DE69014044T2

DE69014044T2 - Neue alkylische Pullulanase Y mit alpha-Amylase-Aktivität, sie produzierender Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms.

Info

Publication number: DE69014044T2
Application number: DE1990614044
Authority: DE
Inventors: Katsutoshi Ara; Kazuaki Igarashi; Susumu Ito; Katsuhisa Saeki
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-18
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2010-09-19
Also published as: JPH0632613B2; FI95482C; EP0418835B1; HK154795A; NO904057L; NO180643C; FI95482B; DK0418835T3; CA2024952C; JPH03108482A; NO904057D0; CA2024952A1; EP0418835A1; DE69014044D1; ES2066925T3; FI904587A0; NO180643B

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung:

Diese Erfindung bezieht sich auf eine neue alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität, einen die alkalische Pullulanase Y erzeugenden Mikroor-ganismus und ein Verfahren zum Herstellen der alkalischen Pullulanase Y.

Beschreibung des Standes der Technik:

Pullulanase ist ein Enzym, das nur die α-1,6 glykosidische Bindung von Pullulan spaltet und schließlich Maltotriose erzeugt. Pullulanase wurde zuerst durch Bender und Wallenfels 1961 aus einem zu Aerobacter aerogenes gehörenden Stamm isoliert (Biochem. Z., 334, 79 (1961)] Kürzlich wurde über verschiedene zur Erzeugung von Pullulanase fahige Mikroorganismen berichtet. Diese Mikroorganismen sind z. B. Bacillus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sci., 30, 200, (1983)]; Bacillus acidopullulyticus [Agric. Biol. Chem., 52, 2293 (1984)]; Bacillus stearothermophilus [Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17, 24 (1983)]; Streptococcus mitis [Biochem. J., 108, 33 (1968)]; Lactobacillus [Denpun Kagaku, 28, 72 (1981)]; Clostridium sp. [Appl. Envoron. Microb., 53, 7 (1987)]; Clostridium thermohydrosulfuricum [Appl. Environ. Microb., 49, 5 (1985), J. Bacteriol., 164, 3 (1985), Biochem. J., 246 (1987)]; Thermus aquaticus [Enzyme Microb. Technol., 8, (1986)] und Thermus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sci., 34, 1 (1987)].
Es ist bekannt, daß Pullulanase nicht nur gegenüber Pullulan aktiv ist, sondern auch hydrolytisch auf die α-1,6 glykosidische Bindung von Stärke, Glycogen, Amylopectin sowie verzweigter Oligosaccharide wirkt, die durch deren Teilzersetzung erzeugt werden. Wegen dieser Eigenschaft wird Pullulanase als ein " Verzeigungen entfernendes Enzym" bezeichnet.
Weiter wurde festgestellt, daß der Einsatz von Pullulanase in Kombination mit sowohl Endo-Amylase als auch Exo-Amylase Glucose oder Maltooligosaccharide, wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose oder Maltohexaose aus Stärke in einer hohen Ausbeute ergeben kann. Diese Eigenschaft hat kürzlich beträchtliche Aufmerksamkeit erregt.
Die Entwicklung von Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität, die in der Lage ist, mit einer α-1,4 glykosidischen Bindung zu reagieren, war erwünscht, um die konventionellen Zuckerherstellungsverfahren zu vereinfachen, bei denen zwei oder mehr Enzyme eingesetzt werden. In dieser Hinsicht wurden nur zwei Enzyme berichtet. Eines ist ein Kombiniertes Enzym von Pullulanase-Amylase, erzeugt durch Bacillus subtilis TU (Agric. Biol. Chem., 51, 9 (1987); JP-PS 18717/1989), und das andere ist eine Amylase mit Pullulanase-Aktivität, erzeugt durch Bacillus circulans (JP-OS 60376/1989).
In der Zwischenzeit wurde herausgefunden, daß der kombinierte Einsatz einer Pullulanase mit den oben erwähnten Eigenschaften zusammen mit einer α-Amylase als Zusätze für Geschirrspülmittel oder Waschmittel die Reinigungswirkung gegenüber hauptsächlich Stärkeverschmutzung merklich verbessert (JP-OS 285424/1988). Ein weiterer Einsatz von Pullulanase auf diesen Gebieten wird erwartet.
Fast alle natürlich vorkommennden Pullulanasen werden jedoch in neutrale oder saure Pullulanasen eingeteilt, die die maximale und stabile enzymatische Aktivität unter neutralen oder sauren Bedinungen aufweisen. Es gibt wenige alkalische oder alkalibeständige Pullulanasen, die in einem alkalischen pH-Bereich, bei dem das Waschen von Wäsche oder das Abwaschen von Geschirr ausgeführt wird, eine bessere Stabilität haben und die maximale Aktivität zeigen. Eine alkalische Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität ist bisher nicht entdeckt worden. Eine alkalische Pullulanase bedeutet hier, daß sie einen optimalen pH im alkalischen Bereich hat. Eine alkalibestandige Pullulanase bedeutet, daß sie einen optimalen pH in einem neutralen bis sauren Bereich hat, aber einen genügenden Grad der Aktivitäten in einem alkalischen Bereich zeigt, wie sie bei ihrem optimalen pH hat, wahrend sie eine gute Stabilität beibehält. Der Begriff "neutral" bedeutet hier einen pH-Bereich von 6-8 und der Begriff "alkalisch" bedeutet einen pH- Bereich von nicht weniger als 8.
Mit Ausnahme eines Berichtes von Horikoshi et al., der ein Verfahren zum Herstellen alkalischer Pullulanase durch Züchten eines zur Gattung Bacillus gehörenden alkalophilen Mikroorganismus offenbart [Biochem. Biophys. Acta, 397, 188 (1975) und JP-PS 27786(1978)] waren bisher keine Verfahren zur Herstellung alkalischer Pullulanase oder alkalibeständiger Pullulanase bekannt.
Die Pullulanase von Horikoshi et al. ist ein Enzym, dessen optimaler pH im alkalischen Bereich liegt und das eine breitere Substratspezifität aufweist als konventionelle bekannte Pullulanasen. Sein optimaler pH liegt jedoch in einem schwach alkalischen Bereich von 8-9, und es hat keine α-Amylase-Aktivität und ist nicht für Reinigungsmittel einsetzbar. Zusätzlich hat die Pullulanase von Horikoshi et al. den Nachteil, daß das Enzym instabil und die Enzymproduktivität gering ist. Diese Art von Verfahren ist daher für eine industrielle fermentative Produktion ungeeignet. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung von Pullulanasen mit einem optimalen pH im höheren alkalischen Bereich und mit α-Amylase-Aktivität erwünscht.
Das Geschirrspülen oder Wäschewaschen wird üblicherweise in einem weiten pH-Bereich vom Neutralen bis zum stark Alkalischen ausgeführt. Es ist daher nützlich, natürliche Mikroorganismen zu entdecken und zu gewinnen, die einen optimalen pH im stark alkalischen Bereich aufweisen und in der Lage sind, alkalische Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität zu erzeugen, die als ein Enzym wirkt, das für Geschirrspülmittel und Waschmittel brauchbar ist.
In Anbetracht dieser Situation haben die vorliegenden Erfinder ausgedehnte Untersuchungen ausgeführt, um natürliche Mikroorganismen zu erhalten, die in der Lage sind, alkalische Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität zu erzeugen, und sie haben als ein Ergebnis festgestellt, daß ein alkalophiler Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM P-10886), der durch die Erfinder in den Böden in Tochigi-shi, Tochigi-ken, Japan entdeckt wurde, in der Lage war, eine neue alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität zu erzeugen, die wirksam war als eine reinigende Komponente für Geschirrspüler und für Waschmittel. Diese Feststellung hat zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung geführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es daher, eine neue alkalische Pullulanase mit α- Amylase-Aktivität zu schaffen, die die folgenden enzymologischen Eigenschaften aufweist:

