicht derartige Verbindungen chemisch in den speziellen Liganden zu inkorporieren. In klassischer Weise war die erste Klasse von Verbindungen, die derart eingesetzt wurde Radionukleide. Diese können in biologische Moleküle inkorporiert werden und machen sich selbst erfaßbar durch ihre radioaktiven Emissionen, die überwacht werden können durch eine entsprechende Technologie, wie etwa Szintillationszählung und Hochenergiephoton sensitive chemische Filme. Radioaktive Anteile leiden jedoch unter Problemen, die mit ihrem radioaktiven Zerfall zusammenhängen, wie etwa Sicherheit und Instabilität, wie auch der begrenzten Sensitivität der Erfassung bei bestimmten Nukleiden. Konsequenterweise wurden alternativ nicht isotopische Signale erzeugende Systeme gesucht. Diese nicht isotopen Markierungen sind chemisch gekoppelt an eine der Komponenten; die an der Ligandbindungsreaktion teilnehmen.
Beispiele solcher alternativen nicht, isotopischer Signalerzeugersysteme umfassen Fluoreszenz, wobei das Ausgangssignal erzeugt wird durch die Erregung eines geeigneten molekularen Adduktes, Chemilumineszenz, wobei das Ausgangssignal erzeugt wird durch chemische Modifikation der Signalverbindung, oder Enzyme, wobei eine Enzym abhängige Sekundärerzeugung eines Signals eintritt, wie etwa die Bildung eines gefärbten Produktes aus einem nicht gefärbten Substrat.
Die britische Patentschrift 2 112 779 beschreibt Techniken, bei welchen Acridiumsalze erfolgreich eingesetzt wurden als direkte Signal erzeugende Markierungen in Ligandbindungsanordnungen. Hier ist das Acridiumsalz gleichwertig gekoppelt direkt an den Liganden. Der Anordnungsprozedur folgend, wird die Lumineszenz gemessen, indem man das Acridiumsalz, welches an den speziell in dem Ligandbindungskomplex gefangenen Liganden gekoppelt ist, gegenüber Peroxid in starkem Alkali (pH 14) aussetzt. Unter diesen Bedingungen wird eine Acridiumesterbindung beispielsweise aufgebrochen, was zur Bildung eines erregten Produktmoleküls führt, welches zu seinem Grundstatus zurückkehrt bei Verlust von Energie in der Form von Photonen. Diese Photonen können dann quantifiziert werden durch Standardluminometriktechniken. Typischerweise, obwohl nicht exklusiv, geht die Freisetzung von Photonen rasch von sich, wenn die Signalerzeugungsreaktion vervollständigt wird innerhalb 1 bis 2 Sekunden, wenn Überschußquantitäten von einleitendem Alkaliperoxid anwesend sind. Damit diese Reaktion überwacht werden kann, muß notwendigerweise die Beigabe einer oder mehrerer Initiatorverbindungen erfolgen, wenn die Reaktanten in physikalischer Nachbarschaft zu der luminometrischen Vorrichtung sind. Dies kann zu Einschränkungen führen hinsichtlich der Anwendung insbesondere, wenn das Signal, welches von dem markierten Liganden erfaßt wird, gefangen ist auf einer flachen Oberfläche, wie etwa einem Gel, einer Membran oder einem Gewebe. In konsequenter Weise wurde trotz ihrer sehr hohen Sensitivität der Einsatz von Acridiumsalzlumineszenz bis heute beschränkt auf Ligandbindungssysteme, bei welchen die Reaktanten in Röhren eingeschlossen sind, die in Luminometer eingesetzt werden können vor der In-situ-Beigabe von Initiatorreagenzien.
Für den Fall, daß Enzyme eingesetzt werden als Primärsignalgeneratoren, kann die Wirkung des Enzyms auf einem entsprechenden Substrat selbst zur Erzeugung eines Sekundärsignals führen, welches beispielsweise chemilumineszenter oder fluoreszenter Art ist. In dieser Situation ist die Rolle des markierten Enzyms entweder direkt, d. h. das Substrat selbst wird umgesetzt von einer inaktiven in eine aktive und dementsprechend erfaßbare Form, oder indirekt, wobei das Substrat konvertiert wird von einer inaktiven in eine aktive Substanz, die selbst ein Initiator oder Cofaktor bei der Umsetzung einer inaktiven in eine aktive Verbindung ist. Ein Beispiel der ersteren ist die direkte Wirkung der Alkaliphosphatase auf stabile Dioxetane, wobei die Entfernung einer Phosphatgruppe die Dioxetane instabil macht mit einer nachfolgenden Freigabe quantifizierbarer Lumineszenz. Ein Beispiel für die letztere ist die indirekte Wirkung der Peroxidase auf Luminol, wobei die Lumineszenz erzeugt wird durch Enzym katalysierte Produktion von aktiven Sauerstoffspezies durch den Verfall von Peroxidsubstrat. In beiden Beispielen ist die Lumineszenz nach einer geeigneten Inkubationsperiode relativ langlebig, da sie abhängt von der Erzeugung eines Produktes durch das Signalenzym, ein Vorgang, der im wesentlichen weiterläuft, bis das verfügbare Substrat aufgebraucht ist. Von diesen Systemen, die die weiteste Verbreitung bei der Anwendung gefunden haben, ist die Signalintensität inhärent niedrig, so daß der Rahmen der Anwendung eingeschränkt ist. Um dieses Problem zu überwinden, benötigen derartige Systeme Unterstützer (beispielsweise Para-iodo-phenol) oder Verstärker (beispielsweise fluoreszente Polymere), wodurch die Komplexität dieser Signalerzeugungsverfahren erhöht wird.
Ligandbindungsanordnungen setzen Oxidaseenzyme ein, wie etwa Glukoseoxidase, welche als Signalerzeugungsmarkierungen zuvor beschrieben worden sind. Bei diesen Systemen wird die Anwesenheit des Ligand gekoppelten Oxidaseenzyms überwacht indirekt durch die Kopplung der Reaktion an Peroxidaseenzyme, wie etwa Meerrettichperoxidase zur Erzeugung aktiver Sauerstoffspezien, die sich mit einem geeigneten farblosen löslichen Reduzierungsmittel kombinieren, um ein gefärbtes Produkt zu erzeugen. Diese Technik leidet jedoch unter einer schlechten Erfaßbarkeit.
