DE68928203T2

DE68928203T2 - Rekombinante dns-moleküle, wirte und dem menschlichen somatomedin-trägerprotein ähnliche polypeptide

Info

Publication number: DE68928203T2
Application number: DE68928203T
Authority: DE
Inventors: Emerald Spencer; Carol Talkington-Verser
Original assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1988-12-22
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2009-12-22
Also published as: GR3025094T3; KR910700261A; AU4836890A; IL92816A0; WO1990006950A1; EP0375438A2; EP0375438A3; ATE155793T1; ES2107422T3; ZA899832B; EP0451194B1; CA2006322A1; EP0451194A1; EP0451194A4; JPH11236400A; CA2006322C; DK95291A; DK95291D0; JPH04503352A; HK1000826A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche Somatomedin-Trägerprotein-Untereinheiten und Verfahren zu deren Herstellung. Im speziellen betrifft die vorliegende Erfindung Trägerprotein-Untereinheiten, die sich an menschliche somatomedinartige Polypeptide binden, die auch als insulinartige Wachstumsfaktoren bekannt sind. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung im wesentlichen reine menschliche Somatomedin-Trägerprotein-Untereinheiten. Die Trägerprotein-Untereinheiten und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können bei einer Vielzahl therapeutischer, diagnostischer oder anderer nützlicher Anwendungen zum Einsatz kommen.
Ebenfalls beschrieben werden DNA-Moleküle, die für menschliche trägerproteinartige Polypeptide kodieren, rekombinante DNA-Moleküle, mit derartigen Molekülen transformierte Wirte, Verfahren zur Herstellung von menschlichen somatomedin-trägerproteinartigen Polypeptiden und menschliche somatomedin-trägerproteinartige Polypeptide, die unter Einsatz dieser Moleküle, Wirte und Verfahren hergestellt werden. Im speziellen können die obengenannten DNA-Moleküle in geeigneten Wirten exprimiert werden. Die rekombinanten DNA-Moleküle enthalten DNA-Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die biologische Wirkung auf das menschliche Trägerprotein ausüben. Wie aus der nachstehenden Offenbarung hervorgeht, können die DNA-Moleküle, rekombinanten DNA-Moleküle, Wirte und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden eingesetzt werden, die bei einer Vielzahl therapeutischer, diagnostischer und anderer nützlicher Anwendungen nützlich sind.
Somatomedine (die manchmal auch als "SMs" bezeichnet werden) sind Hormone mit nützlichen biologischen Eigenschaften. SMs sind Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 7.500 Dalton. SMs (a) vermitteln die wachstumsfördernden Wirkungen von Wachstumshormon (manchmal auch als "GH" bezeichnet), (b) haben schwache insulinartige Aktivität (und werden aus diesem Grund auch als "insulinartige Wachstumsfaktoren" oder "IGFs" bezeichnet), (c) sind für eine Vielzahl von Skelett- und anderen Geweben mitogen und (d) werden im Plasma an ein großes Trägerprotein gebunden transportiert. Es gibt beim Menschen zwei SM-Zusammensetzungen. SM-C ist ein basisches Polypeptid und wird manchmal als SM-C bezeichnet. SM-C vermittelt die wachstumsfördernden Wirkungen von GH nach der Geburt. SM-A ist ein Gemisch aus hauptsächlich einem Polypeptid, das als IGF-II bekannt ist, sowie variierenden Mengen einer modifizierten Form von SM-C. Spencer, E.M. et al., "The Identity of Human Insulin-like Growth Factors I and II With Somatomedins C and A With Rat SM I and II" in "Insulin-like Growth Factors/Somatomedins"; Hrsg.: Spencer E.M. (Walter de Gruyter 1983). IGF-II ist weniger von GH abhängig und spielt möglicherweise eine Rolle beim fötalen Wachstum.
SMs können in vivo nützlich sein, um Knochenbildung (beispielsweise bei der Behandlung von Osteoporose), Wundheilung und das Wachstum von Tieren und Menschen mit GH-Defizienz zu stimulieren. Die Serumspiegel von SM-C werden gemessen, um Akromegalie, hypophysären Gigantismus, GH-Defizienz und andere das Wachstum betreffende Leiden zu diagnostizieren. Spencer, E.M. "Somatomedins" in Basic and Clinical Endocrinology", Hrsg.: Greenspan F.S. und Forsham, P.H. (1986), S.89, Appleton- Century-Crofts. SMs werden auch eingesetzt, um in vitro die Vermehrung einer Vielzahl von Zellen in Gewebekultur zu stimulieren und eignen sich daher zur Untersuchung der Regulierung von normalem und anormalem Zeiwachstum. SMs, die von bestimmten Brust- und Nierenkrebszellen erzeugt werden, können die Vermehrung von sowohl Krebszellen als auch Gefäß- und Fasergewebe stimulieren, die erforderlich ist, um das Wachstum der Krebsgewebe zu unterstützen. Spencer, E.M. et al., "Possible Auto-stimulation of Human Mammary Carcinoma Growth by Somatomedins", "Annals of the N.Y. Acad. Sci." 464, S.448 (1986); K.K. Huff et al., "Secretion of Insulin-like Growth Factor-I-related Protein by Human Breast Cancer Cells", Cancer Research 46, S. 4613-4619 (1986). Ein Blockieren der Wirkung von SMs kann dazu dienen, das Wachstum dieser Krebsarten einzudämmen.
Menschliche SMs scheinen in vivo von anderen Proteinen transportiert und reguliert zu werden. R.L Hintz et al., "Demonstration of Specific Plasma Protein Binding Sites for Somatomedin", J. Clin. Endocrinol. Metab. 45, S.988 (1977). Diese Proteine binden sich offenbar an die SMs und steuern die biologische Wirkung der SMs in vivo. Gelfiltration von menschlichem Serum bei neutralem pH hat gezeigt, daß 95% der immunreaktiven SM-C-Aktivität und wahrscheinlich der IGF-II-Aktivität bei etwa 1 50.000 bis 160.000 Dalton (150-160 Kilodalton oder "kDa") eluieren, wobei eine geringere Menge im Bereich von 35-50 kDa eluiert. Nur eine sehr geringe Menge an immunreaktiver Aktivität eluiert bei 7,5 kDa, wo freie SMs auftreten sollten. G.L. Smith, "Molecular and Cellular Endocrinology" 34, S.83-89 (1984). Dies weist darauf hin, daß SMs im Plasma mit größeren Proteinen komplexiert werden.
Von zumindest zwei verschiedenen Klassen von Proteinen oder Proteinkomplexen in menschlichem Plasma wurde berichtet, daß sie SMs binden. S.L. Drop et al., "Immunoassay of a Somatomedin-binding Protein from Human Amniotic Fluid; Levels in Fetal, Neonatal, and Adult Sera", J. Clin. Endocrinol. Metab. 59, S.908 (1984); J.R. Wilkins et al., "Affinity-labeled Plasma Somatomedin-C+/Insulin-like Growth Factor I Binding Proteins", J. Clin. Invest. 75, S.1350 (1985). Diese Beschreibung bezeichnet eine Klasse dieser nativen Proteine oder Proteinkomplexe als SM-"Trägerprotein", da seine Funktion im Transport von SMs zu bestehen scheint. Dieser Begriff soll nicht darauf hinweisen, daß das Trägerprotein ein einzelnes Protein ist. Es kann sich auch um mehrere Trägerproteine oder um einen Proteinkomplex handeln. Diese Beschreibung bezeichnet die andere Klasse als "Fruchtwasser-Bindeprotein" oder "AFBP". Es kann sich auch um mehr als ein AFBP handeln. Es ist auch möglich, daß weitere Klassen von Proteinen oder Proteinkomplexen entdeckt werden, die SMs binden.
Trägerproteinaktivität, wie z.B. SM-C-Aktivität, ist GH-abhängig, bei Personen mit GH- Defizienz schwach und bei Patienten mit GH-produzierenden Tumoren, einem als Akromegalie bekannten Zustand, erhöht. R.M. White et al., "The Growth Hormone Dependence of Somatomedin-binding Protein in Human Serum", J. Clin. Endocrinol. Metab. 53, S.49 (1981). Das Trägerprotein weist biologische Eigenschaften auf, die auf nützliche Verwendungsmöglichkeiten hinweisen. Es wird berichtet, daß, wenn sich SMs an Trägerprotein binden, die Halbwertszeit der SMs je nach getesteter Tierart von etwa 1 h auf etwa 24 h ansteigt (K.L. Cohen et al., "The Serum Half-life of Somatomedin Activity: Evidence for Growth Hormone Dependence" Acta Endocrinol. 83, S.243 (1 976)) und die SMs bis zur Freisetzung inaktiviert werden. Untersuchungen an anderen Modellsystemen weisen darauf hin, daß verunreinigte Präparate, die das Trägerprotein enthalten, (a) die metabolische Wirkung der SMs auf das durchströmte Rattenherz beenden (C. Meuli et al., "NSILA-carrier Protein Abolishes the Action of Nonsuppressible Insulin-like Activity (NSILA-s) on Perfused Rat Heart", Diabetologia 13, S.255 (1978)), (b) die mitogene Wirkung der SMs auf Zellen in Kultur hemmen (D.J. Knauer, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 77, S.7252-7256 (1980) und A.D. Kuffer et al., "Partial Purification of a Specific Inhibitor of the Insulin-like Growth Factors by Reversed Phase High- performance Liquid Chromatography" J. of Chromatography 336, S.87-92 (1984)) und (c) die insulinartige Aktivität von SMs auf Ratten-Fettgewebe blockieren (J. Zapf et al., "Inhibition of the Action of Nonsuppressible Insulin-like Acitivity on Isolated Rat Cells by Binding to its Carrier Protein" J. Clin. Invest. 63, S.1077 (1979). Teilweise reine Präparate des Trägerproteins wurden mit radiomarkierten SMs in der Forschung eingesetzt, um kompetitive Bindungsassays zum Messen der SMs durchzuführen. A.C. Moses et al., Endocrinology 104, S.536 (1979).
Aufgrund ihrer wertvollen biologischen Eigenschaften wurden viele Bemühungen unternommen, das Trägerprotein oder die Untereinheiten des Trägerproteins, die für diese Aktivität verantwortlich sind, zu isolieren und zu charakterisieren. Frühere Versuche, das Trägerprotein oder seine aktiven Untereinheiten in reiner Form zu isolieren und zu charakterisieren, sind fehlgeschlagen. Das ist teilweise auf die niedrige Konzentration an Trägerprotein in Plasma zurückzuführen. Bei einem erfolgreichen Reinigungsverfahren mußten auch die Probleme des Aktivitätsverlusts aufgrund von enzymatischem Aufschluß und Instabilität des Trägerproteins, insbesondere bei Änderungen des pH-Werts, gelöst werden. Die Reinigung der Trägerprotein-Untereinheiten wird weiters durch das Vorhandensein des AFBP im Plasma kompliziert, das sich ebenfalls an Somatomedine bindet.
Das Trägerprotein ist ein Glykoprotein. In Serum mit neutralem pH ist es mit SMs verbunden, und der Komplex hat ein Molekulargewicht von etwa 150-160 kDa, gemessen mittels Gelfiltration. Das Molekulargewicht des Trägerproteinkomplexes bei neutralem pH wurde auch nach anderen Verfahren mit etwa 135 kDa bestimmt. Es wurde berichtet, daß Gelfiltrationschromatographie von Serum oder Plasma unter sauren Bedingungen gebundene SMs vom Trägerprotein trennt und eine Einheit des Trägerproteins liefert, die ein Molekulargewicht von etwa 40-50 kDa aufweist. Diese Einheit bindet sich auch an Somatomedine. R.L. Hintz et al., "Demonstration of Specific Plasma Protein Binding Sites for Somatomedin", J. Clin. Endocrinol. Metab. 45, S.988 (1977). Da die säurestabile Einheit mit 40-50 kDa nicht dazu gebracht werden kann, erneut den Trägerproteinkomplex mit 150-160 kDa zu bilden, haben andere Autoren vermutet, daß das Trägerprotein möglicherweise auch teilweise aus einer säurelabilen Einheit besteht, die sich selbst nicht an Somatomedine bindet. A. C. Moses et al., Endocrinology 104, S.536 (1979). Furlanetto berichtet von der Behandlung von Serum mit einer 35-55%- igen Ammoniumsulfatlösung, Isolieren des Präzipitats, Lösen des Präzipitats in 0,05 M Tris, pH 8,20, und Chromatographieren auf DEAE-Sephadex A-50 mit Tris-Puffern. R.W. Furlanetto, "The Somatomedin C Binding Protein: Evidence for a Heterologous Subunit Structure", J. Clin. Endocrinol. Metab. 51, S.12 (1980). Furlanetto offenbart keine weitere Reinigung. Stattdessen führte Furlanetto Versuche an verschiedenen Fraktionen durch, um seine Ansicht zu bestätigen, daß die Somatomedin-C-Bindungsaktivität in Serum aus zumindest zwei Einheiten besteht, wovon eine einen Stokes-Radius von 36 Å aufweist und SM-C bindet (die sogenannte säurestabile Einheit) und die andere einen Stokes-Radius von 30-38 Å aufweist und SM-C nicht bindet (die sogenannte säurelabile Einheit).
Wilkins identifizierte durch Affinitätsmarkierung Plasmaproteine, die mit SM-C Komplexe bildeten. J.R. Wilkins et al., "Affinity-labeled Plasma Somatomedin-C/Insulin-like Growth Factor I Binding Proteins", J. Clin. Invest. 75, S.1350 (1985). ¹²&sup5;I-SM-C war kovalent mit Proteinen vernetzt, die SM-C in Vollplasma- und in Sephadex G-200- Plasma-Fraktionen banden. Nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Autoradiographie wurde zusätzlich zu Spezies mit etwa 160, 110, 80, 50 und 25 kDa das AFBP identifziert. Wilkins et al. stellten die Hypothese auf, daß der Trägerproteinkomplex mit 160 kDa aus 6 Untereinheitskomplexen mit etwa 25 kDa (24-28 kDa) bestand, die jeweils aus der Untereinheit plus SM-C bestanden. Wilkins et al. berichten jedoch nicht von der Isolierung oder Reinigung dieser Untereinheit mit 25 kDa. Ein weiterer Autor stellte eine etwas größere Untereinheitsstruktur vor, identifizierte sie aber nicht. W.H. Daughaday et al., "Characterization of Somatomedin Binding in Human Serum by Ultracentrifugation and Gel Filtration", J. Clin. Endocrinol. Metab. 55, S.916 (1982).
Mehrere Forscher berichteten von erfolglosen Versuchen, die säurestabile Trägerproteineinheit mit 40-50 kDa aus menschlichem Plasma zu isolieren. Draznin et al. berichten von einem Material, das nur 1% SM-Bindungsaktivität enthält und offenbaren nicht, ob dieses Material von Trägerprotein oder AFBP stammt. B. Draznin et al., "Somatomedins and Growth", Hrsg.: G. Giordano et al. (Academic Press 1979), S.149-160. Fryklund et al. fraktionierten gefrorenes menschliches Plasma durch Polyethylenglykol-Ausfällung, Carboxymethyl-Sephadex-Chromatographie und Gelfiltration. L. Fryklund et al., "Hormones and Cell Culture" Hrsg.: G.H. Sato et al. (Cold Spring Harbor Laboratory 1979), S.49-59. Fryklund et al. meinten, daß das Trägerprotein aus 2 unterschiedlichen Ketten mit 35 und 45 kDa bestand. Fryklund et al. offenbarten, daß Glycin durch N-terminale Molekülanalyse freigesetzt wurde, identifizierten aber nicht, von welcher Kette es stammte oder ob beide in Glycin endeten. Die berichtete Bindungsaktivität des Präparats von Fryklund et al. war sehr gering, und die Reinheit wurde nicht angesprochen. Fryklund et al. stellten nicht fest, ob das Trägerprotein oder das AFBP in ihrem Präparat vorhanden war.
Keine der obigen Untersuchungen offenbart eine Klasse menschlicher Trägerprotein- Untereinheiten, die zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden befähigt sind. Außerdem offenbart keine dieser Untersuchungen irgendwelche Untereinheiten des Trägerproteins, die fähig sind, SMs zu binden, und bis zur Homogenität gereinigt sind.
