DE69010691T2 - Mikroperoxidasepräparat mit einem hämopeptid als aktive komponente. - Google Patents

Mikroperoxidasepräparat mit einem hämopeptid als aktive komponente.

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Description

    TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft ein Hämopeptid mit Peroxidaseaktivität, ein Peroxidasepräparat und Herstellung und Verwendung solch eines Präparats.
    • HINTERGRUNDTECHNIK
  • Peroxidaseaktivität katalysiert die Oxidation eines Substrats (eines Elektronen- oder Wasserstoffdonors, wie etwa Lignin) mit Wasserstoffperoxid.
  • Hochmolekulare Peroxidasen (E.C.1.11.1.7) werden van einigen Mikroorganismen intrazellulär produziert. So beschreiben S. Loprasert et al., Journal of General Microbiology (1988), 134, 1971-1976, eine Peroxidase-Katalase aus Bacillus stearothermophilus mit einer relativen Molekülmasse von 175.000 und US 4,698,306 beschreibt eine Peroxidase aus Coprinus mit einer relativen Molekülmasse von 37.000-41.000. Sogenannte Mikroperoxidasen mit Säugetierursprung sind ebenfalls bekannt; diese sind Hämopeptide, typischerweise mit einer relativen Molekülmasse im Bereich von 1.500-3.000, die Peroxidaseaktivität zeigen (z.B. DE 31 34 526).
  • Die Verwendung von Peroxidase zusammen mit Wasserstoffperoxid oder eirier Wasserstoffperoxid-Vorstufe ist vorgeschlagen worden z.B. beim Bleichen von Zellstoff für die Papierherstellung (SE 88/0673), bei der Behandlung von Abwasser aus der Zellstoffherstellung (US 4,623,465, JP-A 2- 31887) und für verbessertes Bleichen in Waschmitteln (WO89/09813). Die anhängige US-Patentanmeldung S.N. 07/421,414 (eingereicht am 13. Oktober 1989) und eine mitanhängige PCT- Anmeldung offenbaren die Verwendung für die Farbübertragungshemmung während des Waschens.
  • Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Peroxidase für diese Zwecke bereitzustellen. Die Peroxidase sollte bei hoher Temperatur und H&sub2;O&sub2;-Konzentration, insbesondere bei alkalischen Bedingungen, aktiv und stabil sein. Sie sollte frei von Katalase sein, da diese Aktivität Wasserstoffperoxid abbaut, das in der Reaktion benötigt wird. Für bessere Herstellungswirtschaftlichkeit sollte die Peroxidase mikrobiell sein und sollte von dem fraglichen Mikroorganismus extrazellulär produziert werden.
    • DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Wir haben überraschenderweise entdeckt, daß Peroxidase von einigen Stämmen von Bacillus pumilus extrazellulär produziert wird. Das neuartige Peroxidasepräparat aus B. pumilus ist ein Mikroperoxidasepräparat, d.h. es enthält Hämopeptid als eine aktive Komponente. Das Präparat hat verbesserte Stabilität bei hoher Temperatur, bei hohem pH und bei hohen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid. Es kann ohne unerwünschte Katalaseaktivität produziert werden.
  • Demgemäß stellt die Erfindung ein Hämopeptid zur Verfügung, das gekennzeichnet ist durch die Formel:
  • wobei die Schwefelatome der zwei Cysteine an die Vinylgruppen von Häm gebunden sind.
  • Die Erfindung stellt auch ein Peroxidasepräparat zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als eine aktive Komponente ein Hämopeptid, wie oben definiert, umfaßt, und ein Peroxidasepräparat, das dadurch gekennzeichnet, daß es:
  • - eine oder mehrere aktive Komponenten umfaßt, gewonnen aus einem Stamm von B. pumilus, mit einer relativen Molekülmasse im Bereich von 800-2.500, die eine Häm-Gruppe enthält (enthalten), die an eine Peptidkette gebunden ist, die die Sequenz Gln-Glu-Gln-Thr-Xaa-Ile- Ser-Yaa-His-Gly-Asp-Asn-Met-Gln enthält, wobei Xaa und Yaa irgendeine Aminosäure repräsentieren,
  • - ein pH-Optimum im Bereich 7-9 besitzt,
  • - wenigstens 40 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 80ºC und pH 7 zurückbehält und
  • - ansteigende Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 20 mM H&sub2;O&sub2; zeigt.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Peroxidasepräparats zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Kultivierung eines Peroxidaseproduzierenden Stammes von B. pumilus umfaßt, gefolgt von der Gewinnung von Peroxidase.