Die EP-A-0 256 932 beschreibt Verfahren zur Erfassung von Analyten in chemilumineszenten Immunanordnungssystemen, basierend auf bestimmten Oxidasen, die Wasserstoffperoxid erzeugen und das Superoxidanion. Diese Systeme erfordernden Einsatz eines Verstärkers.
Arakawa et al (Clinical Chemistry, Band 31, S. 430-434, 1984) beschreiben eine Ligandbindungsanordnung unter Einsatz von Glucoseoxidase ge koppeltem bis-Oxalatester erzeugter Lumineszenz unter Verwendung einer fluoreszierenden Farbe. Alternativ wurde ein Verfahren beschrieben von Kiriyama et al (Clinica Chimica Acta Bd. 220, S. 201-209, 1993), wobei das Peroxid, erzeugt aus Glucoseoxidase gekoppeltem Ligand, überwacht wird durch die Fähigkeit, Luminolchemilumineszenz zu erzeugen in der Anwesenheit von Ferricyanid.
Diese beiden Verfahren sind jedoch unempfindlich, und eine extensive Dauer (über Nacht) der Preinkubation des Enzym gekoppelten Liganden mit Glucosesubstrat ist erforderlich zur Erzeugung ausreichend erfaßbarer Konzentrationen von Peroxid.
Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, welches die hohe Photonenemission von chemilumineszenten Acridiniumverbindungen und ihrer Analoge ausnutzt, ohne die sich in die Länge ziehenden Vorinkubationsperioden von typischen Enzym gekoppelten Anordnungen zu erfordern, während eine andauernde Photonenemission bereitgestellt wird, verglichen mit der rascheren Lichtemission, die normalerweise verbunden ist mit chemilumineszenten Acridiniumverbindungen und ihrer Analoge. Die fortdauernde Emission bedeutet, daß die hohe Sensitivität von chemilumineszenten Acridiniumverbindungen und ihrer Analoge nun für Gele eingesetzt werden kann wie auch für Membrane und Gewebe, wobei viele Stellen gleichzeitig untersucht werden können, und die Photonenemission wird fotografisch aufgezeichnet oder durch andere Bilddarstellungsverfahren. Darüber hinaus erfordert die fortdauernde Emission nicht, daß die Reagenzien gleichzeitig auf alle Gelstellen aufgebracht werden müssen.
Die Verfahren können jedoch auch außer bei Gelen, Membranen oder Geweben in vielen anderen Anwendungen eingesetzt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytes in einem Medium bereitgestellt, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
(a) In Kontakt bringen des Mediums mit einem Enzymkonjugat, welches den Ligandpartner konjugiert mit dem Enzym enthält, wobei das Enzym geeignet ist, eine oder mehrere Reaktionen zu einer Kaskade zu katalysieren, um Wasserstoffperoxid herzustellen;
(b) Bildung von Komplexen zwischen dem Enzymkonjugat und dem Analyt;
(c) In Kontakt bringen des zu einem Komplex reagierten Enzymkonjugates und/oder des nicht zu einem komplex reagierten Enzymkonjugates mit einem entsprechenden Enzymsubstrat, um die Reaktion oder die Kaskade von Reaktionen zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu initiieren;
(d) Reagieren des Wasserstoffperoxids mit einer Substanz, welche in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid Chemilumineszenz zeigt, wobei die Substanz aus der Gruppe von Acridiniumverbindungen und deren Analoge ausgewählt ist, mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, und
(e) Bestimmen, Messen oder Beobachten der Photonenemission während der Chemilumineszenzreaktion, um das Vorhandensein oder die Menge des Analytes zu bestimmen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytes in einem Medium, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
(a) In Kontakt bringen des Mediums mit dem Ligandpartner und
(i) einem Konkurrenzanalyt oder
(ii) einem Analogen des Analyts,
wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit dem Enzym konjugiert ist, um ein Enzymkonjugat zu bilden, wobei das Enzym in der Lage ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zum Herstellen, von Wasserstoffperoxid zu katalysieren;
(b) Bildung von Komplexen des Enzymkonjugats und/oder Analyts mit dem Ligandpartner;
(c) In Kontakt bringen des zu einem Komplex reagierten Enzymkonjugates und/oder des nicht zu einem Komplex reagierten Enzymkonjugates mit einem entsprechenden Enzymsubstrat, um die Reaktion oder die Kaskade von Reaktionen zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu initiieren;
(d) Reagieren des Wasserstoffperoxids mit einer Substanz, welche in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid Chemilumineszenz zeigt, wobei die Substanz aus der Gruppe von Acridiniumverbindungen und deren Analoge ausgewählt ist mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, um eine Chemilumineszenzreaktion zu erzeugen, und
(e) Bestimmen, Messen oder Beobachten der Photonenemission während der Chemilumineszenzreaktion, um das Vorhandensein oder die Menge des Analytes zu bestimmen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können bei vielen unterschiedlichen Anwendungen zum Einsatz kommen. Sie können verwendet werden, um Materialien auf einem Gel zu erfassen unter Einsatz von Enzym markierten Antikörpern oder Enzym markierten Nukleinsäureproben usw. Sie können auch in homogenen Anordnungen, heterogenen Anordnungen, doppelseitigen Anordnungen und vielen anderen Anordnungen zum Einsatz kommen, wobei Markierungstechniken dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt sind. Bei heterogenen Anordnungen ist es erforderlich, die Ligandkomplexbindung und die ungebundenen Fraktionen zu trennen. Dies kann durchgeführt werden unter Einsatz anderer Techniken, die dem Sachverständigen auf diesem Gebiet zur Verfü gung stehen, wie z. B. immobilisierten oder festen Antikörpern oder Antigenen usw. Alternativ können das Konjugat dieses Enzyms und der Ligandpartner oder Analyt oder Analoganalyt (wie dies auch immer der Fall sein kann) so ausgelegt werden, daß bei der Bindung zur Bildung eines Ligandkomplexes das Enzym modifiziert oder veranlaßt wird, sich vom aktiven Status in den inaktiven Status zu verändern oder umgekehrt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird durch die vorliegende Erfindung eine Ausrüstung bereitgestellt zum Einsatz bei der Untersuchung oder Bestimmung eines Analytes in einer Probe, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei die Ausrüstung die folgenden Merkmale umfaßt:
