WO2004033610A1

WO2004033610A1 - イネ由来ペルオキシダーゼの利用法

Info

Publication number: WO2004033610A1
Application number: PCT/JP2003/012143
Authority: WO
Inventors: Miyuki Morita; Kiyoshi Ito
Original assignee: Mitsui Chemicals, Inc.
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2003-09-24
Publication date: 2004-04-22
Also published as: JPWO2004033610A1; US20060048306A1; AU2003273583A1; EP1550711A1; EP1550711A4

Abstract

本発明は高温での反応性並びに安定性に優れているイネ由来ペルオキシダーゼ、特に、イネモミガラ由来ペルオキシダーゼの利用方法を提供する。イネ由来ペルオキシダーゼを用いて洗液中の着色物質(染料など)の分解(脱色・漂白)する。より具体的には、染色布ともう1つの布を同一の洗液中で一緒に洗った場合、または、すすぐ場合の染色布からもう1つの布への繊維染料の移染を阻害する。また、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する。本発明により洗濯又はすすぎにおいて優れた染料の移動防止が可能になり、溶液又は分散液中の繊維染料を漂白するより優れた方法、更には染料の移動防止、漂白用の組成物が提供される。

Description

イネ由来ペルォキシダーゼの利用法技術分野本発明は、高温での反応性並びに安定性に優れているイネ由来ペルォキシダーゼ、より具体的には、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの利用方法に関する。

より特定的に言うと、本発明は、イネ由来ペルォキシダーゼを用いた溶液中の着色物質（染料など）の分解（脱色 ·漂白）方法および組成物の提供に関する。

すなわち、本発明は、洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯および/またはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法（以下、染料移動阻止方法と呼ぶ）に関する。さらに、本発明は、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法に関する。また、本発明は、イネ由来ペルォキシダーゼを含有する洗剤組成物もしくは漂白剤組成物に関する。背景技術ペルォキシダ一ゼ（E . C . 1 . 1 1 . 1 . 7 ) は、植物組織、動物組織、血液等に広く分布しており、さらに、いくつかの微生物も同酵素を分泌することが以前より確認されている。該酵素は、過酸化水素による基質（電子又は水素供与体）の酸化触媒として作用する酵素である。尚、ペルォキシダーゼは、補欠分子族並びに反応形式の違いによりいくつかのタイプに分類されるが、ェ業的には、補欠分子族としてヘムを含んでいるヘム型ペルォキシダーゼの利用が最もよく知られている。次に上述のヘム型ペルォキシダ一ゼについて説明する。ヘム型ペルォキシダ

—ゼは、 3価の鉄イオンを含むヘム蛋白質であり、過酸化水素や有機過酸化物の存在下で種々の化合物の酸化を蝕媒する酵素である。その作用機作については、下のステップ 1〜ステップ 3のように、過酸化物の存在下で種々の化合物の酸化的な脱水素反応を触媒すると説明されている。

ステップ 1 ：ペルォキシダーゼ + H ₂ 0 ₂→コンプレックス I

ステップ 2 ：コンプレックス I + AH (還元型供与体）

—コンプレックス I I + A (酸化型供与体）ステップ 3 ：コンプレックス I I + A H→ペルォキシダ一ゼ + A + 2 H ₂ 0 ヘム型ペルォキシダーゼの代表例としては、例えば西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ、大豆由来ペルォキシダーゼ、コルプリヌス *シネレウス（Corpr imis c inerus) 由来ペルォキシダーゼ（例えば、特公平 0 3— 1 9 4 9号公報参照）等がよく知られている。

ペルォキシダ一ゼの産業上の利用については、幅広い提案が既になされているが、その中には、各種有機化合物の分解プロセスに使用することも含まれる。たとえば、製紙用パルプの製造プロセスでの利用や繊維染料の漂白 ·分解を目的とする利用等である。尚、上述の作用機作に基づき、これらの公知の方法においては、ペルォキシダ一ゼは、通常過酸化水素または現場において過酸化水素を発生しうる化合物や酵素系と一緒に使用される。

繊維染料の漂白 ·分解という観点から見た場合、ペルォキシダーゼは、染料移動阻止剤および繊維染料の漂白剤としての利用が提案されている。ここで、 "染料移動阻止" とは、例えば特許掲載第 2 8 0 1 3 9 8号公報に記載されたような布の洗浄中に染色された布から他の布への繊維染料の移動阻止からなるプロセスであるが、この染料移動の問題は、染料が洗濯の間に滲出する暗色の布と白色または淡色布を一緒に洗濯する場合に重要である。さらに、溶液または分散液中の繊維染料に対するペルォキシダーゼの漂白作用に基づいて、該酵素が繊維工業からの排水処理に有効であると期待されている。また、ペルォキシダ一ゼのこれら能力は、過酸化水素と共に、活性化剤と称される染料以外の被酸化性基質、と組み合わせると、特に顕著になることも知られている。

残念ながら、自然環境中における上記ペルォキシダーゼの活性レベルは、比較的非自然な洗浄や排水処理環境中で維持されないことがしばしばある。特に、反応性（反応速度）、熱安定性、 P H安定性、酸化安定性および基質特異性等のペルォキシダーゼが有する種々の特性が、該酵素の自然環境外での利用にとつて必ずしも最適とは限らない。実際に、染料移動阻止および漂白に関して有効なペルォキシダーゼとして、西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ、大豆由来ペルォキシダーゼ、または、コルプリヌス ·シネレウス由来ペルォキシダーゼのような細菌 ·酵母 ·糸状菌のような微生物により産生されるペルォキシダーゼが既に提案されているが、いずれも実用的な活性.レベルには達していない。特に、繊維染料の移動が起り易いのは、 4 0 °C以上で洗浄を行った場合であるが、この温度において優れた反応性と安定性を示すペルォキシダ一ゼは、知られていない。

また、造粒化等の洗剤組成物としての加工時、並びに、加工後の保存時においても、優れた安定性を示すペルォキシダ一ゼは、知られていない。

今日の遺伝子工学の進歩により、タンパク質のアミノ酸配列中における特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることが可能であり、かつ、比較的容易になっている。そして、置換されるアミノ酸残基の位置、置換されたアミノ酸残基の化学的な性質や物理的な大きさ等に応じて、元の酵素の性能を様々な程度に変化させうるし、場合によっては、元の酵素を不活化させることすらある。ペルォキシダーゼについても、そのようなアプローチは可能であり、たとえば、特表平 9— 5 0 3 6 6 4号公報では、洗浄環境中での効力を増加させたペルォキシダーゼを取得するという目的で、コルプリヌス ·シネレウス由来ペルォキシダ一ゼのアミノ酸配列を変化させて、その性能を改善することが試みられているが、残念ながら、十分な能力を獲得するには至っていない。また、ペルォキシダーゼを染料移動阻止や排水処理で利用するためには、ぺルォキシダーゼ自体が低コストで製造される必要がある。すなわち、ペルォキシダーゼが多量に含有されており、入手し易く、豊富に存在し、かつ、それ自体が安価な材料からペルォキシダ一ゼを分離 ·精製 ·回収するか、細菌 ·酵母 · 力ビなどの微生物に該酵素を効率よく生産させることが必須である。