  • Schließlich stellt die Erfindung die Verwendung des obigen Peroxidasepräparats zusammen mit Wasserstoffperoxid (fakultativ in situ gebildet) beim Bleichen von ligninhaltigem Material zur Verfügung.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Hämopeptid
  • Das Hämopeptid der Erfindung kann synthetisch durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, nämlich indem zunächst die Peptidkette einschließlich der zwei Cysteine synthetisiert wird und man anschließend dieses Peptid mit Häm reagieren läßt, oder es kann genetisch mit in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden: eine degenerierte Oligonukleotid-Sonde wird synthetisiert (auf der Grundlage der bekannten Aminosäuresequenz) und verwendet, um das B. pumilus- Gen zu isolieren, das die Vorläufer-Peptidkette der Mikroperoxidase kodiert. Modifizierte Mikroperoxidasen werden hiernach durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten (vgl. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, Ed. J. Sambrook, E.F. Fritsh and T. Maniatis, ISBN 0- 87969-309-6)
  • Das folgende zeigt einen Vergleich der Sequenzen von Hämopeptiden der Erfindung mit einer bekannten Mikroperoxidase (DE 31 34 526), die hergestellt ist durch Hydrolyse von Cytochrom C aus Tieren oder Pflanzen: Stand der Technik Erfindung
  • Man sieht, daß die neuartige mikrobielle Mikroperoxidase sehr wenig Homologie mit der bekannten Mikroperoxidase aufweist.
    • Kultivierung von B. pumilus
  • B. pumilus-Stämme, die in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden können, sind atypisch in ihrer Fähigkeit, Peroxidase zu produzieren. Es ist festgestellt worden, daß einige B. pumilus-Stämme, einschließlich des Typstammes, Peroxidase nicht produzieren.
  • Zwei Peroxidase-produzierende Stämme sind unter den Hinterlegungsnummern ATCC 12905 und NCIB 8600 frei zugänglich und ein Stamm (interne Bezeichnung S 197) ist von der Anmelderin unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden; das Hinterlegungsdatum war der 23. Juli 1990 und die Hinterlegungsnummer ist DSM 6124.
  • ATCC bezeichnet die American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., NCIB bezeichnet die National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen A139 8DG, Schottland, und DSM bezeichnet die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, West-Deutschland.
  • Peroxidase-produzierende B. pumilus-Stämme können unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert werden, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderer essentieller Nährsubstanz enthält. Das Medium kann gemäß in der Technik bekannten Prinzipien zusammengesetzt sein.
  • Während der Kultivierung sekretieren die Zellen Peroxidase extrazellulär, während sie die Katalase offensichtlich intrazellulär produzieren. Extrazelluläre Produktion der Peroxidase ist vorteilhaft, da sie hohe Fermentationsausbeute und einfache Gewinnung ermöglicht. Katalase ist für die meisten Anwendungszwecke von Peroxidase unerwünscht, so daß die Gewinnung von Peroxidase vorzugsweise die Abtrennung der Zellmasse von der Zellbrühe einschließt, während Zell-Lyse vermieden wird, z.B. durch Filtration oder Zentrifugation.
  • Die resultierende zellfreie Kulturbrühe enthält ein Gemisch von Hämopeptiden mit Peroxidaseaktivität, hauptsächlich mit einer relativen Molekülmasse im Bereich von 800-2.500. Diese kann als solche verwendet werden, fakultativ nach Konzentration z.B. durch Eindampfen oder Ultrafiltration. Falls gewünscht, können die verschiedenen Hämopeptide abgetrennt und mit herkömmlichen Verfahren, z.B. Säulenchromatographie, bis zum gewünschten Grad gereinigt werden.
    • pH- und Temperaturabhänaiakeit
  • Ein rohes Peroxidasepräparat der Erfindung (Fig. 1) und ein ähnliches gereinigtes Präparat (Fig. 2) haben leicht unterschiedliches pH-Optimum, liegen aber beide im Bereich 7-9.
  • Die Thermostabilität von Peroxidasepräparaten der Erfindung (Fig. 3 und 4) ist signifikant besser als bei einer mikrobiellen Peroxidase nach dem Stand der Technik (Fig. 5). Ein Rohpräparat gemäß der Erfindung (Fig. 3) ist thermostabiler als ein ähnliches gereinigtes Präparat. Beide Präparate der Erfindung behalten mehr als 40 % Restaktivität nach 30 Minuten Inkubation bei 80ºC bei pH 7 zurück.
