DE3852033T2

DE3852033T2 - Follistatin und verfahren zur reinigung desselben.

Info

Publication number: DE3852033T2
Application number: DE3852033T
Authority: DE
Inventors: Frederick Esch; Roger Guillemin; Nicholas Ling; Shunichi Shimasaki; Naoto Ueno; Shao-Yao Ying
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2008-08-27
Also published as: JPH04504105A; EP0377659B1; AU2420088A; AU620346B2; CA1340972C; US5041538A; JP2709113B2; EP0377659A4; EP0377659A1; ATE113654T1; WO1989001945A1; DE3852033D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein menschliches Protein mit inhibinartiger Aktivität, welches aus menschlichem Körpermaterial im wesentlichen zu Homogenität isoliert worden ist und auf welches als menschliches Follistatin Bezug genommen wird. Die Erfindung betrifft auch allgemein Säugetier-Follistatin-DNA und Verfahren zur Reinigung von Säugetier-Follistatin.
Die Idee, daß Inhibin als eine wasserlösliche Substanz, die in der Keimdrüse produziert wird, aber spezifisch auf dem Hypophysenniveau wirkt um die Sekretion des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu hemmen, wurde durch 1932 McCullagh (Science, 76, 19-20) postuliert. Eine solche vorzugsweise Regulierung der Gonadotropinausschüttung hat ein großes maß an Interesse erzeugt und hat in den vergangenen 50 Jahren viele Laboratorien dazu gebracht zu versuchen diese Substanz aus Extrakten von Testis, Spermatozoa, Rete-Testis-Flüssigkeit, Spermenplasma und ovarieller Follikelflüssigkeit unter Verwendung verschiedener Bioassays zu isolieren und zu charakterisieren. Obschon in der Literatur viele Berichte erschienen sind, die die Reinigung von inhibinartigem Material mit Molekulargewichten ,im Bereich von 5'000 bis 100'000 Daltons beansprucht haben, haben nachfolgende Studien gezeigt, daß diese Substanzen entweder nicht homogen waren oder nicht die hohe spezifische Aktivität aufwiesen, welche für echtes Inhibin erwartet wird, de Jong, Molecular & Cellular Endocrin., 13, 1-10 (1979). 1985 wurde die ganze Sequenz von zwei 32K-Formen von Inhibin aus Follikelflüssigkeit von Schweinen (PFF) entdeckt und publiziert, Mason, A.J.
et al. Nature, 318, 659-663 (1985). Beide waren Dimeren einer 18K alpha-Untereinheit, verknüpft mit einer 14K β- Untereinheit. Material mit inhibinartiger Aktivität kann verwendet werden, um die Fruchtbarkeit in Säugetieren, insbesondere männlichen Tieren, zu regulieren.
Zwei Proteine, das eine mit einem Molekulargewicht von etwa 35'000 Datons (35K) und das andere mit etwa 32'000 Daltons (32K) und beide mit Inhibinaktivität wurden erfolgreich aus Follikelflüssigkeit des Schweins isoliert. Diese zwei Proteine wurden unter Verwendung von Mikrosequenzierungs- und molekularbiologischen Verfahren vollständig charakterisiert. Unter Verwendung von Aminosäuresequenzinformation des Schweins wurden cDNA-Klone, welche diese Proteine codieren, aus einer ovariellen cDNA-Bank des Schweins isoliert. Dann wurde unter Verwendung der cDNA des Schweins als Sonde das Klonieren und Sequenzieren der entsprechenden menschlichen und Rattenproteine durchgeführt.
Spezieller wurden die Proteine zuerst aus Material, welches aus den Körpern von Schweinen erhalten worden war, isoliert und auf wesentliche Homogenität gereinigt, und auf diese wird hier in der Folge als Follistatin A und Follistatin B Bezug genommen. Jedes Protein ist aus einer Einzelpolypeptidkette zusammengesetzt.
Mikrosequenzierung zeigte, daß die aminoterminale Aminosäurerestsequenz beider Proteine Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg- Gln-Ala-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gln-Val-Leu war. Es wurde auch ermittelt, daß die nächsten acht Reste von Follistatin A Tyr-Lys-Thr-Glu-Leu-Ser-Lys-Glu waren. Follistatin A wurde nun als Resultat einer weiteren Mikrosequenzierung und der Verwendung molekularbiologischer Techniken vollständig charakterisiert. Jedes Protein zeigt inhibinartige Aktivität derart, daß es spezifisch die basale Ausschüttung von FSH hemmt, aber die basale Ausschüttung des Luteinisierungshormons (LH) nicht hemmt.
Die Reinigung von Schweinefollistatin bis zu wesentlicher Homogenität, d. h. etwa 90 Gew.-% des gesamten Proteins in der Fraktion, wurde durch eine Kombination von Proteintrennverfahren einschließlich Heparin- Sepharose-Affinitätschromatographie, Gelfiltration und Reverse-Phase-Hochauflösungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) erzielt.
Gemäß der Erfindung wird nicht-chromosomale DNA bereitgestellt, welche monomeres Säugetier-Follistatin mit einer amino-terminalen Sequenz codiert, die mit Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln-Ala-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gln- Val-Leu beginnt, und spezifisch die basale Ausschüttung von Follikel-stimulierendem Hormon hemmt, nicht aber die basale, Ausschüttung des Luteinisierungshormons.
Die Erfindung stellt ferner menschliches Follistatin als das 315-Reste-Protein bereit, welches hier in der Folge dargelegt wird, sowie Fragmentformen desselben, wie das 228-Reste-Humanfollistatin, dessen Aminosäuresequenz hier in der Folge dargelegt wird.
Insbesonders wird durch die Erfindung DNA bereitgestellt, welche Schweine- und Human-Follistatin in der 315-Reste-Form und in verkürzten Formen codiert. Die Proteine, auf die Bezug genommen wird, liegen vorzugsweise, wie später ausführlicher erläutert wird, in glycosylierter Form vor und werden, wenn sie isoliert sind, in einer Form erhalten, welche in beschränktem Ausmaß glycosyliert ist.
In einem speziellen Aspekt der Erfindung wird ein gegebenenfalls glycosyliertes Protein bereitgestellt, welches sich vom Inhibin in Aminosäuresequenzgliedern unterscheidet, und als Humanfollistatin bezeichnet, wobei das genannte Protein dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) es die folgenden inhibinartigen Testeigenschaften zeigt, nämlich daß (i) es spezifische Inhibition der Basis-FSH- Sekretion zeigt; (ii) es keine Inhibition der Basis-LH- Sekretion zeigt; (b) es durch DNA codiert wird, die hiefür in einer menschlichen testikulären Bibliothek von menschlicher cDNA in Lambda gt11-Plasmiden aus mRNA, welche aus einer menschlichen Testikulärquelle von biologischem Material stammt, Umkehr-transkribiert ist, codiert;