先に述べたように、ペルォキシダ一ゼは植物（組織）に広く存在しているので、その種類を問わず植物（組織）からの抽出が考えられる。その代表例として西洋ヮサビがよく知られているが、西洋ヮサビは、ペルォキシダーゼは多量に含有されているものの、入手し易く、豊富に存在し、かつ、それ自体が安価な材料とは言い難い。

また、近年の遺伝子工学的な手法の進歩により、細菌 ·酵母 ·糸状菌などの微生物にペルォキシダーゼを効率よく生産させることが可能になっている。その場合、該酵素生産時における宿主微生物の生育環境を厳密に制御することが、高い生産効率の維持並びに遺伝子組換え生物の封じ込めという観点から必須である。しかしながら、生育環境を厳密に制御するためには、高度に密閉され、かつ、殺菌が可能な専用の装置 ·機器やそれを格納するための専用施設が必要となるため、一般的には、低コストで製造することは必ずしも容易ではない。イネにもペルォキシダ一ゼが含まれており、特にイネモミガラ中に比較的多量のペルォキシダーゼが含まれていることが既に報告されている（日本作物学会東海支部研究発表梗概第 5 9巻，第 6頁)。また、その精製方法（特公平 5 - 2 2 5 1 0号公報）、並びに、植物成長促進剤としての利用方法（特公平 7— 9 1 1 6 9号公報）についての提案が既になされているが、染料移動阻止や漂白に関する利用についての報告はなされていない。発明の開示以上の状況に鑑み、本発明の課題は、従来のペルォキシダーゼにはないより非自然な条件で活性の発現が可能なペルォキシダーゼを見出し、これを利用する方法を提供する事にある。

そして、本発明の目的は、. 洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の染料の漂白を伴なう繊維工業等での排水処理に対する有効な活性レベルに優れ、かつ、安価なペルォキシダーゼの利用を提供することである。

イネモミガラは、日本においては、年間約 2 0 0万トン発生しており、その 3割近くが焼却ないし廃棄されている（参考文献：バイオマス ·エネルギー · 環境アイピ一シ一）。すなわち、イネモミガラは、ペルォキシダーゼが多量に含有されており、入手し易く、豊富に存在し、かつ、それ自体が安価な材料である。

驚くべきことに、本発明者らは、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼは、先に例示した西洋ヮサビ由来ペルォキシダ一ゼ、大豆由来ペルォキシダーゼ、および、コルプリヌス ·シネレウス由来ペルォキシダーゼと比較して、高温での反応性並びに安定性に優れていることを見出し、よって、染料移動阻止および漂白に関して有効な活性レベルを維持できるペルォキシダーゼであることを確認し、本発明を完成するに至った。また、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼは染色された布自体には何らの明らかな色分解を起こさないという重要な利点も併せて有していた。

すなわち、高温での反応性並びに安定性を示すイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを利用することで、室温から高温までの幅広い温度域での繊維染料の移動阻止効果および漂白効果が期待できると共に、造粒化等の洗剤組成物としての加工時、並びに、加工後の保存時においても、優れた安定性を期待することができる。

即ち、本発明は以下のとおりである。

[ 1 ] 洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯および Zまたはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、該洗液に過酸化水素の存在下でイネ由来ペルォキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。

[ 2 ] 溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に過酸化水素の存在下でィネ由来ペルォキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。 [3] イネ由来ペルォキシダーゼが、耐熱性のイネ由来ペルォキシダーゼであることを特徴とする [1] または [2] のいずれか 1項に記載の方法。

[4] イネ由来ペルォキシダーゼが、イネモミガラ由来のペルォキシダーゼであることを特徴とする [1] から [3] のいずれか 1項に記載の方法。

[5] 過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求の [1] から [4] のいずれか 1項に記載の方法。

[6] 過酸化水素前駆体が過ホウ酸塩または過炭酸塩である [5] に記載の方法。

[7] 活性化剤の存在下において実施することを特徴とする [1] から [6] のいずれか 1項に記載の方法。

[8] 界面活性剤の存在下において実施することを特徴とする [1] から [7] のいずれか 1項に記載の方法。

[9]繊維染料が合成染料、天然染料又は天然同一性染料である [1]から [8] のいずれか 1項に記載の方法。

[10] イネ由来ペルォキ,シダーゼを含んでいる組成物。

[1 1] 洗剤組成物もしくは漂白剤組成物であることを特徴とする [10] に記載の組成物。

[12] 過酸化水素、一種類以上の過酸化水素前駆体、および、過酸化水素を発生せしめることのできる一種類以上の酵素系のうちの少なくともどれか一つを含んでいることを特徴とする [10] または [1 1] のいずれか一項に記載の組成物。

[13] イネ由来ペルォキシダーゼ、過酸化水素前駆体、および、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる一種類以上の漂白活性化剤を含んでいることを特徴とする組成物。

[14] 一種類以上の界面活性剤、もしくは、一種類以上の活性化剤を共に含んでいることを特徴とする [1 0] から [13] のいずれかに一項に記載の組成物。

本発明により、洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を伴なう繊維工業等での排水処理に関して、反応性と安定性に優れ、かつ、安価なペルォキシダ一ゼが提供される。図面の簡単な説明図 1は、種々ペルォキォキシダ一ゼの温度と反応速度の関係についての比較結果を示す。図中、 △： R H Pはイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを、口： H R Pは西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼを、 ◊ : C C Pはコルプリヌス *シネレウス由来ペルォキシダ一ゼを、〇： S B Pは大豆由来ペルォキシダ一ゼをそれぞれ示す。

図 2は、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによるオレンジ I Iの退色反応における ¾性化剤（p _ョ一ドフエノール）の添加効果を示す。図中、 R H P はイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを示す。 Xは活性化剤の添加を、 △は活性化剤の無添加をそれぞれ表す。発明を実施するための最良の形態以下本発明を詳細に説明する。

本発明は、洗液中で布を一緒に洗濯および Zまたはすすぐ場合において、染色した布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、前記布を洗 '濯しおよびまたはすすぐ洗液に、イネ由来ペルォキシダーゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に存在させることを特徴とする方法に関するものである。

また、本発明は、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に、イネ由来ペルォキシダーゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に存在させることを特徴とする方法に関するものである。

さらに、本発明は、イネ由来ペルォキシダ一ゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に含有している洗剤組成物もしくは漂白組成物の提供に関するものである。

本発明におけるイネ由来ペルォキシダ一ゼは、精製の程度により該酵素と共に含まれる不純物の量や質が異なってくるが、好ましくはその R Z値が 0 . 0 1以上、より好ましくは 0 . 1以上、さらに好ましくは 1 . 0以上のものを使用すればよい。尚、ここでいう R Z値とは、 2 7 5 n mと 4 0 3 n mに於ける吸光度の比である（A 2 7 5 n m/A 4 0 3 n m)。この値は、ペルォキシダ一ゼ溶液中の蛋白質含量に対するヘム含量の比を表しており、ペルォキシダ一ゼの精製度の指標となる。