(1) Wirkung

Wirkt auf Pullulan und lösliche Stärke zur Erzeugung von hauptsächlich Maltotriose aus Pullolan und hauptsächlich Maltotetrose und Maltopentose aus löslicher Stärke und wirkt auch auf Glykogen zur Erzetigung von Maltotetrose und Maltopentose;

(2) Substrat-Spezifität

Wirkt auf Pullolan lösliche Stärke und Glykogen;

(3) Arbeits-pH und optimaler pH-Bereich

Hat gegenüber Pullolan einen aktiven pH-Bereich von 5 bis 12, mit einem optimalen pH-Bereich von 8,5 bis 10 und hat bezüglich löslicher Stärke einen aktiven pH-Bereich von 4 bis 12, bei einem optimalen pH-Bereich von 7 bis 9,5;

(4) pH-Stabilität

Ist im pH-Bereich von 6 bis 10,5 gegenüber Pullolan stabil und in einem pH-Bereich von 4 bis 12 gegenüber löslicher Stärke stabil (Behandlungsbedingungen: 45ºC, 10 Minuten);

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

Wirkt auf Pullolan und lösliche Stärke innerhalb eines weiten Temperaturbereiches von 10 bis 65ºC mit einer optimalen Temperatur von 50ºC;

(6) Thermische Stabilität

Ist bei Behandlung in einem 10 mM Glycin-NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) bis zu 45ºC 30 Minuten stabil;

(7) Molekulargewicht

Etwa 200.000 ± 5.000, gemessen mittels Elektrophorese unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS);

(8) Wirkungen von Metallionen

Pullulanase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;- und Pb²&spplus;-Ionen und α-Amylase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;-, Pb²&spplus;-, Zn²&spplus;- und Cd²&spplus;-Ionen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Mikroorganismus zu schaffen, der eine alkalische Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität mit den oben erwähnten Eigenschaften erzeugt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen einer alkalischen Pullulanase mit den obigen Eigenschaften zu schaffen.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindiing werden aus der folgenden Beschreibung deutlicher.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein Papierchromatogramm, das die Erzeugung von Maltooligosacchariden zeigt, wenn man die enzymatische Reaktion unter Einsatz der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanse Y mit α-Amylase-Aktivität und als einem Substrat von Pullulan, Amylopektin, Amylose und Glykogen ausführt.
Fig. 2(a) und 2(b) sind graphische Darstellungen, die die Abhängigkeit der relativen Aktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität vom Reaktions-pH zeigen.
Fig. 3(a) und 3(b) sind graphische Darstellungen, die die Abhängigkeit der Restaktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität vom pH zeigen.
Fig. 4(a) und 4(b) sind graphische Darstellungen, die die Abhängigkeit der relativen Aktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität von der Reaktionstemperatur (beim pH 9,5) zeigen.
Fig. 5(a) und 5(b) sind graphische Darstellungen, die die Abhängigkeit der Restaktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität von der Reaktionstemperatur (beim pH 9,5) zeigen.
Fig. 6 ist eine Zeichnung, die die Ergebnisse der Elektrophorese der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität nach dem Verfahren von Davis zeigt.
Fig. 7 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der SDS-Elektrophorese der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfinduns und bevorzugte Ausführungsförmen