Reinheit ist erforderlich, um festzustellen, ob anstelle des AFBP oder einer Verunreinigung das Trägerprotein isoliert wurde, und um die biologische Aktivität zu untersuchen. Ein verunreinigtes Präparat kann Enzyme enthalten, die bewirken, daß das Produkt instabil ist und leicht abgebaut oder denaturiert wird. Verunreinigte Präparate können auch nicht für Tiere und Menschen verwendet werden, weil viele im ursprünglichen Serum enthaltene oder als Ergebnis des Reinigungsverfahrens erzeugte Verunreinigungen antigen sind und unerwünschte biologische Wirkungen hervorrufen könnten. Beispielsweise erfordert die Anwendung bei Menschen mit Osteoporose das Entfernen aller Verunreinigungen, die antigen sein oder negative biologische Wirkungen haben können.
Andere Forscher haben ein anderes Protein isoliert, das zur Bindung von SMs fähig ist und aus menschlichem Fruchtwasser aus dem mittleren Zeitraum der Schwangerschaft erhalten wird, wobei das Fruchtwasser Protein oder "AFBP" bindet. Das AFBP ist nicht das Trägerprotein oder eine Untereinheit des Trägerproteins Wilkins, J.R. et al., "Affinity-labeled Plasma Somatomedin-C/Insulin-like Growth Factor I Bindung Proteins", J. Clin. Invest. 75, S.1350 (1985). Das AFBP (a) ist kleiner als die sogenannte säurestabile Einheit des Trägerproteins und weist ein Molekulargewicht im Bereich von 32-40 kDa auf, (b) ist nicht glykosyliert, (c) unterscheidet sich in seinem berichteten N-terminalen Molekül von Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung (G. Povoa et al., "Isolation and Characterization of a Somatomedin-binding Protein from Mid-term Human Amniotic Fluid" Eur. J. Biochem. 144, S.199-204 (1984)), und (d) hat andere immunologische Eigenschaften. S.L.S. Drop et al., "Immunoassay of a Somatomedin-Binding Protein from Human Amniotic Fluid: Levels in Fetal, Neonatal and Adult Sera", J. Clin. Endocrinol. Metab. 59, S.908 (1984); J.L. Martin et al., siehe oben, J. Clin. Endocrinol. Metab. 61, S.799-801 (1985). Antiseren gegen das AFBP zeigen keine Kreuzreaktion mit dem Trägerprotein mit 150 kDa oder seiner säurestabilen Einheit. Drop et al. berichten, daß festgestellt wurde, daß die durch Radioimmunoassay (RIA) ermittelten AFBP-Mengen während Säuglingsalter und Kindheit - im Gegensatz zum Trägerprotein - abnehmen, und auch, anders als Trägerprotein, am Tag beträchtliche Schwankungen zeigen. Enberg hat ebenfalls das AFBP aus menschlichem Plasma von Erwachsenen mittels vier Chromatographieschritten isoliert: CM-Affigel blue, Hydroxylapatit, Fast protein-Flüssigchromatographie-Gelpermeation und Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC")-Hydroxylapatit. G. Enberg, "Purification of a High Molecular Weight Somatomedin Binding Protein from Human Plasma", Biochem. and Biophys. Res. Commun. 135, S.178-82 (1986). Enberg berichtet von einem Molekül mit dem "möglichen" N-Terminus Ala-Pro-Trp-, was zeigt, daß das AFBP isoliert wurde, und nicht das Trägerprotein mit 150 kDa, wie Enberg fälschlich geschlossen hatte.
Proteine, die SMs binden, wurden auch in Zellkulturextrakten identifiziert (z.B. S.O. Adams et al., Endocrinology 115, S.520-526 (1984)). Somit wurde das Trägerprotein bisher nicht isoliert. Spencer zeigte erstmals, daß Primärkulturen von Leberzellen ein Protein produzieren, das mit SMs komplexiert. E.M. Spencer, "The Use of Cultured Rat Hepatocytes to Study the Synthesis of Somatomedin and Its Binding Protein", FEBS Letters 99, S. 157, (1979). Daraufhin wurde bei mehreren sowohl normalen als auch abnormalen Zelltypen festgestellt, daß sie ein Protein synthetisieren, das mit SMs komplexiert. Kultivierte Büffelrattenleber-Tumorzellen (BRL 3A) erzeugen ein SM-Bindeprotein mit 33 kDa, das sich vom Trägerprotein durch Antikörperreaktivität, N-terminales Aminosäuremolekül und das Fehlen von Glykosylierung unterscheidet. R.M. Lyons et al., "Characterization of Multiplication-Stimulatory Activity "MSA" Carrier Protein", Molecular and Cellular Endocrinol. 45, S.263-70 (1986). C. Mottola et al., "J. of Biol. Chem." 261, S.1180-88 (1986). Romanus et al. berichten, daß Antikörper gegen dieses Bindeprotein mit einem Protein kreuzreaktiv sind, das in fötalem Serum vorhanden ist, nicht aber im Serum erwachsener Ratten. .A. Romanus et al., "Insulin-like Growth Factor Carrier Proteins in Neonatal and Adult Rat Serum Are Immunologically Different: Demonstration Using a New Radioimmunoassay for the Carrier Protein from BRL-3A Rat Liver Cells", Endocrinology 118, S.1743 (1986). Das BRL-3A-Bindeprotein kann das Nagetier-Äquivalent zu AFBP sein, aber die Daten des N-terminalen Moleküls zeigen keine Ähnlichkeit zwischen den beiden Molekülen.
Viele Proteine und Polypeptide wurden unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken hergestellt. Es gibt keinen veröffentlichen Bericht über die Herstellung von trägerproteinartigen Polypeptiden auf diese Weise. Es gibt zahlreiche Hindernisse beim Einsatz rekombinanter DNA-Technik zum Klonieren und Exprimieren eines trägerproteinartigen Polypeptidgens. Der Erhalt eines Gens, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, ist aus verschiedenen Gründen schwierig. Vor der Erfindung waren die Proteinsequenzen des Trägerproteins und der Trägerproteinuntereinheiten unbekannt, weshalb keine DNA-Moleküle bekannt waren, die für die Untereinheiten kodieren. Es wurde keine menschliche Gewebequelle festgestellt. Es war gezeigt worden, daß Fibroblasten geringe Mengen eines großen uncharakterisierten SM-Bindeproteins erzeugen (S.O. Adams et al., Endocrinology 115, S.520-526 (1984)). Obwohl die Leber die Hauptquelle für Somatomedine ist, wurde nie gezeigt, daß sie das Trägerprotein erzeugt. Außerdem ist es aufgrund von Ribonukleasen schwierig, die Leber zum Isolieren von mRNA zu verwenden. Die Trägerproteinmengen in Serum sind sehr gering. Daher ist mRNA möglicherweise selten. Das Genom, das ein DNA-Molekül umfaßt, welches für das Trägerprotein kodiert, kann intervenierende Sequenzen enthalten. Aus diesen und anderen Gründen gab es beim herkömmlichen Ansatz des Versuchs, ein Gen zu isolieren, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, viele Fallen, nämlich das Identifizieren einer Quelle für mRNA, die große Mengen des gewünschten Moleküls enthält, das Erzeugen einer cDNA-Bibliothek dieser mRNA, das Screenen der Bibliothek mit Oligonukleotidsonden, die zum Hybridisieren mit cDNA bestimmt sind, die das gewünschte Molekül aufweisen, sowie das Isolieren oder Zusammenstellen eines Gens aus diesen cDNA-Molekülen.
In der folgenden Beschreibung werden folgende Begriffe verwendet:
"Somatomedinartig" - Ein Polypeptid, das die biologischen Aktivitäten eines der menschlichen SMs oder der insulinartigen Wachstumsfaktoren aufweist, einschließlich von SM-C, SM-A, IGF-I und IGF-II (aber nicht beschränkt darauf). Dieses Polypeptid kann außer jenen von nativen menschlichen SMs andere Aminosäuren aufweisen, oder es kann auch nicht alle Aminosäuren von nativen menschlichen SMs enthalten.
"Trägerprotein" - Ein Glykoprotein oder ein Komplex von Glykoproteinen in menschlichem Plasma, das/der die Fähigkeit aufweist, die biologische Aktivität der menschlichen SMs in vivo aufgrund eines Vorgangs zu regulieren, der die Bindung der SM-artigen Polypeptide umfaßt, das/der wachstumshormonabhängig ist und unter physiologischen pH-Bedingungen ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 125.000-160.000 Dalton aufweist, wenn es/er mit SMs komplexiert wird. Das Trägerprotein kann auch polymorph sein. Beispielsweise können Zellen verschiedener Individuen Trägerproteinspezies erzeugen, die physiologisch ähnlich, aber strukturell leicht verschieden vom Prototyp sind.
"Untereinheit" - Ein(e) Polypeptidfragment, -teil oder -komponente einer größeren Proteineinheit. Der Begriff Untereinheit ist nicht auf seine gebräuchliche Bedeutung als diskrete Polypeptidkette beschränkt, die durch kovalente oder andere Arten von Bindungen an eine andere diskrete Polypeptidkette gebunden ist.
"Trägerproteinuntereinheiten" - Eine Klasse von Untereinheiten des Trägerproteins.
"Polypeptid" - Eine lineare Kette von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Ein Polypeptid kann auch eine oder mehrere Disulfidbindungen zwischen Cysteinen der gleichen Aminosäurekette enthalten.
"Trägerproteinartiges Polypeptid" - Ein Polypeptid, das eine menschliches Somatomedin regulierende biologische Aktivität des Trägerproteins aufweist und zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist. Vorzugsweise weist ein trägerproteinartiges Polypeptid eine Somatomedin-C regulierende Aktivität des Trägerproteins auf. Ein trägerproteinartiges Polypeptid kann eine Trägerproteinuntereinheit sein, die zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist, wenn sie über eine gewisse somatomedinregulierende Aktivität verfügt. Dieses Polypeptid kann zusätzlich zu jenen des Trägerproteins oder solchen Trägerproteinuntereinheiten eine oder mehrere Aminosäuren umfassen. Dieses Polypeptid kann auch nicht alle Aminosäuren des Trägerproteins oder solcher Trägerprotein-Untereinheiten umfassen, wenn eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder durch andere ersetzt wurden. Daher kann ein trägerproteinartiges Polypeptid die Aminosäuresequenz des Trägerproteins oder einer Trägerprotein-Untereinheit aufweisen, in der ein Aminosäurerest hinzugefügt, gelöscht oder substituiert wurde. Ein trägerproteinartiges Polypeptid kann die natürliche Glykosylierung des Trägerproteins aufweisen, nicht die natürliche Glykosylierung des Trägerproteins aufweisen oder eine andere Glykosylierung als die natürliche Glykosylierung des Trägerproteins aufweisen. Daher ist das trägerproteinartige Polypeptid möglicherweise nicht von der natürlichen Glykosylierung des Trägerproteins begleitet. Dieses Polypeptid hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 40.000 - 50.000 Dalton oder weniger, wenn es in einer Form gemessen wird, die von natürlicher Glykosylierung begleitet wird. Dieses Polypeptid hat mehr bevorzugt ein Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton oder weniger, wenn es in dieser Form gemessen wird.
"Somatomedin-C" ("SM-C" oder "IGF-I") - Das wichtigste wachstumregelnde Hormon nach der Geburt. SM-C vermittelt die wachstumsfördernde Wirkung von GH und bindet sich an das Trägerprotein.
"Nukleotid" - Eine Monomer-Einheit von DNA oder RNA, die aus einer Zuckergruppe (Pentose), einem Phosphat und einer heterozyklischen Base besteht. Die vier DNA- Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA- Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
"DNA-Molekül" - Ein anderes Molekül als das gesamte menschliche Genom, das aus einer Sequenz von Nukleotiden besteht, die durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffen benachbarter Pentosen miteinander verbunden sind. Ein DNA-Molekül kann aus einer isolierten Sequenz von Nukleotiden bestehen, die Teil des menschlichen Genoms sind. Ein DNA-Molekül kann aus einem einzelnen DNA- Molekül (üblicherweise als "einstrangige DNA" bezeichnet) oder zwei DNA-Molekülen bestehen, die aus komplementären Nukleotiden aufgebaut sind (üblicherweise als "doppelstrangige DNA" bezeichnet).
"Rekombinantes DNA-Molekül" - Ein DNA-Molekül, das zumindest eine Nukleotidsequenz aufweist, die durch Verbinden oder Aneinanderfügen von zumindest zwei DNA-Molekülen besteht.
"Genom" - Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es umfaßt die Gene, die für die Polypeptide des Organismus kodieren, sowie Operatoren, Promotoren sowie Ribosombindungs- und andere Wechselwirkungsstellen.
"Gen" - Ein DNA-Molekül, das durch seine mRNA für eine Sequenz von Aminosäuren eines spezifischen Polypeptids kodiert.
"cDNA" - Ein doppelstrangiges DNA-Molekül, das unter Verwendung dieser RNA als Schablone für RNA-gerichtete Synthese des ersten DNA-Strangs erzeugt wird, gefolgt vom Einsatz dieses DNA-Strangs als Schablone für DNA-gerichtete Synthese des zweiten DNA-Strangs.
"Transkription" - Das Verfahren zur Produktion von mRNA aus einem Gen.
"Translation" - Das Verfahren zur Produktion eines Polypeptids aus mRNA.
"Expression" - Das Verfahren zur Produktion eines Polypeptids durch Transkription und Transation.
"Plasmid" - Ein nicht-chromosomales doppelstrangiges DNA-Molekül, das ein intaktes "Replikon" umfaßt, sodaß das Molekül in einem Wirtsorganismus repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, können die Merkmale dieses Organismus aufgrund der DNA des Plasmids geändert werden. Eine mit einem Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.
"Virus" - DNA- oder RNA-Moleküle in einer/einem Proteinhülle oder -überzug, die zum Infizieren einer Zelle oder eines Organismus fähig sind.
"Phage oder Bakteriophage" - Bakterielles Virus.
"Vehikel oder Vektor" - Ein Plasmid, Phage, Säugetiervirus, Kosmid oder anderes DNA- Molekül, die in einen Wirt transformiert und darin repliziert werden können sowie eine oder mehrere Stellen aufweisen, an denen solche DNA-Moleküle nachweisbar geschnitten werden können, ohne daß eine grundlegende biologische Funktion der DNA, wie z.B. Replikation, Produktion von Hüllenproteinen oder Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, verloren geht, und die einen Marker aufweisen, der sich zur Identifizierung eines transformierten Wirts eignet, z.B. Tetracyclinresistenz.
"Klonieren" - Ein Verfahren zum Erhalten einer Population von Organismen, Zellen oder DNA-Molekülen, die von einem/einer solchen Organismus, Zelle oder DNA-Molekül abgeleitet sind.
"Expressionskontrollsequenz" - Eine DNA-Sequenz, die die Expression von Genen kontrolliert und steuert, wenn sie operativ mit diesen Genen verbunden ist. Sie umfassen das Iac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von λ-Phagen, das T7-System, die Kontrollregion von fd-Hüllenprotein, die Kontrollsequenzen von SV-40, das Aktinsystem, das Metallothioneinsystem, das LTR-System (das Wiederholungssystem des promotorhältigen langen Terminus von Retroviren) und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer und eukaryotischer Zellen oder Organismen und deren Viren oder Kombinationen davon steuern. "Wirt, Wirtsorganismus oder Wirtszelle" - Ein(e) prokaryotische oder eukaryotische Zelle oder Organismus, die/der mit einem Vehikel oder Vektor transformiert werden kann.