eine erste Reagenz enthaltend:
(i) einen Ligandpartner konjugiert mit einem Enzym, welches in der Lage ist, eine Reaktion oder eine oder mehrere Kaskadenreaktionen zu katalysieren,
(ii) einen Konkurrenzanalyten oder ein Analoges des Analyten, welcher in der Lage ist, einen Ligandkomplex zu bilden mit dem Ligandpartner, wobei der Konkurrenzanalyt oder das Analytanaloge zu einem Enzym konjugiert ist, welches in der Lage ist, eine Reaktion oder eine oder mehrere Kaskadenreaktionen zu katalysieren zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid, und
ein zweites Reagenz, welches eine chemilumineszente Verbindung enthält, die aus der Gruppe der Acridiniumverbindungen und deren Analoge gewählt ist mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, welche mit Wasserstoffperoxid reagiert und Photonenemission erzeugt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Ausrüstung zur Verfügung zur Verwendung bei der Untersuchung oder Bestimmung eines Analytes in einer Probe, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei in dem Verfahren die Probe zuerst mit folgendem in Kontakt gebracht wird:
(i) einem Anteil, welcher den Ligandpartner enthält, der mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist, der in der Lage ist, sich mit einem entsprechenden komplementären Zwischenligandpartner zu einem Zwischenligandbindungskomplex zu binden, oder
(ii) den Ligandpartner und einen Anteil umfassend einen Konkurrenz analyt oder ein Analoges des Analytes, wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist, wobei der Zwischenligandpartner in der Lage ist, sich mit einem entsprechenden komplementären Zwischenligandpartner zu einem Zwischenligandbindungskomplex zu binden, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
eine erste Reagenz enthaltend
(i) einen Anteil, welcher den Ligandpartner enthält, der mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist, oder
(ii) den Ligandpartner und einen Anteil umfassend einen Konkurrenzanalyt oder ein Analoges des Analyten, wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist,
ein zweites Reagenz, welches ein Konjugiertes des komplementären Zwischenligandpartners enthält, das an ein Enzym gekoppelt ist, welches in der Lage ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu katalysieren, und
ein drittes Reagenz, welches eine chemilumineszente Verbindung enthält, welche aus der Gruppe der Acridiniumverbindungen und deren Analoge ausgewählt ist mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, welche mit Wasserstoffperoxid reagiert und Photonemission erzeugt.
Die chemilumineszente Verbindung kann ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Phenanthridin, Quinolin und Benzacridin.
Entsprechend den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der markierte Lingand direkt oder indirekt gekoppelt an Oxidaseenzym, welches unter den korrekten Bedingungen in der Lage ist, die Erzeugung von Initiatorperoxid aus dem entsprechenden oxidierbaren Substrat zu katalysieren. Die Beigabe des Substrats und des Acridiniumsalzes zu dem gebundenen Oxidaseenzym markierten Ligandkomplex führt zu einer raschen Erzeugung eines langlebigen chemilumineszenten Signals, welches überwacht werden kann nach einer kurzen (typischerweise 5-minütigen) Vorinkubationszeit. Das Acridiniumsalz wird der Ligand gekoppelten Oxidase in einer Lösung präsentiert, die außerdem das entsprechende Substrat enthält. Diese Lösung muß gepuffert werden bei einem pH-Wert, der innerhalb des Arbeitsbereiches des Oxidaseenzyms liegt, wobei es sich allgemein um den Bereich pH 5 bis 7 handelt. Die Reaktivität des Acridiniumesters muß so sein, daß er in der Lage ist, innerhalb dieses pH-Bereiches mit einer ausreichend hohen Mengenausbeute zu reagieren. Die Emission von Licht kann überwacht werden durch herkömmliche Erfassungssysteme, bleibt jedoch langlebig im Gegensatz zu Ligandbindungssignalerzeugungssystemen, die ein direktes Markieren mit Acridiniumsalzen einsetzen, wie dies oben beschrieben wurde.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben zwei bestimmte und neuartige Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Ligandbindungssystemen, die Acridiniumsalze als Signalgeneratoren einsetzen, nämlich (a) das Signal ist langlebig und (b) der Signalgenerator führt zu höheren Lichtintensitäten in Abwesenheit von einer in-situ-Initiatorreagenzbeigabe. Darüber hinaus sind im. Gegensatz zu den üblicherweise eingesetzten Enzymchemilumineszentligandbindungssignalerzeugungssystemen keine Verstärker oder Unterstützungs-"Cofaktoren" erforderlich, obwohl solche in manchen Fällen, falls erwünscht, eingesetzt werden können.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die beiden Hauptkomponenten dieses Systems sind das Enzym, welches chemisch gekoppelt ist, entweder direkt oder indirekt an den Liganden, und das Acridiniumsalz, welches mit dem erzeugten Peroxid reagiert zur Bildung des chemilumineszenten Signals.
Die Art des eingesetzten Enzyms als Ligandmarkierung kann sein:
(a) ein jedes von denen, die als Oxidasen klassifiziert sind. Ein geeignetes Enzym ist beispielsweise Glykoseoxidase, die die Oxidation von Glykose katalysiert; andere umfassen Xanthinoxidase, Uricase, Galactoseoxidase und Ester, deren Katalyse zur Erzeugung von Peroxid aus dem entsprechenden Substrat führt;