本発明における耐熱性のイネ由来ペルォキシダ一ゼとは、同酵素を含有しているイネモミガラから分離 ·精製 ·回収されるイネモミガラ由来ペルォキシダ —ゼを代表例として挙げることができるが、耐熱性を有しているイネ由来ペルォキシダーゼであれば、その局在部等に関しては特に制限はない。たとえば、糠や茎葉部由来のイネ由来ペルォキシダ一ゼであっても、耐熱性を有していれば、本発明でいう耐熱性のイネ由来ペルォキシダーゼとする。尚、本発明においては、 5 0 °C以上で 3 0分間の熱処理後においても、 5 0 %以上の活性が保持されていれば、耐熱性を有していると判定するが、後述の実施例のように、 9 0 °Cにて 3 0分間の熱処理後においても、 9 0 %以上の活性が保持されているような場合が最も好適な事例と言える。

本発明におけるイネ由来ペルォキシダーゼ、特にイネモミガラ由来ペルォキシダーゼは、特公平 5— 2 2 5 1 0号公報記載の精製方法により、イネモミガラより容易に入手することができる。また、フナコシ株式会社より、試薬としても購入することができる。

さらに、近年のイネゲノム解析の成果等により、イネにおいても、複数のぺルォキシダーゼ遺伝子の存在が報告されている（Chen ZHら； Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu L i Xue Bao (Shanghai) 2001 ; 33 (2) : 163-172) ₀ すなわち、今日の遺伝子工学的な手法を利用すれば、これらのイネ由来のペルォキシダーゼをコ一ドする D N A配列と、該ペルォキシダーゼをコードする D N A配列の発現を目的とする機能を有する D N A配列を結合させた組換え D N A分子を構築し、続いて該組換え D N A分子で宿主細胞や宿主植物体を形質転換して、イネ由来ペルォキシダ一ゼを効率良く生産させることも可能である。以上のような技術的な背景を踏まえた場合、形質転換された宿主細胞を培養し、もしくは、形質転換された宿主植物体を生育させて、得られた培養物、培養細胞、もしくは植物体からペルォキシダーゼを分離 ·精製 ·回収することにより得られるィネ由来ペルォキシダーゼも、本発明のイネ由来ペルォキシダーゼの範疇に含まれるものとする。

本発明におけるイネ由来ペルォキシダーゼの形態についての制限は特にないが、洗剤組成物や漂白剤組成物の成分として添加される場合を考慮すれば、無粉塵性顆粒や液体酵素製剤の形態であることが好ましい。尚、無粉塵性顆粒の場合は、米国特許第 4， 1 0 6， 9 9 1号公報および第 4， 6 6 1 , 4 5 2号公報に記載のように作られ、そして場合により当該技術で公知の方法により被覆することができる。また、液体酵素製剤の場合は、確立された方法にしたがつてポリオールた i:えばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸等を加えることにより安定化させることができる。

本発明における洗液中で布を一緒に洗濯および/またはすすぐ場合、または、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する場合においては、洗液や漂白液 1リットル当たり 0 . 0 0 l m gから 1 0 0 O m gのイネ由来ペルォキシダーゼを添加すればよい。さらに、その温度は、 1 0 から 8 0 °Cの範囲、好ましくは 20°Cから 70°Cの範囲、より好ましくは 20°Cから 60°Cの範囲で実施すればよい。さらに、洗液や漂白液の pHは、一般的 pH、洗濯および Zまたはすすぐ場合の一般的な PH、すなわち pH 6. 5〜10. 5、好ましくは 6. 5 〜9. 5、より好ましくは 7. 5〜9. 5で実施すればよい。

本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、イネ由来ペルォキシダーゼと過酸化水素が実質的に同時に存在していることが必須である。この際、過酸化水素は洗濯およびまたはすすぐプロセスの初め又は途中で、 0. 00 l〜5mM、好ましくは 0. 01〜 ImMの量で存在させればよい。

過酸化水素の供給に際しては、過酸化水素自体が洗液、溶液または分散液に添加されてもよいし、現場において過酸化水素を発生する過酸化水素前駆体として供給されてもよい。

代表的な過酸化水素前駆体として、過ホウ酸塩、過炭酸塩、ペルォキシカルボン酸、またはその塩等が挙げられる。具体的には、過ホウ酸ナトリウムや過炭酸ナ卜リゥムが挙げられる。

また、上述の過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤を過酸化水素前駆体と共存させてもよい。その様な漂白活性化剤としては、具体的には、ノナノィルォキシベンゼンスルホナート ·ナトリウム塩、ドデカノィルォキシベンゼンスルホナー卜 ·ナトリウム塩、 4—デカノィルォキシ安息香酸、テトラァセチルエチレンジァミン等が挙げられる。共存させるべき漂白活性化剤の量は、洗濯および Zまたはすすぐプロセスの初め又は途中で、約 l M〜10mM、より好ましくは、約 10 M〜lmMの間が適当である。さらに、過酸化水素供給源として、現場において過酸化水素を発生させる過酸化水素生成酵素系を選択してもよい。好ましい過酸化水素生成酵素系は、洗剤組成物へ都合良く含まれる安価で容易に入手可能な基質 (過酸化水素前駆体）に作用するものである。このような基質（過酸化水素前駆体）の例としてはグルコースであり、これはグルコースォキシダーゼを用いることにより過酸化水素を供給することができる。他の適当なォキシダーゼは尿酸ォキシダ一ゼ、ガラク！ ^一スォキシダーゼ、アルコ一ルォキシダーゼ、アミンォキシダーゼ、ァミノ酸ォキシダーゼおよびコレステロールォキシダーゼである。

本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、使用するイネ由来べルォキシダーゼの染料移動阻止および漂白効果を強化するために、別の酸化性基質を共存させてもよい。これらの酸化性基質は、一般に活性化剤と称され、 p—ョ一ドフエノ一ル、 Lーァスコルビン酸、 p —ァミノフエノール、 p—ァミノ安息香酸基質などが具体例として挙げられるが、これらに限られたものではない。また、共存させるべき酸化性基質の量は、約 1 ^ Μ〜1 0 ιηΜ、より好ましくは、約 1 0 M〜 I mMの間が適当である。

本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤ならびにこれら界面活性剤の混合物が共存していてもよい。このような界面活性剤の例としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩（L A S ：陰イオン界面活性剤）、ひ一才レフィンスルホン酸塩（A O S：陰イオン界面活性剤）、硫酸アルキルポリオキシェチレン塩（A E S ：陰イオン界面活性剤）ドデシル硫酸ナトリウム（S D S ：陰イオン界面活性剤）ラウリン酸ナトリウムのような長鎖脂肪酸塩（石鹼：陰ィオン界面活性剤）、 B r i j 3 5 (非イオン界面活性剤）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（非イオン界面活性剤）、アルキルトリメチルアンモニゥム塩 (陽イオン界面活性剤）、ジアルキルジメチルアンモニゥム塩（陽イオン界面活性剤）、ジメチルアルキルアミンォキシド（両性界面活性剤）などが挙げられるが、これらに限られたものではない。また、共存させるべき界面活性剤の量は、特に制限はないが、各界面活性剤の臨界ミセル濃度（C M C )以上が好ましい。本発明においてイネ由来ペルォキシダーゼにより染料移動阻止および漂白の対象となる繊維染料については特に制限はなく、上述の活性化剤との共存下も含めて、通常使用される繊維染料に対して効果を発揮する。尚、ここでいぅ繊維染料とは、天然染料はいうまでもなく、合成的に作られるがただし構造および特性は天然染料と同じである天然同一性染料、一般的なァゾ染料をはじめとして、アントラキノン染料などその他の合成染料を挙げることができる。さらに、繊維と共有結合により結合する反応性染料に対しても有効である。