    • Wasserstoffperoxidabhängigkeit
  • Ein Peroxidasepräparat der Erfindung (Fig. 4) zeigt ansteigende Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 20 mM H&sub2;O&sub2; (die höchste getestete). Zum Vergleich zeigt eine mikrobielle Peroxidase nach dem Stand der Technik abnehmende Reaktionsgeschwindigkeit bei H&sub2;O&sub2;-Konzentrationen oberhalb 0,1 mM (Fig. 7).
    • Bleichen von ligninhaltigem Material
  • Aufgrund seiner guten Stabilität bei hoher Temperatur und hoher H&sub2;O&sub2;-Konzentration ist das Peroxidasepräparat der Erfindung gut geeignet zum Bleichen von ligninhaltigen Materialien, wie etwa Zellstoff zur Papierherstellung oder Abwasser aus der Zellstoffherstellung, zusammen mit Wasserstoffperoxid, z.B. wie beschrieben in SE 88/0673, US 4,623,465 oder JP-A 231887. Typische Bedingungen sind pH 7-10, 25-70ºC, 10-300 mM H&sub2;O&sub2; und eine Dosis von 10-100 NOPA/g Trockensubstanz. Wasserstoffperoxid kann als solches zugegeben oder in situ gebildet werden, z.B. durch Einbeziehung einer Vorstufe, wie etwa eines Perborats oder Percarbonats, oder eines enzymatischen Systems, das in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu erzeugen, z.B. eine Oxidase und ein Substrat dafür (wie etwa Glucose und Glucose-Oxidase).
    • Andere Verwendung von Peroxidase
  • Die Verwendung des Peroxidasepräparats der Erfindung ist besonders vorteilhaft bei hoher Temperatur und/oder hoher H&sub2;O&sub2;- Konzentration und bei alkalischem pH. Als ein Beispiel kann es zusammen mit einem Wasserstoffperoxid-Vorläufer (wie etwa Natriumperborat oder -percarbonat) in ein Waschmittel eingearbeitet werden, um das Bleichen von Flecken zu verbessern, gemäß WO89/09813.
  • Als ein anderes Beispiel kann das Peroxidasepräparat verwendet werden, um die Übertragung eines Textilfarbstoffes von einem gefärbten Gewebe auf ein anderes Gewebe zu hemmen, wenn die Gewebe zusammen in einer Waschlauge gewaschen und/oder gespült werden, indem es zusammen mit einem Wasserstoffperoxid- Vorläufer zur Waschlauge zugegeben wird, in der die Gewebe gewaschen und/oder gespült werden.
    • Peroxidasetest (NOPA)
  • Peroxidaseaktivität wird gemessen bei 2 mM H&sub2;O&sub2;. Folgendes wird in einer auf 30ºC thermostatisierten 1 ml Quarzküvette gemischt:
  • 200 ul 1 mM 4-Aminoantipyrin (4-AA, Sigma No. A- 4382, 0,2 mg/ml)
  • 200 ul N-Ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidin-Na (ESBT, 5,86 mg/ml)
  • 200 ul 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,0
  • 200 ul Enzvmprobe, verdünnt auf 0,02-0,10 NOPA/ml
  • 200 ul 10 mM Wasserstoffperoxid werden zugegeben und die Extinktion bei 550 nm wird für 1 Minute verfolgt. Die Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt, die mit NOPA bezeichnet sind, berechnet als der Anstieg in der Extinktion innerhalb der ersten Minute nach Zugabe von H&sub2;O&sub2;, multipliziert mit der Verdünnung. Die Enzymprobe sollte verdünnt werden, damit der Anstieg in der Extinktion pro Minute innerhalb der Grenze 0,02 bis 0,10 liegt.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Figuren 1 und 2 zeigen die pH-Aktitivätskurve eines rohen bzw. eines gereinigten Peroxidasepräparats gemäß der Erfindung, gemessen mit dem NOPA-Verfahren, aber unter Variieren des pHs, wie dargestellt.
  • Die Figuren 3 und 4 veranschaulichen die Thermostabilität einer rohen bzw. einer gereinigten Peroxidase der Erfindung. Zum Vergleich zeigt Figur 5 die Thermostabilität eines Peroxidasepräparats nach dem Stand der Technik (aus Coprinus). Die Messungen wurden durchgeführt, indem mit der angegebenen Zeit und Temperatur inkubiert wurde, anschließend eine Probe sofort 10fach in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 bei 25ºC verdünnt und die Peroxidaseaktivität gemessen wurde (NOPA).