Es werden nun mykologische Eigenschaften eines Mikroorganismus diskutiert, der alkalische Pullulanase nach der vorliegenden Erfindung erzeugt. Die folgenden 21 Kulurmedien (Medium 1 bis 21) wurden für die Klassifizierung der Stämme benutzt. Sie enthalten alle 0,5 Gew.-% sterilisiertes Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;).

Zusammensetzungen der benutzten Kulturmedien(Gew.-%)

Medium 1: Nährbrühe, 0,8; Agar-Pulver (hergestellt-durch Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 2: Nährbrühe, 0,8
Medium 3: Nährbrüne, 0,8; Gelatine, 20,0; Agar-Pulver (hergestellt durch Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 4: Bacto-Lackmusmilch, 10,5
Medium 5: Nährbrühe 0,8; KNO&sub3;, 0,1
Medium 6: Bacto-Pepton, 0,7; NaCl, 0,5; Glukose, 0,5,
Medium 7: SIM Agar-Medium (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 8: TSI Agar (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 9: Hefeextrakt, 0,5; Bakto-Pepton, 1,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02; lösliche Stärke, 2,0; Agar-Pulver (hergestellt durch Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 10: Koser's Medium (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 11: Christensen's Medium (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 12: Das die folgenden Zusammensetzungen (1) und (2) einschließenden Zusammensetzungen, zu denen Stickstoffquellen hmzugegeben wurden, bestehend aus Natriumnitrat, Natriumnitrit, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat in einer Menge von 0,25; 0,2025; 0,158 bzw. 0,195 Gew.-% des Mediums.
(1) Hefeextrakt, 0,05; Na&sub2;SO&sub4;, 0,1; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; Glucose 1,0
(2) Hefeextrakt, 0,05; Na&sub2;SO&sub4;, 0,1; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; Glucose 1,0; CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 0,05; MnSO&sub4;-6H&sub2;O, 0,01; FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,001; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02
Medium 13: King A-Medium "Eiken" (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 14: King B-Medium "Eiken" (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 15: Harnstoff-Medium "Eiken" (hergestellt durch Eiken Kagaku), angegebene Menge
Medium 16: Cytochrome-Oxidase Test-Filterpapier (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
Medium 17: 3 %-iges wässriges Wasserstoffperoxid
Medium 18: Bacto Pepton, 0,5; Hefeextrakt, 0,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; Glucose 1,0; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02
Medium 19: Bacto-Pepton, 2,7; NaCl, 5,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,3; Glucose, 0,5; Bromthymolblau, 0,06; Agar-Pulver (hergestellt durch Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 20: (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1; KCl, 0,02; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02; Hefeextrakt, 0,05; Zucker, 1,0
Medium 21: Casein, 0,5; Hefeextrakt, 0,5; Glucose, 1,0; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02; Agar-Pulver (hergestellt durch Wako Pure Chemical), 1,5

Mykologische Eigenschaften

(1) Beobachtung unter dem Mikroskop

Die Zellen sind Stäbe einer Größe von 0,8-2,4 um x 1,8 - 4,0 um mit einer elliptischen Endospore (1,0 - 1,2 um x 1,2 - 1,4 um), die sich an ihren Unterenden ausbildet. Sie haben Geißeln und sind beweglich. Die Gram-Färbung ist unbestimmbar. Säure-Festigkeit: negativ

(2) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien

(a) Nahragar-Platte (Medium 1)

Das Wachstum der Zellen ist gut. Die Kolonie hat eine kreiskörmige Gestalt, wobei ihre Oberfiäche und ihr peripheres Ende glatt sind. Die Farbe der Kolonie ist gelb, halbtransparent und glänzend.

(b) Geneigte Nähragar-Kultur (Medium 1)

Zellen können wachsen. Die Kolonie hat eine Gewebe ausbreitende Gestalt, wobei die Farbe der Kolonie glänzend, gelb und halbtransparent ist.

(c) Nahrbrühe (Medium 2)

Zellen können wachsen.

(d) Stabkultur in Nährbrühe-Gelantine (Medium 3)

Das Wachstum der Zellen ist gut. Es wird Verfiüssigung von Gelantine beobachtet.

(e) Lackmusmilch-Medium (Medium 4)

Milchkoagulation und Peptonisierung werden nicht beobachtet. Die Lackmus-Verfärbung ist unbestimmbar, weil das Medium ein alkalisches Medium ist.

(3) Physiologische Eigenschaften

(a) Nitrat-Reduktion und Denitrifikation (Medium 5)

Nitrat-Reduktion: positiv
Denitrifikation: negativ

(b) MR-Test (Medium 6)

Unbestimmbar, weil das Medium ein alkalisches Medium ist.