最後に、本発明は、イネ由来ペルォキシダ一ゼ含んでいる組成物に関する。具体的には、洗剤組成物もしくは漂白剤組成物に関する。また、過酸化水素、または、その供給を目的とする成分との共存が必須であるが、そのために、過酸化水素前駆物質、漂白活性化剤や過酸化水素生成酵素系を成分の一つとして選択してもよい。すなわち、本発明は、イネ由来ペルォキシダ一ゼ、および、過酸化水素、過酸化水素の前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および、過酸化水素を発生せしめることのできる酵素系のうちの少なくともどれか一つを含んでいることを特徴とする洗剤組成物もしくは漂白剤組成物に関する。

この組成物中のィネ由来ペルォキシダーゼ量については、特に制限はないが、好ましくは、洗液、溶液、もしくは分散液 1リットル当たり 0 . O O l m gから 1 0 0 O m gのイネ由来ペルォキシダーゼを含有させればよい。

その形態についても、目的に都合の良いように紛体または液体いずれかの形態を選択すればよい。具体的には、上述のような無粉塵性顆粒や種々の安定剤により安定化された液体酵素製剤を選択することができる。特に、紛体の場合は、該組成物中の全成分を混合した造粒物からなる組成物、該組成物中の個別成分単独の造粒物や任意の複数成分の混合造粒物を混合させた組成物であってもよい。尚、ここでいう任意の複数成分の混合造粒物とは、一例を挙げれば、イネ由来ペルォキシダーゼと過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤を混合させた造粒物のことである。

この漂白剤組成物中のイネ由来ペルォキシダーゼ量については、洗剤組成物と同様に特に制限はない。また、その形態についても、同様である。

本発明における洗剤組成物中もしくは漂白剤組成物中には、過酸化水素自体は言うまでもなく、過酸化水素を効率よく発生させる目的で、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの成分が含まれていてもよい。また、本発明における洗剤組成物.中もしくは漂白剤組成物中には、イネ由来ペルォキシダーゼによる漂白活性を増強するための活性化剤や、洗浄効果を増強するための界面活性剤を含んでいてもよい。

さらに、洗剤組成物を目的とする場合には、さらに当該技術での公知となつている他の洗剤成分、たとえば、ビルダー、抗腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、抗一よごれ再付着剤、芳香剤、酵素安定剤等、他の洗剤酵素（たとえばプロテアーゼ、リパ一ゼまたはアミラーゼ) を含んでもよい。

本発明の洗剤組成物が添加された洗液もしくは漂白剤組成物が添加された漂白液の pHは、 6. 5〜12であり、好ましくは、 6. 5〜10. 5である。次に、本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの温度と反応速度オレンジ I I ( I. Acid Orange 7：関東化学より購入：以下同じ）を基質とした退色反応により、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの温度と反応速度の関係について検討した。、日立製紫外可視分光光度計 U— 2010のセル内（光路 1 cm) に、 100 Mオレンジ I Iおよび 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0. lM T r i s— HC 1緩衝溶液（pH 9. 0) lmLを加え、各温度で 10分間プレインキュペートした後、予め同じ温度にてプレインキュペートしておいた 1. 5 mM過酸化水素水を lmL注入して反応を開始し、オレンジ I Iの最大吸収波長である 485 nmの経時的な吸光度の変化を測定した。尚、イネモミガラ由来ペルォキダーゼは、フナコシ株式会社より販売されているイネモミガラ由来ペルォキダーゼ（商品番号 K03 10100 ：純度 RZ >1. 2) を使用した。また、同酵素のモル吸光係数は、西洋ヮサビと同じく 1. 02 X 10⁵mo 1— ¹ dm³ c m^_1 (403 nm) とした。また、オレンジ I Iは、和光純薬製の試薬を再結晶法で精製し、口紙分配クロマトグラムと uvスぺクトルで純度を確認して使用した。

このオレンジ I Iの退色曲線から、反応速度式を解析した結果、退色反応はいずれの場合も擬一次反応で進行することが明らかとなった。そこで、以下の式（1)

式（1) ： I n (C。ノ C_t) =k_t

(ここで、 k _t ( m i n— ¹ ) は擬一次速度定数、 C。はオレンジ I Iの初濃度、 C _tは反応時間 t におけるオレンジ I Iの濃度である。）に示す擬一次反応速度式からオレンジ I Iの退色反応における温度と速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表一 1に示した。表一 1

また、次の比較例 1で示す西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ、コルプリヌスシネレウス (Corprinus cinerus：旧名 Ar thromyces ramosus) 由来ペルォキシダ一ゼ、大豆ペルォキシダ一ゼに関する同様の結果（表一 2) の温度と速度定数 k _tの関係と、本実施例におけるイネモミガラ由来ペルォキシダーゼの温度と速度定数 k_tの関係について、図— 1のように比較を行った。

その結果、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼは、他のペルォキシダーゼと比較した場合、高温での反応性並びに安定性に優れていることが判明した。

[比較例 1] 種々のペルォキシダーゼの温度と反応速度

オレンジ I Iを基質とした退色反応により、西洋ヮサビ由来ペルォキシダ一ゼ、コルプリヌスシ不レウス (Corpr inus cinerus：旧名 Arthroinyces ramosus) 由来ペルォキシダーゼ、大豆ペルォキシダ一ゼの温度と反応速度の関係について検討した。 '

使用するペルォキシダーゼとして西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ、コルプリヌスシネレウス由来ペルォキシダーゼ、大豆ペルォキシダーゼを用いた以外は、実施例 1と同一の方法と条件にて測定を行い、温度と速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表一 2に示した。

尚、西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼは和光純薬製の試薬（R. Z. =2. 65)、コルプリヌス ·シネレウス由来ペルォキシダーゼは S i gma社製の試薬（R. Z. =2. 32)、および、大豆ペルォキシダ一ゼは S i gma社製の試薬（R. Z. = 1. 1 1) を使用した。また、各酵素のモル吸光係数は、 1. 02 X 10⁵mo 1 ^_1 dm³ c m^_1 (403 nm) とした。

また、本比較例並びに実施例 1の結果について、図— 1のように比較を行つた。表一 2

[実施例 2] 9. _Q°Gにおける熱安定性の検討

オレンジ I Iを基質とした退色反応において、 90°Cにおけるイネモミガラ由来ペルォキシダーゼの熱安定性について検討した。

100 Mオレンジ I I、および、 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを含む 0. 1M T r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) を 90でで