Trägerprotein-Untereinheiten

Die Erfindung löst die genannten Probleme, indem sie menschliche Trägerprotein Untereinheiten bereitstellt, die zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig sind. Die Fähigkeit der Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden wurde durch Bindung dieser Untereinheiten in vitro an Somatomedin-C bei in etwa physiologischem pH gezeigt. Diese Bindungsaktivität zeigt, daß die Trägerprotein-Untereinheiten somatomedinartige Polypeptide in vivo binden und im wesentlichen für den Transport und die Regulierungsaktivität des nativen Trägerproteins sorgen. Wenn diese Beschreibung sich auf die Fähigkeit der Trägerprotein-Untereinheiten bezieht, somatomedinartige Polypeptide zu binden, ist damit die Fähigkeit, solche Polypeptid in vitro oder in vivo zu binden, gemeint. Die Trägerprotein-Untereinheiten weisen keine nennenswerte Bindungsaktivität für Insulin auf.
Die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung stellen jeweils eine einzelne Polypeptidkette dar. Die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung weisen ein N-terminales Aminosäuremolekül der Formel:
auf, worin R ein Cystein oder Halbcystin ist. Halbcystin bezeichnet eine Aminosäure, die über eine Disulfidbindung mit einer weiteren Halbcystin-Aminosäure in derselben Polypeptidkette verbunden ist. Da das Trägerprotein polymorph sein kann, variiert gegebenenfalls auch das Aminosäuremolekül der Trägerprotein-Untereinheiten je nach dem polymorphen Charakter des Trägerproteins. Beispielsweise enthalten die Trägerprotein Untereinheiten gegebenenfalls einen Glycin ("Gly")-Rest anstelle des Alanin ("Ala") an Position 5 vom N-Terminus. Auf ähnliche Weise kann das Glu an Position 14 vom N- Terminus manchmal teilweise durch Phe ersetzt sein.
Die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung liegen in einem Molekulargewichtsbereich. Die Molekulargewichte der Trägerprotein-Untereinheiten, auf die in vorliegender Beschreibung Bezug genommen wird, wurden durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese im Vergleich zu Proteinen mit bekanntem Gewicht in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels, wie z.B. β-Mercaptoethanol "BME", ermittelt. Die bekannten Proteinstandards waren 200.000 (Myosin (H-Kette)), 97.400 (Phosphorylase b), 66.200 (Rinderserumalbumin), 43.000 (Ovalbumin), 25.700 (α-Chymotrypsinogen), 18.400 (β-Ladoglobulin) und 14.300 (Lysozym). Es wurden Trägerprotein-Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 15.000, 21.000, 26.000 und 30.000 Dalton isoliert und identifiziert. Die Trägerprotein-Untereinheiten unterscheiden sich gegebenenfalls im Molekulargewicht, weil sie im Trägerprotein als Polypeptide dieser Größe vorliegen oder aufgrund von enzymatischer Spaltung oder Zerfall aus anderen Gründen. Gleichgültig, welchen Ursprung diese Unterschiede haben, die Trägerprotein-Untereinheit gemäß vorliegender Erfindung haben ein Molekulargewicht von etwa 30.000 oder weniger. Die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 15.000 bis und einschließlich etwa 30.000 Dalton.
Die Trägerprotein-Untereinheiten sind Glykoproteine, wie ihre positive Reaktion gegenüber dem Perjodsäure-Schiff-Reagens und ihre Fähigkeit zur Bindung von mit Agarose vernetztem Concanavalin A (Con-A-Sepharose, Pharmacia) zeigt. Die Bindung an Con- A-Sepharose ist spezifisch für Glykoproteine, die Glucose- und Mannosereste enthalten. Spezifische Reste sind u.a. α-D-Mannopyranosyl- und α-D-Glucopyranosyl-Reste. Daher sind die Trägerprotein-Untereinheiten im wesentlichen glykosyliert.
Die Erfindung stellt auch im wesentlichen reine Trägerprotein-Untereinheiten mit SM- Bindungsaktivität bereit. Die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung sind im wesentlichen frei von anderen Proteinen, Peptiden, Nukeotiden, Polysacchariden, Lipiden und Salzen. Dank der Erfindung ist es möglich, diese Untereinheiten in ausreichender Reinheit zu erhalten, um sie in Therapiemitteln für Mensch und Tier zu verwenden, wie z.B. in wachstumsfördernden Mitteln für Tiere, in Diagnosereagenzien für Mensch und Tier und in Forschungsanwendungen für Mensch und Tier.
Die Erfindung stellt auch therapeutische Zusammensetzungen bereit, die eine wirksame Menge zumindest einer Trägerprotein-Untereinheit, die zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist, oder pharmakologisch akzeptable Salze davon, sowie einen pharmakologisch akzeptablen Träger umfaßt. Die Trägerprotein-Untereinheit solcher therapeutischer Zusammensetzungen kann zumindest eine im wesentlichen reine Trägerprotein-Untereinheit sein. Zusammensetzungen von Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung können therapeutische Verwendungen finden, die mit wichtigen biologischen Eigenschaften von SMs in Zusammenhang stehen. Zusammensetzungen, die die menschlichen Trägerprotein-Untereinheiten umfassen, können bei der Behandlung von Krankheiten nützlich sein, die mit verstärktem, von unkontrollierten SMs abhängigem Wachstum verbunden sind. Daher ermöglicht die Fähigkeit der Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung, SMs durch Bindung zu inaktivieren, eine neue Therapie für verschiedene Leiden. Bei solchen Therapien ist es offensichtlich, daß eine wirksame Menge der Trägerprotein-Untereinheit eine solche ist, die einen ausreichenden Überschuß gegenüber der biologisch aktiven, unregulierten SMs darstellt, um die SM-Aktivität zu blockieren oder zu inaktivieren. Beispielsweise kann eine wirksame Menge an Trägerprotein-Untereinheiten das 10fache oder mehr der Menge der biologisch aktiven SMs auf molarer Basis darstellen. Beispielsweise wurde für manche Krebsarten gezeigt, daß sie SMs erzeugen: Fibrosarkome, Chondrosarkome und Hepatom-Zelllinien. J.E. De Larco et al., "A Human Fibrosarcoma Cell Line Producing Multiplication Stimuting Activity "MSA"-related Peptides", Nature 272, S. 356-358 (1978). Brust- und Nierenkrebs erzeugen ein SM, das das Wachstum des Krebs autostimuliert. E.M. Spencer et al., "Possible Auto-stimulation of Human Mammary Carcinoma Growth by Somatomedins", Annals New York Academy Sciences 464, S. 448-449 (1986). Da Endothelzell- und Fibroblastenvermehrung ebenfalls durch SMs stimuliert werden, können durch Brustkrebs erzeugte SMs auch als Paracrin wirken und das Wachstum des für das Überleben des Tumors kritische Stromagewebe stimulieren. R.S. Bar et al., "Receptors for Multiplication-stimulating Activity on Human Arterial and Venous Endothelial Cells", J. Clin. Endocrinol. Metab. 52, S.814, (1981); D.R. Clemmons et al., "Hormonal Control of Immunoreactive Somatomedin Production by Cultured Human Fibroblasts", J. Clin. Invest. 67, S.10 (1981). Es wäre zu erwarten daß die Verabreichung der menschlichen Trägerprotein-Untereinheit durch Blockieren der Wirkung von SMs die Rate des Tumorwachstums verringert und außerdem die bösartigen Zellen für andere Arzneimittel empfindlicher macht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die zumindest eine Trägerprotein-Untereinheit umfaßt, die im wesentlichen mit zumindest einem somatomedinartigen Polypeptid komplexiert ist. Eine solche Zusammensetzung eignet sich für eine Vielzahl therapeutischer Anwendungen. SMs verfügen über biologische Aktivität, die sie in vielen therapeutischen Anwendungen potentiell nützlich machen. Um jedoch die erforderliche konstante Menge von SMs in Plasma beizubehalten, müßten mehrmals täglich Injektionen verabreicht werden, weil die Halbwertszeit von SMs im freien Zustand unter einer Stunde liegen kann. Dieses Hindernis kann nicht überwunden werden, indem eine höhere Dosis verabreicht wird, weil (a) SMs starke Mitogene für Subkutan-, Muskel- und Gefäßgewebe (Fibroblasten, Endothelzelen, Muskelzellen, Adipocyten und Endothezellen) sind und lokales Gewebewachstum hervorrufen könnten, (b) große Mengen freier SMs Hypoglykämie verursachen würden und (c) die übermäßige Menge an SMs, die zum Beibehalten eines konstanten Plasmaspiegels erforderlich wäre, nicht kosteneffizient wäre.
SMs könnten auf sichere wirksame physiologische Weise an Zielgewebe abgegeben und ihre Halbwertszeit wesentlich verlängert werden, indem sie an die Trägerprotein-Untereinheiten gemäß vorliegender Erfindung komplexiert werden. Das SM in einem SM- Trägerprotein-Untereinheitskomplex ist weder an Injektionsstellen mitogen noch hypoglykämisch. Dieser Komplex könnte so formuliert werden, daß er für gesteuerte langfristige Absorption sorgt. Nach dem Transport zu Zielgeweben wird durch Dissoziation SM freigesetzt. Daher simuliert die Therapie das physiologische Abgabesystem. Erfolgreiche Verwendung von SM-C, IGF-II und anderen somatomedinartigen Polypeptiden in der Therapie und Tierzucht wird durch eine Zusammensetzung aus zumindest einem menschlichen somatomedinartigen Polypeptid und zumindest einer Trägerprotein- Untereinheit ermöglicht. Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Trägerprotein- Untereinheiten und ein oder mehrere SMs umfassen, wären zur Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. nach den Wechseljahren auftretender Osteoporose, anderer Formen von Osteoporose und menschlicher GH-Defizienz, sowie zum Heilen von Wunden und Verstärken des Wachstums von Tieren nützlich. Eine derartige Zusammensetzung würde eingesetzt werden, um SM an Knochengewebe abzugeben und das Knochenwachstum zu stimulieren. Die Dissoziation des SM aus Trägerprotein-Untereinheit-SM-Komplexen sollte Osteobasten stimulieren, sodaß die Knochenbildung bei nach den Wechseljahren auftretender Osteoporose verstärkt, die poröse Matrix eines künstlichen Gelenks durchdrungen, was die Prothese stabilisiert, und die Heilung nicht-eingerichteter Brüche gefördert wird.
Therapeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge zumindest einer Trägerprotein-Untereinheit, die zur Bindung von somatomodinartign Polypeptiden fähig sind, oder pharmakologisch akzeptabler Salze davon und einen pharmakologisch akzeptablen Träger umfassen, sowie therapeutische Verfahren, bei denen solche Zusammensetzungen verwendet werden können, können auch zur Behandlung von Verletzungen oder Erkrankungen dienen, bei denen der/die natürliche Heilungsmechanismus oder -reaktion das Vorhandensein regulierter Mengen biologisch aktiver Somatomedine umfaßt. Beispielsweise können solche Zusammensetzungen bei der Wundheilung nützlich sein, wo die natürliche physiologische Reaktion das Vorhandensein endogener SMs an der Stelle der Wunde vorsieht. Eine wirksame Menge Trägerprotein-Untereinheit ist eine Menge, die ausreicht, um die Halbwertszeit der endogenen biologisch aktiven Somatomedine zu verlängern.
Aus all diesen Gründen wurden viele Versuche unternommen, die Proteinstruktur zu ermitteln, welche für trägerproteinartige Aktivität erforderlich ist. Bei keinem davon wurden die Trägerproteinuntereinheiten gemäß vorliegender Erfindung identifiziert und isoliert oder gar in reiner Form isoliert.

Rekombinante DNA und trägerproteinartige Polypeptide

Nun werden Verfahren zum Lokalisieren, Identifizieren und Isolieren von DNA-Molekülen, die für trägerproteinartige Polypeptide kodieren, rekombinante DNA-Moleküle, Vektoren, Wirte sowie Verfahren zur Verwendung dieser Moleküle, Vektoren und Wirte bei der Herstellung von trägerproteinartigen Polypeptiden beschrieben, d.h. Polypeptiden, die somatomedinregulierende Aktivität eines Trägerproteins aufweisen und zur Bindung somatomedinartiger Polypeptide fähig sind. Unter Einsatz dieser Verfahren ist es möglich, trägerproteinartige Polypeptide zur Verwendung in Therapie- und Diagnosezusammensetzungen und -verfahren zu erhalten. Die Herstellung dieser Polypeptide ist nun in Mengen und nach Verfahren möglich, die zuvor nicht möglich waren. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Herstellung solcher Polypeptide, die im wesentlichen, insbesondere vollständig, frei von anderen Polypeptiden sind, die in menschlichem Plasma natürlich vorhanden sind.
Wie aus der Offenbarung hervorgeht, enthalten die DNA-Moleküle und rekombinanten DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung Gene, die in einem geeigneten Wirt zur Steuerung der Expression trägerproteinartiger Polypeptide fähig sind. Die Repliaktion dieser DNA-Moleküle und rekombinanten DNA-Moleküle in geeigneten Wirten ermöglicht auch die Herstellung von Genen, die für diese Polypeptide kodieren, in großen Mengen. Die Molekülstruktur und die Eigenschaften dieser Polypeptide und Gene lassen sich so leicht ermitteln. Die Polypeptide und Moleküle, entweder wie im Wirt produziert oder nach entsprechender Modifikation, dienen für Zusammensetzungen und Verfahren zum Verbessern der Produktion dieser Produkte selbst oder zur Verwendung in Therapie- und Diagnosezusammensetzungen und -verfahren.
Es wird ein DNA-Molekül bereitgestellt, welches ein Gen umfaßt, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, nämlich eines, das somatomedinregulierende Aktivität des Trägerproteins aufweist und zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist. Ein solches DNA-Molekül ist in dem Sinne isoliert worden, als es nicht das gesamte menschliche Genom ist. Ein solches DNA-Molekül ist vorzugsweise frei von Introns. Ein solches DNA-Molekül ist auch vorzugsweise im wesentlichen frei von Genen, die für irgendein anderes Polypeptid kodieren, für welches das menschliche Genom kodiert. Vorzugsweise kodiert ein solches Gen für ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 40.000 bis 50.000 Dalton oder weniger, wenn das Molekulargewicht einer Form gemessen wird, die von natürlicher Glykosylierung begleitet ist. Ein solches Gen kann für ein Polypeptid kodieren, das somatomedinregulierende Aktivität des Trägerproteins aufweist, und im speziellen eine Somatomedin-C regulierende Aktivität des Trägerproteins. Ein solches Gen kann auch für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodieren, das eine Trägerprotein-Untereinheit ist, die zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist, und mehr bevorzugt eine Trägerprotein-Untereinheit, die zur Bindung von Somatomedin-C fähig ist.
Ein Verfahren zum Erhalten eines solchen DNA-Moleküls umfaßt die Herstellung von cDNA-Molekülen aus mRNA, die in das Trägerprotein erzeugenden Zellen oder Geweben vorkommt, die Bestimmung auf Basis der DNA-Sequenz aus Fig. 4, welche der cDNA-Moleküle an eine oder mehrere markierte Polynukleotidsonden hybridisieren, sowie das Erhalten eines DNA-Moleküls mit einem Gen, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert. Bei diesem Verfahren kann ein DNA-Molekül, welches das Gen enthält, durch Ligieren von einem oder mehreren cDNA-Molekülen erhalten werden, die mit anderen cDNA-Molekülen, synthetischen DNA-Molekülen oder rekombinanten DNA-Molekülen hybridisieren. Das cDNA-Molekül, das an die Sonde hybridisiert, kann ein cDNA-Molekül sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer menschlichen Leber-Genbibliothek, einer menschlichen Fibroblasten-Genbibliothek, einer menschlichen Plazentabibliothek und einer menschlichen Epithelbibliothek besteht. Bei diesem Verfahren kann die markierte Polynukleotidsonde die in Fig. 2a gezeigte DNA-Sequenz aufweisen. Die Erfindung umfaßt auch ein DNA-Molekül, das nach diesem Verfahren hergestellt wird, und ein DNA-Molekül, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, für das ein nach diesem Verfahren erhältliches DNA-Molekül kodiert, sowie eine Oligonukleotidsonde mit der gesamten oder einem Abschnitt der DNA-Sequenz eines beliebigen der DNA-Moleküle LCP, LCP 0,70, LCP 0,77, LCP 2,3, LCP 2,5, FCP 1,8 und FCP 2,5, das selektiv an ein DNA-Molekül hybridisiert, welches für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodiert.
Außerdem kann ein DNA-Molekül gemäß vorliegender Erfindung aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus den DNA-Molekülen LCP 0,70, LCP 0,77, LCP 2,3, LCP 2,5, FCP 1,8 und FCP 2,5, aus DNA-Molekülen, die an eines der DNA-Moleküle LCP 0,70, LCP 0,77, LCP 2,3, LCP 2,5, FCP 1,8 und FCP 2,5 hybridisieren und für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodieren, und aus DNA-Molekülen besteht, die für ein Polypeptid kodieren, für das eines der obigen DNA-Moleküle kodiert. Ein bevorzugtes DNA-Molekül umfaßt ein DNA-Molekül, das der trägerproteinverwandte Abschnitt von LCP 2,3 ist. Ein weiteres rekombinantes DNA-Molekül umfaßt ein DNA-Molekül, das der trägerproteinverwandte Abschnitt von LCP 2,3 ist, sowie DNA-Moleküle, die für ein Polypeptid kodieren, für das die genannten Abschnitte von LCP 2,3 kodieren.
Weiters kann ein DNA-Molekül gemäß vorliegender Erfindung ein Gen umfassen, das für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren -1 bis 290 aus Fig. 4, der Aminosäuren 1 bis 290 aus Fig. 4 oder der Aminosäuren 27 bis 290 aus Fig. 4 kodiert. Ein DNA-Molekül kann auch ein Gen umfassen, das für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 aus Fig. 4 kodiert, bei dem der Aminosäure 27 ein Methioninrest vorangeht.
Ein DNA-Molekül kann auch ein Gen umfassen, das für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 kodiert und bei dem eine Sequenz von Aminosäureresten der Aminosäure 27 vorhangeht, die eine Sekretions-, Signal- oder andere Vorläufersequenz darstellt, die von einem Wirt erkannt wird.
Diese DNA-Moleküle können verwendet werden, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren, bei dem solche DNA-Moleküle operativ mit eiper Expressionskontrollsequenz verbunden sind. Vorzugsweise bildet ein solches rekombinantes DNA-Molekül einen Vektor oder ein Vehikel. Verfahren zur Herstellung eines Vektors, die das Einführen eines DNA-Moleküls in einen Vektor umfassen, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren können den zusätzlichen Schritt des Einfügens einer Expressionskontrollsequenz in den Vektor umfassen, um die Expression dieses DNA-Moleküls zu steuern und zu regulieren. Die Expressionskontrollsequenz kann ein Iac-System, ein trp-System, ein tac-System, ein trc-System, ein T7-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von λ-Phagen, die Steuerregion von fd-Hüllenprotein, die Steuersequenzen von SV-40, das Aktinsystem, das Metallothioneinsystem, das LTR-System (einen Promotor, umfassend die Wiederholung des langen Terminus von Retroviren), sowie andere Sequenzen sein, welche die Expression von Genen oder prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und deren Viren steuern, sowie Kombinationen davon.
Die rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren ermöglichen die Herstellung von trägerproteinartigen Polypeptiden in Wirten. Ebenfalls verfügbar ist ein Wirt, der mit zumindest einem dieser rekombinanten DNA-Moleküle oder Vektoren transformiert ist. Transformierte Wirte können Stämme von E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, andere Bakterien, Hefe, Pilzen, Tier-, Insekten oder Pflanzenwirte und menschlichen Gewebezellen sein.
Das trägerproteinartige Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das die Schritte des Transformierens eines geeigneten Wirts mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül oder -Vektor und des Kultivierens des Wirts umfaßt, um ein solches Polypeptid herzustellen. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Sammelns des Polypeptids. Bei diesem Verfahren können die Wirte Stämme von E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Badilus stearothermophilus, andere Bakterien, Hefe, Pilze, Tier-, Insekten- oder Pflanzenwirte und menschliche Gewebezellen sein. Das Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids kann auch die Schritte des Kultivierens eines Wirts umfassen, der mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül oder -Vektor transformiert ist.
Die Anmelder haben ein Polypeptid gefunden, für das bei der Expression ein rekombinantes/r DNA-Molekül oder -Vektor, wie oben beschrieben, kodiert.
Dadurch wird ein im wesentlichen reines trägerproteinartiges Polypeptid bereitgestellt, das keine Trägerprotein-Untereinheit ist und zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist. Ein solches im wesentlichen reines Polypeptid ist vorzugsweise im wesentlichen frei von Substanzen, die in menschlichem Serum natürlich vorhanden sind. Ein solches Polypeptid kann ein reifes trägerproteinartiges Polypeptid sein. Ein solches reifes Polypeptid ist eines, bei dem jene Aminosäurereste, die eine Sekretions-, Signal- oder andere Vorläufersequenz darstellen, gelöscht sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein trägerproteinartiges Polypeptid bereit, das eine Sequenz mit in vivo-Effektoraktivität eines Polypeptids mit der Sequenz aus Fig. 4 umfaßt, der die natürliche Glykosylierung des Trägerproteins fehlt. Ein Beispiel für ein solches Polypeptid ist das Polypeptid mit der Sequenz aus Fig. 4. Geeigneterweise ist das Polypeptid im wesentlichen frei von Substanzen, die in menschlichem Serum natürlich vorkommen.
Die Erfindung stellt weiters ein im wesentlichen reines Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 aus Fig. 4 bereit, bei dem der Aminosäure 27 ein Methinoninrest vorhangeht. Eine oder mehrere Aminosäurereste können hinzugefügt, gelöscht oder substituiert sein, vorausgesetzt, das Polypeptid stellt ein trägerproteinartiges Polypeptid dar.
Die Erfindung stellt weiters ein Polypeptid bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren -1 bis 290 aus Fig. 4 und aus Polypeptiden besteht, die einen Abschnitt dieser Sequenz aufweisen und ein trägerproteinartiges Polypeptid darstellen.
Erfindungsgemäße Polypeptide können im wesentlichen mit zumindet einem somatomedinartigen Polypeptid komplexiert sein.
Die Erfindung betrifft auch eine therapeutische Zusammensetzung zum Hemmen der Wirkung von Somatomedin-C, um das Wachstum von Narbengeschwulsten zu hemmen. Die Erfindung umfaßt die Verwendung des oben beschriebenen Polypeptids zum Hemmen des Wachstums somatomedinabhängiger Krebsarten und zum Hemmen des Wachstums von Narbengewebe.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auch eine Zusammensetzung, bei der zumindest ein solches, oben beschriebenes, trägerproteinartiges Polypeptid im wesentlichen mit zumindest einem somatomedinartigen Polypeptid komplexiert ist. Derartige Zusammensetzungen können in einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose beim Menschen eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen können auch bei einem Verfahren zur Behandlung solcher Leiden verwendet werden, die die Verabreichung einer wirksamen Menge einer solchen Zusammensetzung umfassen.
Es kann ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt werden, das ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Gen enthält, welches für ein solches trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, das mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, und ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Gen enthält, das für ein somatomedinartiges Polypeptid kodiert, das mit einer Expressionskontrollsequenz operativ verbunden ist. Ein Wirt kann mit zumindest einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, um es ihm zu ermöglichen, beide Arten von Polypeptiden zu produzieren.
Es kann auch ein einzelner Vektor so konstruiert werden, daß er ein DNA-Molekül, das für zumindest ein oben beschriebenes trägerproteinartiges Polypeptid kodiert, sowie ein DNA-Molekül enthält, das für ein somatomedinartiges Polypeptid kodiert, die jeweils operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden sind. Ein Wirt kann mit einem solchen Vektor transformiert werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die einen Komplex aus einem trägerproteinartigen Polypeptid und einem somatomedinartigen Polypeptid umfaßt, umfaßt das Transformieren eines geeigneten Wirts mit einem solchen Vektor und das Kultivieren des Wirts, um die Polypeptide herzustellen. Dieses Verfahren könnte den zusätzlichen Schritt des Sammelns der Polypeptide umfassen. Dieses Verfahren könnte das einfach Kultivieren eines mit einem solchen Vektor transformierten Wirts umfassen. Ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung umfaßt auch das Transformieren eines geeigneten Wirts mit zumindest einem rekombinanten DNA-Molekül oder Vektor mit einem DNA-Molekül, das für ein trägerproteinartiges Polypeptid wie oben beschrieben kodiert, das Cotransformieren eines solchen Wirts mit zumindest einem rekombinanten DNA-Molekül oder Vektor mit einem DNA-Molekül, das für ein somatomedinartiges Polypeptid kodiert, und das Kultivieren eines solchen Wirts, um beide Arten von Polypeptiden herzustellen. Die Erfindung umfaßt auch Wirte, die mit zumindest einem jedes derartigen Typs von rekombinantem DNA-Molekülen oder Vektoren transformiert ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Sequenz der N-terminalen 42 Aminosäurereste einer menschlichen Trägerprotein-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 15.000 Dalton. Außerdem werden die N-terminalen Sequenzen der Trypsin-Fragmente T1, T6, T7, T1' und T10 gezeigt.
Fig. 2a zeigt die Sequenz der N-terminalen 57 Aminosäuren der in Fig. 1 gezeigten Untereinheit und ein Oligonukleotid, das für die Aminosäuren 29-44 kodiert, bestimmt zur Verwendung als Sonde. Dieses Oligonukleotid wird als 48-mer bezeichnet.
Fig. 2b zeigt das Protein und die DNA-Sequenz der synthetischen DNA mit 181 bp und ihre entsprechende Proteinsequenz.
Fig. 3a zeigt die Größe und die Restriktionsstellen der DNA-Einfügungen LCP 0,70 und LCP 0,77, die an die Sonde aus Fig. 2a hybridisierten, sowie die Größe und die Restriktionsstellen der DNA-Einfügung LCP 2,3, die an Sonden hybridisierte, welche die DNA-Sequenzen dieser DNA-Einfügungen LCP 0,70 und LCP 0,77 aufwiesen.
Fig. 3b zeigt die Vorgangsweise beim Sequenzieren von LCP 2,3.
Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz des Kodierstrangs von DNA-Molekül LCP 2,3 und die Aminosäuresequenz der 291 Aminosäuren des Polypeptid, für das sie kodiert. "C" bezeichnet einen Cystein- oder Halbcystinrest.
Fig. 5 zeigt die funktionelle und partielle Restriktionskarte von Vektor pDJ4219 zur Expression in E.coli-Zellen, der ein Gen für menschliches trägerproteinartiges Polypeptid enthält, bei dem 264 Aminosäuren in pKK233-2 eingefügt sind.
Fig. 6 zeigt die Herstellung verschiedener rekombinanter DNA-Moleküle, die in Vektoren zum Transformieren geeigneter Wirte eingesetzt werden, welche beim Kultivieren trägerproteinartige Polypeptide erzeugen.
Fig. 7 zeigt die funktionelle und partielle Restriktionskarte von Vektor pD4212 zur Expression in COS-Zellen, der ein Gen für ein menschliches trägerproteinartiges Pollypeptid mit den ersten 120 Aminosäuren von reifem Trägerprotein enthält, das in das pSVL-Derivat pDJ4210 eingefügt wurde.
Fig. 8 zeigt die funktionelle und partielle Restriktionskarte von Vektor pKG4403 zur Expression in CHO-Zellen, der ein Gen für ein menschliches trägerproteinartiges Polypeptid enthält, bei dem 264 Aminosäuren in pKG3226 eingefügt sind.
Fig. 9 zeigt die Wirkung der 15kDa-Trägerprotein-Untereinheit auf die Halbwertszeit von SM-C im Kreislauf.