(b) andere Enzyme; deren Aktion darin liegt, ein Oxidasesubstrat von einem Vorläufermolekül zu erzeugen in der Anwesenheit von der entsprechenden Oxidase in Lösung; ein Beispiel einer solchen Ligandmarkierung ist Glykosesynthetase.
Das Markierungsenzym kann gekoppelt werden direkt an den Liganden durch chemische Kopplung unter Einsatz etablierter Kopplungstechniken. Alternativ kann das Enzym indirekt an den Liganden gekoppelt werden durch ein Zwischenligandbindungssystem. Ein Beispiel für ein derartiges indirektes System involviert den Einsatz des etablierten Avidin-Biotinsystems, bei welchem diese beiden Substanzen selbst an der Bindungsreaktion teilnehmen mit einer extrem hohen Affinität. In diesem Beispiel wird eine Komponente, beispielsweise Biotin, chemisch an den Liganden angekoppelt (wie ein Antikörper oder eine Nukleinsäuresequenz, wobei viele Beispiele solcher biotinilierten Liganden handelsüblich verfügbar sind) und das Oxidaseenzym an Avidin. Im Anschluß an die Ligandbindungsreaktion wird der Ligandkomplex, welcher den biotinilierten Liganden enthält, dem Enzym gekoppelten Avidin ausgesetzt, wobei man das Enzym durch den Ligandkomplex aufnehmen läßt. Die Chemilumineszenzreaktion kann dann eintreten durch das anschließende Aussetzen dieses indirekt Enzym markierten Ligandkomplexes einer Lösung, die das Acridiniumsalz und entsprechendes Enzymsubstrat enthält.
Die Art des Acridiniumsalzes wird ausgewählt, daß sie so ist, daß sie mit einem hohen Wirkungsgrad reagiert mit der Erzeugung einer hohen Lumines zenzintensität in einem pH-Wertbereich, der optimal ist für die Aktivität der Oxidaseenzyme, die als Ligandmarkierung eingesetzt werden. Beispielsweise liegt der optimale pH-Wertbereich für die Aktivität von Glukoseoxidase zwischen pH 5,0 und 7,0, und es ist dementsprechend erstrebenswert, eine Spezies des Acridiniumsalzes einzusetzen, welches bei diesem pH-Wert arbeiten kann, um das Ausmaß der Glykoseoxidaseaktivität, die in der Ligandbindungsreaktion anwesend ist, zu überwachen.
Acridiniumsalze, die für diesen Zweck geeignet sind, sind diejenigen, die eine konjugierte Base besitzen mit pKa-Werten von weniger als 9 oder vorzugsweise weniger als 8. Beispiele derartiger Acridiniumsalze sind Phenylester, wobei der Phenylanteil Elektronen abziehende Gruppen besitzt, wie Halogen, Carbonyl oder Nitro, plaziert in Positionen an dem Phenylanteil derart, daß der erforderliche pKa erreicht wird. Elektronenspendergruppen können ebenfalls anwesend sein, vorausgesetzt, daß sie nicht im Gegensatz stehen zu den Elektronen abziehenden Gruppen in einem Ausmaß, daß der pKa-Wert ansteigt über den gewünschten Bereich. Der Aufbau und die Synthese der chemischen Anteile mit einem vorgegebenen pka-Wert sind dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt. Die Voraussage der pKa-Werte für die angegebenen Anteile kann leicht gemacht werden, beispielsweise wie dies beschrieben ist von Perrin et al. (Perrin D D et al, pKa Prediction of Organic Acids and Bases, Chapman and Hall, London, 1981). Weitere Beispiele würden sein Amide, aliphatische Ester und Thioester, die Elektronen abziehende Gruppen enthalten. Gemäß einem weiteren Aspekt können derartige geeignete Acridiniumsalze auch hydrophile Gruppen enthalten zur Verbesserung der Löslichkeit der Verbindungen in wässrigen Medien. Die Einführung von hydrophilen Gruppen, wie etwa Sulfonaten und Hydroxylen, ist dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt.
Die Auswahl und der Aufbau geeigneter Acridiniumverbindungen liegt ohne weiteres in der Kompetenz eines Sachverständigen auf diesem Gebiet. Die britische Patentschrift Nr. 2 112 779 beschreibt, die Synthese einer besonderen Verbindung, und viele Dokumente, die dieser Pionierarbeit folgen, beschreiben alternative Verbindungen; s. beispielsweise EP-A 257 541, 273 115, 322 926 und 324 202, welche chemilumineszente Verbindungen beschreiben mit Acridini umanteilen, die zum Einsatz kommen könnten in der vorliegenden Erfindung, obwohl natürlich einleuchtet, daß reaktive Gruppen, die erforderlich sind für das covalente Ankoppeln an Substanzen von biologischem Interesse in der obigen Arbeit, gemäß der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich sind. Darüber hinaus wird verwiesen auf GB-A 1 461 877, die geeignete chemilumineszente Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung beschreibt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Fähigkeit des Enzymkonjugats zu Nutze zumachen zur Erzeugung einer Akkumulation von Wasserstoffperoxid oder einem Zwischenprodukt vor der Beigabe des chemilumineszenten Acridiniumsalzes. Dies besitzt den Vorteil, daß man sich die Fähigkeit eines Moleküls des Enzyms zu Nutze macht zur Erzeugung vieler Produktmoleküle, um das man einen weiteren Bereich von Acridiniumsalzen einsetzt, andere als diejenigen, die chemilumineszente Reaktionen eingehen innerhalb des optimalen pH-Bereiches des Enzyms. Somit würde unter einem besonderen Aspekt Glukose einem Glukoseoxidase signalisierenden Konjugat beigegeben für die Reaktion über ein vorbestimmtes Zeitintervall. Eine Lösung von Acridiniumsalz würde dann beigegeben, gefolgt von einer Lösung von Natriumhydroxid zur Erleichterung der Chemilumineszenzreaktion. Die Intensität des emittierten Lichtes würde dann erfaßt und/oder quantifiziert über ein vorbestimmtes Zeitintervall. Verschiedene Variationen dieses typischen Schemas können in Betracht gezogen werden durch den Sachverständigen auf diesem Gebiet.