0分間から 1 50分間までプレインキュペートした。続いて、予め 80 に保つておいた日立製紫外可視分光光度計 U— 2010のセル内（光路 l cm) に該プレインキュベート液 l m Lを加え、予め 8 0 °Cにてプレインキュペートしておいた 1 . 5 mM過酸化水素水を l m L注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、オレンジ I Iの退色曲線から、プレインキュペート時間と速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表一 3に示した。

すなわち、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼが 9 0 °Cで高い耐熱性を示すことが判明した。表一 3

[比較例 2 ] 種々のペルォキシダーゼの 9 0 における熱安定性の検討オレンジ I Iを基質とした退色反応により、西洋ヮサビ由来ペルォキシダ一ゼ、大豆ペルォキシダーゼについて、 9 0 における熱安定性について検討した。また、コルプリヌスシネレウス由来ペルォキシダ一ゼについては、 9 0 °C では酵素が急速に失活してしまい、オレンジ I Iの退色反応が進行しなかったので、 5 0 °Cにおける熱安定性について検討した。

使用するペルォキシダ一ゼとして、比較例 1と同様にとして西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ、コルプリヌスシネレウス由来ペルォキシダーゼ、大豆ペルォキシダーゼを用いた以外は、実施例 2と同一の方法と条件（但し、コルプリヌスシネレウス由来ペルォキシダーゼの場合のみ、プレインキュベートおよび反応共に 5 O t}にて実施）にて測定を行い、プレインキュペート時間と速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表— 4に示した。表一 4

[実施例 3] 活性化剤（p—ョードフエノール）の添加効果

オレンジ I Iを基質とした退色反応において、活性化剤（p—ョードフエノール）共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼの温度と反応速度の関係について検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 2010のセル内（光路 1 cm) に、 100 Mオレンジ I I、 100 MP_ョ一ドフエノール、および、 680 riMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0.1 M T r i s— HC 1緩衝溶液

(pH9. 0) lmLを加え、各温度で 10分間プレインキュペートした後、予め同じ温度にてプレインキュペートしておいた 1. 5 mM過酸化水素水を 1 mL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、オレンジ I Iの退色曲線から、温度と速度定数 k_tの関係を求め、その結果を以下の表— 5に示した。また、本結果と実施例 1の結果（表— 1) より、 p—ョ一ドフエノールの添加効果について比較した（図— 2)。

すなわち、活性化剤（=P—ョードフエノール）の添加により、各温度で反応速度が 1. 3〜1. 5倍増大することが判明した。表一 5

[実施例 4 ] 各種色素の退色速度定数の比較

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる各種色素の退色反応について、活性化剤（p—ョードフエノール）の共存下 ·非共存下で検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 20 1 0のセル内（光路 1 cm) に、以下の表一 4に示した各種色素 1 00 M、および、 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0. 1 M T r i s— HC 1緩衝溶液（pH 9. 0) 1 mLを加え、 2 O で 1 0分間プレインキュベ一トした後、予め同じ温度にてプレインキュベートしておいた 1. 5 mM過酸化水素水を 1 mL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、各種色素の退色曲線から、速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表— 6に示した。尚、 p—.ョードフエノールを添加した場合は、 1 0 0 Mとなるように 0. 1M T r i s— HC 1緩衝溶液（p H9. 0) に添加した。

実験の結果、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの各種色素に対する退色効果が確認され、特に活性化剤の存在下で顕著であった。

表一 6

- p—ョードフエノール反応温度測定波長

添加なし（k_t) 添加あり（k_t) オレンジ I I 485. 0 nm 1. 52 2. 42 オレンジ I 48 1. 0 nm 1 2. 9 24. 3 オレンジ G 476. 0 nm 0. 060 3 0. 574 トロペオリン o 427. 8 nm 0. 0653 0. 2 ァリザリンイェロー R 3 72. 3 nm 0. 0434

ァリザリンレツド S 5 1 6. 0 nm 0. 39 5 70. 6 カルコン 6 35. 6 nm 34. 2 6 5。 5 [実施例 5 ] 各種活性化剤の添加効果の比較

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによるオレンジ I Iの退色反応について，各種活性化剤の添加効果について検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 20 10のセル内（光路 l cm) に、オレンジ I I 1 0 0 M、以下の表一 5に示した各種活性化剤 1 0 0 M、および、 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ、を含む 0. 1M T r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) ImLを加え、 20 °Cで 10分間プレインキュペートした後、予め同じ温度にてプレインキュべ一卜しておいた 1. 5mM過酸化水素水を ImL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、オレンジ I I の退色曲線から、速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表一 7に示した。

実験の結果、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I Iの退色反応における各種活性化剤の添加効果が確認された。表一 7

[実施例 6] 活性化剤（=P—ョ一ドフエノール）濃度の検討

イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I Iおよびオレンジ Gを基質とした退色反応において、活性化剤（P—ョードフエノール）濃度の影響について検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 2010のセル内（光路 1 cm) に、 100 Mオレンジ I I (またはオレンジ G)、以下の表— 8に示す濃度の p—ョードフエノール、および、 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0. 1 M T r i s -HC 1緩衝溶液（pH9. 0) ImLを加え、 20でで 1 0分間プレインキュベ一トした後、予め同じ温度にてプレインキュベ一トしておいた 1. 5 mM過酸化水素水を ImL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、オレンジ I Iの退色曲線から、 p—ョードフエノ一ル濃度と速度定数 k _tの関係を求め、その結果を以下の表— 8に示した。尚、オレンジ I Iは、 4 85 nmの吸光度変化を、オレンジ Gは、 476 n Mの吸光度変化をそれぞれ測定した。

その結果、種々の p—ョードフエノール濃度下でのィネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I I及びォレンジ Gの退色効果が確認された。表一 8

[実施例 7 ] 界面活性剤添加の影響

イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I Iを基質とした退色反応において、界面活性剤を添加した場合の影響について検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 20 10のセル内（光路 1 c m) に、 100 Mオレンジ I I、以: Fの表一 9に示す界面活性剤、および、 ϋ 0 nMのィネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0. 1M T r i s— H C I緩衝溶液

(pH 9. 0) ImLを加え、 20 または 60 で 10分間プレインキュべートした後、予め同じ温度にてプレインキュベ一トしておいた 1. 5mM過酸化水素水を ImL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、オレンジ I Iの退色曲線から速度定数 k _tを求め、その結果を以下の表一 9に示した。尚、各界面活性剤の添加量は、反応時の濃度が臨界ミセル濃度（CMC) の 1. 5倍濃度となるように調製した。

その結果、各種界面活性剤の存在下においても、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I Iの退色効果が確認された。表一 9

[実施例 8 ] モデル洗剤系での効果

モデル洗剤系でのイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるオレンジ I Iを基質とした退色効果について検討した。