(c) V-P-Test (Medium 6)

Negativ

(d) Produktion von Indol (Medium 7)

Negativ

(e) Produktion von Hydrogensulfid(Medium 8)

Negativ

(f) Hydrolyse von Stärke (Medium 9)

Positiv
(g) Nutzung von Zitronensäure (Medium 10, Medium 11) Negativ in Koser's Medium (Medium 10) und unbestimmbar in Christensen's Medium (Medium 11)

(h) Nutzung anorganischer Stickstoffquellen (Medium 12)

Nitrat, Ammoniumsalze und Nitrit werden alle genutzt.

(i) Verfärbung (Medium 13, Medium 14)

Negativ

(j) Urease Medium 15)

Negativ

(k) Oxidase (Medium 16)

Negativ

(l) Catalase (Medium 17)

Positiv

(m) Wachstumsbereich (Medium 18)

Wachstumstemperatur: 20 - 40ºC,
Optimale Wachstumstemperatur: 30 - 35ºC
Wachstums-pH-Bereich: 7 - 10,5
Optimaler pH: 10

(n) Verhalten bezüglich Sauerstoff

Aerobisch

(o) O-F-Test (Medium 19)

Verfärbung ist unbestimmbar, weil das Medium ein alkalisches Medium ist. Zellen können nur unter aerobischen Bedingungen wachsen.

(p) Zuckernutzung (Medium 20)

L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, Fructose, D-Galaktose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke, Raffinose, Salicin, D- Ribose und Dextrin werden alle genutzt.

(q) Wachstum in einem Natriumsalz enthaltenden Medium (eine Modifikation von Medium 1)

Zellen können in Gegenwart von 7 % Natriumchlorid wachsen, nicht aber in Gegenwart von 10 % Natriumchlorid.

(r) Hydrolyse von Casein (Medium 21)

Positiv
Auf der Grundlage der obigen mykologischen Eigenschaften wurde der Stamm der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determiniative Bacteriology, Band 8 und "The Genus Bacillus" Ruth, E. Gordon, Agriculture Handbook No. 427, Agriculural Research Service, US Deparment of Agriculture Washington D. C., (1973) untersucht und als ein sporogener stabförmiger Mikroorganismus bestimmt, der zur Gattung Bacillus gehört. Der Stamm wächst nicht in einem neutralen Bereich, kann jedoch hauptsächlich in einem stark alkalischen Bereich wachsen. Auf der Grundlage dieser Tatsache wird der Stamm der vorliegenden Erfindung als ein alkalophiler Mikroorganismus klassifiziert, der durch Horikoshi und Akiba [Alkalophilic Microorganism, Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982] gezeigt wurde. Der Stamm der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von einer Gruppe von Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören und in einem neutralen pH-Bereich wachsen.
Der Stamm der vorliegenden Erfindung hat außer den obigen Eigenschaften mykologisch andere Eigenschaften als konventionell bekannte "alkalophile Bacillus". Demgemäß wurde der Stamm der vorliegenden Erfindung als ein neuer Stamm bestimmt und Bacillus sp. KSM- AP1378 bezeichnet, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science und Technology als FERM P-10886 hinterlegt wurde. Die Herstellung von alkalischer Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität nach der vorliegenden Erfindung kann ausgeführt werden dürch Incculieren der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung und züchten der Mikroorganismen gemäß konventionellen Züchtungsverfahren. Es ist erwünscht, eine geeignete Menge Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen hinzuzugeben, die der Mikroorganismus im Medium nutzen kann. Es gibt keine spezifischen Einschränkungen hinsichtlich der Kohlenstoff- und Stickstoff- Quellen. Als Stickstoffquellen seien aufgeführt organische Stickstoff-Quellen, wie Maisklebermehl, Sojabehnenmehl, Mais-Einweichlauge, Kasin-Aminosäure, Hefeextrakt, Pharma-Medien, Fleischextrakt, Trypton, Soytone, Hypro, Ajipower, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Kultivator, Ajipron, Zitronen oder Orangenschale und ähnliche; und anorganische Stickstoff- Quellen sind solche, wie Ammoniumsulfat, -nitrat, -phosphat, -carbonat, Natriumnitrat, Ammoniumacetat und ähnliche. Als Beispiel für Kohlenstoff-Quellen seien angegeben lösliche Starke, unlösliche Stärke, Amylopektin, Glykogen, Pullulan und verzweigte Oligomere, die durch ihre Teilzersetzung erzeugt werden sowie nutzbare Kohienstoff-Quellen, wie Glucose, Maltose, Arabinose, Xylose, Ribose, Manose, Fructose, Galaktose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Mannit, Sorbit, Glycerin und nutzbare organische Säuren, wie Zitronensäure, Essigsäure und ähnliche. Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen können anorganische Ionen, wie Phosphat, Magnesium, Calcium, Mangan, Zink, Cobalt, Natrium, Kalium und ähnliche, wie erforderlich, andere mikronährende organische oder anorganische Substanzen zum Kulturmedium hinzugegeben werden.
Ein bevorzugter Temperaturbereich für die Züchtung ist 20-40ºC, am meisten bevorzugt sind 30-35ºC. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 8-10,5, wobei der bevorzugteste pH 10 ist. Unter diesen Umstähden ist die Züchtung üblicherweise in 2-3 Tagen abgeschlossen.
Die erfindungsgemäße alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität kann aus der Kulturbrühe mittels konventionellen Gewinnungs- und Reinigungs-Verfahren, die auf allgemeine Enzyme angewendet werden, gewonnen werden. Spezifisch werden die Zellen aus der Kulturbrühe mittels konventioneller Feststeff-Flüssigkeit-Trennverfahren abgetrennt, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder ähnliche, um eine Rohenzym-Flüssigkeit zu erhalten. Obwohl es möglich ist, die so erhaltene Rohenzym-Flüssigkeit zu benutzen, kann sie, wie erforderlich, nach dem Abtrennen mittels Trennverfahren, z. B. Aussalzen, Ausfällen, Ultrafiltration und ahniiches zur Herstellung eines Rohenzyms und Reinigen und Kristallisieren des Rohenzyms nach konventionellen Verfahren benutzt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Y wird nun erläutert. Stämme eines alkalophilen Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, z. B. Stamme von KSM-AP1378, werden drei Tage lang in einem Medium, enthaltend 1 Gew.-% Pullulan, 1 Gew.-% Polypepton, 0,5 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% KH&sub2;PO&sub4;, 0,25 Gew.-% Na&sub2;HPO&sub4;.12H&sub2;O, 0,02 Gew.-% MgSO&sub4;.7H&sub2;O und 0,5 Gew.-% Natriumcarbonat einer aerobischen Schüttelkultur bei 30ºC unterworfen. Die Zellen werden aus der Kulturflüssigkeit entfernt und ein Überstehendes erhalten. Das Überstehende wird dann mittels DEAE- Cellulose-Adsorption, α-Cyclodextrin-Affinitätschromatographie, DEAE-Toyopeal (hergestellt durch Tosoh)-Chromatographie und Sephacryl (hergestellt durch Pharmacia)-Chromatographie gereinigt. Ein so erhaltenes gereinigtes Enzym ergibt bei der Elektrophorese unter Einsatz von Polyacrylamidgel (Gelkonzentration 15 % Gew/Vol) und der Elektrophorese unter Einsatz von Natriumdodecylsulfat (SDS) ein einzelnes Band. Bei diesem Verfahren beträgt die Ausbeute an aktiver Pullulanase etwa 2 %.
Die enzymologischen Eigenschaften des neuen Enzyms, der alkalischen Pullulanase Y dieser Erfindung, werden nun diskutiert. Die enymatischen Aktivitäten wurden unter Einsatz der folgenden Pufferlösungen (jeweils 50 mM) gemäß dem unten erläuterten Verfahren gemessen.