Gebiet bevorzugter Anwendungen

Es wird ins Auge gefaßt, daß die hier beschriebene Technik einen weit verbreiteten Einsatzbereich besitzt innerhalb des Gebietes der Ligandbindungsanordnungen. Es gibt verschiedene bestimmte Kategorien von Ligandbindungsanordnungssystemen, bei welchen die vorliegende Erfindung somit eine Anwendung finden kann, und Beispiele hiervon werden nachfolgend aufgeführt.
(1) Eine Immunprobe, bei welcher die einzigartige Spezifizierung von Antikörpern hinsichtlich ihrer entsprechenden Partnerantigene ausgeführt wird, um eine Quantifizierung des Antigens oder Antikörpers zu ermögli chen. Das Ausmaß oder der Reaktionsgrad der Ligandbindung ist proportional der Menge des Antigens und/oder Antikörpers, welcher anwesend ist, und wird überwacht durch die Markierung eines der Partnerliganden. Immunproben sind dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt, und diese Technik wird exemplifiziert durch die Arbeit von Tijssen (Tijssen P, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 15, Elsevier Amsterdam 1990).
(2) Nucleinsäureanalyse, bei welcher die einzigartige Spezifizierung von Nucleotidsequenzen hinsichtlich ihrer entsprechenden Komplementärnucleotidsequenzen ausgewertet wird, um die Identifizierung und Analyse solcher Sequenzen zu ermöglichen. Diese Spezifizierung wurde eingesetzt in Beispielen, wie etwa bei der DNA-Sequenzierung, dem DNA- "Fingerabdruck", der Identifizierung von Markierungen von genetisch gekoppelten Krankheiten und der Diagnoseidentifizierung von pathogenen Organismen. Diese Techniken besitzen das Erfordernis für die qualitative und manchmal quantitative Identifizierung von Nukleotidsequenzbindung. Gegenwärtig wird ein Großteil der qualitativen Analyse von Nukleotidbindungen ausgeführt mit dem Einsatz von Gelen, und die Anwendung von lumineszenten Endpunkten, die Acridiniumsalze einsetzen, war in dieser Situation noch nicht möglich aufgrund der raschen Freigabe des Lumineszenzsignals. Es wird dementsprechend ins Auge gefaßt, daß die hier beschriebene Technik besondere Anwendung in diesem Bereich besitzt, da gegenwärtige Techniken sich hauptsächlich auf Nukleotidsequenzen verlassen, markiert mit radioaktiven Anteilen mit den hiermit einhergehenden Problemen der Sicherheit und Instabilität.
Eine spezielle Anwendung dieser Technik nutzt die leichte Verfügbarkeit von Biotin bezogenen Nukleotiden, wobei das Oxidaseenzym gekoppelte Streptavidin einen generischen Nutzen unter solchen Umständen besitzt. Molekularbiologietechniken, im besonderen die Analyse von Nukleinsäuren durch Ligandbindung, sind dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt und werden beispielhaft erläutert durch die Arbeit von Brown (Brown T A, Essential Molecular Biology A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, 1991).
(3) Proteinanalyse an Gelen, bei welcher die Proteine auf der Basis von physiochemischen Charakteristika aussortiert werden, wie etwa die Größe oder Beladung, und ihre qualitative Identifizierung wird dann erreicht durch eine Untersuchung mit speziellen Antiprotein-Antikörpern (Western Blotting). Gegenwärtige Identifizierung von Ligandbindung wird üblicherweise erreicht durch den Einsatz gefärbter visueller Endpunkte mit konsequenten Einschränkungen hinsichtlich der Sensitivität der Erfassung. Derartige Techniken sind dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt und werden beispielhaft beschrieben durch die Arbeit von Walker (Walker J M, Ed, New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Bd. 3, Humana Press, Clifton NJ, 1988).

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Zeichnung ist ein entwickeltes Probenbild, erhalten in Beispiel 4.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, und es ist nicht beabsichtigt, daß diese den Rahmen der Erfindung in irgend einer Weise einschränken.