Assay auf Somatomedin-Bindungsaktivität

Die Somatomedin-Bindungsaktivität wird mittels eines Proteinbindungsassays gemessen, bei dem ein radiomarkiertes ¹²&sup5;I-SM (SM-C oder IGF-II) als Ligand eingesetzt wird. Die Menge an gebundenem ¹²&sup5;I-SM wird mit jener eines Standard präparats gemessen.
Der Standard wird durch Gelfiltration eines Pools von menschlichem Serum von 10 normalen Spendern hergestellt. 35 ml des Serums wurden zu, 35 ml 4 N Essigsäure zugegeben. Nach der Klärung wurde die Probe auf Sephadex G-50 (5 x 100 cm) (Fraktionierbereich 1.500 bis 30.000), äquilibriert mit 1 M Essigsäure, mit einer Flußrate von 80 ml/h chromatographiert. Alle Fraktionen wurden unter Verwendung von ¹²&sup5;I-SM- C auf Somatomedin-Bindungsaktivität untersucht. Die Bindungsaktivität erschien bei Kd 0-0,4. Diese Fraktionen wurden lyophilisiert, in 1 M Essigsäure wiederaufgelöst und erneut chromatographiert, um alle Spuren von gebundenen SMs zu entfernen. Das erhalten Pulver wurde in 30 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, wiederaufgelöst, in gleich große Mengen von 100 µl aufgeteilt und bei -26ºC gelagert. Für jedes Bindungsassay wurde ein Röhrchen dieses Materials als Bezug verwendet, dem willkürlich ein Wert von 1,0 U/ml zugewiesen wurde.
Das Assayverfahren war das von Zapf et al. beschriebene ("Serum Levels of the Insulin- like Growth Factor (SM) and its Carrier", Acta Endocrinol. 95, S.505-517, (1980)). Bei Proben, wo die Trägerprotein-Untereinheit noch an SMs komplexiert war, wurden die beiden durch Sephadex G-50-Chromatographie (0,9 x 110 cm) in 1 M Essigsäure getrennt. Der Bindungsaktivität-Peak (Kd 0,1 - 0,4) wurde dann lyophilisiert, in Assaypufer rekonstituiert und getestet. Bei Proben, die keine gebundenen SMs enthielten, wurden die Proben entweder gegen Assaypuffer dialysiert und direkt getestet, oder, wenn die Konzentration der Bindungsaktivität gering war, gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert, lyophilisiert und in einem geringeren Volumen Assaypufer gelöst. Der Assaypuffer war 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, und enthielt 0,2% menschliches oder Rinder-Serumalbumin, das zuvor getestet worden war, um zu gewährleisten, daß keine konkurrierende Aktivität vorhanden war. SM-C oder IGF-II wurden nach dem Verfahren von Spencer iodiert. E.O. Grecu, E.M. Spencer et al., "Serum Somatomedin Response to Human Growth Hormone Infusion in Patients with Diabetes mellitus: Correlation with the Degree of Control of Diabetes", Am. J. Med. Sci., 287, S.7-10 (1984). Verdünnungsreihen (2- oder 4fach) von Proben und Standard wurden je dreimal dem Assay unterzogen. Die Assayröhrchen enthielten 100 µl ¹²&sup5;I-SM, 20.000 cpm, und 200 µl Probe. Das Assay erfolgte bei 4ºC über 16 h, obwohl auch nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden kpnnten. Das gebundene ¹²&sup5;I-SM wurde durch Aktivkohleextraktion vom freien abgetrennt. Es wurden 0,8 ml einer eiskalten Lösung von 2%-iger Aktivkohle mit 1 % menschlichem (oder Rinder-) Albumin in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zugegeben, und die Röhren 15 min lang bei 4ºC gerührt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand einer Zählung unterzogen. Die gebundenen cpm wurden gegen den Logarithmus der Dosis aufgetragen, und die Potenz der Unbekannten auf jene des Standards bezogen, dem ein Wert von 1,0 U/ml zugewiesen worden war. Die Bindungsspezifität wurde durch Inkubieren der Probe mit einem großen Überschuß an unmarkiertem SM bestimmt.

Andere Somatomedin-Bindungsassays

Dot-blot- und Western-Assays können ebenfalls eingesetzt werden, um die Gegenwart von Polypeptiden mit Somatomedin-Bindungsaktivität nachzuweisen.
Dot-Blot-Format "Bindung in Näpfen"
Die Nitrocellulosemembran und 3 mm-Filterpapier werden zuerst in Wasser eingelegt und daraufhin 20-30 min lang in PBS (10 mM NaPO&sub4;, pH 7,2, 0,15 M NaCl) eingeweicht. Das Filterpapier und die Membran werden auf die Dot-Blot-Vorrichtung gelegt, wobei die Membran auf dem Filterpapier liegt. Die Vorrichtung wird nach den Angaben des Herstellers (Bio-Rad) zusammengesetzt und -geklemmt. Die Dot-Blot-Vorrichtung enthält 96 Näpfe, wodurch sehr zweckmäßig viele Proben gleichzeitig behandelt werden können. Die Näpfe werden mit 200 µl PBS gespült. Trägerproteinartige Polypeptide werden in PBS auf die entsprechenden Konzentrationen verdünnt, um Gesamtvolumina von 50 µl/Napf zu erhalten. Vergleichs- und Blind-Näpfe enthalten BSA (Rinderserumalbumin) bzw. kein Protein. Die Proben werden in Näpfe eingefüllt und unter Schwerkraftwirkung durch die Membran hindurch fließen gelassen. Die Bindung des Proteins an die Membran ist innerhalb von 30-60 min abgeschlossen. Die Membran wird mit 200 µl/Napf 1% BSA in PBS blockiert, das unter Schwerkraftwirkung fließen gelassen wird, und wird dann mittels Vakuum durch die Membran "gezogen". Die Näpfe werden dreimal mit 100 µl TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl), 0,1% Tween 20, gewaschen. ¹²&sup5;I-SM-C (20.000 - 200.000 cpm) wird in 50 µl PBS pro Napf zugegeben. Die Vorrichtung wird mit Parafilm dicht abgedeckt und 1,5-2 h lang bei 4ºC stehen gelassen. In diesem Schritt entsteht die Bindung von SM-C an trägerproteinartige Polypeptide. Die Vorrichtung wird zerlegt und die Membran in großen Volumina TBS; TBS, 0,1% Tween 20; und TBS gewaschen; jede Waschung erfolgt 15 min lang bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Die Membran wird luftgetrocknet und bei -70ºC 1-6 h lang Kodak X-Omat AR-Film mit Verstärkerfolie ausgesetzt.

Dot-Blot-Format "Bindung im Beutel"

Die Vorbehandlung der Membran, die Dot-Blot-Vorrichtungsanordnung und die Bindung von Protein an Membran erfolgt wie oben beschrieben. Nach der Bindung von Protein an die Membran wird die Dot-blot-Vorrichtung zerlegt und die Membran luftgetrocknet. Die Membran wird in eine Schale eingelegt und bei 4ºC unter leichtem Schütteln in den folgenden Lösungen gewaschen: TBS plus 3% NP40 für 30 min; TBS plus 1% BSA für 1 h; TBS plus 0,1% Tween 20 für 10 min. Die Membran wird in einen Beutel mit 6-10 ml Bindelösung (TBS, 1% BSA, 0,1% Tween 20) eingelegt. ¹²&sup5;I-SM-C (2- 20 Millionen cpm) wird zugegeben, und die Bindung erfolgt 2 h lang oder über Nacht bei 4ºC unter leichtem Schütteln. In diesem Schritt erfolgt die Bindung von SM-C an trägerproteinartige Polypeptide. Die Membran wird zweimal in großen Volumina TBS mit 0,1% Tween 20 und zweimal in TBS allein gewaschen. Jede Waschung dauert 15 min bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Die Membran wird luftgetrocknet und bei -70ºC für 5-16 h Kodak X-Omat AR-Film mit Verstärkerfolie ausgesetzt.

Western

Proteinproben, die trägerproteinartige Polypeptide enthalten, werden auf Polyacrylamid- SDS-Gels aufgebracht und laufen gelassen. Normalerweise werden 12%-ige Gele eingesetzt, was eine gute Trennung der Proteine zwischen 10.000 und 70.000 Dalton ermöglicht. Die Trennung erfolgt durch Elektrophorese. Die Proteine im Gel werden dann auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und die resultierende Membran 5 min lang bei 37ºC luftgetrocknet. Die die gebundene Proteine enthaltende Membran wird mit TBS plus 3% NP40 bei 4ºC 30 min lang gespült. Die nichtspezifischen Stellen der Membran werden mit 1% BSA in TBS bei 4ºC 2 h lang blockiert. Die Membran wird mit TBS plus 0,1% Tween 20 bei 4ºC 10 min lang gespült. Die Membran wird mit ¹²&sup5;I-SM-C sondiert, indem die Membran in einen Beutel mit 6-10 ml TBS, 1% BSA, 0,1% Tween 20 plus 500.000 cps ¹²&sup5;I-SM-C eingelegt wird. Die Membran wird über Nacht bei 4ºC leicht geschüttelt, um die Bindung zwischen SM-C und trägerproteinartigen Polypeptiden, die auf der Membran immobilisiert sind, zu ermöglichen. Die Membran wird den folgenden Waschungen bei 4ºC unterzogen: TBS plus 0,1% Tween 20, zweimal jeweils 15 min; TBS dreimal jeweils 15 min. Die Membran wird luftgetrocknet und bei -70ºC für 5-16 h Kodak X-Omat AR-Film mit Verstärkerfolie ausgesetzt.