Pufferlösungen:

pH 4 - 6: Acetatpuffer
pH 6 - 8: Phosphatpuffer (zum Messen der Pullulanase-Aktivität)
pH 6 - 8: Trismalatpuffer (zum Messen der α-Amylase-Aktivität)
pH 8 - 11: Glycin-NaCl-NaOH-Puffer
pH 11 - 12: KCl-NaOH-Puffer

Messung der enzvmatischen Aktivität

(1) Pullulanase-Aktivität

0,1 ml Enzymlösung wurden zu 0,9 ml jeder Substratlösung hinzugegeben, hergestellt aus jeder Pufferlösung, enthaltend Pullulan (Endkonzentration im Reaktionssystem: 0,25 % Gew/Vol), und die Mischung wurde 30 Minuten bei 40ºC umgesetzt. Nach der Umsetzung wurden reduzierende Zucker mit Hilfe des 3,5-Dinitro-salicylsäure (DNS)-Verfahrens quantitativ bestimmt. Spezifisch wurde 1,0 ml eines DNS-Reagenz zu 1,0 ml einer Reaktionsmischung hinzugegeben und die Mischung 5 Minuten bei 100ºC erhitzt, um eine Farbe zu entwickeln. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung durch Hinzugabe von 4,0 ml entionisiertem Wassers verdünnt. Diese Lösung wurde der kolorimetrischen quantitativen Analyse bei einer Wellenlänge von 535 nm unterworfen. Eine Einheit (1 U) der Enzym-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die 1 uMol reduzierenden Zuckers (wie Glucose) unter Standard-Versuchsbedingungen pro Minute freisetzte.

(2) α-Amylase-Aktivität

0,1 ml Enzymlösung wurde zu 0,9 ml jeder Substrat-Lösung hinzugegeben, die aus jeder Pufferlösung, enthaltend lösliche Stärke (Endkonzentration im Reaktionssystem: 0,25 % Gew/Vol) zubereitet war, und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 50ºC umgesetzt. Nach der Umsetzung wurden reduzierende Zucker nach einem DNS-Verfahren quantitativ bestimmt. Spezifisch wurde 1,0 ml eines DNS-Reagenz zu 1,0 ml einer Reaktionsmischung hinzugegeben und die Mischung 5 Minuten bei 100ºC erhitzt, um eine Farbe zu entwickeln. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung durch Hinzugabe von 4,0 ml entionisiertem Wassers verdünnt. Diese Lösung wurde der kolorimetrischen quantitativen Analyse bei einer Wellenlänge von 535 nm unterworfen. Eine Einheit (1 U) der Enzym-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die 1 uMol reduzierenden Zuckers (wie Glucose) unter Standard-Versuchsbedingungen pro Minute freisetzte.