日立製紫外可視分光光度計 U— 20 10のセル内（光路 l cm) に、 1 00 オレンジ I I、以下に示す組成のモデル洗剤成分、および、 680 nMのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼを含む 0.1M T r i s— H C I緩衝溶液 (pH 9. 0) lmLを加え、 20° (：、 40 、または 60 t:で 10分間プレィンキュベートした後、予め同じ温度にてプレインキュベートしておいた 1. 5mM過酸化水素水を lmL注入して反応を開始し、実施例 1と同様に、ォレンジ I Iの退色曲線から速度定数 k _tを求め、その結果を以下の表— 10に示した。

尚、モデル洗剤における各成分（終濃度）は以下のとおりである。

• ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) ； 8. 6mM

•炭酸ナトリウム； 2. 8 M

•亜硫酸ナトリウム； 1. 8mM •メタケイ酸ナトリウム； 4. 1 M

• EDTA； 59 M

•カルボキシメチルセルロース； 0. 0001 %

すなわち、モデル洗剤系での、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによるォレンジ I Iの退色効果が、各温度で確認された。表一 10

[実施例 9] 試験布への移染防止効果（1)

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について，才レンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。

衣生活研究会の実験用ナイロン白生地を容量比 1 ： 1のメタノール—水混合溶液中で水溶性成分を除去した後、風乾し、ついでベンゼンで油性成分を除去し、風乾した。以後、これを試験布（白布、以下同じ）として使用した。

試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにィネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM) と過酸化水素（790 M) を含む 5 OmMT r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 9. 5mLを加え、 20°Cにて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMオレンジ I I水溶液を 0. 5mL加え、 20 で 30分間反応 ¾行つた。反応後，取り出した試験布を風乾した。続いて、移染防止実験を行った後のオレンジ ΓΤの試験布への着色の度合いを表すために、ミノル夕製色彩色差計 CR— 300を用いて色差 (^E) を測定した。 '

尚、ここでいう色差（ E) とは、国際照明委員会（C I E) による感覚的表色法の色相、明度、彩度の 3属性ではなく色の感覚を定量的に表示するために定義している数値を示す。すなわち、色差（ 1E) のパラメ一夕である L、 a、 bを色差計を用いて測定し，以下に示す Hun t e rの色差式（数 2 ) より Eを算出することができる。

E=, i( L) ²+ {A a) ²+ {Ah) ²] ^1/2

L = L_n-L, A a 8· _n一 3· b

(式中、 L。、 a。、 b。は処理前の試験布の L、 a、 b値を示し、 L_w、 a_w、 b_wは処理後の試験布の L、 a、 b値を示す。）

また、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを添加しない系でも同様の検討を行った。さらに、上記の系に界面活性剤として、アルキルベンゼンスルホネート（LAS ：陰イオン界面活性剤）、または、ラウリン酸ナトリゥム（石けん）を終濃度がそれぞれ 7. 35mMまたは 10. ImMとなるように添加した場合についても検討を行った。以下の表一 1 1にそれぞれの試験区の結果をまとめた。

下記に示すとおり、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの添加により試験布へのオレンジ I Iの移染が防止された。また、 LAS、または、ラウリン酸ナトリゥムの存在下でも移染防止効果が確認された。表一 1 1

[実施例 10 ] 試験布への移染防止効果（ 2 )

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果に及ぼす pHの影響について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。関西衣生活研究会のナイロン布（6ナイロン）を容量比 1 ： 1のメタノール一水混合溶液中で水溶性成分を除去した後、風乾した。ついでベンゼンで油性成分を除去し、風乾した後に、試験布（白布、以下同じ）とした。試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにィネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼ（360 nM)、過酸化水素（790 M)水溶液 9. 5mL、または、過酸化水素（790 zM) を含む 5 OmMT r i s 一 H C I緩衝溶液（pH9. 0) 9. 5mL、または、過酸化水素（790 M M) を含む C a rmo d y緩衝溶液（pH 10. 0) 9. 5mL、を加え、 2 0°Cにて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMオレンジ I I水溶液を 0. 5mL加え、 20でにて 30分間反応を行った。

反応後，取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ E) を測定した結果、以下の表— 12のようになった。尚、比較例として、 S D S、または、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼを添加しない系でも同様の検討を行つた。

その結果、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼの添加により試験布へのォレンジ I Iの移染が防止された。また、 pHの影響は見出されなかった。

2

[実施例 11] 試験布への移染防止効果（3)

S D S共存下でのィネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。実施例 9で調製した試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM)、ドデシル硫酸ナトリウム（S D S ： 9. OmM)、過酸化水素（790 M) を含む 50 mMT r i s— HC 1緩衝溶液（pH 9. 0) 9. 5mLを加え、 20°C、または、 60°Cにて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMオレンジ I I 水溶液を 0. 5mL加え、 20°C、または、 60°Cにて 30分間反応を行った。反応後，取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ 1E) を測定した結果、以下の表一 1 3のようになった。尚、比較例として、 SDS、または、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼを添加しない系でも同様の検討を行つた。

その結果、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼの添加により試験布へのォレンジ I Iの移染が防止された。また、 S D Sの共存下では、移染防止の相乗効果が確認された。表一 1 3

[実施例 1 2] 試験布への移染防止効果（4)

B r i j 35の共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。

実施例 9で調製した試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼ（36 0 nM)、 B r i j 3 5 ( 9 5 M)、過酸化水素（7 9 0 M) を含む 5 OmMT r i s— HC 1 緩衝溶液（pH9. 0) 9. 5mLを加え、 20=0、または、 60°Cにて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMオレンジ I I水溶液を 0. 5mLカロえ、 20° (：、または、 60 にて 30分間反応を行った。

反応後，取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ E) を測定した結果、以下の表一 14のようになった。尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼを添加しない系でも同様の検討を行った。

すなわち、 B r i j 35の共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布へのオレンジ I Iの移染防止効果が確認された。表一 14

[実施例 1 3 ] 試験布への移染防止効果（ 5 )

過炭酸ナトリウムの共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。

実施例 10で調製した試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM)、過炭酸ナトリウム（105mM) または過酸化水素（790 M) を含む 5 OmMT r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 9. 5mLを加え、 20°C、または、 4 0 にて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMオレンジ I I水溶液を 0. 5mL加え、 20 、または、 40 にて 30分間反応を行った。

反応後、取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ IE) を測定した結果、以下の表一 1 5のようになった。尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ^-ゼを添加しない系でも同様の検討を行った。

すなわち、過炭酸ナトリゥムの共存下でのィネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布へのオレンジ I Iの移染防止効果が確認された。表一 1 5

[実施例 1 4 ] モデル洗剤系での移染防止効果（ 1 )

モデル洗剤成分共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。

実施例 9で調製した試験布 0 . 2 gをバイアル瓶に入 l、最終の浴比が 1 ： 5 0となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（3 6 0 n M)、過酸化水素（7 9 0 Μ) とモデル洗剤成分（組成と終濃度は実施例 8と同じ）を混合した水 9 . 5 m Lを加え、 2 0 にて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に I mMオレンジ I I水溶液を 0 . 5 m L加え、 2 0 °Cにて 3 0分間反応を行つた。