Beispiele

Beispiel

Ein Beispiel des Einsatzes der vorliegenden Erfindung ist eine Ligandbindungsprobe zum Zirkulieren von menschlichen anti-(HIV 1 und 2) Antikörpern in Testproben. Testproben sind diejenigen, bei welchen es für erforderlich gehalten wurde zu bestimmen, ob der entsprechende Testprobendonor Träger einer dieser pathogenen Viren ist, beispielsweise in Blutproduktscreeningkliniken oder Kliniken zur Behandlung von sexual übertragenen Krankheiten. Individuen, die infiziert worden sind durch diese Viren, besitzen spezifische anti-(HIV) Antikörper in ihrem Kreislauf.
Weiße plastic 96 Microtiterplatten werden überzogen mit synthetischen Peptidsequenzen entsprechend den reaktiven und konservierten Regionen der Umfassungsglykoproteine von HIV 1- und HIV 2-Retroviren. Dieser Überzug wird erreicht durch das Auflösen der synthetischen Peptide in einer geeignet gepufferten Lösung, wie etwa 0,1 M Natriumcarbonat/bicarbonat pH 9,6 (für diesen Zweck und nachfolgende Beispiele entsprechend als "Überzugspuffer" bezeichnet), wobei man diese Lösung in Kontakt läßt mit den Behälterwandungen für eine Zeitdauer von 18 Stunden bei +4ºC. Überschüssiges nicht überzogenes Peptid wird dann abgewaschen, und nicht in Anspruch genommene Bindungsstellen an dem Plastik werden blockiert durch die Beigabe einer Lösung, die 0,05% Tween®20 im Überzugspuffer (für diesen Zweck und nachfolgende Beispiele entsprechend als "Blockierpuffer" bezeichnet) eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Behälter mit dem überzogenen Peptid läßt man in Kontakt mit der Testprobe verdünnt in einem geeigneten Träger (für diesen Zweck und nachfolgende Beispiele entsprechend als "Probenverdünner" bezeichnet). Dieser Probenverdünner ist eine Phosphat gepufferte Salinlösung, die Trägerproteine und Detergentien enthält. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer (beispielsweise 1 Stunde bei 37ºC) wird die verdünnte Testprobe entfernt, und die Behälter werden ausgewaschen. Wenn die Testprobe anti-(HIV) Antikörper enthält, wird ein Teil davon gebunden sein an das immobilisierte HIV-Antigen an der Behälterwandung.
Die Anwesenheit solcher gebundener Antikörper kann erfaßt werden durch die Beigabe von Glukoseoxidase, gekoppelt an Ziegen-anti-(Humanimmunglobulin). Dieses Antikörper-Enzymkonjugat kann leicht synthetisiert werden durch den Sachverständigen auf diesem Gebiet unter Einsatz herkömmlicher Proteinkonjugationsmethodologie. Das Konjugat ist anwesend in einer Lösung von Probenverdünner, und man läßt es die Behälter kontaktieren für eine weitere Zeitdauer (z. B. 30 Minuten bei 37ºC), um eine Bindung des Anti-(Humanimmunglobulin)-Enzymkonjugats an das Immunglobulin zu gestatten, wenn es von der ursprünglichen Testprobe anwesend ist.
Nach dem Abwaschen von ungebundenem Anti-(Humanimmunglobulin)-Enzymkonjugat wird die Anwesenheit von gebundenem Konjugat und dementsprechend Anti-HIV-Immunglobulin in den Testproben bestimmt durch die Beigabe einer Lösung in einem geeigneten Puffer, in diesem Beispiel Phosphat gepuffertes Salm pH 6,5 der spezifischen Enzymsulbstratglukose (0,1% w/v) und Acridiniumestersalz (bei einer Konzentration von 1 Mikrogramm/ml). Die Anwesenheit von gebundener Glukoseoxidase veranlaßt den Zerfall der Glukose zu dem Produkt Wasserstoffperoxid. Dies wiederum aktiviert Acridiniumesterchemilumineszenz. Das Ausmaß der Lumineszenz steht in direkter Proportion zum Ausmaß der Glukoseoxidase, die indem Behälter anwesend ist.
Die Lumineszenz kann dann überwacht werden für eine Zeitdauer, die größer ist als eine Stunde, im Anschluß an die Beigabe der Substrat/Acridiniumesterlösung. Der Grad der Photonenabgabe ist jedoch derart, daß eine ausreichende Messung erreicht werden kann innerhalb einer Sekunde Meßzeit pro Gefäß. Aus praktischen Gründen ist es jedoch vorteilhaft, eine Inkubation von mindestens 5 Minuten auszuführen, bevor man mit der Luminometrie beginnt.
Probendaten aus diesem Beispiel werden nachfolgend angegeben:
Die Daten sind als relative Lichteinheiten pro Sekunde angegeben.
Die Ergebnisse zeigen an, daß der Lumineszenzausgang, gemessen als relative Lichteinheiten pro Sekunde, in Beziehung steht zu dem Ausmaß der Verdünnung der positiven Humanserenproben. Dies zeigt an, daß die Bindung des Glukose- Oxidase-Ziegen-Anti-(Humanglobulin)-Antikörperkonjugats leicht und rasch überwacht werden kann im Anschluß an die Beigabe der Substratlösung.

Beispiel 2

Ein zweites Beispiel demonstriert den Einsatz der Erfindung, verwendet zur indirekten Markierung eines Liganden. Die Signalerzeugung ist abhängig von der indirekten Bindung eines Streptavidin-Glukose-Oxidasekonjugats an ein Anti-(Humanimmunglobulin)-Biotinkonjugat. Steptavidin bindet sich speziell an sein entsprechendes Partnerligandbiotin mit einer sehr hohen Affinität. Biotinilierte Liganden sind leicht handelsüblich verfügbar oder können durch den Sachverständigen auf diesem Gebiet synthetisiert werden. Der Einsatz von Biotin- Streptavidin als Mittel einer direkten Markierung von Liganden besitzt weit verbreitete Anwendung innerhalb des Gebietes von Ligandbindungsproben.
Undurchsichtige weiße Mikrotiterplatten werden überzogen mit menschlichem Gamma-Globulin durch Inkubieren der. Behälter in einer Lösung von 50 ug/ml Gamma-Globulin in einem Überzugspuffer 18 Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dem Blockieren und Waschen werden die Behälter einer Lösung ausgesetzt in einem Probenverdünner, enthaltend Verdünner von Biotinyl- Ziegen-Anti-(Humanimmunglobulin). Im Anschluß an die Inkubation 1 Stunde lang bei 37ºC werden die Behälter gewaschen und einer Lösung ausgesetzt in Probenverdünner mit einem Gehalt von Steptavidin-Glukose-Oxidasekonjugat. Im Anschluß an eine weitere Kombination 30 Minuten lang bei 37ºC werden die Behälter erneut gewaschen, und eine Lösung mit Glukosedehalt als Enzymsubstrat (0,1% w/v) und Acridiniumsalz (1 ug/ml) in Phosphat gepufferter Saline pH 6,5 wird den Gefäßen beigegeben. Die Chemilumineszenz wird dann quantifiziert wie in Beispiel 1.
Die Probendaten werden nachfolgend aufgeführt:
Die Daten zeigen an, daß die Lumineszenz direkt proportional ist zur Konzentration von Biotinyl-Anti-(Humanimmunglobulin)-Konjugat, welches den Gefäßen ausgesetzt ist und wiederum in Beziehung steht zum Ausmaß des Komplexes: [Humangammablobulin/Biotinyl-Anti-(Humanimmunglobulin)/Steptavidinglukoseoxidase], eingefangen durch die Gefäße.