(c) es aus einer Einzelpolypeptidkette zusammengesetzt ist, welche eine aminoterminale Aminosäuresequenz beginnend mit Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln-Ala-Lys-Asn-Gly-A-g Cys-Gln-Val-Leu aufweist; (d) es als ein möglicherweise glycosyliertes Isolat aus dem zuvorgenannten Follikelprotein ein Molekulargewicht von etwa 35'000 bis etwa 32'000 hat, wie dies durch SDS-PAGE gemessen wurde; und (e) es einen pKa von etwa 5 hat.
Die Erfindung stellt insbesonders auch Rattenprotein bereit, welches mit monomerem Ratten-Follistatin bezeichnet ist und die Aminosäuresequenz [Ser171,176, Gly²²², Asp247,251, Glu293,300, Thr³¹²] pFS(1-315) hat.
In den Rahmen der Erfindung eingeschlossen sind biologisch aktive monomere Polypeptide, welche eine der unten definierten Aminosäuresequenzen enthalten:
hFS ( 66-135) = [Arg¹³&sup4;] pFS ( 66-135)
hFS (139-210) = [Ala¹&sup7;¹] pFS (139-210)
hFS (216-287) = [Asp247,251] pFS (216-287)
rFS (139-210) = [Ser171,176] pFS (139-210)
rFS (216-287) = [Gly222, Asp247,251] pFS (216-287)
Die Verwendung von DNA gemäß der Erfindung für die Herstellung von Follistatinprotein, welches durch diese codiert wird, ist ebenfalls ein Teil der Erfindung.
Die Erfindung schließt nicht-toxische Salze der Follistatinproteine der Erfindung ein sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Follistatinprotein der Erfindung (oder ein nichttoxisches Salz desselben) zusammen mit einem Träger enthalten.
In den Zeichnungen: -
Fig. 1 ist eine Gruppe von drei Chromatogrammen, welche gewisse Schritte zu Beginn der Reinigung von Follistatin (FS) und anderen Proteinen aus Schweinefollikelflüssigkeit (PFF) unter den wie folgt beschriebenen Bedingungen darstellt:
Fig. 1a zeigt RP-HPLC-Reinigung der aus Gelfiltration gewonnenen FSH-freisetzungs-hemmenden und FSH- freisetzenden Proteine. Die Komponenten der aktiven Bereiche der Gelfiltration, wie durch in vitro-Bioassay bestimmt, wurden zusammengegossen, lyophilisiert und, nach Auflösen in 0,2 N Essigsäure, direkt auf eine Vydac C&sub4;- Säule aufgebracht und mit dem angegebenen Gradienten von Acetonitril im TEAP-Puffersystem mit 3 ml/Min. eluiert. Zwei Inhibinproteine, Inhibin A und B, Follistatin und zwei Aktivinproteine, die mit einem festen Balken angegeben sind, wurden gewonnen.
Fig. 1b zeigt die aktiven Fraktionen 3 und 4, die in Fig. 1a mit dem festen Balken bezeichnet sind, der als Follistatin angegeben ist. Diese wurden zusammengegossen und, nachdem sie auf dreimal ihr Originalvolumen verdünnt worden waren, direkt auf eine Vydac C&sub4;-Säule aufgebracht und mit dem angegebenen Gradienten an Acetonitril in einem Trifluoressigsäure (TFA)-Puffersystem bei 3 ml/Min. eluiert.
Fig. 1c zeigt das aktive Material, welches in Fig. 1b mit dem festen Balken bezeichnet ist, und welches zusammengegossen wurde und nach Entfernen des Acetonitrils und einstellen auf pH 6,5 auf eine Spherogel-TSK DEAE-5PW-Säule aufgebracht und dann davon mit dem angegebenen Gradienten an Natriumchlorid in einem Natriumphosphatpuffersystem mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Min. eluiert wurde.
Fig. 2 zeigt Chromatogramme der RP-HPLC- Reinigung von Follistatin wie folgt:
Fig. 2a zeigt die Fraktionen an aktivem Material von der in Fig. 1c gezeigten Säule, welche zusammengegossen wurden und, nachdem sie auf das Dreifache ihres ursprünglichen Volumens verdünnt worden waren, direkt auf eine Vydac C&sub4;-Säule aufgebracht und mit dem angegebenen Gradienten an Acetonitril im Trifluoressigsäure(TFA)-Puffersystem bei 1 ml/Min. eluiert wurden.
Fig. 2b zeigt die Fraktionen aktiven Materials von der Säule, welche durch den festen Balken I in Fig. 2a bezeichnet sind, welche zusammengegossen wurden, auf das Dreifache ihres ursprünglichen Volumens verdünnt und ebenso auf einer Vydac Phenyl-Säule mit dem angegebenen Gradienten an Acetonitril in einem Triethylammoniumphosphat (TEAP)-Puffersystem bei 1 ml/Min. gereinigt wurden.
Fig. 2c zeigt die Fraktionen aktiven Materials von der Säule, die im Chromatogram der Fig. 2b durch einen festen Balken bezeichnet sind, welche zusammengegossen und auf einer Aquapore RP-300-Säule mit dem angegebenen Gradienten an Acetonitril im TFA-Puffersystem bei 0,5 ml/Min. konzentriert wurden.
Fig. 3 zeigt Nukleotid- und abgeleitete Proteinsequenzen von Human-Follistatin cDNAs, welche die 317 und 344 Aminosäure-Vorläufer und das Human-Follistatin- Gen codieren; die Nucleotide sind links und rechts numeriert und die Aminosäuren im Ein-Buchstaben-Code sind durchwegs numeriert.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Unter Verwendung eines Vielstufen-Verfahrens wurden zwei Proteine aus Schweine-Follikelflüssigkeit (PFF) zu beträchtlicher Homogenität isoliert. Jedes Protein (Follistatin A und Follistatin B) ist ein Monomer; sie haben Molekulargewichte von etwa 35K und 32K. Eine Aminosäureanalyse des Gesamtproteins wurde für jedes durchgeführt und die Aminosäurerestsequenzen des Amino- Endes jeder Kette wurde mittels Mikrosequenzierung bestimmt und festgestellt als: Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln- Ala-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gln-Val-Leu. Als Resultat früherer Arbeit wird angenommen, daß 35K Follistatin A 315 Aminosäurereste und eine freie Säure als C-Terminus aufweist. Für Follistatin B wird eine freie Säure mit 288 Resten angenommen, welche am C-Terminus um 27 Reste verkürzt ist.
Jedes Protein ist sauer mit einem pKa von etwa 5 und ist allgemein in wäßrigen Medien löslich. Jedes ist zu einem beschränkten Maß glycosyliert, wie durch die beschränkte Affinität gegenüber Concanavalin A bestimmt wurde. Jedes Protein zeigt Inhibinaktivität derart, daß es spezifisch die basale Sekretion von FSH in einem Ratten-Hypophysenvorderlappen-Monolayer-Kultursystem hemmt. Follistatin A zeigt bei Konzentrationen von 2,5 bis 6,0 ng/ml (0,07-0,17 · 10&supmin;&sup9;M) eine Hemmung der FSH-Freisetzung entsprechend der Hälfte des Maximums. Follistatin B ist statistisch äquipotent. Jedes Protein ist verwendbar, um die Fruchtbarkeit von Säugetieren zu regulieren, insbesondere von männlichen Säugetieren.
Beim Reinigungsverfahren wird Schweine-Follistatin aus rohem Extrakt-Material, welches aus dem Tierkörper des Schweins erhalten wird, insbesonders aus Schweine-Follikelflüssigkeit (PFF), obschon andere geeignete Körperextrakte verwendet werden könnten, mittels aufeinanderfolgender Reinigungsverfahren, welche Heparin- Sepharose-Affinitätschromatographie, Gelfiltration und mindestens eine und vorzugsweise mehrere RP-HPLC's unter verschiedenen Bedingungen der stationären Phase und/oder der mobilen Phase einschließen, isoliert. Das gleiche Verfahren ist geeignet für die Gewinnung eines gewünschten Follistatinproteins aus einem rohen Extrakt, der aus rekombinanten DNA-Vefahren stammt.