反応後、取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差を測定した結果、以下の表— 1 6ようになった。尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼおよびモデル洗剤成分を添加しない系（単純な水系）でも同様の検討を行った。 - すなわち、モデル洗剤成分共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによる試験布へのオレンジ I Iの移染防止効果が確認された。表一 16

[実施例 1 5 ] モデル洗剤系での移染防止効果（ 2 )

漂白活性化剤を含有するモデル洗剤成分共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とした系にて検討した。

実施例 10で調製した試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼ（360 nM)、過炭酸ナトリウム（105mM)、モデル洗剤成分（組成と終濃度は実施例 8と同じ）、および、漂白活性化剤（ノナノィルォキシベンゼンスルホナート ·ナトリウム塩、または、ドデカノィルォキシベンゼンスルホナート ·ナトリウム塩、または、 4ーデカノィルォキシ安息香酸；濃度は各 52mM) を混合した水 9. 5 m Lを加え、 20°Cにて撹拌を開始した。つぎに、バイアル瓶に ImMオレンジ I I水溶液を 0. 5mL加え、 20°Cにて 30分間反応を行った。

反応後、取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ 1E) を測定した結果、以下の表一 1 7ようになった。すなわち、漂白活性化剤共存下でのイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布へのオレンジ I Iの移染防止効果が確認された。表一 17

[実施例 16 ] 試験布への移染防止効果（ 6 ) イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、反応性染料シバクロンブルー F 3 G-A(C. I. Reactive Blue 2:Fluka Bioceika 社より購入）をモデル繊維染料とした系にて検討した。

(社）日本油化学会指定の洗浄試験用綿布（晒金巾 2023) を容量比 1 ： 1のメタノール一水混合溶液中で水溶性成分を除去した後、風乾し、ついでべンゼンで油性成分を除去し、風乾した。以後、これを試験布として使用した。実施例 1 0で調製したナイロン試験布 0. 2 g、または、上記の綿試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM)、 p—ョードフエノール（52 M)、過炭酸ナトリウム（105 mM) または過酸化水素（ 790 μ M) を含む 50 mM T r i s -HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 9. 5mLを加え、 20°C、または、 40°Cにて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMシバクロンブル一 F 3 G— A水溶液を 0. 5mL加え、 20X、または、 40 にて 30分間反応を行つた。

反応後、取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ E) を測定した結果、以下の表一 18および表一 1 9のようになった。

尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼを添加しない系、過炭酸ナトリウムを添加しない系、 5 OmMT r i s -HC 1緩衝溶液の変わりに水を用いた系でも同様の検討を行った。

表— 18 ナイロン試験布での結果

イネモミガラ由来 Tris

過酸化水素源温度色差（ E) ペルォキシダ一ゼ緩衝液

無添加無添加不使用（水） 20°C 10. 31 無添加無添加使用同上 10. 41 無添加過灰 E¾ 使用同上 2. 84

ナトリウム

添加過酸化水素使用同上 1. 10 添加過灰酸使用同上 1。 38

ナトリウム

無添加無添加不使用（水） 40。C 17. 38 無添加無添加使用同上 13. 79 添加過酸化水素使用同上 4. 01 表一 1 9 綿試験布での結果

[実施例 1 7 ] 試験布への移染防止効果（ 7 )

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる試験布への移染防止効果に及ぼす pHの影響について、反応性染料シバクロンブルー F 3 G— Aをモデル繊維染料とした系にて検討した。

実施例 1 0で調製したナイロン試験布 0. 2 g、または、実施例 1 6で調製した綿試験布 0. 2 gをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が 1 ： 50となるようにイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ ( 3 6 0 ηΜ)、 ρ—ョードフエノール（ 5 0 M)、過酸化水素（7 90 を含む C a rmo d y緩衝液（pH 1 0.

0) 9. 5mLを加え、 20t、または、 40 にて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に ImMシバクロンブルー F 3 G— A水溶液を 0. 5mL加え、 2 0°Cまたは、 40 にて 30分間反応を行った。

反応後、取り出した試験布を風乾し、実施例 9と同様に色差（ E) を測定した結果、以下の表一 20のようになった。

尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを添加しない系でも同様の検討を行った。表一 2 0

[実施例 1 8 ] 染色布の色落作用（ 1 )

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布の色落作用について、ォレンジ I Iをモデル繊維染料とし、洗浄温度を 2 0°Cとした場合について、検討した。

衣生活研究会の実験用ナイロン布をオレンジ I I 2 % (対繊維重量）、酢酸 1 0 % (対繊維重量）、無水硫酸ナトリウム 1 0 % (対繊維重量）を含み、かつ、浴比が 1 ： 5 0の水溶液中に入れ、該水溶液を室温から 1 5分間で 9 0°Cに昇温した。その後 1 5分間染色処理し、水洗後風乾し、染色布（原布）とした。バイアル瓶に過酸化水素（終濃度で 7 5 0 ιιΜ), および、以下の表一 2 1に示す成分を含む水溶液 1 0. OmLを加え、 2 0°Cにて撹拌を開始した。つぎに、染色布 0. 2 g (最終の浴比が 1 : 5 0) を入れ、 2 0 で攪拌を続けた。 3 0分後、染色布を取り出し、原布に対する色差（ 1E) を実施例 9と同様に測定した。その結果を以下の表一 2 1にまとめた。

すなわち、 2 0 において、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼは、染色布対する色落ち作用を示さなかった。表一 2

[実施例 1 9] 染色布の色落ち作用（2)

イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによる染色布の色落作用について、ォレンジ I Iをモデル繊維染料とし、洗浄温度を 60 とした場合について、検討した。

バイアル瓶に過酸化水素（終濃度で 750 , Μ), および、以下の表一 22に示す成分を含む水溶液 10. OmLを加え、 60 にて撹拌を開始した。つぎに、実施例 1 8で調製した染色布 0. 2 g (最終の浴比が 1 ： 50) を入れ、 60 で攪拌を続けた。 30分後、染色布を取り出し、原布に対する色差（ 1 E) を実施例 9と同様に測定した。その結果を以下の表一 22にまとめた。実験の結果、 60 では、 SDS及ぴ T r i s— HC 1緩衝剤による染色布に対する色落ち作用が示されたが、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを添加しても、染色布に対する色落ち作用は増幅されなかった。表一 22

[実施例 20] 染色布から白色布への移染防止作用（1)

イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布から白色布への移染防止作用について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とし、洗浄温度を 20 とした場合について検討した。

バイアル瓶にイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM；)、過炭酸ナトリウム（1 05 mM) または過酸化水素（ 790 M) を含む 50 mMT r i s 一 HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 20. OmLを加え、 20 にて撹拌を開始した。つぎに、実施例 18で調製した染色布 0. 2 g (最終の浴比が 1 ： 50)、並びに、実施例 10で調製した試験布（白布） 0. 2 gを入れ、 20Tで攪拌を続けた。 30分後、染色布および試験布を取り出し、それぞれの原布に対する色差（ Ε) を実施例 9と同様に測定した。尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを添加しない系、過炭酸ナトリゥムを添加しない系、 5 OmM T r i s—HC 1緩衝溶液の変わりに水を用いた系でも同様の検討を行った。その結果を以下の表— 23、および、表一 24にまとめた。すなわち、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布から白色布への移染防止作用が確認された。表一 23 染色布の変退色（退色した色差）