Verfahren zur Herstellung von Träger: Protein-Untereinheiten aus Plasma

Das Verfahren zur Herstellung der Trägerprotein-Untereinheiten begann mit Cohn-Fraktion IV-1. Dabei handelt es sich um eine menschliche Plasmafraktion, die etwa 10% der Plasmaproteine und 40% der ursprünglichen Plasmaträgerproteinaktivität enthält. Es handelt sich um eine grüngelbe Paste mit etwa 35% Feststoffen, von denen viele denaturierte unlösliche Proteine und Glykoproteine sind. Jedes Kilogramm dieser Paste enthält etwa 10 mg Trägerprotein.
Alle nachstehend beschriebenen Assaypuffer enthielten, falls nicht anders angegeben, die folgenden Enzyminhibitoren: 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid ("PMSF"), 1 mM N- Ethylmaleimid ("NEM") und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure ("EDTA"). Enzyminhibitoren waren wesentlich, weil entweder das Trägerprotein selbst Proteaseaktivität aufweist oder zumindest eine andere Plasmaprotease im Affinitätschromatographie- Schritt mitgereinigt wurde.

Präparat 1

Die Trägerprotein-Untereinheit wurde unter Einsatz von Gelfiltration gereinigt. Ein 30 mg-Aliquot der resultierenden Probe, die SM-Bindungsaktivität enthielt, wurde in 0,1% TFA-Lösung gelöst und in eine präparative Vydak-C&sub1;&submin;&sub4;-RP-Säule injiziert. Die Säule wurde in 60 min mit einem 0-60% Acetonitril-Gradienten eluiert. Der SM-Bindungsaktivitätspeak, der bei etwa 39% Acetonitril eluiert, wurde gesammelt und lyophilisiert. Die SM-Bindungsaktivität wurde quantitativ gewonnen.
Die Probe wurde daraufhin erneut in einem Tris-Glycinpuffer suspendiert, der β-Mercaptoethanol enthielt, und mittels SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamid) getrennt. Jene Banden, die 15, 21, 26 und 30 kDa-Trägerprotein-Untereinheiten entsprachen (die in einem Western-Blot alle markierten SM banden), wurden aus dem Gel herausgeschnitten, und die Proteine wurden in Tris-Glycinpulver elektroeluiert. Jede der Trägerprotein-Untereinheiten wurde lyophilisiert: die Ausbeuten waren quantitativ.

Beispiel 1

Versuche, die dazu dienten, die Fähigkeit der SM-Trägerprotein-Untereinheiten zur Verstärkung der Wundheilung zu messen, wurden auf folgende Weise durchgeführt: Jeder von 6 narkotisierten männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit 300 g wurden subkutan (s.c.) in jedem der 4 Quadranten ihres Rückens Schilling-Hunt-Drahtgitter-Wundzylinder implantiert. Zylindrische Kammern mit 20 x 5,8 mm ∅ und einem Volumen von 520 µl wurden aus rostfreiem Stahldrahtgitter konstruiert. Ein Ende wurde mit Drahtgitter abgedichtet, das andere mit einer Silastikscheibe. Nach der Implantation kam es zum typischen Verlauf der Wundheilung: Thrombose der Blutgefäße, nacheinander gefolgt von Migration polymorphonuklearer Leukozyten, Makrophagen und Fibroblasten durch das Drahtgitter, mit darauffolgender Fibroplasie, Kolagensynthese und Angiogenese. Während dieses Verfahrens konnten aus der Wundflüssigkeit, die sich in der hohlen Kammer ansammelte, Proben gezogen oder Wirkstoffe (s.c. durch die Silastikscheibe hindurch) in diese injiziert werden. Der Großteil der Heilung war 17 Tage nach der Implantation abgeschlossen; der Hohlraum in der Mitte war jedoch nie vollständig ausgefüllt.
Die SM-Trägerprotein-Untereinheit mit 15 kDa wurde in PBS (150 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4) gelöst, das 0,1% Rinderalbumin enthielt. In die Wundkammern wurden alle 12 h 100 µl dieser Lösung injiziert (die 1,4 µg der 15 kDa- Spezies enthielt). Diese Menge wurde so gewählt, daß sie nur leicht über der Menge an biologisch aktiven Somatomedinen lag und erhöht daher die Halbwertszeit der vorhandenen Somatomedine. Nach 17 Tagen wurden die Wundzylinder entfernt und das Fasergewebe sorgfältig von jedem Zylinder abgeschabt. Zylinder, in die 15 kDa Trägerprotein-Untereinheitsmaterial injiziert worden waren, waren alle mit dichtem Fasergewebe gefüllt, das deutlich mehr als bei den Vergleichstieren war. Im speziellen wurden 19,5 ± 7 (SD) mg Protein in Wundkammern abglagert, die 15 kDa-Trägerprotein- Untereinheiten enthielten, verglichen mit 7,0 ± 1,6 mg, die in den Vergleichstieren abgelagert waren. Die DNA-Synthese war in Trägerprotein-Untereinheiten enthaltenden Kammern ebenfalls viel stärker (1.160 ± 200 µg gegenüber 380 ± 15 µg in den Vergleichstieren). Ebenso waren die Hydroxyprolinmengen (ein Indikator für die Kollagensynthese) in Trägerprotein-Untereinheiten enthaltenden Kammern deutlich höher (460 µg gegenüber 270 µg in den Vergleichstieren). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Injektion von 15 kDa-Trägerprotein-Untereinheiten in Wundkammern die Heilungsrate deutlich erhöht.

Beispiel 2

Es wurde ein Tierversuch durchgeführt, um zu zeigen, daß die Trägerprotein-Untereinheiten die Serumhalbwertszeit von SM-C erhöhen. Es wurde gezeigt, daß die menschliche Trägerprotein-Untereinheit mit 15 kDa die Halbwertszeit von in den Blutkreislauf einer Ratte injiziertem, gereinigtem, menschlichem SM-C verlängert.
Der Komplex zwischen der Trägerprotein-Untereinheit mit 15 kDa und ¹²&sup5;I-SM-C wurde durch Inkubieren von ¹²&sup5;I-SM-C mit der Trägerprotein-Untereinheit über Nacht bei 4ºC in PBS (10 mM Natriumphosphat, pH 7,25, 150 mM Natriumchlorid) gebildet. Der Komplex wurde durch Gelfiltration von freiem ¹²&sup5;I-SM-C abgetrennt. Die spezifische Aktivität des ²&sup5;I-SM-C betrug 6,7 x 10&sup5; cpm pro µg.
Ratten (etwa 200 g schwer) wurden narkotisiert und durch die Jugularvene katheterisiert. Vor den Injektionen wurden die Katheter und Spritzen mit 4% BSA (Rinderserumalbumin) gespült, um ein Festkleben der Proteine an den Kunststoffoberflächen zu verhindern. Vier Ratten erhielten BSA, vier Ratten erhielten 2 µg ¹²&sup5;I-SM-C allein, und vier Ratten erhielten 2 µg ¹²&sup5;I-SM-C komplexiert mit 15 kDa Trägerprotein-Untereinheit. Sowohl der Komplex als auch das SM-C lagen in PBS vor. Eine Ratte erhielt 1 µg ¹²&sup5;I- SM-C, komplexiert mit der Trägerprotein-Untereinheit. Blutproben (100-200 µl) wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der Injektion abgenommen. Die Blutzellen wurden sofort durch Zentrifugieren vom Plasma abgetrennt. Ein 25 µl-Plasmaaliquot wurde gezählt, um die Konzentration des vorhandenen ¹²&sup5;I-SM-C zu ermitteln, und ein 10 µl- Aliquot wurde auf einem 15% Polyacrylamid-SDS-Gel laufen gelassen, um die SM-C- Integrität zu ermitteln. Die Injektionen erfolgten über ein Zeitraum von 2 Tagen. Jeden Morgen wurde 2 Ratten der Komplex und 2 Ratten SM-C allein injiziert. Am dritten Tag wurde 4 Vergleichsratten BSA injiziert.
Diese Untersuchung zeigt, daß die 15 kDa-Trägerprotein-Untereinheit die Halbwertszeit von SM-C im Kreislauf deutlich erhöht. Eine gleiche Anzahl an Counts (i.e. 1,3 x 10&sup5; cpm/ml Rattenblut) SM-C wurde den Ratten zusätzlich - entweder allein oder mit der Trägerprotein-Untereinheit komplexiert - verabreicht. Wie in Fig. 9 gezeigt, wird der Großteil an freiem SM-C rasch aus dem Kreislauf entfernt, während die Trägerprotein- Untereinheit SM-C davor schützt. (Auf 15% SDS [Natriumdocecylsulfat] gelaufene Polyacrylamidgele wiesen darauf hin, daß alle ¹²&sup5;I-Counts SM-C waren; das heißt, es gibt kein freies ¹²&sup5;I, das den Versuch stört.) Das fortgesetzte Auftreten der restlichen Menge an freiem SM-C nach 7,5 min kann darauf zurückzuführen sein, daß SM-C ungesättigte Ratten-Trägerprotein-Untereinheitsmoleküle besetzt. Offensichtlich waren nicht genug endogene Trägerprotein-Untereinheiten vorhanden, um auch nur 30% des gesamten freien injizierten SM-C zu binden. Es ist zu beachten, daß nicht genug endogene ungeättigte Trägerprotein-Untereinheiten bei Ratten oder Menschen vorhanden sind, um therapeutisch nützlich zu sein. Daher muß SM-C an seine Trägerprotein-Untereinheit komplexiert verabreicht werden.

Rekombinante DNA- und trägerproteinartige Polypeptide Herstellung von Oligonukletoidsonden auf Basis der Proteinsequenzinformation

Das Trägerprotein enthält Untereinheiten, die isoliert werden können und die Fähigkeit zum Binden von Somatomedinen beibehalten, einschließlich von Untereinheiten, die, wenn sie glykosyliert sind, ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 15, 21, 26, 30 und 45 kDa aufweisen, und deutlich weniger, wenn sie nicht glykosyliert sind oder anderen post-translationalen Modifkationen ausgesetzt werden. Wenn die N-terminalen Sequenzen der Untereinheiten gleich sind und das/die gleiche(n) Gen(e) für die verschiedenen Untereinheiten kodiert/kodieren, sollte es möglich sein, eine Sonde auf Basis einer gemeinsamen N-terminalen Sequenz herzustellen, um DNA zu identifizieren, die für trägerproteinartige Polypeptide kodiert. Eine als S-15 identifizierte Trägerprotein- Untereinheit wurde wie in Beispiel 2 isoliert und gereinigt. Das Protein S-15 wurde carboxymethyliert und N-terminaler Sequenzanalyse unter Verwendung eines Gasphasen-Proteinsequenzers von Applied Biosystems, Modell 470, durch automatisierten Edman-Abbau unterzogen. Die ersten 42 Aminosäuren sind Fig. 1 zu entnehmen. Außerdem wurde die Untereinheit S-15 mit der Protease Trypsin gespalten, die spezifisch nach Argininen und Lysinen spaltet, falls auf nicht Lysin Prolin folgt. Im speziellen wurde carboxymethyliertes S-15 mit Trypsin in 0,3 M Natriumbicarbonat, pH 8,0, digeriert. Die Trypsin-Fragmente wurden mittels RP-HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub4;-Säule getrennt. Die gereinigten Fragmente wurden gesammelt und sequenziert, wie oben beschrieben. Die Sequenzen mehrerer solcher Trypsin-Fragmente, die als T-1, T-6, T-7, T-1' und T-10 bezeichnet werden, sind ebenfalls in Fig. 1 gezeigt. Aufgrund der Homologie zwischen dem Aminoterminus und Trypsin-Fragment T-7 wurde ermittelt, daß die ersten 57 N-terminalen Aminosäuren der Untereinheit S-15, mit zwei unbestimmten Aminosäuren, wie in Fig. 2a gezeigt sind.
Aus diesem Molekül wurden viele Oligonukleotide konstruiert, um als Sonden zum Screenen von cDNA-Bibliotheken zu dienen. Diese umfassen kurze degenerierte Sonden und lange codon-gerichtete Sonden. Ein Oligonukleotid, das einem als 48mer identifizierten N-terminalen Molekül mit 57 Aminosäuren entspricht, wird in Fig. 2a gezeigt.

Selektion von Geweben zur Herstellung von PolyA±-RNA die Trägerprotein-mRNA enthält

Die zum Isolieren von Trägerproteingenen eingesetzte Strategie bestand darin, ein Gewebe zu identifizieren, das große Mengen Trägerprotein erzeugt, mRNA von diesem Gewebe zu isolieren, eine cDNA-Bibliothek aus dieser mRNA zu konstruieren und das Gen unter Verwendung von Oligonukleotidsonden zu screenen. Die Hoffnung war die, daß eine angereicherte cDNA-Sammlung mehr Kopien eines solchen Gens enthalten würde als eine genomische (Gesamt-DNA-)Bibliothek, die vielleicht nur eine Kopie enthält. Es gab keine Information in der Literatur, um festzustellen, welches Gewebe oder welcher Zelltyp das Trägerprotein erzeugt, ein Protein, das im Serum vorkommt. Es war gezeigt worden, daß Fibroblasten geringe Mengen eines großen aber ansonsten uncharakterisierten Somatomedinbindeproteins erzeugen (Adams et al., oben). Es ist jedoch bekannt, daß der Großteil des SM-C in der Leber synthetisiert wird. Außerdem wird SM- C von Fibroblasten und anderen Geweben, wie z.B. Herz, Knochen, Plazenta und Niere, synthetisiert. Da spekuliert wurde, daß SM-C und das Trägerprotein von den gleichen Geweben synthetisiert werden, wurden daher die Leber- und Fibroblastenzellen als zwei potentielle Quellen der für das Trägerprotein kodierenden mRNA gewählt.
Um eine Gewebe- oder Zellinienquelle solcher mRNA zu identifizieren, wurden von mehreren menschlichen Lebern isolierte RNAs hergestellt und auf ihre Fähigkeit, die Synthese von Trägerprotein zu lenken, getestet. Außerdem wurden verschiedene Fibroblasten-Zellinien auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Trägerprotein getestet.

Herstellung von PolyA±-hältiger RNA

Gesamt- und PolyA&spplus; enthaltende RNA wurden nach Standardverfahren aus verschiedenen Lebergeweben und Fibroblastenzellen isoliert (J.M. Chirgwin, A.E. Pryzbyla, R.J. Macdonald, W.J. Rutter, Biochemistry 18, 5294-5299 (1979), und P.L. Ivesen, J.E. Mata und R.N. Hines, Biotechniques 5, 521-523 (1987).) Entweder Gewebe (z.B. Leber) oder Zeilen (z.B. Fibroblasten) wurden in GIT-Puffer (4 M Guanidiniumisothiocyanat, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6) homogenisiert. Bruchstücke wurden entfernt und der RNA-hältige Überstand in 2% Sarkosyl (Natriumlauroylsarkosinat) und 1% β-Mercaptoethanol übergeführt. Das Gemisch wurde dann durch einen Cäsiumchloridgradienten zentrifugiert. Die Pellets wurden resuspendiert, mit Phenol und Chloroform extrahiert und daraufhin mit Ethanol ausgefällt. PolyA&spplus;-RNA, die die mRNA darstellt, wurde aus Gesamt-RNA gereinigt, indem Gesamt-RNA über eine Oligo-dT-Zellulosesäule (H. Aviv & P. Leder [1972] PNAS 69:1408) laufen gelassen wurde. Die resultierende PolyA&spplus; enthaltende RNA wurde mit 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS) aus der Säule eluiert, eingeengt und zur weiteren Verwendung gelagert. Den Leber-PolyA&spplus;-RNAs wurden die Namen H10 und H14 gegeben, was auf die Leberprobe hinweist, aus der sie gereinigt wurden, und den Fibrobastenzellen- PolyA&spplus;-RNAs wurden die Codenamen W138, HS27, MRC5, 8387 und MDA-MB-231 gegeben, die die Zellquelle der RNA angeben.