Beim bevorzugten Verfahren, bei dem Schweini- Inhibin erstmals zu wesentlicher Reinheit isoliert worden war, wurde PFF zuerst mit Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie gereinigt, dann mit Gelfiltration an Sephacryl S-200-Gel und dann mit fünfaufeinanderfolgenden RP-HPLC's unter Verwendung verschiedener mobiler Phasengradienten und/oder derivatisierten Siliciumdioxid- Trägern plus einem Schritt Ionenaustausch-HPLC. Vorzugsweise werden stationäre Phasen mit relativ tiefer Hydrophobizität verwendet, wobei C&sub3;-C&sub8;-Säulen bevorzugt und C&sub3;-C&sub5;- und Phenylsäulen stark bevorzugt sind. Die Spezivität der mobilen Phase gegenüber dem gelösten Stoff wird vorzugsweise durch Variieren der Konzentration der organischen Komponente, insbesondere Acetonitril, eingestellt. Obschon eine einzige RP-HPLC-Fraktionierung die Reinheit gegenüber dem gelfiltrierten Material wesentlich erhöht, werden gewöhnlich zwei oder mehr und vorzugsweise 6 HPLC-Reinigungen durchgeführt, nachfolgend auf auf einanderfolgende Behandlung mit Heparin-Sepharose-Chromatographie und Gelfiltration.
Das Ausgangsprodukt für das Verfahren war gefrorenes PFF, welches von J.R. Scientific, Woodland, CA, beschaffen wurde. Etwa 18 Liter von solchem gefrorenen PFF wurden in 250 ml Ansätzen behandelt, um das Follistatin zu isolieren.
Der erste Schritt der Reinigung war Heparin- Sepharose-Affinitätschromatographie, in welcher das Protein unter Anwendungsbedingungen an den Sepharose-gebundenen-Heparin-Einheiten adsorbiert wird, und das adsorbierte Follistatin-Material durch Eluation mit 1 M NaCl gewonnen wird. Dieser Schritt beschleunigt das Reinigungsverfahren für rohen Extrakt sehr, da es erlaubt, ein relativ großes Volumen an rohem Extrakt, wie PFF, recht schnell zu behandeln, wobei eine Menge an Protein erhalten wird, die gesamthaft eine Inhibin-artige Aktivität zeigt, die mindestens 90% jener des rohen Extraktes entspricht.
Während des Reinigungsverfahrens wurde die Inhibin-artige Bioaktivität mittels eines in vitro Bioassays unter Verwendung einer Ratten-Hypophysenvorderlappen-Monolayerkultur überprüft, Vale, W. et al. Endocrinology, 91, 562-572 (1972). Kurz ausgedrückt wurden Hypophysenvorderlappen von 21 Tage alten weiblichen Ratten gesammelt, enzyinatisch dispergiert und mit 10%igem fötalem Rinderserum in HDMEM (GIBCO Laboratories, Santa Clara, CA.) in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (Falcon Plastic, Oxnard, CA.) am Tage 1 beschichtet. Am Tage 2 wurde das Medium auf 1%iges fötales Rinderserum in HDMEM gewechselt und die Probe zugegeben. Die Inkubation wird für weitere 48 Stunden fortgesetzt. Das Medium wird dann geerntet und die LH- und FSH-Gehalte werden mittels Radio-Immunoassays (RIA) unter Verwendung von Materialien, die von The Pituitary Hormone Program of NIADDKD bereitgestellt worden waren, bestimmt. In diesem Test hemmen die Follistatin- und Inhibin-Proteine nur die basale Freisetzung von FSH, aber nicht jene von LH, wie aus dem Vergleich mit Kontrollzellen folgt, die nur das Inkubationsmedium erhielten.
Für die Ermittlung solcher Inhibin-Aktivität in den verschiedenen Kolonnenfraktionen wurden gleiche Teile im Bereich von 0,01 Vol.-% bis 0,1 Vol.-% entfernt, und nach Zugabe von 100 ug Human-Serum-Albumin in 100 ul Wasser wurden die Lösungsmittel in einem Speed-Vac-Konzentrator (Savant, Hicksville, N.Y.) verdampft. Der Rückstand wurde in 3 ml 1%igem fötalem Rinderserum in HDMEM wieder gelöst, durch einen Millex-GS 0,22 um Filter (Millipore Corp., Bedford, MA) filtriert und im Doppel getestet. Um die Bioassays während des Reinigungsverfahrens zu beschleunigen, wurde nur die basale Hemmung der FSH Sekretion, die durch Follistatin und Inhibin bewirkt wird, bestimmt und in dem Bereich aufgezeichnet, in denen die Wanderung solcher Proteine im Chromatogram erwartet wurde.
Für die Durchführung der Heparin-Sepharose- Affinitätschromatographie wurde eine 500 ml Flasche gefrorenes PFF auf getaut, und die Zellbruchstücke wurden in einer Beckman J2-21-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA.) unter Verwendung eines JA-20-Rotors bei 10'000 rpm (Umdrehungen pro Minute) während 30 Minuten hinuntergewirbelt. Eine Hälfte des Ueberstands (250 ml) wurde durch die Zugabe von 2'250 ml 0,01 M Tris-HCl enthaltend 0,1 M NaCl, pH 7, in einem 4 Liter Erlenmeyer- Kolben auf das 10-fache seines Volumens verdünnt und gleichzeitig über acht silastische Schläuche (0,76 mm ID) mittels zweier Rabbit 4-Kanal-Perestalticpumpen (Rainin Instrument Co., Inc., Emeryville, CA.) mit 40 ml/Std. pro Säule in acht Heparin-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)-Säulen (3,5 · 9 cm) gepumpt.
Nachdem alle Flüssigkeit durch die Heparin-Sepharose gepumpt worden war, wurden die acht Säulen simultan mit 3,5 Litern 0,01 M Tris-HCl, pH7, enthaltend 0,1 M NaCl auf die gleiche Art gewaschen. Die adsorbierten Proteine mit Inhibin-Aktivität wurden durch simultanes Waschen der acht Säulen mit 1,3 Litern 0,01 M Tris-HCl enthaltend 1 M NaCl, pH 7, wie oben entfernt und das Ausgewaschene wurde in 16 ml Fraktionen gesammelt. Die Inhibin-Aktivität wurde durch den oben beschriebenen in vitro-Bioassay überprüft. Die Säulen wurden durch weiteres Waschen mit 1,6 Litern 2M NaCl in 0,01 M Tris-HCl, pH 7, regeneriert und mit 3,5 Litern 0,01 M Tris-HCl, enthaltend 0,1 M NaCl, für die Reinigung der zurückgebliebenen 250 ml PFF wieder equilibriert.
Danach wurde das Material mittels Gelfiltration fraktioniert, um die Proteine allgemein gemäß ihren Molekulargewichten zu separieren. Die Fraktionen mit solcher Inhibin-artiger Aktivität, die durch die acht Heparin-Sepharose-Säulen extrahiert worden waren, wurden zusammengegossen (400 ml) und über Nacht in einem Spectrapor Nr. 3 Membran-Röhrensystem mit 28,6 mm Zylinderdurchmesser mit Grenz-Molekulargewicht(Mr) bei 3'500 (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, CA.) gegen 16 Liter 30%ige Essigsäure dialysiert, um NaCl zu entfernen. Das zurückbehaltene Fluid wurde wie oben zentrifugiert, um einen weißen Niederschlag zu entfernen, und der Überstand wurde in acht gleiche Anteile für die Anwendung auf acht 5 · 100 cm Sephacryl S-200 superfeine Säulen (Pharmac¹a Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) aufgeteilt. Jede Säule wurde mit 30%iger Essigsäure bei 20 ml während 22 Min. eluiert und die Säulenfraktionen wurden mittels UV-Absorption bei 280 nm und mittels Bioassay überprüft.