表一 24 白布の変色（着色した色差）

[実施例 2 1] 染色布から白色布への移染防止作用（2)

漂白活性化剤の共存下において、イネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布から白色布への移染防止作用について、オレンジ I Iをモデル繊維染料とし、洗浄温度を 20°Cとした塲合について検討した。

バイアル瓶にイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（360 nM)、過炭酸ナトリウム（105mM)、漂—白活性化剤（ノナノィルォキシベンゼンスルホナート · ナトリウム塩、または、ドデカノィルォキシベンゼンスルホナ一ト ·ナトリウム塩、または、 4—デカノィルォキシ安息香酸；濃度は各 52mM) を含む 50m MT r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 20. OmLを加え、 20°Cにて撹拌を開始した。つぎに、実施例 18で調製した染色布 0. 2 g (最終の浴比が 1 ： 50)、並びに、実施例 1 0で調製した試験布（白布） 0. 2 gを入れ、 20°C で攪拌を続けた。 30分後、染色布および試験布を取り出し、それぞれの原布に対する色差（ 1E) を実施例 9と同様に測定した。

その結果を以下の表一 25、および、表— 26にまとめた。すなわち、漂白活性化剤の共存下におけるイネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布から白色布への移染防止作用が確認された。表一 25 染色布の変退色（退色した色差）

[実施例 22 ] 染色布から白色布への移染防止作用（ 3 )

ィネモミガラ由来ペルォキシダーゼによる染色布から白色布への移染防止作用について、反応性染料シバクロンブル一 F 3 G— Aをモデル繊維染料とし、洗浄温度を 20 °Cとした場合について検討した。

シパクロンブル一 F3 G— A (対繊維重量の 2%)、無水硫酸ナトリウム（6 0 g/L) を含む水溶液中に、（社）日本油化学会指定の洗浄試験用綿布（晒金巾 2023) を浴比が 1 ： 30となるように入れ、該水溶液を室温から 5分間で 40°Cに昇温した。 25分間染色処理した後、綿布を取り出し、軽く脱液した。残った染色水溶液中に炭酸ナトリウムを 60 g/Lの濃度になるように加え、再度綿布を入れて、 20分で 75°Cから 80 に昇温後、 30分間染色した。綿布を再び取り出し、水洗後風乾し、染色布（原布）とした。

バイアル瓶にイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ（ 3 6 0 nM)、 p—ョ一ドフエノール（52 M)、過炭酸ナトリウム（1 0 5mM) または過酸化水素

(7 90 //M) を含む 5 OmMT r i s— HC 1緩衝溶液（pH9. 0) 3 0. OmLを加え、 2 0°Cにて撹拌を開始した。つぎに、調製した染色布 0. 2 g

(最終の浴比が 1 : 50).、および、実施例 1 0で調製したナイロン試験布（白布） 0. 2 g、および、実施例 1 6で調製した綿試験布（白布） 0. 2 gを入れ、 20°Cで攪拌を続けた。 3 0分後、染色布および試験布を取り出し、それぞれの原布に対する色差を実施例 9と同様に測定した。尚、比較例として、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼを添加しない系、過炭酸ナトリウムを添加しない系、 5 0mMT r i s— H C 1緩衝溶液の変わりに水または C a rmo d y緩衝液（pH 1 0. 0) を用いた系でも同様の検討を行った。

その結果を以下の表— 27、表— 28、および、表— 2 9にまとめた。すなわち、反応性染料においても、イネモミガラ由来ペルォキシダ一ゼによる染色布から白色布への移染防止作用が確認された。表一 2 7 染色布の変退色（退色した色差）

イネモミガラ由来

過炭酸水素源緩衝液の種類色差（ E) ペルォキシダ一ゼ

無添加無添加不使用（水） 2. 9 1 無添加無添加 Carmody緩衝液 2. 9 5 添加過酸化水素 Carmody緩衝液 2. 78 無添加無添加 Tris緩衝液 3. 36 添加過酸化水素 Tris緩衝液 3. 67

過炭酸

無添加 Tris緩衝液 2. 9 1

ナトリウム

過灰酸

添加 Tris緩衝液 2. 9 3

ナトリウム表一 2 8 ナイロン白布の変色（着色した色差）

表一 2 9 綿白布の変色（着色した色差）

産業上の利用可能性本発明に係るイネ由来ペルォキシダ一ゼ（より具体的にはイネモミガラ由来ペルォキシダーゼ) は高温での反応性並びに安定性に優れている。よって、本発明によりイネ由来ペルォキシダーゼを用いることにより、洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯および Zまたはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法（染料移動阻止方法）が提供される。また、本発明によりイネ由来ペルォキシダーゼを用いて溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法が提供きれる。

更に本発明によりイネ由来ペルォキシダ一ゼを用いた溶液中の着色物質（染料など）の分解（脱色 ·漂白）用組成物が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . 洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯およびまたはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、該洗液に過酸化水素の存在下でイネ由来ペルォキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。

2 . 溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に過酸化水素の.存在下でイネ由来ペルォキシダ一ゼを作用させることを特徴とする方法。

3 . イネ由来ペルォキシダーゼが、耐熱性のイネ由来'ペルォキシダーゼであることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項のいずれか 1項に記載の方法。

4 . イネ由来ペルォキシダ一ゼが、イネモミガラ由来のペルォキシダーゼであることを特徴とする請求の範囲第 1項から第 3項のいずれか 1項に記載の方法。

5 . 過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載の方法。

6 . 過酸化水素前駆体が過ホウ酸塩または過炭酸塩である請求の範囲第 5項に記載の方法。

7 . 活性化剤の存在下において実施することを特徴とする請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 界面活性剤の存在下において実施することを特徴とする請求の範囲第 1 項から第 7項のいずれか 1項に記載の方法。

9 . 繊維染料が合成染料、天然染料又は天然同一性染料、反応性染料である請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか 1項に記載の方法。

1 0 . イネ由来ペルォキシダーゼを含んでいる組成物。

1 1 . 洗剤組成物もしくは漂白剤組成物であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の組成物。

1 2 . 過酸化水素、一種類以上の過酸化水素前駆体、および、過酸化水素を発生せしめることのできる一種類以上の酵素系のうちの少なくともどれか一つを含んでいる ζとを特徴とする請求の範囲第 1 0または第 1 1項のいずれか一項に記載の組成物。

1 3 . イネ由来ペルォキシダーゼ、過酸化水素前駆体、および、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる一種類以上の漂白活性化剤を含んでいることを特徴とする組成物。

1 4 . 一種類以上の界面活性剤、もしくは、一種類以上の活性化剤を共に含んでいることを特徴とする請求の範囲第 1 0項から第 1 3項のいずれかに一項に記載の組成物。