Testen von RNA auf Translationsprodukte

Ein Aliquot menschlicher Leber-PolyA&spplus;-RNA von H10 und H14 wurde in vitro unter Verwendung eines Kaninchen-Reticulozyten-Translationssets mit ³³S-Methionin nach Standardverfahren translatiert (L.G. Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier, New York, NY, 1986)). Die Proteintranslationsprodukte wurden mit einem von Robert C. Baxter (Royal Prince Alfred Hospital, Australia) bereitgestellten und nach J.L. Martin et al. "Antibody Against Acid-Stable Insulin-like Growth Factor Binding Protein", J. Clin. Endocrinol. Metab. 261, S.799-801 (1985), hergestellten Antikörper (nach Davis) immungefällt. Dieser Antikörper wurde gegen Material hergestellt, das die sogenannte säurestabile Untereinheit des von menschlichem Serum erhaltenen Trägerproteins enthielt. Immungefällte Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Es wurden Proteinbanden mit etwa 68.000, 43.000, 39.000 und 32.000 Dalton identifiziert, die spezifisch mit Antiträgerprotein-Untereinheits-Antikörper reagierten. Die Proteine wurden nicht mit einem Vergleichsserum gefällt, das keine Anti- Trägerprotein-Untereinheits-Antikörper enthielt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß Trägerprotein von der Leber erzeugt wird und daß eine aus Leber-mRNA hergestellte cDNA-Bibliothek das Trägerproteingen enthalten sollte.
Auch mehrere Fibroblastenzellinien wurden auf ihre Fähigkeit zur Produktion des Trägerproteins getestet. Beispielsweise wurden embryonale WI38-Fibroblasten (ATCC Nr. CCL-75) bis zu 70-80%-iger Konfluenz in DMEM-F12-Medien gezüchtet, die 10% Kalbfötenserum enthielten. Die Zellen wurden in serumfreie Medien übergeführt und 72 h lang inkubiert. Die Kulturüberstände wurden geerntet und durch TCA-Fällung oder Zentrifugieren konzentriert. Proben wurden einer SM-Western-Analyse unterzogen (wobei der SDS-PAGE-Schritt unter nichtreduzierenden Bedingungen erfolgte), was zeigte, daß WI38-Zellen zumindest 4 Proteine synthetisierten und ausschieden, die zur Bindung von SM-C fähig sind, und zwar im Größenbereich von 25.000-45.000 Dalton. Davon wurde ein Protein mit etwa 40.000 Dalton (durch reduzierende SDS-PAGE) spezifisch vom Anti-Trägerprotein-Untereinheits-Antikörper erkannt. Bei diesem Versuch umfaßte die 72stündige Inkubation von WI38-Zellen in serumfreiem Medium die Zugabe von ³&sup5;S-Cystein. Die Proteine wurden mit Anti-Trägerprotein-Untereinheits-Antikörper immungefällt und unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE analysiert.
Andere Zellinien, die für Trägerprotein-Untereinheiten kodieren, die beide von Anti- Trägerprotein-Untereinheits-Antikörper erkannt und von SM-C gebunden wurden, sind HS27 (menschliches Fibroblast), MRC5 (menschliches Fibroblast), 8387 (menschliches Fibrosarkom) und MDA-MB-231 (menschlicher Brustkrebs). Es wird erwartet, daß aus anderen Fibroblastenlinien isolierte PolyA&spplus;-RNA ebenfalls für Trägerprotein kodiert.
Es ist festzustellen, daß das aus diesen Quellen erhaltene PolyA&spplus;-RNA-Produkt eine sehr große Anzahl verschiedener mRNAs enthält. Die anderen mRNAs als die für Trägerprotein oder Trägerprotein-Untereinheiten spezifische mRNA sind unerwünschte Verunreinigungen. Unglücklicherweise können sich diese verunreinigenden RNAs während des gesamten restlichen Klonierverfahrens gemäß vorliegender Erfindung ähnlich wie Trägerprotein-Untereinheits-mRNA verhalten. Daher führt ihre Gegenwart in der PolyA&spplus;- RNA zur schlußendlichen Herstellung einer großen Zahl unerwünschter bakterieller Klone, die Gene enthalten, die für andere Polypeptide als Trägerprotein kodieren. Diese Verunreinigung bringt komplexe Screening-Probleme beim Isolieren der gewünschten Trägerprotein-Hybridklone. Im Fall von Trägerprotein wurde das Screening-Problem durch Fehlen einer ausreichend gereinigten Probe von Trägerprotein-mRNA oder -DNA oder eines Abschnitts davon, die als Screening-Sonde zur Identifizierung der gewünschten Klone wirkt, verschärft. Die einzigen verfügbaren Sonden waren jene auf Basis der begrenzten N-terminalen Proteinmolekülinformation. Daher ist das Screening-Verfahren für die Trägerproteinklone sehr zeitaufwendig und schwierig. Weiters ist, weil erwartet wird, daß nur ein sehr kleiner Prozentsatz an Trägerproteinklonen trägerproteinartiges Polypeptid in biologisch oder immunologisch aktiver Form exprimiert, die Isolation eines aktiven Klones ein schwieriges Screening-Verfahren.

Synthese doppelstrangiger cDNA die Trägerprotein-cDNA enthält

PolyA&spplus;-RNA, die Trägerprotein-mRNA enthält, wurde als Schablone zur Herstellung komplementärer DNA ("cDNA") im wesentlichen wie von Gubler und Hoffman beschrieben verwendet. cDNA-Sammlungen wurden aus den mRNAs hergestellt, von denen gezeigt worden war, daß sie für potentielle trägerproteinartige Polypeptide kodieren. Die Sammlungen wurden im λ-Vektor gt10 konstruiert, konnten aber auch in anderen Vektoren konstruiert werden. (zB λ-gt11 [R.A. Young & R.W. Davis (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.\80, 1194-1198]). Doppelstrangige cDNA wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von Gubler-Hoffan (U.Gubler & B.J. Hoffman, (1983) Gene 25, 263-269) erzeugt. Nach dieser Arbeitsvorschrift wurde der erste cDNA-Strang unter Einsatz von reverser Transkriptase nach Moloney synthetisiert, um die PolyA&spplus;- RNA zu kopieren. Die nachstehend beschriebenen Bibliotheken umfassen eine zufallsgeprimte menschliche Leber-cDNA-Bibliothek (H14), zwei oligo-dT-geprimte menschliche Leber-cDNA-Bibliotheken (H14, H10/H14 [ein Pool von H10 und H14]), sowie eine oligo-dT-geprimte menschliche embryonale Fibroblasten-Bibliothek (WI38). Zufallsprimer (pd(N)&sub6;) und Oligo-dT (pT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;)-Primer wurden von Pharmacia erhalten. Der zweite Strang wurde unter Verwendung einer Kombination aus RNAseH und DNA- Polymerase I erzeugt.
Die resultierende cDNA-Population ist tatsächlich ein komplexes Gemisch aus cDNAs, die von den verschiedenen mRNAs herrühren, die in der PolyA&spplus;-RNA vorhanden waren. Außerdem sind wegen der vorzeitigen Terminierung durch reverse Transkriptase von Moloney viele der cDNAs unvollständige Kopien der verschiedenen mRNAs in der PolyA&spplus;-mRNA.

Klonieren doppelstrangiger cDNA

Zum Klonieren oder Exprimieren der wie oben beschrieben hergestellten doppelstrangigen cDNA kann eine große Vielzahl von Wirtsvehikelkombinationen eingesetzt werden. Beispielsweise können nützliche Klonier- oder Expressionsvehikel aus Segmenten chromosomaler, nichtchromosomaler und synthetischer DNA-Moleküle bestehen, wie z.B. verschiedene bekannte Derviate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z.B. Plasmide von E.coli, einschließlich von col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und deren Derivate, Plasmide aus einem größeren Wirtsbereich, z.B. RP4, Phagen- DNAs, z.B. die zahlreichen Derivate von X-Phagen, z.B. NM 989, und andere DNA- Phagen, z.B. M13 und filamentöse einstrangige DNA-Phagen und Vektoren, die von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie z.B. Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen-DNA oder andere Expressionskontrollmoleküle einzusetzen, oder Hefeplasmide, wie z.B. das 2 µ-Plasmid oder Derivate davon. Geeignete Klonier- oder Expressionswirte können bakterielle Wirte, wie z.B. E.coli HB 101, E.coli X1776, E.coli X2282, E.coli MRCI, E.coli LE 392, E.coli C600 und Stämme von Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus und andere Bakterien, Hefen sowie andere Pilz-, Tier-, Insekten- oder Pflanzenzellen umfassen. Selbstverständlich sind möglicherweise nicht alle Wirt/Vektor-Kombinationen gleichermaßen effizient. Die jeweilige Wahl der Wirt-Vehikel-Kombination kann von Fachleuten nach reiflicher Überlegung der hierin dargelegten Prinzipien getroffen werden, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Weiters können innerhalb jedes spezifischen Klonier- oder Expressionsvehikels verschiedene Stellen zum Einfügen doppelstrangiger DNA ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise nach der Restriktionsendonuklease bezeichnet, die dort spaltet. Diese Stellen sind für Fachleute leicht zu erkennen. Es versteht sich natürlich, daß ein gemäß vorliegender Erfindung geeignetes Klonier- oder Expressionsvehikel nicht notwendigerweise eine Restriktionsendonukleasenstelle zum Einfügen des gewählten DNA-Fragments aufweist. Stattdessen könnte das Vehikel durch alternative Mittel an das Fragment angefügt werden.
Das/der Klonier- oder Expressionsvehikel oder -vektor und insbesondere die darin gewählte Stelle zum Anbringen eines gewählten DNA-Fragments zur Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls wird durch eine Vielzahl an Faktoren bestimmt, z.B. die Anzahl der für ein spezielles Restriktionsenzym anfälligen Stellen, die Größe des zu exprimierenden Proteins, die Anfälligkeit des gewünschten Proteins für proteolytischen Abbau durch Wirtszellenzyme, die Verunreinigung oder Bindung des zu exprimierenden Proteins durch Wirtszellproteine, die während der Reinigung schwer zu entfernen sind, Expressionseigenschaften, wie z.B. Position von Start- und Stopcodons relativ zu den Vektormolekülen, und andere Faktoren, die Fachleuten klar sind. Die Wahl eines Vektors und einer Einfügungsstelle für ein spezielles Gen wird durch ein Gleichgewicht dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht jede Wahl für einen bestimmten Fall gleichermaßen wirksam ist.
Nach dem Stand der Technik sind zwar mehrere Verfahren bekannt, um fremde DNA in ein Kloniervehikel oder einen Expressionsvektor einzufügen, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu bilden, das zum anfänglichen Klonieren gemäß vorliegender Erfindung bevorzugte Verfahren ist jedoch Digerieren von λ-gt10 mit EcoRI. Die doppelstrangige cDNA wird dann mit dieser λ-gt10-DNA ligiert, nachdem den cDNA-Molekülen zuerst EcoRI-Linker zugesetzt werden. Das resultierende rekombinante DNA-Molekül trägt nun ein eingefügtes Gen in einer gewählten Position des Kloniervektors.
Selbstverständlich sind auch andere bekannte Verfahren zum Einfügen von DNA-Molekülen in Klonier- oder Expressionsvehikel zur Bildung rekombinanter DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung gleichermaßen geeignet. Diese umfassen beispielsweise dA-dT-Tailing, direkte Ligation, synthetische Linker, exonuklease- und polymeraseverbundene Reparaturreaktionen, gefolgt von Ligation, oder Verlängerung des DNA- Strangs mit DNA-Polymerase sowie eine geeignete einstrangige Schablone, gefolgt von Ligation.
Es versteht sich natürlich, daß die Nukleotidmoleküle von cDNA-Fragmenten, die an ausgewählter Stelle des Kloniervehikels eingefügt sind, gegebenenfalls Nukleotide umfassen, die nicht Teil des tatsächlichen Gens sind, das für das gewünschte Polypeptid kodiert, oder gegebenenfalls nur ein Fragment des vollständigen Gens für das gewünschte Protein umfassen. Gleichgültig, welches DNA-Molekül schlußendlich eingefügt wird, ist nur erforderlich, daß ein transformierter Wirt ein Polypeptid mit somatomedinregulierender biologischer Aktivität des Trägerproteins erzeugt, das zur Bindung von somatomedinartigen Polypeptiden fähig ist, oder daß das DNA-Molekül selbst als Hybridisierungssonde verwendet wird, um Klone zu selektieren, die DNA-Moleküle enthalten, die für die Herstellung von Polypeptid mit solcher biologischer und Bindungsaktivität nützlich sind.
Das Kloniervehikel oder der Expressionsvektor, das/der das fremde Gen enthält, wird eingesetzt, um einen Wirt so zu transformieren, daß es diesem Wirt möglicht ist, trägerproteinartige Polypeptide zu exprimieren. Die Wahl des geeigneten Wirts wird auch durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Dazu gehören beispielsweise Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, Toxizität von Proteinen, für die das Hybridplasmid kodiert, leichte Gewinnung des gewünschten Proteins, Expressionsmerkmale, Sicherheit und Kosten. Ein Gleichgewicht dieser Faktoren muß unter dem Gesichtspunkt erreicht werden, daß für das Klonieren oder die Expression eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls nicht alle Wirte gleichermaßen wirksam sind.
Bei der vorliegenden Synthese ist das bevorzugte anfängliche Kloniervehikel λ-gt10, und die bevorzugte anfängliche Restriktionsendonukleasestelle ist EcoRI. Der bevorzugte anfängliche Wirt ist E.coli.
EcoRI-gespaltene λ-gt10-DNA (Promega) wurde an cDNA-Moleküle mit EcoR1-Linker ligiert, die wie von T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) und L.G. Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier, New York, NY 1986) ("Maniatis"), beschrieben hergestellt wurden.
Die nach dem Ringschluß erhaltene Hybrid-DNA ist natürlich ein großes Gemisch aus verschiedenen rekombinanten DNA-Molekülen und einigen Kloniervehikeln ohne eingefügte DNA-Moleküle. Jedes rekombinante DNA-Molekül enthält jedoch ein cDNA- Segment an der EcoRI-Stelle. Jedes derartige cDNA-Segment kann ein Gen oder ein Fragment davon umfassen. Nur sehr wenige cDNA-Fragmente kodieren für Trägerprotein oder einen Abschnitt davon. Die große Mehrheit kodiert für eines der anderen Proteine oder Abschnitte davon, deren mRNAs Teil der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten PolyA&spplus;-RNA waren. Es versteht sich auch, daß es möglich ist, daß keiner der Klone der oben hergestellten Bibliothek die Expression von trägerproteinartigen Polypeptiden zulassen kann. Stattdessen sind sie möglicherweise nur zum Screenen und Identifzieren eines solchen Klons geeignet.
Die resultierenden λ-DNA-Vektoren, die cDNA-Einfügungen enthalten, wurden unter Verwendung eines λ-Phagen-Packungssets (Stratagene) in λ-Phagen gepackt.
E.coli-Zellen (z.B. C600 hfl) wurden mit dem rekombinanten Phagen infiziert und auf Platten mit angereichertem Medien (z.B. LB) aufgebracht. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert, bis Phagenplaques sichtbar waren.
Die Phagenplaques (Klone) enthalten eine Vielzahl rekombinanter DNA-Moleküle, die nach Größen getrennte, vollständige oder teilweise Kopien des Gemisches von PolyA&spplus;- RNA enthalten, das aus der Leber erhalten wird. Jede dieser Plaques enthält ein einzelnes rekombinantes DNA-Molekül. Es sind jedoch nur sehr wenige dieser rekombinanten DNA-Moleküle mit Trägerprotein verbunden. Demgemäß müssen die Klone gescreent werden, um die mit Trägerprotein verbundenen Klone von den anderen zu trennen.

Screenen nach einem Klon, der Trägerprotein-cDNA enthält

Es gibt mehrere Ansätze zum Screenen nach Klonen, die Trägerprotein-cDNA enthalten. Diese umfassen beispielsweise RNA-Selektionshybridisierung, Differentialhybridisierung; Hybridisierung mit einer synthetischen Sonde oder Screenen nach Klonen, die das gewünschte Protein enthalten, mittels immunologischer oder biologischer Assays. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstands haben Hybridisierung mit einer synthetischen Sonde als geeignetstes und vielversprechendstes Verfahren für das Primärklonscreening gewählt.
Es gibt keine Garantie, daß die rekombinanten DNA-Moleküle und die damit transformierten Bakterienkulturen, die durch Hybridisierung mit einer Sonde identifiziert werden, das vollständige Trägerprotein-cDNA-Molekül enthalten oder daß das DNA- Molekül tatsächlich für Trägerprotein kodiert oder es dem Klon ermöglicht, ein trägerproteinartiges Polypeptid zu exprimieren. Die rekombinanten DNA-Moleküle enthalten jedoch sicherlich zahlreiche Nukleotidmoleküle, die zum Trägerprotein-UntereinheitsmRNA-Kodiermolekül komplementär sind. Daher kann das rekombinante DNA-Molekül zumindest als Quelle für eine Sonde verwendet werden, um rasch andere rekombinante DNA-Moleküle und damit transformierte Klone zu screenen, die ein authentisches oder vollständiges Trägerprotein-Untereinheitsnukleotid-Kodiermolekül enthalten. Diese Klone können dann direkt auf mögliche Expression von Polypeptiden analysiert werden, die die biologische und Bindungsaktivität von Trägerprotein aufweisen. Was wichtiger ist, das Nukleotidmolekül des eingefügten DNA-Fragments dieser Hybridplasmide und sein Aminosäure-Translationsprodukt kann unter Einsatz herkömmlicher Mittel ermittelt und dieses DNA-Molekül verwendet werden, um geeignete Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Synthese von trägerproteinartigen Polypeptiden in geeigneten Wirten, die damit transformiert sind, zulassen.