Enzymologische Eigenschaften

(1) Wirkung

Wirkt auf Pullulan und lösliche Stärke unter Erzeugung von hauptsächlich Maltotriose aus Pullulan und hauptsächlich Maltotetrose und Maltepentose aus löslicher Stärke. Wirkt auch auf Glykogen unter Erzeugung von Maltotetrose und Maltopentose (s. Fig. 1).

(2) Substrat-Spezifität

Wirkt auf Pullulan, lösliche Stärke und Glykogen (siehe Tabelle 1). Tabelle 1 Substrat Konzentration relative Aktivität (%) Pullulan Glykogen (Austern) Glykogen (Kaninchen-Leber) Amylopectin Amylose Maltose Maltotriose Panose Isomaltose Isomaltotriose Gentiobiose

(3) Arbeits-pH und optimaler pH-Bereich

Der aktive pH-Bereich bei der Wirkung auf Pullulan ist der von 5-12, wobei ein optimaler pH-Bereich der von 8,5-10 ist.
Die Pullulanase-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden gemessen, wobei jedes Reaktionssystem benutzt wurde, bestehend aus 0,25 % Gew/Vol von Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-5), Phosphat (pH 6-8), Glycin-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) und KCl-NaOH (pH 11-12). Jede Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 40ºC ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2(a) gezeigt.
Der aktive pH-Bereich bei der Einwirkung auf lösliche Stärke ist der von 4-12, wobei ein optimaler pH-Bereich der von 7-9,5 ist.
α-Amylase-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden gemessen, wobei jedes Reaktionssystem benutzt wurde, bestehend aus 0,25 % Gew/Vol löslicher Stärke und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-5), Trismalat (pH 68), Glycin-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) und KCl- NaOH (pH 11-12). Jede Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 50ºC ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2(b) gezeigt.

(4) pH-Stabilität

Ist in einem pH-Bereich von 6-10,5 gegenuber Pullulan stabil.
Pullulanase-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden gemessen, wobei jedes Reaktionssystem benutzt wurde, bestehend aus 0,25 % Gew/Vol von Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-5), Phosphat (pH 6-8), Glycin-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) und KCl- NaOH (pH 11-12). Jede Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 40ºC ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3(a) gezeigt.
Ist in einem pH-Bereich von 4-12 gegenüber löslicher Stärke stabil.
α-Amylase-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden gemessen, wobei jedes Reaktionssystem benutzt wurde, bestehend aus 0,25 % Gew/Vol löslicher Stärke und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-5), Trismalat (pH 6-8), Glycin-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) und KCl- NaOH (pH 11-12). Jede Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 50ºC ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3(b) gezeigt.

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

Wirkt auf Pullulan und lösliche Stärke in einem weiten Temperaturbereich von 10 bis 65ºC, wobei die optimale Temperatur 50ºC beträgt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4(a) und 4(b) gezeigt.

(6) Thermische Stabilität

Die Temperatur, bei der das Enzym seine Aktivität verliert, wurde untersucht, indem man das Enzym einer Wärmebehandlung bei verschiedenen Temperaturen für 30 Minuten beim pH-Wert 9,5 unterwarf. Das Enzym war stabil zu 45ºC. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5(a) und 5(b) gezeigt.

(7) Molekulargewicht

Etwa 200.000 ± 5000 gemessen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 7,5 % Gew/Vol).

(8) Wirkungen von Metallinonen

Pullulanase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;- und Pb²&spplus;-Ionen, und die α-Amylase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;-, Cd²&spplus;- und Zn²&spplus;-Ionen. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Restaktivität (%) Verbindung Konzentration Pullulanase-Aktivität α-Amylase-Aktivität keine Zugabe Metallsalz Chelatbildner * Der Wert in Klammern ist eine Restaktivität, wenn Ca²&spplus;-Ionen nochmals hinzugegeben wurden.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, sind die Metallinonen, die die Pullulanase-Aktivität oder die α- Amylase-Aktivität der alkalischen Pullulanse der vorliegenden Erfindung beeinträchtigen verschieden voneinander.

(9) Wirkung von Reinigungsmitteln (Detergenzien)

Eine 0,05 %ige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, wie von linearem Alkylbenzolsuffonat (LAS), Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat (ES), Natrium-α-Olefinsulfat (AOS), Natrium- α-sulfoniertem Fettsäureester (α-SFE), Natriumalkylsulfonat (SAS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Seifen und Softanol wurden 15 Minuten lang bei 40ºC getestet, um zu bestätigen, daß es keine nachteiligen Wirkungen auf die enzymatischen Aktivitäten gibt.

(10) Wirkungen von Chelatbildnern

Chelatbildner, wie EDTA (10 mM), EGTA (10 mM) ergeben keine nachteilige Auswirkung auf die Pullulanase-Aktivität, beeinflussen die α-Amylase-Aktivität jedoch stark. Die α- Amylase-Aktivität, die durch ein Gelierungsmittel beeinträchtigt worden war, kann durch Zugabe von Ca²&spplus;-Ionen wiederhergestellt werden, wie in Tabelle 2 gezeigt.