Das Elutionsprofil des in einer Sephacryl-S- 200-Säule gereinigten Materials zeigte mehrere Elutionszonen, welche Inhibin- und FSH-freisetzende Aktivität zeigten. Diese Bereiche wurden für die weitere Reinigung mittels RP-HPLC ausgewählt und entsprechend zusammengegossen und lyophilisiert. Das lyophilisierte Material (40 mg) wurde in 40 ml 0,2 N Essigsäure aufgelöst und durch einen Millex-HA 0,45 um Filter (Millipore Corp., Bedford, MA.) filtriert. Das Filtrat wurde direkt auf eine 1 · 25 cm Vydac 5-um Partikelgrösse-C&sub4;-Säule (The Separation Group, Hesperia, CA.) angewendet und mit einem Gradienten von TEAP Puffer entwickelt. Im TEAP-System besteht der Puffer A aus 0,25 N Triethylammoniumphosphat (TEAP), pH 3, und Puffer B ist 80% Acetonitril in Puffer A. Nachdem alles Filtrat geladen worden war, wurde die Säule mit dem wäßrigen Puffer A gewaschen, bis die UV-Absorption die Grundlinie erreichte. Die Fraktionen, die Inhibin- und FSH-Freisetzungs-Aktivität zeigten, wurden in einem Beckman 332 Gradienten-Flüssigkeitschromatographie-SySt-m (Beckman Instruments, Inc., Berkeley, CA.) aufgetrennt, welches mit einem Spectroflow 757 UV-Detektor (Kratos Analytical Instruments, Ramsey, N.J.), einem Soltec 220- Recorder (Soltec Corp., Sun Valley, CA.) und einem Redirac 2112 Fraktionensammler (LKB Instruments, Inc., Gathersburg, MD.) ausgerüstet war. Drei Zonen mit wesentlicher Inhibin-Aktivität wurden ermittelt, wobei die frühere Elutionszone Follistatin genannt wird und die späteren Inhibin A und Inhibin B sind. Zwei Zonen FSH- freisetzende Faktoren wurden ermittelt, welche später als Activin A und Activin AB bezeichnet wurden, ein Homodimer resp. ein Heterodimer. Die Follistatin-Zone wurde zuerst eluiert, wie in Fig. 1a gezeigt ist, zwischen der siebten und der zwölften Minute des Gradienten.
Die Follistatin-Fraktionen von der in Fig. 1a dargestellten Säule wurden zusammengegossen, mit einem gleichen Volumen an 0,2 N Essigsäure gemischt und durch einen weiteren RP-HPLC-Schritt, welcher eine 1 · 25 cm Vydac-5 um-Partikelgrösse-C&sub4;-Säule und ein Trifluoressigsäure (TFA) Puffersystem verwendet (Fig. 1b), weiter gereinigt. Im TFA-System enthält Puffer A 1 ml Trifluoressigsäure in 999 ml Wasser und Puffer B ist 1 ml Trifluoressigsäurein 199 ml Wasser und 800 ml Acetonitril. Das aktive Material eluiert von der Säule mit einem linearen Gradienten von 21 bis 30% Acetonitril im TFA- System in 90 Min. bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. Fraktionen mit FSH-Freisetzungshemmungs-Aktivität (Fraktionen 19-23), die mittels Bioassay ermittelt wurden, wurden zusammengegossen und, nach Entfernen des Acetonitrils in einem Speed-Vac-Konzentrator (Savant, Hicksville, N.Y.) und Einstellen auf pH 6,5 mit 0,1 N Ammoniumhydroxid, direkt auf eine 7,5 · 75 mm Spherogel-TSK- 10 u-DEAE-5-PW-Säule (Toyo Soda, Tokyo, Japan) gepumpt. Nach dem Laden wurde die Säule mit Puffer A gewaschen, bis die UV-Absorption die Grundlinie erreichte. Puffer A war 0,1 M Natriumhydrogenphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;)pH 7,5. Die Follistatin-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in Puffer A in 90 Min. bei einem Fluß von 1 ml/Min., wie in Fig. 1c dargestellt, abgetrennt. Das aktive Material, welches in den Fraktionen 19 bis 22 von der Säule eluierte, wurde zusammengegossen und, nach Verdünnen auf das 4-fache des ursprünglichen Volumens mit 0,2 N Essigsäure, auf einer 1 · 25 cm Vydac- 5u-C&sub4;-Säule weiter gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 21 bis 30% Acetonitril im TFA-Lösungsmittel- System in 90 Min. bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. eluiert, wie in Fig. 2a gezeigt. Das aktive Material, welches in den Fraktionen 33-35 (Peak I) eluierte, wurde zusammengegossen und auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und abermals auf einer 10 · 250 mm Vydac 5 u-Phenyl-Säule mit einem linearen Gradienten von 18 bis 27% Acetonitril im TEAP-System in 90 Min. bei einem Fluss von 1 ml/Min., wie in Fig. 2b gezeigt, re-chromatographiert. Schließlich wurde das Follistatin in den Fraktionen 34 bis 36 zusammengegossen und, nach Verdünnung mit 0,2 N Essigsäure, mittels RP- HPLC unter Verwendung einer 0,46 · 25 cm Aquapore RP-300- 10 um-Partikelgrösse-Säule (Brownlee Labs., Santa Clara, CA.) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20 bis 80% Acetonitril im TFA-Puffer-System, wie in Fig. 2c gezeigt, konzentriert. Allee zusammen wurden gesamthaft näherungsweise 400 ug aktives Material isoliert und von den 18 Litern PFF gereinigt und als Follistatin A bezeichnet.
Aminosäure-Analyse des im wesentlichen homogenen Follistatin A wurde, wie in Bohlen P., et al. Anal. Biochem. 126 144-152 (1982) beschrieben, durchgeführt, und die Resultate sind in Tabelle 1 unten dargestellt. TABELLE 1 AMINOSÄURE-ZUSAMMENSETZUNG VON GEREINIGTEM FOLLISTATIN PROTEIN AUS SCHWEINE-FOLLIKELFLÜSSIGKEIT Aminosäure Follistatin A* B*
* Die Daten entsprechen dem Mittelwert ± Standardabweichung zweier Analysen und sind für ein Protein von 35'000 Dalton für die Mr 35'000 Form des Follistatins und für ein Protein von 32'000 Dalton für die Mr 32'000 Form genormt.
** Cystein wurde nach Oxidation mit Perameisensäure als Cysteinsäure bestimmt.
Das Follistatin A aus der letzten RP-HPLC- Reinigung wurde unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen in 1 mm dickem 10% Acrylamid-Gel gemäß dem Verfahren von Laemmli, U., Nature 227 1677-1685 (1970) analysiert. Das Protein wurde mit Silberfärbereagens (BIO-RADK Richmond CA.) aufgedeckt. Die folgenden Molekulargewicht-Standards wurden verwendet um das Gel zu kalibrieren: Rinderserumalbumin (Mr = 67'000), Ovalbumin (Mr = 43'000), alpha-Chymotrypsinogen (Mr = 25'700) und Lysozym (Mr = 14'500). Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurden vor dem Beladen des Gels 2 ug Follistatin A in 20 ul Wasser mit 20 ul Puffer (0,152 M Tris-HCl, pH 6,8, enthaltend 20% Glycerol (V/V), 4% Natrimdodecylsulfat und 0,04% Bromphenolblau) während 1 Stunden bei 537ºC incubiert. Die Elektrophorese wurde bei konstant 200 Volt während 6 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Unter reduzierenden Bedingungen wurden 2 ug Protein zuerst mit 20 ul 0,02 M Dithiothreitol während 15 Min. bei 37ºC inkubiert und dann wurden 20 ul Puffer zugegeben und die Inkubation während einer weiteren Stunde fortgeführt, bevor die Probe auf das Gel aufgebracht wurde. Die Elektrophorese wurde wie oben durchgeführt, außer daß 0,005 M Dithiothreitol in den Elektrophoresepuffer eingeschlossen war. Auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte Follistatin A eine einzelne Bande, welche bei einem Mr von 35'000 wanderte und unter reduzierenden Bedingungen zeige es eine einzelne Bande, die bei Mr 42'000 wanderte.