Oligonukleotidsondenhybridisierung

Die Phagen-cDNA-Bibliothek wurde mit E.coli vermischt und auf LB (angereicherte Medien) Platten aufgebracht. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert, bis Phagenpaques sichtbar waren. Jede Plaque stellt einen Klon eines einzigen λ-gt10-Phagen dar, der eine cDNA-Einfügung enthält. Pro Versuch wurden etwa 0,5-1,0 Millionen Phagenpaques analysiert.
Die Analyse wurde durchgeführt, indem die Phagen-DNA dieser Plaques unter Einsatz von Standardtechniken (Davis und Maniatis) von den Platten auf Nitrocellulosefilter (0,45 µm Porendurchmesser von Schleicher und Schuell oder Millipore) übertragen wurden. Daher war das DNA-Muster auf dem Filter eine Replik des Plaquemusters auf der Platte. Nach der Identifizierung von Einfügungen, die innerhalb von Phagen-DNA enthalten waren, die mit der Sonde hybridisierte, können die Filter den Platten und isolierten Phagen zugeordnet werden.
Eine Oligonukleotidsonde, das 48mer, aus 48 Basen (in Fig. 2a gezeigt) wurde verwendet, um die zufallsgeprimte menschliche Leber-cDNA-Bibliothek H14 zu screenen. Die Sonde ensprach dem Molekül, das jene Nukleotide umspannt, die für die Aminosäuren Ala[29] bis Leu[44] der Trägerprotein-Untereinheit S-15 kodieren. Dieses einzelne Oligonukleotid war dazu bestimmt, den Bias für menschliche Codons zu maximieren.
Die Hybridisierungsbedingungen wurden durch Binden der Sonde mit 48 Basen (48mer) an Southern Blots menschlicher genomischer DNA von der Plazenta und einer synthetischen DNA mit 181 bp, die für die Aminosäuren Gly[1] bis Tyr[57] (in Fig. 2b) gezeigt unter anderen Schärfebedingungen bestimmt. Die endgültigen Bedingungen der Hybridisierung, welche die Genidentifizierung mit minimalem Hintergrund zulassen, waren 40% Formamid, 5X SSPE (0,9 M Natriumchlorid, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 5 mM EDTA), 42ºC.
Die Nitrocellulosefilter, die Repliken der Phagenplaques der zufallsgeprimten menschlichen H14-Leber-cDNA-Bibliothek enthielten, wurden unter Einsatz der oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen mit ³²P-markiertem 48mer hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte üblicherweise über Nacht, und die Filter wurden vor der Autoradiographie mehrmals mit 0,1X SSC (15 mM Natriumchlorid, 1,5 mM Natriumzitrat, pH 7,0), 0,1% SDS bei 45-50ºC gespült. DNAs, die stark an das 48mer hybridisierten, wurden durch Autoradiographie identifiziert, und die entsprechenden Phagenpaques wurden isoliert. Da die ursprüngliche Phagenplattierung in hoher Dichte erfolgte, war eine zweite Plattierungs- und Screeningrunde erforderlich, um einzelne Plaques zu isolieren. Diese zweite Screeningrunde verifizierte auch, daß die ursprünglichen isolierten Phagenpaques tatsächlich an das 48mer hybridisierten. Von den Platten wurden einzelne Plaques ausgewählt, und der Phage wurde in Phagenpuffer (100 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,01% Gelatine) eluiert. Nach dem Entfernen der Bakterien durch Zentrifugieren wurden diese Phagenstammösung auf 4ºC gehalten. Phagen-DNA wurde nach Standardverfahren (z.B. Maniatis) gereinigt und charakterisiert (d.h. durch Restriktionsendonukleasen, wie EcoRI, gespalten, um die Einfügungsgröße zu ermitteln). Die Einfügungen wurden an der EcoRI-Stelle unter Einsatz von Standardverfahren häufig in kleinere Plasmide, wie pBR322 oder pGEM, subkloniert.
Eine Anzahl positiver Plaques wurde identifiziert (48 pro 600.000 gescreenter Plaques). Davon wurden 9 für die weitere Analyse gewählt. Zwei von diesen Klonen (als cLCP 0,70 und cLCP 0,77 bezeichnet), die eine Größe von etwa 700 bis 800 bp hatten und die stärkste Bindung durch die 48mer-Sonde aufwiesen, wurden vor dem Sequenzieren in kleinere Fragmente gespalten.
An das 48mer hybridisierende Fragmente, die anfängliche Sequenzierungskandidaten wären, wurden auf folgende Weise identifiziert: Die cDNA-Einfügungen LCP 0,70 und LCP 0,77 wurden mit Restriktionsendonuklease HaeIII gespalten. Diese Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit einer ³²P-markierten 48mer-Sonde sondiert. Wenn HaeIII-Fragmente sondiert wurden, band nur ein Frgment das 48mer. Dieses Fragment mit 90 bp war in beiden Klonen LCP 0,70 und LCP 0,77 vorhanden. Es wurde nach F. Sanger et al., "Proc. Natl. Acad. Sci." 74, S.5463 (1977) isoliert. Die DNA-Moleküle der Fragmente mit 90 bp sowohl von LCP 0,70 als auch LCP 0,77 entsprachen genau der Trägerprotein-Untereinheit S-15-Aminosäuresequenz, die Gln[23] bis Glu[50] umspannt, wie nachstehend gezeigt. Die obere Zeile stellt die ersten 57 Aminosäuren der Trägerprotein-Untereinheit S-15 dar, und die untere Zeile stellt die Translation der 84 bp HaeIII-Fragmente dar. Die eine Nichtübereinstimmung ist das Ergebnis der Tatsache, daß die Aminosäure an Position 45 nicht identifiziert war. DNA-Molekülanalyse identifizierte sie als Threonin (T).
Diese Klone wurden als cLCP 0,70 und cLCP 0,77 bezeichnet, ihre rekombinanten DNA-Moleküle als λ-gt10:LCP 0,70 und λ-gt10: LCP 0,77, und ihre DNA-Einfügungen als LCP 0,70 und LCP 0,77. Diese Nomenklatur weist darauf hin, daß der Klon und das rekombinante DNA-Molekül Phagen-λ-gt10 umfaßt, der mit Trägerprotein in Verbindung stehende cDNA enthält, die aus Leber-cDNA isoliert wurde.
Es wurde gezeigt, daß die Einfügungen LCP 0,70 und LCP 0,77 ähnlich sind, was Größe und Restriktionsstellen betrifft. Die Einfügungen LCP 0,70 und LCP 0,77 haben etwa 700 bzw. 770 bp. Die Restriktionskarten für LCP 0,70 und LCP 0,77 werden in Fig. 3a gezeigt. Die DNA-Sequenzen der LCP 0,70- und LCP 0,77-Einfügungen, die sowohl durch einzel- als auch doppelstrangige Didesoxysequenzierung erhalten werden (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 (1977)), sind in der in Fig. 4 gezeigten Sequenz als Nukleotide 1-699 bzw. 7-769 enthalten. Zusätzlich zum Aminoterminus entsprachen die Trypsin-Fragmente T1' und T10 den DNA-Molekülen dieser Klone. LCP 0,70- und LCP 0,77 sind ausreichend groß, um für Proteine mit 17.558 und 20.320 Dalton zu kodieren. Daher ist die zum Kodieren des gesamten S-15-Moleküls erforderliche Information in diesen Einfügungen enthalten.

Identifizierung von Klonen, die für Trägerprotein kodierende DNA-Sequenzen enthalten, durch Kreuzhybridisierung entweder an LCP 0,70 oder LCP 0,77

Die wie oben beschrieben isolierten rekombinanten DNA-Moleküle und DNA- Einfügungen der Klone cLCP 0,70 und cLCP 0,77 wurden verwendet, um die Bibliothek von Klonen zu screenen, die zuvor durch Hybridisierung an Phagenplaques hergestellt worden war. Dieses Verfahren ermöglicht die rasche Identifizierung verwandter Klone durch Hybridisierung einer radioaktiven Sonde aus LCP 0,70 an DNA rekombinanter Phagen, die auf Nitrocellulosefilter fixiert sind.
Nitrocellulosefilter, die Phagen-DNAs enthalten, die den von den LB-Platten übertragenen Phagenplaques entsprachen, wurden wie oben beschrieben hergestellt.
Entweder das LCP 0,70-Restriktionsfragment mit 700 bp oder das LCP 0,77-Eco-RI- Restriktionsfragment mit 770 bp wurde verwendet, um zufallsgeprimte menschliche Leber-cNDA-Bibliothek H14, oligo-dT-geprimte menschliche Leber-cDNA-Bibliothek H10/H14 und oligo-dT-geprimte menschliche Embryonalfibroblasten-cDNA-Bibliothek WI38 zu screenen. Diese Sonden könnten auch verwendet werden, um andere cDNA- Bibliotheken zu screenen, die unter Verwendung von RNAs von anderen Geweben konstruiert wurden, die für das Trägerprotein kodieren. Außerdem könnten sie verwendet werden, um genomische Bibliotheken zu screenen.
Das Sondenfragment (LCP 0,70 oder LCP 0,77) wurde durch Elektrophorese der EcoRI- Spaltprodukte der rekombinanten DNA-Moleküle (um die Einfügung vom Kloniervehikel abzutrennen) in etwa 1% Agarosegel gereinigt, gefolgt von Elektroelution auf DE81- Papier. Das jeweilige Fragment wurde dann konzentriert und durch "Nick-Translation" nach Standardverfahren ³²P&supmin;markiert.
Die Hybridisierung der obigen Sonde an den Nitrocellulosefilter, der die cDNA-Klone enthielt, wurde im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt.
Etwa 500.000 Klone, die aus der oligo-dT-geprimten menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek H10/H14 stammten, und etwa 500.000 Klone, die aus der oligo-dT-geprimten menschlichen embryonalen Fibroblasten-cDNA-Bibliothek WI38 stammten, wurden gescreent.
Die Häufigkeit der positiven Signale in der W138-Fibroblasten-Bibliothek betrug etwa 0,1%, während die Häufigkeit der Leberbibliotheken nur 0,01-0,02% betrug. Positive Klone wurden plaquegereinigt und durch Restriktionskartierung und Sequenzanalyse charakterisiert, um andere Klone zu identifizieren, die Trägerprotein-cDNA enthalten. Die Klone wurden unter Einsatz ein- und doppelstrangiger Sequenzierungstechniken (Sanger) sequenziert.
Ein Klon, der eine 2,3 kb Einfügung enthielt (cLCP 2,3) wurde aus oligo-dT-geprimter menschlicher Leber-cDNA-Bibliothek H10/H14 isoliert, die die trägerproteinartige Kodiersequenz voller Länge enthält. Klone, die Einfügungen mit 1,8 kb (cFCP 1,8) bzw. 2,5 kb (cFCP 2,5) enthielten, wurden aus der oligo-dT-geprimten W138-FibroblastencDNA-Bibliothek isoliert. DNA-Sequenzanalyse der Klone (Fig. 4) zeigte, daß beide die gesamte trägerproteinartige Polypeptidkodiersequenz enthalten. Das kodierte Protein besteht aus einem Leader mit 27 Aminosäuren (81 Nukleotide) plus einer reifen Kodierregion mit 264 Aminosäuren (792 Nukleotiden). Sowohl die Leber- als auch die Fibroblastenklone weisen im wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz in der Kodierregion auf. Einer der Leberklone kodiert für ein GLY anstelle eines ALA an der Aminosäureposition 5, wobei Position 1 die erste Aminosäure des reifen Protein ist. Diese Polymorphie entspricht jener, die in Trägerprotein-Untereinheiten beobachtet wird, die aus Cohn Fraktion IV-1 gereinigt werden.
Northern-Analyse von menschlicher embryonaler W138-RNA, menschlichen Leber- RNAs H10/H14, menschlicher Plazenta-RNA und Makaken-Leber-RNA unter Verwendung von LCP 0,70 oder LCP 0,77 als Sonde wies darauf hin, daß die TrägerproteinmRNA eine Größe von etwa 2.000 - 2.500 Basen aufweist. Daher stellen die 2,2-2,4 kb- Klone wahrscheinlich cDNAs voller Länge dar, die diesen RNAs entsprechen. Die Analyse der menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek und von Klon cLCP 2,3 durch Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Amplifikation (R.K. Saiki et al., Science 239, S.487-491 [1988]) weist darauf hin, daß cLCP 2,3 eine kleine Löschung von etwa 200 bp in der untranslatierten 3'-Region aufweisen kann. Tatsächlich wurde vor kurzem ein Klon aus der Leber-cDNA-Bibliothek isoliert, der eine 2,5 kb-Einfügung enthält (cLCP 2,5). Diese Einfügung (LCP 2,5) ist mit Ausnahme einer 200 bp-"Einfügung" zwischen der Xhol- Stelle bei 1063 und der Sphl-Stelle bei 1270 (Fig. 3b) die gleiche wie LCP 2,3. LCP 2,5 ist im wesentlichen analog zu FCP 2,5.
Es ist natürlich klar, daß dieses Verfahren des Klonscreenings unter Verwendung der DNA-Einfügung der Klone LCP 0,70 und LCP 0,77, wie oben beschrieben, ebenso gut für andere Klone eingesetzt werden kann, die DNA-Moleküle enthalten, die aus rekombinanter DNA-Analyse, -Synthese, natürlichen Quellen oder einer Kombination daraus stammen, sowie für Klone, die DNA-Moleküle enthalten, die mit einem der obigen DNA-Moleküle durch Mutation, einschließlich von einfachen oder mehrfachen Basen- Substitutionen, -Insertionen, -Inversionen oder -Deletionen, mit einem der obigen DNA- Moleküle verwandt sind. Daher fallen derartige DNA-Moleküle und deren Identifizierung ebenfalls in den Bereich der vorliegenden Erfindung. Es versteht sich auch, daß DNA-Moleküle, die nicht mit dem obigen DNA-Molekül gescreent sind, die aber als Ergebnis ihrer Nukeotidanordnung für jene Polypeptide kodieren, für welche die obigen DNA-Moleküle kodieren, ebenfalls in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen.
Außerdem sind wegen der erwarteten Homologie zwischen dem DNA-Molekül, das für das menschliche trägerproteinartige Polypeptid kodiert, und dem DNA-Molekül, das für Trägerproteine aus nichtmenschlicher Quelle kodiert, die DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung nützlich für die Wahl der DNA, die für diese nichtmenschlichen Trägerproteine kodiert, sowie zum Klonieren und Exprimieren jener nichtmenschlichen Trägerproteine zur Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen und Verfahren. Schließlich können DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung oder von ihnen abgeleitete Oligonukleotide eingesetzt werden, um andere DNA-Moleküle auszuwählen, die für trägerproteinartige Polypeptide kodieren, die gegebenenfalls nicht das Trägerprotein oder eine Trägerprotein-Untereinheit sind. Diese Moleküle und Polypeptide sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.

Expression von Polypeptiden, die Aktivität des Trägerproteins aufweisen

Die Herstellung von Polypeptiden durch Exprimieren von DNA-Molekülen, die für ein trägerproteinartiges Polypeptid kodieren, wurde in E.coli und Säugetierzellen durchgeführt.

Expression von trägerproteinartigen Sequenzen mit voller Länge und alternierender Signalsequenz in E.coli

Ein DNA-Fragment, das die gesamte Kodierregion des Trägerproteingens enthält, in dem die Signalsequenz durch die für Präproinsulin ersetzt war, wurde in den Expressionsvektor pKK233-2 (Pharmacia) ligiert. Dieser Vektor enthält einen trp-Iac-Fusionspromotor, in dem das -35 trp-Signal 17 Basen (die Konsensdistanz) von der Iac-10-Region an geordnet ist. Das Vorhandensein der Iac-Operatorsequenzen ermöglicht es, daß durch Zugabe von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Medium Expression von diesem Promotor ausgehend herbeigeführt wird. Außerdem enthält dieser Vektor die Iacz-Ribosombindungsstelle.
Die Einfügung (pDJ4219), die die mit der reifen Kodiersequenz des Trägerproteingens fusionierte Präproinsulin-Signalsequenz enthält, wurde auf folgende (in Fig. 5 gezeigte) Weise erreicht: Es wurde eine Präproinsulin-Signalsequenz synthetisiert, in der das Initiations-ATG innerhalb einer Ncol-Restriktionsstelle enthalten war. Der Signalsequenz folgen die Nukleotide GGCGCGAGCTCG, die für die ersten vier Aminosäuren des reifen Trägerproteins kodieren, bis zur Sacl-Stelle. Daher war es möglich, das in Fig. 5 gezeigte Ncol/Sacl-Fragment zu erzeugen. Dieses Fragment wurde an das Sacl/Xhol- Fragment ligiert, das den Rest der Kodiersequenz für das Trägerprotein enthält, wie ebenfalls in Fig. 5 gezeigt. Die Xhol-Stelle, die 85 bp jenseits der Translationsterminationsstelle liegt, wurde durch Zugabe von HindIII-Linker unter Einsatz von Standardverfahren in eine HindIII-Stelle umgewandelt. Das resultierende Ncol/HindIII-Fragment, das die Präproinsulin-Signalsequenz und die Trägerprotein-Kodierregeion enthält, wurde in die Ncol- und HindIII-Steln von pKK233-2 eingefügt. Die durch IPTG induzierte Expression dieses Konstrukts in E.coli lieferte ein Protein mit 25.000 - 30.000 Dalton, das durch seine Fähigkeit zum Binden von Anti-Trägerprotein-Antikörper identifiziert wurde. Die Expression erfolgte in Gegenwart von ³&sup5;S-Cystein. 2 Stunden nach der Induktion durch IPTG wurde der Zellextrakt (Cytoplasma und periplasmatischer Raum) mit Anti-Trägerprotein-Antikörper immungefällt und SDS-PAGE unterzogen. Die Fähigkeit des Trägerproteins, durch IPTG induziert zu werden, wurde gezeigt, da ohne IPTG- Induktion vermehrte Zellen, die dieses Konstrukt enthalten, nur sehr geringe Mengen des Proteins mit 25.000 - 30.000 Dalton exprimierten. Vergleiche, in denen pKK233-2 allein getestet wurde, zeigten kein Protein in diesem Größen bereich.