  • Die Figuren 6 und 7 veranschaulichen die Reaktion bei verschiedenen H&sub2;O&sub2;-Konzentrationen mit Peroxidase der Erfindung bzw. Peroxidase nach dem Stand der Technik (Coprinus). Oxidation von ESBT + 4-AA wurde durch Messen der Extinktion bei 550 nm verfolgt.
  • Die Figuren 1 und 3 wurden unter Verwendung zellfreier Kulturbrühe, hergestellt wie in Beispiel 1, erstellt. Die Figuren 2, 4, 6 und 7 wurden unter Verwendung von Pool II aus Beispiel 1 erstellt.
  • Die Figuren 8-11 zeigen Chromatogramme aus der Reinigung von Peroxidase der Erfindung. Details sind in Beispiel 2 angegeben.
    • BEISPIELE BEISPIEL 1 Produktion von Peroxidase aus Bacillus tumilus
  • Die Medien wurden wie folgt hergestellt (Inhaltsstoffe in g/l): TY*3 Trypticase, BBL g/l Hefeextrakt, Difco g/l pH (eingestellt mit KOH)
  • Das Medium wurde bei 121ºC für 45 Minuten autoklaviert. Agar3 Pepton Bacto g/l Pepticase g/l Hefeextrakt, Difco g/l Fleischextrakt g/l Glucose pH
  • Agar (von Merck) 20 (zuletzt zugegeben)
  • Der Agar wurde bei 121ºC für 45 Minuten autoklaviert
    • Impfagar :
  • 10 Agar3-Schrägplatten wurden mit 1 gefriergetrocknetem Bacillus pumilus-Stainm No. 5197 beimpft und bei 30ºC für 24 Std. inkubiert.
    • Impfmedium :
  • Zwei 500 ml-Rüttelkolben, die 100 ml TY*3-Medium enthielten, wurden mit einer Agar3-Schrägplatte geimpft und bei 30ºC und 250 UPM für 24 Std. inkubiert.
    • Peroxidaseproduktion :
  • 50 Rüttelkolben, die 100 ml TY*3 enthielten, wurden jeder mit 2 ml des oben beschriebenen Impfmaterials beimpft. Dann wurden 2,5 ml einer sterilen 40%igen (w/w) Glucoselösung in Wasser zu jedem Rüttelkolben zugegeben. Die Rüttelkolben wurden bei 30ºC für 48 Std. inkubiert und dann geerntet. Die endgültige Peroxidaseaktivität betrug 1 NOPA/ml (NOPA gemessen bei 20 mM H&sub2;O&sub2;).
    • BEISPIEL 2 Reinigung von Peroxidase aus B. pumilus
  • 3250 ml der Kulturbrühe, die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde durch eine Filterplatte Seitz Supra 100 und zweitens durch eine Platte Supra 50 filtriert, um ein klares Filtrat mit einer Aktivität von 1,29 NOPA/ml zu erhalten.
  • Zu 900 ml des Filtrats wurden 70 g hydrophobes Harz Amberlite XAD16 zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde durch Dekantieren isoliert und mit 10%igem (v/v) Ethanol gewaschen. Peroxidase wurde aus dem Harz extrahiert mit 200 ml 50%igem (v/v) Ethanol, der auf 72 ml eingedampft wurde, mit einer Aktivität von 13,8 NOPA/ml (Ausbeute: 86 %).
  • Der eingedampfte Peroxidase-Extrakt wurde auf eine DEAE- Sepharose-FF-Säule (5x8 cm), äquilibriert mit 20 mM Phosphat pH 7, aufgebracht. Die Säule mit mehr als einem Volumenteil Puffer, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und Peroxidase wurde mit Puffer eluiert, der 0,3 M NaCl enthielt. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und in drei Pools gepoolt entsprechend dem Protein(A280)- und Aktivitätsprofilen (Fig. 8): Fraktion Nr. Ausbeute Pool Gesamtausbeute: 45,7 %
  • Zu einer 90 ml-Probe mit 7,34 NOPA/ml von Pool C wurde 1,6 M Ammoniumsulfat bis zu einer Leitfähigkeit von 108 mS (pH 7,05) zugegeben und auf eine Octyl-Sepharose-Säule (5x11 cm), äquilibriert mit 0,8 M Ammoniumsulfat pH 7, aufgebracht. Nicht-gebundenes Material wurde mit 0,8 M Ammoniumsulfat eluiert und Peroxidaseaktivität wurde dann mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat von 0,8- bis 0-molar (reines Wasser) eluiert.
  • Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und in 3 Pools gepoolt, entsprechend der Peroxidaseaktivität (Fig. 9): Fraktion Nr. Ausbeute Pool Gesamtausbeute: 39 %
  • Ein Probe von Pool I wurde durch Ultrafiltration auf einer gerührten 50 ml-Amicon-Zelle mit einer DDS-GS90PP-Membran konzentriert. Eine konzentrierte 7,5 ml-Probe mit einer Aktivität von 131,2 NOPA/ml wurde auf Sephacryl-S200-Säule (2,5x85 cm), äquilibriert mit 12,5 mM Phosphatpuffer pH 7,0, aufgebracht und mit demselben Puffer mit einem Durchfluß von 0,9 ml/min eluiert. Fraktionen von 9,8 ml wurden gesammelt und gepoolt, entsprechend der Peroxidaseaktivität und den Spektraleigenschaften (Rz-Wert: A398/A280) (Fig. 10): Fraktion Nr. Ausbeute Pool Gesamtausbeute: 65,8 %
  • Das Massenspektrum von Pool IA zeigt einen Hauptpeak bei MG 2214,0/2228,1 und zwei kleinere Peaks bei MG 972,8 bzw. 1768,1.
  • Die Aminosäuresequenz der Hauptkomponente zeigte sich als:
  • Gln-Glu-Gln-Thr-?-Ile-Ser-?-His-Gly-Asp-Asn-Met-Gln
  • wobei angenommen wird, daß die zwei fehlenden Aminosäuren Cystein sind, durch die eine Häm-Gruppe (verantwortlich für die A398-Extinktion) gebunden werden kann.
  • Eine Probe von Pool II wurde durch Ultrafiltration auf einer gerührten 50 ml-Amicon-Zelle mit einer DDS-GS90PP-Membran konzentriert. Eine konzentrierte 10 ml-Probe mit einer Aktivität von 143,8 NOPA/ml wurde auf eine AcA-202-Säule (2,5x85 cm), äquilibriert mit 12,5 mM Phosphatpuffer pH 7,0, aufgebracht und mit demselben Puffer bei einem Durchfluß von 0,4 ml/min eluiert. Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt und auf A280, A398 und Peroxidaseaktivität überwacht (Fig. 11).
  • Von diesem AcA-202-Gel wird vom Hersteller angegeben, daß es Moleküle im Bereich von 1 kD bis 15 kD trennt. Aus dem Chromatogramm kann man sehen, daß ein breiter Bereich von Substanz mit relativ niedrigem MG eluiert wurde, und alle zeigten dieselbe Peroxidaseaktivität relativ zur A398(Soret)- Extinktion.
    • BEISPIEL 3 Bleichen von Kraftzellstoff
  • Die in diesem Beispiel verwendete Peroxidase war das Permeat aus der Ultrafiltration des Überstandes aus der Alkoholausfällung einer zellfreien Kulturbrühe (im wesentlichen erhalten wie in Beispiel 1).
  • 1 g Hartholz(Birken)-Kraftzellstoff, mit Sauerstoff delignifiziert wurde in 250 ml Wasser eingemischt, eingestellt auf pH 8,0-8,2 mit NaOH. H&sub2;O&sub2; wurde bis zu einer Konzentration von 1 % (0,3 M) zugegeben und das obige Peroxidasepräparat wurde bis zu einer Dosis von 0,32 NOPA/ml zugegeben. Die Mischung wurde bei 40ºC für 2 Stunden inkubiert. Dann wurde der Zellstoff auf einem Büchner-Trichter gesammelt und mit genügend Wasser gewaschen, um ein klares Filtrat zu erhalten. Die Pulpe wurde gepreßt und getrocknet und der ISO-Weißgrad des erhaltenen Blattes wurde gemessen. Eine Vergleichsprobe wurde in derselben Art und Weise ohne das Enzym hergestellt.
  • Erfindung: 57,2 % ISO-Weißgrad
  • Vergleichsprobe: 55,6 % ISO-Weißgrad
    • BEISPIEL 4 Bleichen von CTMP-Zellstoff
  • Das Experiment von Beispiel 3 wurde bei 30ºC mit CTMP- Weichholz(Kiefer)-Zellstoff wiederholt.