Unter Verwendung ähnlicher Reverse-Phase- HPLC-Bedingungen wurde eine Mr 32'000-Form, genannt Follistatin B, aus den Fraktionen 36-37 von Fig. 2a (Peak II) isoliert. Seine Aminosäure-Zusammensetzung ist verwandt mit jener der Mr 35'000-Form (vgl. Tabelle l) und nach Reduktion wandert dieses Protein ebenfalls als einzelne Bande bei Mr 40'000.
NH&sub2;-terminale Sequenzanalyse von Schweine- Follistatin A und B (pFS-A und pFS-B) wurde, wie in Esch, F. Anal. Biochem. 136, 39-47, 1984, beschrieben, durchgeführt. Basierend auf den Resultaten von vielfachen Sequenzanalysen beider Follistatine, sind die NH&sub2;-terminalen Reste beider als uly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln-Ala-Lys- Asn-Gly-Arg-Cys-Gln-Val-Leu nachgewiesen worden. Die Sequenz des NH&sub2;-terminalen Rests von Follistatin A ging weiter mit den Resten Tyr-Lys-Thr-Glu-Leu-Ser-Lys-Glu Sobald ein wesentlicher Teil der Sequenz von Follistatin bekannt ist, kann die mRNA, welche das Protein codiert isoliert werden, und die cDNA kann mittels rekombinanter DNA-Techniken synthetisiert werden. Boten- RNA (mRNA) wird aus Ovarien-Geweben erhalten, welche Follistatin produzieren, und dann wird aus der mRNA mittels Umkehr-Transkritpion cDNA synthetisiert. Die cDNA wird in einen Klonierungs-Vektor insertiert, welcher verwendet wird um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen.
Basierend auf der bekannten partiellen Aminosäurerestesequenz wurden gekennzeichnete Oligonukleotide für den Nachweis entsprechender cDNA synthetisiert. Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes wurden gemischte Hybridisierungs-Sonden hergestellt und als Sonden verwendet. Die folgenden zwei Sonden wurden verwendet, um aus der Bibliothek cDNA-Klone auszuwählen, welche die Follistatin codierenden Gensequenzen enthielten: 3'-ACC TGT CTC CTC CTA CAC TTA CTG TTG TGG GAC AAG TTC-5' und 3'-CTC GTC ATG GAC ACA CCG TTA CTA CCG CAC TGG ATG-5'. Dreizehn Klone, welche mit beiden Sonen hybridisierten, wurden identifiziert und gereinigt. cDNA-Banken können auch mittels des Immunologieexpressions-TeSts (immunological expression assay) mit gegen Follistatin-Ketten erzeugten Antikörpern gescreent werden. Der Immunologieexpressions-Test kann auch verwendet werden, um das Absuchen mit Hybridisierungssonden zu bestätigen.
Von 12 bis 13 ausgewählten Klonen wurde cDNA mit Eco RI herausgeschnitten und in M13mp19 Phage insertiert, wo diese für die Sequenzanalyse subkloniert wurden. Als ein Resultat der Sequenzanalyse wird gefolgert, daß zwei Vorläufer-Proteine codiert sind, eines von 344 Aminosäuren und eine C-terminal-verkürzte Version desselben mit 317 Aminosäuren. Es wurde weiter geschlossen, daß diese Vorläufer zur Sekretion zweier reifer FS Proteine führen, wobei eines, Follistatin A, ein 315-Reste- Monomer mit der folgenden Sequenz ist:
Diese Charakterisierung ist in Übereinstimmung mit der früheren Analyse des aus PFF erhaltenen, gereinigten Protein-Materials; die Ungleichheit zwischen der Anzahl Reste und dem gemessenen Wert von 35K wird der Anwesenheit von Glycosylierung zugeschrieben. Etwa 63% des markierten Follistatin A wurde auf der Concanavalin A-Sepharose-4B-Affinitätssäule zurückbehalten, welches mit 0,2 M alpha-Methyl-D-mannopyranosid verdrängt werden konnte, was anzeigt, daß Follistatin A glycosyliert ist. Es wird angenommen, daß eine Kohlenhydrat-Einheit mit einem Molekulargewicht von etwa 3'000 Dalton wahrscheinlich an der Seitenkette eines Asn-Rests angeheftet ist, am wahrscheinlichsten entweder an den Rest in der 95- Stellung oder den in der 259-Stellung. Das andere reife Protein, Follistatin B, hat die gleiche Sequenz wie Follistatin A, aber es ist an seinem C-Ende um 27 Reste verkürzt. Es kann unglycosyliert sein oder eine unterschiedliche Glycosylierung aufweisen.
Die gereinigten Proteine zeigen bei Konzentrationen von 2,5-6,0 ng/ml (0,07-0,17 · 10&supmin;&sup9; M) die Hälfte der maximalen Hemmung der FSH-Freisetzung, was etwa einem Drittel derjenigen von Inhibin A entspricht. Beide haben keinen Einfluß auf die Ausschüttung von Luteinisierungshormon, Wachstumshormon, Prolactin oder Thyroid-stimulierendem Hormon.
Weil die Inhibine aus verschiedenen Spezies große Homologie zeigen, d. h. Schwein, Mensch, Rind, Schaf und Ratte, erschien es sicher, daß solche homologen Follistatine anderer Spezies unter Verwendung der gleichen Sonden abgeleitet werden können, wie sie für das Absuchen der Schweine-cDNA-Bibliothek verwendet wurden. Als Alternative können Sonden unter Verwendung von cDNA- Fragmenten der für Schweine-Follistatin codierenden Gensequenzen hergestellt werden. Deshalb gestattet es die Kenntnis der Sequenz von Schweine-Follistatin dem heutigen Molekularbiologen, die Sequenz des Follistatins anderer Spezies abzuleiten und unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technik auch solche Hormone herzustellen.
Eine Hoden-Lambda-gt11-cDNA-Bibliothek wurde mit einer cDNA-Sonde abgesucht, die die ersten 317 Aminosäuren des Schweine-FS (pFS)-Vorläufers codiert. Aus 8,1 · 10&sup5; Phagenflecken wurden 12 positive Klone erhalten und 8 wurden für die Sequenzierung mittels der Dideoxy-Kettenend-Methode nach Subklonieren in den M13mp19-Vektor ausgewählt. Aus der Nukleotidsequenz der Klone wurde bestimmt, daß ein hFS-Vorläufer codiert ist, der eine 344- Aminosäuresequenz enthält, die weitgehend homolog mit dem 344-Reste-pFS-Vorläufer ist, wobei der Unterschied nur 6 Reste betrifft. Ein ähnlicher, C-terminal-verkürzter Vorläufer wird durch andere Klone auch codiert.