(11) Beständigkeit gegenüber Protease

In Gegenwart einer alkalischen Protease, z. B. Maxatase (IBIS), Sabinase (Novo) oder ähnliche in einer Menge von 0,2 AU/l wurden die Aktivitäten gemessen, um zu bestätigen, daß das Enzym dieser Erfindung eine starke Beständigkeit gegenüber irgendwelchen Proteasen aufwies.
Wie aus den oben erwahnten enzymologischen Eigenschatten deutlich wird, ist die erfindungsgemäße alkalische Pullulanase Y ein Enzym mit physiologisch und chemisch anderen Eigenschaften als konventionelle Pullulanasen mit α-Amylasen-Aktivität.
Um die Neuheit des Enzyms der vorliegenden Erfindung klarzustellen, sind Vergleichsdaten hinsichtlich physiologischer und chemischer Eigenschalten der alkalischen Pullulanse Y der vorliegenden Erfindung und konventioneller Pullulanasen mit α-Amylase-Aktivität in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Pullulanase vorliegende Erfindung Mikroorganismus optimaler pH für Pullulanase-Aktivität optimaler pH für α-Amylase-Aktivität optimaler Temperatur für Pullulanase-Aktivität optimaler Temperatur für α-Amylase-Aktivität Molekulargewicht Hauptprodukte aus löslicher Stärke* Hauptprodukte aus Pullulan* Bacillus subtilis TU Gelfiltration Bacillus circulans F-2 SDS-Elektrophorese Bacillus sp. KSM-AP1378 *: G1: Glucose; G2: Maltose: G3:Maltotriose; G4: Maltotetrose G5: Maltopentose; G6: Maltohexose
Wie aus den physiochemischen und enzymologischen Eigenschaften in Tabelle 3 deutlich wird, unterscheidet sich die alkalische Pullulanase Y der vorliegenden Erfindung klar von einem Pullulanase-Amylase-Komplex, der durch Bacillus subtiles TU erzeugt wird und von einer Amylase mit Pullulanase-Aktivität, die durch Bacillus circulans F-2 produziert wird.
Die alkalische Pullulanase Y der vorliegenden Erfindung weist α-Amylase-Aktivität auf, und sie hat einen optimalen pH-Wert in einem stärker alkalischen Bereich als konventionelle alkalische Pullulanasen, und sie weist eine ausgezeichnete Stabilität in einem weiten pH-Bereich auf. Weiter hat die alkalische Pullulanase der vorliegenden Erfindung eine starke Beständigkeit gegenüber fast allen Reinigungsmittel-Komponenten, wie oberflächenaktiven Mitteln, Chelatbildnern, Proteasen für Detergenzien und ahnliche.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann daher vorteilhaft als eine Reinigungsmittel-Komponente eingesetzt werden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat somit eine hervorragende Brauchbarkeit auf industriellen Gebieten.
Andere Merkmale der Erfindung werden im Laufe der folgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen deutlich, die zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden und diese nicht einschränken sollen.

Beispiele

Beispiel 1

Ein Teelöffel voll Erdboden (etwa 0,5 g) von Tochigi-shi, Tochigi-ken, Japan wurde in sterilisierter Salzlösung suspendiert und die Mischung 15 Minuten lang bei 80ºC wärmebehandelt. Das Überstehende der wärmebehandelten Mischung wurde geeignet verdünnt, auf ein isolierendes Agar-Medium (Medium A) aufgebracht und drei Tage bei 30ºC kultiviert, um Kolonien wachsen zu lassen. Die Kolonien, die aufgrund der Pullulan-Auflösung transparente Zonen in ihren Peripherien bildeten, wurden gesammelt, um Stämme zu erhalten, die Pullulanase mit a-Amylase-Aktivität erzeugen. Diese Stämme wurde in das flüssige Medium B inoculiert und 3 Tage bei 30ºC schüttel-kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, um ein Überstehendes abzutrennen. Die Pullulanase- und α-Amylase-Aktivitäten des Überstehenden wurde beim pH 10 gemessen, um Stämme auszuwahlen, die alkalische Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität erzeugen. Auf diese Weise wurde Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM P-10886) erhalten, der ein zur Erzeugung von alkalischer Pullulanase mit α-Amylase-Aktivität befähigter Mikroorganimus ist. Medium A Pullulan lösliche Stärke gefärbtes Pullulan Polypeptid Hefeextrakt Agar Medium B Pullulan lösliche Stärke Trypton Hefeextrakt

Beispiel 2

Die Stämme von Bacillus sp. KSM-AP1378, die die alkalische Pullulanase Y mit α- Amylase-Aktivität erzeugen, wurden in das flüssige Medium B geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1 aufwies, und sie wurden drei Tage lang bei 30ºC schüttel-kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, um rohes Pullulanase-Enzym herzustellen. Das rohe Enzym wurde nach einem konventionellen Verfahren verarbeitet, um ein Ethanol-getrocknetes Pulver herzustellen. Als Ergebnis wurde die alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität erhalten und, wie in Tabelle 4 gezeigt, bestätigt. Die enzymatische Aktivität wurde beim pH 9 gemessen. Tabelle 4 Enzymatische Aktivität (U/g) Stamm Enzymenge (g) pro 1 Medium Pullulanase α-Amylase

Beispiel 3

Bacillus sp. KSM-AP1378, der zur Erzeugung alkalischer Pullulanase mit α-Amylase- Aktivität in der Lage war, wurde in ein Medium geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das flüssige Medium B in Beispiel 1 aufwies, ausgenommen, daß anstelle von Pullulan und löslicher Stärke 1 % Maltose hinzugegeben wurde, und es wurde 2 - 3 Tage lang bei 30ºC schüttelkultiviert. Die Pullulanase-Aktivität eines Überstehenden nach dem Zentrifugieren wurde zu 211 U/l der Kulturbrühe bestimmt.