Expression von partiellen trägerproteinartigen Sequenzen in COS-Zellen

Insertionsfragmente von pDJ4209 und pDJ4211 (in Fig. 6 gezeigt) wurden an der einzigen Xbal-Stelle in Säugetier-Expressionsvektor pSVL oder pDJ4210 (Pharmacia) ligiert. pSVL enthält den späten Promotor, Intron und Polyadenylierungsstelle von SV40. Es weist auch den SV40- und den pBR322-Replikationsursprung auf. pDJ4210 ist pSVL ähnlich, enthält aber den Replikationsursprung von pUC19 anstelle von pBR322.
Jede dieser Einfügungen enthält ein partielles Trägerproteingen, im speziellen die ersten 120 Codons der reifen Sequenz, gefolgt von einer synthetischen Sequenz (5'- CTCTAGAG..3'), die den Leserahmen terminiert. Jede hat eine andere Steuerungsregion:
pDJ4209 enthält die gesamte untranslatierte 5'-Region (114 Nukleotide), die sich von der EcoRI-Stelle weg erstreckt, die in eine Xbal-Stelle umgewandelt wurde. Sie enthält auch die Trägerprotein-Signalsequenz. Das in pSVL enthaltene pDJ4209-Xbal-Fragment wird als pDJ4207 bezeichnet.
pDJ4211 enthält eine untranslatierte 5'-Region mit 44 Nukeotiden und die Trägerprotein-Signalsequenz. Das in pDJ4210 enthaltene pD4211-Xbal-fragment wird als pDJ4212 bezeichnet und wird in Fig. 7 gezeigt.
Die die partiellen Trägerproteine enthaltenden Vektoren wurden. in COS-Zellen transfiziert (defekte transformierte SV40-Affenzellen), um die vorübergehende Expression zu messen. Die Zeilen wurden in DMEM-F12 gezüchtet. Die Proteine wurden mit ³&sup5;S- Cystein markiert. Die Medien wurden gesammelt, mit Anti-Trägerprotein-Antikörper immungefällt und SDS-PAGE unterzogen. Expressionsstudien unter Verwendung von pDJ4212 und pDJ4207 ergaben zwei Proteine mit etwa 14.000 und 16.000 Dalton. Die Expression dieser Gene war bei pDJ4212 stärker als bei pD4207.

Expression einer trägerproteinartigen Sequenz voller Länge in CHO-Zellen

Das EcoRI/HindIII-Fragment von LCP 2,3 mit 1,66 kb, das das gesamte Trägerproteingen plus untranslatierte 5'- und 3'-Region (114 bzw. 700 Nukleotide) enthält, wurde in Säugetierexpressionvektor pKG3226 eingefügt, der einen β-Actinpromotor (in Lizenz von der Stanford University) und andere für die Expression in Säugetierzellen notwendige Funktionen enthält. Der resultierende Vektor, der als pKG4403 bezeichnet wird, wird in Fig. 8 gezeigt. pKG4403 wurde in CHO (Chinesische Hamster-Eierstock)-Zellen transformiert. Stabil transformierte Linien wurden durch Arzneimittelselektion bestimmt. Serumfreie konditionierte Medien vom transformierten CHO-Pool wurden durch Immunfällung von ³&sup5;S-markierten Produkten und durch die Fähigkeit zur Bindung von ¹²&sup5;I-SM-C in einem SM-C-Western-Versuch auf trägerproteinartige Polypeptidexpression analysiert. Zur Detektion durch Immunfällung wurden Zellen in DMEM-F12, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war, bis zu 80%iger Konfluenz vermehrt, in serumfreies Medium übergeführt, 1 h lang kein Cystein zugegeben und dann über Nacht mit ³&sup5;S-Cystein markiert. Das Medium wurde mit Anti-Trägerprotein-Untereinheit- Antikörper immungefällt, und die resultierenden Protiene wurden unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE analysiert. Trägerproteinartige Polypeptide mit 37.000 und 39.000 Dalton wurden spezifisch identifiziert. Zur Detektion durch SM-C-Bindung wurde serumfreies konditioniertes Medium (unmarkiert) 48 h nach dem Einbringen des transformierten Pools gesammelt und SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen unterzogen. Die Proteine wurden vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter transferiert, das mit ¹²&sup5;I-SM-C sondiert wurde. Es wurden zwei neue trägerproteinartige Polypeptide mit 43.000 und 45.000 Dalton festgestellt. Ein gegenüber CHO-Zellen endogenes Protein mit 23.000 Dalton wurde im transformierten Pool sowie im nichttransformierten Vergleichs-CHO-Pool detektiert. Die Größendifferenz (37.000 und 39.000 gegenüber 43.000 und 45.000) hängt vermutlich davon ab, ob SDS unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde.
Dieses Gen von LCP 2,3 schließt nicht die Möglichkeit aus, daß Modifikationen des Gens, wie z.B. Mutationen, einschließlich einfacher oder mehrfacher Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen oder -Inversionen, nicht bereits im Gen aufgetreten sind oder nicht anschließend eingesetzt werden können, um seine Eigenschaften oder die Eigenschaften der daraus exprimierten Polypeptide zu modifizieren. Auch schließt das keine Polymorphie aus, die zu physiologisch ähnlichen, aber strukturell leicht veränderten Genen oder Polypeptiden als den in Fig. 4 gezeigten führen kann.
Es versteht sich natürlich, daß nach üblichen Verfahren aus PolyA&spplus;-RNA klonierter cDNA 5'-terminale Nukleotide fehlen können und sie sogar Molekülartefakte enthalten kann.
Die Struktur des in Fig. 4 gezeigten Polypeptids berücksichtigt natürlich keine Modifikationen des Polypeptids, die durch dessen Wechselwirkung mit in vivo-Enzymen verursacht werden, wie z.B. Glykosylierung. Daher versteht es sich, daß das in Fig. 4 dargestellte Aminosäuremolekül gegebenenfalls nicht mit in vivo erzeugtem Trägerprotein identisch ist.
Es versteht sich, daß, obwohl das für Trägerproteinaktivität kodierende chromosomale Gen möglicherweise nicht in bakteriellen Wirten exprimierbar ist, weil diese intervenierenden Moleküle von solchen Wirten nicht korrekt verarbeitet werden, die Wahrscheinlichkeit sehr groß ist, daß die chromosomalen Gene sehr nützlich bei der Produktion trägerproteinartiger Polypeptide in eukaryotischen Wirten sind, wo die menschlichen nicht-kodierenden Regionen, Introns und Kodierregionen gegebenenfalls für hohe Expressionsmengen und korrekte Verarbeitung des Produkts zu biologisch aktiven trägerproteinartigen Polypeptiden wichtig sein können.

Verbesserung der Ausbeute und Aktivität von Polypeptiden die Trägerproteinaktivität aufweisen

Die Produktionsmenge eines Proteins wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt: die Anzahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle, die Effizienz, mit der diese Genkopien transkribiert werden, und die Effizienz, mit der sie translatiert werden. Die Effizienz der Transkription und Translation (die zusammen die Expression ausmachen) hängt wiederum von Nukleotidmolekülen ab, die normalerweise vor dem gewünschten kodierenden Molekül angeordnet sind. Diese Nukleotidmoleküle oder Expressionskontrollmoleküle definieren die Position, an der RNA-Polymerase wechselwirkt, um die Transkription (das Promotormolekül) zu initiieren und an der Ribosomen mRNA (das Transkriptionsprodukt) binden und damit wechselwirken, um die Translation zu initiieren. Nicht alle derartigen Expressionskontrollmoleküle funktionieren mit gleicher Effizienz. Es ist daher vorteilhaft, die spezifischen Kodiermoleküle für das gewünschte Protein von ihren benachbarten Nukleotidmolekülen abzutrennen und sie stattdessen mit anderen bekannten Expressionskontrollmolekülen zu fusionieren, um hohe Expressionsmengen zu begünstigen. Nachdem dies erreicht wurde, können die neu erzeugten DNA-Fragmente in Plasmide mit höherer Kopienzahl oder Bakteriophagenderivate insertiert werden, um die Anzahl der Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und die Ausbeute an exprimiertem Protein dadurch weiter zu verbessern.
Mehrere Expressionssteuerungsmoleküle können wie oben beschrieben eingesetzt werden. Diese umfassen die Operator-, Promotor- und Ribosombindungs- und Wechselwirkungsmoleküle (einschließlich von Molekülen wie die Shine-Dalgarno- Moleküle) des Lactose-Operons von E.coli ("das lac-System"), die entsprechenden Moleküle des Tryptophan-Synthetase-Systems von E.coli ("das trp-System"), die Haupt- Operator- und -Promotor-Regionen von λ-Phagen (OLPL und ORPR), den Bakteriophagen T7-Promotor, der nur von T7-RNA-Polymerase erkannt wird, eine Kontrollregion von filamentösen einstrangigen DNA-Phagen, den frühen und späten SV40-Promotor, Actin- Promotoren, Promotoren, die an den langen Terminus-Wiederholungen von Retroviren angeodnet sind, oder andere Moleküle, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und deren Viren steuern, oder Kombinationen davon. Daher kann, um die Produktion eines speziellen Polypeptids in einem geeigneten Wirt zu verbessern, das für dieses Polypeptid kodierende Gen wie zuvor erzeugt und in ein rekombinantes DNA-Molekül insertiert werden, das seinem früheren Expressionskontrollmolekül näher ist oder unter der Kontrolle eines der obigen verbesserten Expressionskontrollmoleküle steht. Derartige Verfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Andere Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der Transation umfassen die Einfügung chemisch oder enzymatisch erzeugter Oligonukleotide vor dem Initiationscodon. Nach diesem Verfahren kann eine optimalere Primär- und Sekundärstruktur der Messenger-RNA erhalten werden. Im spezielleren kann ein Molekül so konstruiert werden, daß das Initiations-AUG-Codon in einer leicht zugänglichen Position (d.h. nicht durch Sekundärstruktur maskiert) entweder an der Spitze einer Haarnadel oder in anderen einstrangigen Regionen auftritt. Ebenso können die Position und das Molekül des obengenannten Shine-Dalgarno-Segments optimiert werden. Die Wichtigkeit der allgemeinen Struktur (Faltung) der Messenger-RNA ist dokumentiert worden.
Weitere Steigerungen der Zellenausbeute der gewünschten Produkte sind abhängig von einer Zunahme der Anzahl an Genen, die in der Zelle eingesetzt werden können. Das kann durch Einfügen des trägerproteinartigen Gens (mit oder ohne seine Transkriptions- und Translationskontrollelemente) in ein Plasmid mit höherer Kopienanzahl oder in ein Plasmid mit temperaturgesteuerter Kopienanzahl (d.h. ein Plasmid, das eine Mutation aufweist, sodaß die Kopienanzahl des Plamids nach einer Temperaturerhöhung zunimmt) erreicht werden.
Alternativ dazu kann eine Zunahme der Gendosierung beispielsweise durch Einfügen rekombinanter DNA-Moleküle erreicht werden, die auf die zuvor beschriebene Weise verarbeitet wurden, in den gemäßigten Bakteriophagen erzielt werden, am einfachsten durch Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, um ein lineares Molekül zu erhalten, das dann mit einem gespaltenen λ-Phagen-Kloniervehikel und dem durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugten rekombinanten DNA-Molekül vermischt wird. Der gewünschte rekombinante Phage wird dann wie zuvor ausgewählt und zum Lysogenisieren eines Wirtsstammes von E.coli verwendet.
Daher versteht es sich, daß die Einfügungs-DNA gemäß vorliegender Erfindung auch in andere Expressionsvektoren insertiert werden kann, wie zuvor beschrieben (oben), und diese Vektoren in verschiedenen Wirten verwendet werden können, wie zuvor beschrieben (oben), um die Expression des für Trägerprotein-Untereinheit kodierenden Gens zu verbessern.
Die biologische Aktivität der gemäß vorliegender Erfindung erzeguten trägerproteinartigen Polypeptide kann auch verbessert werden, indem die DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, um Säugetier-Zellsysteme zu transformieren und das Gen in diesen Systemen zu exprimieren. Derartige Säugetiersysteme sind bekannt. Ein solches System ist das CHO(Chinesischer Hamster-Eierstock)-(DHFR&supmin;)-Zellsystem, in dem die Genexpresion durch Methotrexat (MTX) amplifiziert werden kann. Diese Expressionssysteme ermöglichen die Produktion glykosylierter Proteine. Derartige Zellen können dazu gebracht werden, die Kopienanzahl des trägerproteinartigen Gens stark zu erhöhen.
Es versteht sich auch, daß trägerproteinartige Polypeptide auch in Form eines Fusionsproteins (z.B. gebunden an ein prokaryotisches oder eukaryotisches N-terminales Segment, das die Exkretion steuert), in Form eines proträgerproteinartigen Polypeptids (z.B. mit dem gesamten oder Teilen des Trägerprotein-Signalmoleküls, das bei der Exkretion abgespalten werden könnte) oder als reifes trägerproteinartiges Polypeptid (durch Abspaltung bestimmter unwesentlicher Aminosäuren, einschließlich eines Anfangs-Methionins, während Expression und Exkretion) oder in Form eines f-metträgerproteinartigen Polypeptids hergestellt werden können. Ein besonders nützliches Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung wäre reifes trägerartiges Polypeptid, das eine leicht abzuspaltende Aminosäure oder Abfolge von Aminosäuren ist, die am Aminoterminus befestigt ist. Solche Konstruktionen ermöglichen die Synthese des Proteins in einem geeigneten Wirt, wobei ein in reifen Trägerprotein-Untereinheiten nicht vorhandenes Startsignal erforderlich ist, und die anschließende Abspaltung der zusätzlichen Aminosäuren, um reife Trägerprotein-Untereinheiten zu produzieren.
Wenn die Trägerprotein-Untereinheit oder das trägerproteinartige Polypeptid in Kombination mit somatomedinartigen Molekülen zur Therapie verwendet werden soll, können die beiden Moleküle gemeinsam in derselben Zelle produziert werden, vorzugsweise in Säugetierzellen. Vektoren, die beide Gene enthalten, könnten cotransformiert und stabile Zeilllinien ausgewählt werden, die beide Proteine exprimieren. Daher wäre nur ein Fermentations- und Reinigungsschema erforderlich, um den Komplex zu produzieren, der sowohl trägerproteinartige und somatomedinartige Polypeptide enthält.
Die Ausbeute an diesen verschiedenen Formen von Polypeptiden kann durch ein bestimmtes oder eine Kombination der oben erörterten Verfahren verbessert werden. Einige oder alle der in den vorliegenden DNA-Molekülen verwendeten Codons könnten auch durch andere Codons ersetzt werden. Diese substituierten Codons können für Aminosäuren kodieren, die mit jenen identisch sind, für die die ersetzten Codons kodieren, aber zu einer höheren Ausbeute des Polypeptids führen. Alternativ dazu kann das Ersetzen eines oder einer Kombination an Codons, die zu Aminosäureersetzung oder zu einem längeren oder kürzeren trägerproteinartigen Polypeptid führen, seine Eigenschaften auf nützliche Weise verändern (z.B. die Stabilität erhöhen, die Löslichkeit erhöhen, die therapeutische Aktivität erhöhen).
Schließlich kann die Aktivität der durch die rekombinanten DNA-Moleküle gemäß vorliegender Erfindung erzeugten Polypeptide durch Fragmentieren, Modifizieren oder Derivatisieren der DNA-Moleküle oder Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung mit wohlbekannten Mitteln verbessert werden, ohne daß vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird.
Obwohl bestimmte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, versteht es sich jedoch, daß diese Ausführungsformen abgeändert werden können, um andere Ausführungsformen zu schaffen, bei denen die Verfahren und Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden. Der Schutzumfang der Erfindung ist durch die folgenden Ansprüche und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen definiert, die als Beispiele dargelegt worden sind.

Claims

1. Trägerproteinartiges Polypeptid, das eine Sequenz umfaßt, die die in-vivo- Effektoraktivität eines Polypeptids mit der Sequenz von Fig. 4 aufweist und der die natürliche Glykosylierung des Trägerproteins fehlt.

2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der Sequenz von Fig. 4.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das im wesentlichen frei von Substanzen ist, die in menschlichem Serum auf natürliche Weise vorhanden sind.

4. Im wesentlichen reines Polypeptid, das die Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 von Fig. 4 aufweist, bei dem der Aminosäure 27 ein Methioninrest vorangeht.

5. Polypeptid nach Anspruch 4, worin ein oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt, gelöscht oder substituiert worden sind und worin das Polypeptid ein trägerproteinartiges Polypeptid darstellt.

6. Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren -1 bis 290 von Fig. 4 und Polypeptiden, die einen Abschnitt dieser Sequenz aufweisen und ein trägerproteinartiges Polypeptid darstellen, besteht.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das im wesentlichen mit zumindest einem somatomedinartigen Polypeptid komplexiert ist.

8. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Hemmung des Wachstums von Narbengeschwulsten oder zur Hemmung des Wachstums von somatomedinabhängigen Krebsarten umfaßt.

9. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das im wesentlichen mit zumindest einem somatomedinartigen Polypeptid komplexiert ist, umfaßt, zur Behandlung von Osteoporose bei Menschen.

10. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums von Narbengeschwusten oder bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums von somatomedinabhängigen Krebsarten.

11. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose.

12. DNA-Isolat, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren -1 bis 290 von Fig. 4 kodiert.

13. DNA-Isolat, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 von Fig. 4 kodiert.

14. DNA-Isolat, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 27 bis 290 von Fig. 4 kodiert und bei der der Aminosäure 27 ein Methioninrest vorangeht.

15. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine nach einem der Ansprüche 12 bis 14 definierte DNA-Sequenz umfaßt, die operativ mit einer Expressionssteuerungssequenz verbunden ist.

16. Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 15 transformiert ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines trägerproteinartigen Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 16 zur Herstellung des Polypeptids.

18. Vektor, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 5.

19. Wirt, der mit eineni Vektor nach Anspruch 18 transformiert ist.

20. Verfahren zur Herstellung eines trägerproteinartigen Polypeptids, welches das Kultivieren eines mit einem Vektor nach Anspruch 18 transformierten Wirts umfaßt, um das Polypeptid herzustellen.