Um die Herkunft der zwei Vorläufer weiter abzugrenzen, wurde das hFS-Gen aus einer humanen genomischen Bibliothek geklont und sequenziert. Aus 1 Million Phageflecken wurden mittels Hybridisierung mit der gleichen Schweine-cDNA-Sonde 3 positive erhalten. Restriktionskartierung und Nukleotidsequenzanalyse enthüllte, daß ein Klon, welcher 19,1 kb lang ist, nahezu das ganze menschliche FS-Gen enthaltend 5 Exons codiert. Wie in Fig. 3 dargestellt, codieren diese 5 Exons der Reihe nach die Signalsequenz und die ersten 4 Bereiche von FS (I- IV). Ein anderer 15,0 kb-Klon enthält nur das letzte Exon (V), welches die letzten 27 C-terminalen Reste des 344- Reste-Vorläufers codiert. Die 5'-terminale Sequenz des zweiten Klons konnte nicht mit dem 3'-Ende des längeren' Klons verschmolzen werden, um eine vollständige Gensequenz zu erhalten. Trotzdem wird postuliert, daß die gesamte genomische Organisation menschlichen FS aus einer DNA-Sequenz zusammengesetzt ist, welche mehr als 5 kb lang ist, mit 6 Exons, die an den in Fig. 3 angegebenen Orten durch 5 Introns unterbrochen sind. Außer dem ersten Exon, welches die Signalsequenz codiert, sind die folgenden 4 Exone, welche die Bereiche I bis IV codieren, von annähernd gleicher Größe. Die ersten 29 Aminosäurereste des Vorläufers entsprechen der mutmaßlichen Signalsequenz, gefolgt von 4 sich wiederholenden Bereichen, die durch die 36 Cysteine bezeichnet werden. Die ersten 4 Introne, für die die Sequenz vollständig bestimmt worden ist, enthalten 2009, 430, 346 resp. 702 Basenpaare, die alle die übereinstimmende 5'-GT . . . AG-3' Donor- und Akzeptor-Spleißstellen besitzen.
Fig. 3 zeigt die geklonten cDNA-Sequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der 317- und 344-Reste-hFS-Vorläufer. Die Unterschiede zwischen pFS und hFS sind in Fig. 3 in Klammern gezeigt, wobei die entsprechenden Reste in pFS direkt unter dem humanen Rest an der speziellen Stelle dargestellt sind. Die cDNA, welche preFS317 codiert, enthält die Reihe schattierter Nukleotide, während in der cDNA die preFS344 codiert, die Reihe schattierter Nucleotide herausgespleißt ist. Zwei mögliche N-verknüpfte Glycosylierungs-Stellen im Vorläufer-Protein sind mit Sternen markiert. Pfeilspitzen zeigen die Positionen an, an denen die fünf Introns im Follistatin-Gen auftauchen.
Vergleich mit der Schweine-Struktur zeigt, daß es zwischen den zwei Spezies nur 6 konservative Aminosäuresubstitutionen gibt, von denen zwei Substitutionen innerhalb der Signalsequenz auftreten. Das Vorläufer-Protein sagt an den Resten 95 und 259 zwei mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen voraus. In Schweine-FS wurde Glycosylierung an Asn (259) versuchsweise identifiziert, während keine Kohlenhydratkette an Asn (95) beobachtet wurde. Ob diese Art der Glykosylierung auch bei humaner FS auftritt, wurde noch nicht bestätigt. Daher wurde die Sequenz von reifem menschlichem Follistatin-Protein hergeleitet und diese ist für 311 der 315 Reste exakt die gleiche wie jene des Schweins; die vier Unterschiede zwischen Human- und Schweine-Follistatin sind die folgenden: Arg anstelle von Lys an Position 134; Ala anstelle von Thr an Position 171; Asp anstelle von Glu an Position 247 und an Position 251. Die Sequenz von reifem Ratten-FS wurde auch hergeleitet. Dort gibt es sieben Unterschiede zwischen Ratten-FS und Human-FS für die 315-Reste-Sequenz wie folgt: Lys anstelle von Arg an Position 134; Ser anstelle von Ala an Position 171; Ser anstelle von Tyr an Position 176; Gly anstelle von Thr an Position 222; Glu anstelle von Asp an den Positionen 293 und 300; und Thr anstelle von Ile an Position 312.
Im wesentlichen reines Follistatin A oder B oder die nichttoxischen Salze derselben, kombiniert mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, können Säugetieren, einschließlich Menschen entweder intravenös, subkutan, perkutan, intramuskulär oder oral zur Kontrolle der Fruchtbarkeit verabreicht werden. Verabreichung von Follistatin bewirkt verminderte Fruchtbarkeit in weiblichen Säuregieren und verminderte Spermatogenese in männlichen Säugetieren. Verabreichung einer ausreichenden Menge Follistatin bewirkt Unfruchtbarkeit in Säugetieren und kann auch für Tests verwendet werden, um Unfruchtbarkeit zu diagnostizieren. Es scheint gegenwärtig, daß FS nur in gonodalem Gewebe und in den Nieren exprimiert wird und gewisse zusätzliche biologische Aktivität im Zusammenhang mit dessen Expression in den Nieren aufweisen kann.
Von den vier Domänen von Follistatin sind drei homolog: Die Sequenz zwischen den Resten 66 bis 135, die Sequenz zwischen den Resten 139 bis 210 und die Sequenz zwischen den Resten 216 bis 287. Peptide, die die individuellen Sequenzen dieser Domänen einschließen, werden als mit biologischer Aktivität behaftet angesehen. Deshalb ist vorweggenommen, daß die folgenden Peptide wünschenswerterweise einzeln hergestellt werden können: Schweine-Follistatin (66-135); Schweine-Follistatin (139- 210); Schweine-Follistatin (216-287); Human-Follistatin (66-135); und Human-Follistatin (216-287).
Unter Verwendung üblicher Methoden wie jener, die in Cold Springs Harbor Laboratory Manual, T. Maniatis, et al. (1982), (hier in der Folge CSH), wird ein synthetisches hFS-Gen, welches die 315 Reste der reifen hFS codiert, aufgebaut. Zum Beispiel werden auf einem angewendeten automatischen Syntheseapparat der B10 Systeme Oligonukleotide mit überlappenden Komplementärsequenzen synthetisiert. Die überlappenden Oligonukleotide werden zusammengefügt, so daß eine doppelsträngige DNA gebildet wird, wobei Lücken mit DNA-Polymerase und mit T4- Ligase ausgefüllt werden um nicht-chromosomale DNA herzustellen, die Säugetier-Follistatin codiert. Als Alternative wurde die angemessene cDNA-Sequenz des Klons, von welchem die hFS-Sequenz hergeleitet worden war, mit DNA- Polymerase behandelt, um die gewünschte doppelsträngige DNA-Kette zu erhalten, die reifes hFS-Protein codiert.
Unmittelbar 5' der FS-codierenden Sequenz im Strang in Leserichtung ist ein ATG Start-Signal vorgesehen, welches in einem von außen kommenden Methionin resultiert, welches N-terminal des exprimierten Polypeptids angefügt wird. Unmittelbar 3' der FS-codierenden Sequenz ist ein Stop-Signal. Am 5'-Ende ist ein EcoRI-Überhang und am 3'-Ende ist ein SalI-Überhang, wodurch der synthetische DNA-Strang direkt in die EcoRI- und SalI-Stellen des Plasmids pUC8 insertierbar ist, welches durch Vieira et al. Gene 14, 259-268 (1982) beschrieben wurde. Der DNA-Strang wird auf das pUC8-Plasmid aufgeschmolzen, wo er unter der Kontrolle des beta-Galactosidase-Promotors mit dem ATG Start-Signal und der Shine Delgarno- Sequenz steht, die in ihrer natürlichen Orientierung erhalten wird und verbunden mit dem Promotor.