  • Erfindung: 59,7% ISO-Weißgrad
  • Vergleichsprobe: 56,1 % ISO-Weißgrad
    • BEISPIEL 5 Bleichen von Farbstoffen in Lösusg
  • Die Wirkung des Peroxidasepräparats der Erfindung beim Bleichen eines gelösten Textilfarbstoffes wurde getestet. Die getesteten Farbstoffe waren Direkt-Blau 1 (C.I. #24410, Produkt von Keystone Aniline), Säure-Rot 151 (C.I. #26900, Produkt von Sandoz), Procion-Blau H ERD (Produkt von ICI) und Procion-Blau H EXL (Produkt von ICI). Das Peroxidasepräparat war zellfreie Kulturbrühe, im wesentlichen hergestellt wie in Beispiel 1.
  • Eine Reaktionslösung, die 50 mM Natriumphosphat, 0,3 NOPA/ml Peroxidase, Farbstoff (wie unten angegeben) entsprechend einem Absorptionsmaximum (im sichtbaren Bereich) von 0,025-0,035 und 0,25 mM H&sub2;O&sub2; enthielt, wurde bei Raumtemperatur beim unten angegebenen pH hergestellt. Nach Zugabe von H&sub2;O&sub2; (zuletzt zugegeben) wurde über 12 Minuten jede Minute ein Spectral-Scan durchgeführt. Unten ist die Veränderung in der Extinktion bei der Wellenlänge maximaler Absorption aufgelistet. Extinktionsveränderung sofort/nach 12 min. Wellenlänge Farbstoff pH Säure-Rot Direkt-Blau Procion-Blau
  • Wenn die zwei Werte der Extinktionsveränderung nahe beieinander liegen, erfolgt das Bleichen praktisch augenblicklich. Im allgemeinen folgt das Bleichen über den gesamten sichtbaren Bereich den obigen Trends beim Extinktionsmaximum.
  • In allen Fällen ließ die Verwendung von 0,25 mM H&sub2;O&sub2; ohne Enzym den Farbstoff unverändert.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die potentielle Nützlichkeit des Peroxidasepräparats der Erfindung, um zu verhindern, daß überschüssiger Farbstoff aus stark gefärbten Gewebe während des Waschens erneut abgeschieden wird.

Claims (10)

1. Ein Hämopeptid, gekennzeichnet durch die Formel:
wobei die Schwefelatome der zwei Cysteine an die Vinylgruppen von Häm gebunden sind.
2. Ein Peroxidasepräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es das Hämopeptid nach Anspruch 1 als eine aktive Komponente umfaßt.
3. Ein Peroxidasepräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es: eine oder mehrere aktive Komponenten umfaßt, gewonnen aus einem Stamm von B. pumilus, mit einer relativen Molekülmasse im Bereich von 800-2.500, die eine Häm-Gruppe enthält (enthalten), die an eine Peptidkette gebunden ist, die die Sequenz Gln-Glu- Gln-Thr-Xaa-Ile-Ser-Yaa-His-Gly-Asp-Asn-Met-Gln enthält, wobei Xaa und Yaa irgendeine Aminosäure repräsentieren,
- ein pH-Optimum im Bereich 7-9 besitzt,
- wenigstens 40 % Restaktivität nach 30 Minuten bei 80ºC und pH 7 zurückbehält und
- ansteigende Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 20 mM H&sub2;O&sub2; zeigt.
4. Ein Peroxidasepräparat nach Anspruch 3, wobei der Stamm von B. pumilus-Stamm DSM 6124, ATCC 12905 oder NCIB 8600 ist.
5. Ein katalasefreies Peroxidasepräparat nach einem der Ansprüche 2-4.
6. Ein Verfahren zur Herstellung eines Peroxidasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kultivierung eines Peroxidase-produzierenden Stammes von B. pumilus umfaßt, gefolgt von der Gewinnung von Peroxidase.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Stamm von B. pumilus Peroxidase extrazellulär produziert und die Gewinnung das Entfernen von Zellmasse umfaßt.
8. Ein Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Stamm von B. pumilus DSM 6124, ATCC 12905 oder NCIB 8600 ist.
9. Verwendung des Peroxidasepräparats nach einem der Ansprüche 2-5 oder eines nach einem der Ansprüche 6-8 hergestellten Präparats zusammen mit Wasserstoffperoxid (fakultativ in situ gebildet) beim Bleichen von ligninhaltigem Material.
10. Verwendung nach Anspruch 9 beim Bleichen von Zellstoff zur Papierherstellung oder Abwasser aus der Zellstoffherstellung.
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