Beispiel 4

Zu einem Überstehenden des Rohenzyms, hergestellt in Beispiel 2, wurde DEAE-Zellulose-Pulver hinzugegeben und die Pullulanase im Überstehenden vollständig an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Nach dem Waschen des Harzes mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) wurde das Enzym mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (ph 8), enthaltend 0,6 M Natriumchlorid, eluiert. Das Eluat wurde gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer dialysiert. Dann wurde das Enzym an einer α-Cyclodextrin-Affinitätssäule adsorbiert, die mit 10 mM Tri-HCl-Puffer äquilibriert war, und es wurde mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend β-Cyclodextrin, eluiert, um aktive Fraktionen zu sammeln. Nach dem Dialysieren wurden die aktiven Fraktionen an DEAE Toyopeal 6505, das mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) äquilibriert worden war, adsorbiert. Das adsorbierte Enzym wurde mit einem Gradienten mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,1-1 M, eluiert, um aktive Fraktionen zu sammeln. Nach dem Dialysieren wurden die aktiven Fraktionen in eine mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, äquilibrierte Sephacryl S-200-Säule gefüllt und mit dem gleichen Puffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, eltiiert, um aktive Fraktionen zu sammeln. Die aktiven Fraktionen wurden auf einer Ultrafiltrations-Membran konzentriert und über Nacht gegen 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 8) dialysiert, um die alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität zu erhalten. Die erhaltene Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität wurde der Elektrophorese unter Einsatz von Polyacrylamidgel (Gelkonzentration: 15 % Gew/Vol) gemäß dem Verfahren von Davis [ Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404 (1964)] unterworfen und mit Coomassie Brilliantblau gefärbt; um zu bestätigen, daß es ein einziges Band ergab (siehe Fig. 6).

Beispiel 5

Die in Beispiel 4 erhaltene Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität wurde der Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophorese nach einem konventionellen Verfahren unterworfen, um zu bestätigen, daß das Enzym ein Molekulargewicht von 200.000 ± 5000 (siehe Fig. 7) aufwies.
Offensichtlich sind im Licht der obigen Lehren zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es sollte daher klar sein, daß im Rahmen der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders ausgeführt werden kann, als hier spezifisch beschrieben.

Claims

1. Alkalische Pullulanase Y mit α-Amylase-Aktivität, die die folgenden enzymologischen Eigenschaften aufweist:

(1) Wirkung

wirkt auf Pullulan und lösliche Stärke zur Erzeugung von hauptsächlich Maltotriose aus Pullolan und hauptsächlich Maltotetraose und Maltopentaose aus löslicher Stärke und wirkt auch auf Glykogen zur Erzeugung von Maltotetraose und Maltopentaose;

(2) Substrat-Spezifität

wirkt auf Pullolan, lösliche Stärke und Glykogen;

(3) Arbeits-pH und optimaler pH-Bereich

hat gegenüber Pullolan einen aktiven pH-Bereich von 5 bis 12, mit einem optimalen pH-Bereich von 8,5 bis 10 und hat bezüglich löslicher Stärke einen aktiven pH- Bereich von 4 bis 12, bei eineni optimalen pH-Bereich von 7 bis 9,5;

(4) pH-Stabilität

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

wirkt auf Pullolan und lösliche Stärke innerhalb eines weiten Temperaturbereiches von 10 bis 65ºC, mit einer optimalen Temperatur um 50ºC herum;

(6) Thermische Stabilität

ist bei Behandlung in einem 10 mM Glycin-NaCl- NaOH-Puffer (pH 9,5) bis zu 45ºC 30 Minuten stabil;

(7) Molekulargewicht

(8) Wirkungen von Metallionen

Pullulanase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;- und Pb²&spplus;-Ionen und α-Amylase-Aktivität wird beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Mn²&spplus;-, Pb²&spplus;-, Zn²&spplus;- und Cd²&spplus;- Ionen.

2. Mikroorganismus, der eine alkalische Pullulanase gemäß Anspruch 1 erzeugt, wobei dieser Mikroorganismus als "Bacillus sp. RSM-AP1378" bezeichnet und als FERM P-10886 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt ist.

3. Verfahren zum Herstellen der alkalischen Pullulanase gemäß Anspruch 1, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus, der eine alkalische Pullulanase erzeugt, die α-Amylase-Aktivität zeigt, der als "Bacillus sp. KSM- AP1378" bezeichnet und als FERM P-10886 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt ist, und

Gewinnen der alkalischen Pullulanase Y, die α-Amylase-Aktivität zeigt, aus dem Kulturmedium.