Der rekombinante Vektor, der als hFS bezeichnet wird, wird in den DH-1-Stamm von E. Coli mittels des Calciumchlorid-Verfahrens, CSH, supra, transformiert. Das transformierte E. Coli wird in L-Nährlösung kultiviert und Ampicillin-resistente Stämme werden ausgewählt. Weil die DNA-Sequenz ins Plasmid in einer Orientierung insertiert worden ist, von der erwartet wird, daß sie zur Expression von Protein-Produkt der DNA-Kette führt, wurden die Arnpicillin-resistenten Kolonien mit gegen hFS erzeugtem Antiserum auf Reaktivität abgesucht. Diese Kolonien wurden mittels des immunologischen Verfahrens von Healfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 31-35 (1983) abgesucht und mit hFS-Antikörpern positiv reagierende Kolonien wurden weiter charakterisiert. Die Zellen wurden aus ihrem Kulturmedium abgetrennt und lysiert, um deren Überstand zu erhalten. Der Überstand transformierter Zellen wurde mittels RIA als gegenüber von Antikörpern, die gegen hFS erzeugt worden waren, reaktiv bestimmt.
100 ml Zellüberstand wurde erhalten und hFS wurde daraus gereinigt, unter Verwendung des hierin bereits beschriebenen Verfahrens. Näherungsweise 0,01 mg hFS wurde produziert, welches auf über 98 Gew.-% Gesamtprotein gereinigt war.
Die biologische Aktivität des synthetischen hF, welches den von außerhalb kommenden N-terminalen Methionin-Rest enthält, wird auf biologische Aktitivät getestet durch die Fähigkeit des synthetischen hFS, Inhibin-Aktivität zu zeigen, indem es spezifisch die basale Sekretion von FSH in einem Ratten-Hypophysenvorderlappen-Kultur-System hemmt, wie hierin früher beschrieben. Die biologische Aktivität von synthetischem hFS ist im wesentlichen identisch mit natürlichem, gereinigtem pFS.
Der überflüssige N-terminale Rest ist mittels partieller chemischer Verdauung mit Cyanbromid oder Phenylisothiocyanat, gefolgt von Behandlung mit einer starken, wasserfreien Säure, wie Trifluoressigsäure, entfernbar. Dieses Verfahren greift jedoch interne Met-Reste an und, während es einige pFS mit der natürlichen Proteinstruktur bereitstellt, vermindert es die gesamte Menge an biologisch aktivem Protein. Es wird bevorzugt enzymatisch entfernt.
Außerdem kann das hFS-Plasmid, welches in einem der hFS-produziertenden Klone amplifiziert worden ist, isoliert und mit EcoRI und SalI gespalten werden. Dieses verdaute Plasmid wird auf einem Agarose-Gel electrophorisiert, was die Abtrennung und Gewinnung des ainplifizierten.hFS-Inserts erlaubt. Der Insert wird dann in das plasmidische pYEp insertiert, einen Shuttle-Vektor, welcher verwendet werden kann, um sowohl E. Coli als auch Saccharom ces cerevisiae Hefe zu transformieren. Insertion der synthetischen DNA-Kette an diesem Punkt stellt sicher, daß die DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors ist, im richtigen Leserahmen eines ATG- Signals und im richtigen Abstand bezüglich einer Cap- Stelle. Der Shuttle-Vektor wird verwendet um URA3 zu transformieren, einen Stamm von S. cerevisiae Hefe, aus welchem das Oratatmonophosphatdecarboxalase-Gen entfernt worden ist.
Die transformierte Hefe wird im Medium wachsen gelassen um log-Wachstum zu erhalten. Die Hefe wird aus ihrem Kulturmedium abgetrennt und Zell-Lysate werden hergestellt. Die zusammengegossenen Zell-Lysate werden mittels RIA als gegenüber hFS erzeugte Antikörper reaktiv bestimmt, was zeigt, daß in den Hefezellen ein Peptid exprimiert wird, welches hFS-Peptidsegmente enthält.
Die Erfindung stellt gewisse Polypeptide bereit und macht diese der biologischen und therapeutischen Verwendung zugänglich. Die Herstellung von hFS kann sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zell- Linien durchgeführt werden. Obschon hFS-Synthese entweder unter Verwendung von Bakterien- oder Hefe-Zell-Linien gezeigt werden kann, sollten die synthetischen Gene für die Expression in Zellen höherer Tiere, wie Säugetier-Tumorzellen, insertierbar sein. Solche Säugetierzellen können zum Beispiel als peritoneale Tumoren in Wirtstieren gezogen werden, und hFS kann aus der peritonealen Flüssigkeit geerntet werden.
Obschon die obigen Beispiele zeigen, daß hFS mittels rekombinanter DNA-Techniken synthetisiert werden kann, wurde nicht behauptet, diese hätten die Maximierung der Produktion zum Inhalt. Es wird erwartet, daß nachfolgende Selektion effizienterer Klonierungs-Vektoren und wirtszellinien die Ausbeute an hFS erhöhen wird. Bekannte Genamplifizierungs-Techniken sowohl eukaryotischer als auch prokaryotischer Zellen können verwendet werden, um die Produktion zu erhöhen.
Solche Peptide werden oft in der Form pharmazeutisch annehmbarer, nichttoxischer Salze, wie Säureadditionssalze oder Metallkomplexe, z. B. mit Zink, Eisen oder ähnliche (welche als Salze für die Zwecke dieser Anwendung beurteilt werden), verabreicht. Veranschaulichend für solche Säureadditionssalze sind Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Maleate, Acetate, Citrate, Benzoate, Succinate, Malate, Ascorbate, Tartrate und ähnliche. Falls der aktive Inhaltsstoff in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette Bindemittel wie Tragacanth, Getreidestärke oder Gelatine enthalten, ein Auflösungsmittel wie Algininsäure und ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat, enthalten. Falls Verabreichung in flüssiger Form gewünscht ist, können Süß- und/oder Geschmacksstoffe verwendet werden und intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösungen oder ähnlichem erfolgen.
Follistatin sollte unter der Führung eines Arztes verabreicht werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen werden üblicherweise eine wirksame Menge des Peptids in Verbindung mit einem üblichen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die Dosierung wird in Abhängigkeit des spezifischen Zwecks, für den das Protein verabreicht wird, variieren, und Dosierungen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1 Milligram pro kg Körpergewicht können verwendet werden, wenn das Protein aufregelmäßiger Basis als männliches Contraceptivum verabreicht wird.
Obschon das Reinigungsverfahren von Follistatin zuerst in Begriffen der Isolierung von PFF beschrieben wurde, kann Follistatin aus anderen Rohextrakten ähnlich gereinigt werden. Der Begriff "Rohextrakte" wie hier verwendet, betrifft anderes Säugetierkörpermaterial zusätzlich zu Follikelflüssigkeit, sowie Extrakte aus Organismen, einschließlich von -abor-Mikroorganismen wie Prokaryoten (z. B. E. Coli) und Eukaryoten (z. B. cerevisiae Hefe), welche mittels Stand der Technik Methoden transformiert worden sind, um Säugetier-Follistatin- Protein herzustellen.
Spezielle Eigenschaften der Erfindung werden in den Ansprüchen, die folgen, hervorgehoben.