Beispiel 3

Beispiel 3 demonstriert, wie die Erfindung eingesetzt werden kann als Signalerzeugerendpunkt in einem "doppelseitigen"- oder. "sandwich"-Immunprobensystem. Solche Doppelseiten-Immunproben finden weit verbreitete Anwendung bei der Anordnung von biologischen Proben. Sie hängen ab von dem Einsatz eines oder mehrerer, normalerweise zwei, Antikörper, die in der Lage sind, speziell mit dem Analyten zu reagieren. Normalerweise ist einer hiervon entweder direkt oder indirekt gekoppelt an eine feste Abstützung, wie etwa paramagnetische Partikel oder die Wände eines Mikrotiterplattengefäßes, und wird bezeichnet als der "Einfang"-Antikörper. Der zweite Antikörper wird markiert entweder direkt oder indirekt mit Hilfe der Erzeugung eines Endpunktsignals. In der Anwesenheit eines Analyten wird ein Komplex bestehend aus [Einfangantikörper/Analyt/markierter Antikörper] erzeugt. In dieser Situation ist das Ausmaß eines vorhandenen Analyten direktproportional der Quantität des Signals am Probenendpunkt.
Somit beschreibt dieses Beispiel eine doppelseitige Immunprobe für menschliches Intaktparathyroidhormon (PTH) in einem Serum, welches einen durch Glukoseoxidase erzeugten chemilumineszenten Endpunkt einsetzt. Mikrotiterplattengefäße werden in Kontakt gebracht mit einer Lösung von einem affini tätsgereinigten Schaf-Anti-(C-Terminal-PTH) bei einer Konzentration von 20 ug/ml in einem Überzugspuffer 18 Stunden lang bei Raumtemperatur. Im Anschluß an das Blockieren und Waschen werden die Gefäße präsentiert mit verschiedenen Konzentrationen von synthetischem PTH in Serum (100 ul) plus Probenverdünner (100 ul) mit einem Gehalt an affinitätsgereinigtem Schaf-Anti-(Nterminal-PTH)- Glukoseoxidasekonjugat und inkubiert 4 Stunden lang bei 37ºC unter Rühren. Nach einem weiteren Waschschritt wird die gebundene Glukoseoxidaseaktivität gemessen durch Beigabe einer Lösung von Acridiniumsalz in PBS enthaltender Glukose, und anschließend wird die Chemilumineszenz überwacht, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Probendaten werden in der Tabelle präsentiert:

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung der Erfindung auf die Verwendung von Acridiniumesterluminiszenz zur Überwachung von Ligandbindungsreaktionen in einem Nitrozellulosefleck. Die Technik des Trennens von Protein und Nukleinsäuremischungen in ihre Bestandteile mit Hilfe der Differentialmigration innerhalb der Matrix eines Gels entsprechend ihren physikochemischen Charakteristika, wie etwa Größe oder Ladung, besitzt weitgehende Anwendung innerhalb biologischer Wissenschaft. Es ist übliche Praxis, dann die getrennten Bestandteile zu immobilisieren durch ein Verfahren des Aufbringens auf eine Nitrozellulosematrix. Dies gestattet eine Analyse und Identifizierung der getrennten Bestandteile durch verschiedene Techniken, von denen die am häufigsten eingesetzte eine Ligandbindungsreaktion involviert.
Zum Zwecke der Demonstration der Anwendung der Erfindung auf die Identifizierung von biologischen Verbindungen, die auf Nitrozellulose immobilisiert sind durch Ligandbindung, benutzt dieses Beispiel ein Modellsystem unter Verwendung eines menschlichen Gammaglobulins punktaufgebracht auf Nitrozellulose als ein Modell. Das menschliche Gammaglobulin wird gelöst in PBS pH 7,4, um eine Lösung zu erhalten von 10 mg/ml. Diese Lösung wird dann zehnfach verdünnt vier weitere Male und ergibt Lösungen von 1 mg/ml, 100 ug/ml und 1 ug/ml. 5 ul einer jeden Verdünnung mit einem Gehalt von 50 ug, 5 ug, 500 ng, 50 ng, 5 ng bzw. PBS-Steuerung werden auf eine nitrozellulose Membran (Hiybond®, Amersham International) aufgebracht und inkubiert in einer feuchten Atmosphäre, um eine Immobilisierung zu ermöglichen: Die Membran wird dann gewaschen (drei 5-Minuten-Zyklen) in einem Waschpuffer PBS/0,05% Tween®20) und dann eine Stunde lang blockiert bei Raumtemperatur in Waschpuffver. Die Membran wird dann inkubiert in einer Lösung mit einem Gehalt an Ziegen-Anti- (Humanimmunglobulin G) konjugiert zu Glukoseoxidase in Waschpuffer plus Bovinserumalbumin 0,5% eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Die Membran wird dann gewaschen über drei Zyklen von 5 Minuten in Waschpuffer. Die Membran wird dann getrocknet, und eine Lösung mit einem Gehalt von 1% Glukose, 1 ug/ml Acridiniumsalz in PBS pH 7,4 wird auf die Membran aufgebracht. Die Anwesenheit auf der Membran des Komplexes [Humangamma-Globulin/Ziegen-anti- (Humanimmunglobulin)-glukoseoxidase] an den Positionen der ursprünglichen Flecken wird dann visualisiert durch das Plazieren der getränkten Membran in einer lichtdichten Kammer angrenzend an die belichtete Emulsion eines Polaroid(TM)Filmes, wobei eine solche Vorrichtung handelsüblich verfügbar ist (beispielsweise von Amersham International). Ein hochempfindlicher Polaroidfilm wird in diesem Beispiel eingesetzt (612, ISO 20 000), und eine Belichtung von 2,5 Minuten beginnend 5 Minuten nach der Beigabe der Acridinium/Glukoselösung auf die Membran wurde als optimal empfunden in diesem Zusammenhang. Ein Beispiel des entwickelten Bildes ist in der Figur wiedergegeben.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytes in einem Medium, welcher in der tage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) in Kontakt bringen des Mediums mit einem Enzymkonjugat, welches den Ligandpartner konjugiert mit dem Enzym enthält, wobei das Enzym geeignet ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zu katalysieren, um Wasserstoffperoxid herzustellen;

(b) Bildung von Komplexen zwischen dem Enzymkonjugat und dem Analyt;

(c) in Kontakt bringen des zu einem Komplex reagierten Enzymkonjugates und/oder des nicht zu einem Komplex reagierten Enzymkonjugates mit einem entsprechenden Enzymysubstrat, um die Reaktion oder die Kaskade von Reaktionen zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu initiieren;

(d) Reagieren des Wasserstoffperoxids mit einer Substanz, welche in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid Chemilumineszenz zeigt, wobei die Substanz aus der Gruppe von Acridinium-Verbindungen und deren Analoge ausgewählt ist, mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, um eine Chemilumineszenzreaktion zu erzeugen; und

(e) Bestimmen, Messen oder Beobachten der Photonenemission während der Chemilumineszenzreaktion, um das Vorhandensein oder die Menge des Analytes zu bestimmen.

2. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytes in einem Medium, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) in Kontakt bringen des Mediums mit dem Ligandpartner und

(i) einem Konkurrenzanalyt oder

(ii) einem Analogen des Analytes, wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit dem Enzym konjugiert ist, um ein Enzymkonjugat zu bilden, wobei das Enzym in der Lage ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu katalysieren;

(b) Bildung von Komplexen des Enzymkonjugats und/oder Analyts mit dem Ligandpartner;

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach Schritt (b) zu einem Komplex reagierte Enzymkonjugate und nicht zu einem Komplex reagierte Enzymkonjugate getrennt werden.

4. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chemilumineszierende Substanz Phenanthidrin, Quinolin oder Benzacridin ist.

5. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym direkt mit seinem konjugierten Partner konjugiert ist.

6. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym indirekt mit seinem konjugierten Partnerkonjugiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym über einen Avidin-Biotin-Ligand-Zwischenbindungskomplex konjugiert ist.

8. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in der Lage ist, ein Oxidasesubstrat zu erzeugen, und daß das Verfahren zum Herstellen des Wasserstoffperoxids eine Katalyse des Oxidaseswbstrates mit einer Oxidase umfaßt.

9. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxidase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glukoseoxidase, Xanthinoxidase, Urikase oder Galaktoseoxidase ist.

11. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chemilumineszierende Substanz eine konjugierte Base mit einem pka von kleiner 8 hat.

12. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chemilumineszierende Substanz ein Acridiniumsalz umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Acridiniumsalz einen Akridiniumester umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Acridiniumanteil wenigstens eine Elektron entfernende Gruppe umfaßt, um einen pKa von kleiner 9 zu erzielen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektron entfernende Gruppe Halogene, Carbonyle und/oder Nitrogruppen umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Acridiniumsalz ein Acridiniumamid, Thioester oder aliphatischer Ester ist.

17. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Acridiniumsalz wenigstens eine hydrophobe Gruppe enthält, um die Löslichkeit des Salzes in wässrigen Medien zu verbessern.

18. Ausrüstung zur Verwendung bei der Untersuchung oder der Bestimmung eines Analytes in einer Probe, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:

eine erste Reagenz, enthaltend

(i) den mit einem Enzym konjugierten Ligandpartner, wobei das Enzym geeignet ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zu katalysieren, um Wasserstoffperoxid herzustellen; oder

(ii) ein Konkurrenzanalyt oder ein analoges Analyt, welche in der Lage sind, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit dem Enzym konjugiert sind, um ein Enzymkonjugat zu bilden, wobei das Enzym in der Lage ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu katalysieren; und

ein zweites Reagenz, welches eine chemilumineszente Verbindung enthält, welche aus der Gruppe Acridiniumverbindungen und deren Analoge gewählt ist, mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, welche mit Wasserstoffperoxid reagiert und Plhotonenemission erzeugt.

19. Ausrüstung zur Verwendung bei der Untersuchung oder der Bestimmung eines Analytes in einer Probe, welcher in der Lage ist, sich an einen Ligandpartner zum Ausbilden eines Ligandkomplexes zu binden, wobei in dem Verfahren die Probe zuerst mit folgendem in Kontakt gebracht wird:

(i) einem Anteil, welcher den Ligandpartner enthält, der mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist, der in der Lage ist, sich mit einem entsprechenden, komplementären Zwischenligandpartner zu einem Zwischenligandbindungskomplex zu binden, oder

(ii) dem Ligandpartner und einem Anteil umfassend ein Konkurrenzanalyt oder ein Analoges des Analytes, wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist,

wobei der Zwischenligandpartner in der Lage ist, sich mit einem entsprechenden, komplementären Zwischenligandpartner zu einem Zwischenligandbindungskomplex zu binden, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:

eine erste Reagenz, enthaltend

(i) einen Anteil, welcher den Ligandpartner enthält, der mit einem Zwschenligandpartner konjugiert ist, oder

(ii) den Ligandpartner und einen Anteil umfassend ein Konkurrenzanalyt oder ein Analoges des Analytes, wobei der Konkurrenzanalyt oder der Analoganalyt in der Lage ist, einen Ligandkomplex mit dem Ligandpartner zu bilden und mit einem Zwischenligandpartner konjugiert ist,

ein zweites Reagenz, welches ein Konjugiertes des komplementären Zwischenligandpartners enthält, das an ein Enzym gekoppelt ist, welches in der Lage ist, eine oder mehrere Reaktionen in einer Kaskade zum Herstellen von Wasserstoffperoxid zu katalysieren, und

ein drittes Reagenz, welches eine chemilumineszente Verbindung enthält, welche aus der Gruppe Acridiniumverbindungen und deren Analoge gewählt ist, mit jeweils einer konjugierten Base mit einem pKa kleiner 9, welche mit Wasserstoffperoxid reagiert und Plhotonenemission erzeugt.

20. Ausrüstung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß diese ferner das jeweilige Substrat für das Enzym enthält und optional fer ner Mittel zum physikalischen oder chemischen Isolieren von den Ligandbindungskomplexen enthält.

21. Ausrüstung nach wenigstens einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das die chemilumineszente Verbindung enthaltende Reagenz auf einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 7 gepuffert ist.