Claims

1. Nicht-chromosomale-DNA, welche monomeres Säuger- Follistatin kodiert, welche eine Amino-terminale Sequenz beginnend mit Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln-Ala-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gln- Val-Leu aufweist, welche spezifisch die Basissekretion des Follikel-stimulierenden Hormons inhibiert, jedoch nicht die Basissekretion des luteinisierenden Hormons inhibiert.

2. DNA nach Anspruch 1, kodierend menschliches Follistatin.

3. DNA nach Anspruch 1, kodierend menschliches Follistatin, welches die folgenden Aminosäurereste 1 bis 315 aufweist:

oder ein C-terminal verkürztes Fragment davon, welches biologisch wirksam ist, um die Basissekretion von FSH zu inhibieren.

4. DNA nach Anspruch 3, kodierend menschliches Follistatin, welches die Aminosäurereste 1 bis 288 aufweist.

5. DNA nach Anspruch 1, kodierend Schweine-Follistatin, welches die folgenden Aminosäurereste 1 bis 315 aufweist:

6. DNA, welche die in Fig. 3 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist, welche den Vorlaufer für menschliches Follistatin kodiert, welches die Aminosäurereste -29 bis inklusive +315 aufweist.

7. DNA, welche die in Fig. 3 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist, welche den Vorläufer für menschliches Follistatin kodiert, welches die Aminosäurereste -29 bis inklusive +288 aufweist.

8. Rekombinantes Protein, welches aus der DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche produziert wurde.

9. Rekombinantes Schweine-Follistatin, welches aus der DNA nach einem der Ansprüche I bis 5 produziert wurde.

10. Rekombinantes menschliches Follistatin, welches aus der DNA nach einem der Ansprüche 1, 3 und 4 produziert wurde.

11. Rekombinantes Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 10, welches glykosyliert ist.

12. Gegebenenfalls glykosyliertes Protein, welches von Inhibin in der Aminosäuresequenz und dem bezeichneten menschlichen Follistatin verschieden ist, welches Protein dadurch gekennzeichnet ist, daß:

(a) es die folgenden Inhibin-artigen Untersuchungseigenschaften aufweist; nämlich daß:

(i) es eine spezifische Inhibition der Basis-FSH-Sekretion zeigt;

(ii) es keine Inhibition der Basis-LH-Sekretion zeigt;

(b) es durch DNA, welche hiefür in einer menschlichen, testikulären Bibliothek von menschlichem cDNA in Lamda gt11 Plasmiden aus mRNA, welche aus einer menschlichen Testikulärquelle von biologischem Material stammt, umkehrtranskribiert ist, kodiert;

(c) es aus einer Einzelpolypeptidkette zusammengesetzt ist, welche eine Amino-terminale Aminosäuresequenz beginnend mit Gly-Asn-Cys-Trp-Leu-Arg-Gln-Ma-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gln- Val-Leu aufweist;

(d) es als ein möglicherweise glykosyliertes Isolat aus dem zuvor genannten Follikelprotein ein Molekulargewicht von etwa 35000 bis etwa 32000 hat, wie dies durch SDS-PAGE gemessen wurde;

(e) es einen pKa von etwa 5 hat.

13. Protein enthaltend die folgende Aminosäuresequenz:

14. Biologisch wirksames Fragment von hFS(1-315), welches Fragment eine spezifische Inhibition der Basis-FSH-Sekretion zeigt.

15. Biologisch wirksames Follistatinfragment nach Anspruch 14, worin die Aminosauresequenz in bezug auf das menschliche Follistatin mit der gesamten Sequenz nach Anspruch 13 Carboxy-terminal verkürzt ist.

16. Rattenprotein, welches als monomeres Ratten-Follistatin bezeichnet ist und welches die Aminosäuresequenz [Ser171,176, Gly²²², Asp247,251, Gln293,300, Thr³¹²]pFS(1- 315) aufweist.

17. Biologisch wirksames Polypeptid, welches eine der in der Folge definierten Aminosäuresequenzen aufweist:

hFS (66-135) = [Arg¹³&sup4;] pFS (66-135)

hFS (139-210) = [Ala¹&sup7;¹] pFS (139-210)

hFS (216-287) = (Asp247,251] pFS (216-287)

rFS (139-210) = [Ser171,176] pFS (139-210)

rFS (216-287) = [Gly²²², Asp247,251] pFS (216-287).

18. Verwendung von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung des hiebei kodierten Follistatinproteins.

19. Nicht-toxisches Salz eines Follistatinproteins nach einem der Ansprüche 8 bis 17.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Follistatinprotein nach einem der Ansprüche 8 bis 17 oder ein nicht-toxisches Salz davon zusammen mit einem Träger.

21. Segment von Säuger-Follistatinprotein gewählt aus der folgenden Klasse von Polypeptidsequenzen: Schweine-Follistatin (66-135), (139-210) oder (216-287) unter Bezugnahme auf die spezifisch in Anspruch 5 gezeigte Aminosäuresequenz; und menschliches Follistation (66-135) oder (216-287) unter Bezugnahme auf die in Anspruch 3 gezeigte Aminosäuresequenz.

22. Verfahren zum Erhalten von im wesentlichen homogenen Säuger-Follistatinprotein, welches Bereitstellung eines Materials mit Follistatinwirksamkeit, Aussetzen des Materials an ein Trägermedium, an welches Heparinreste unter derartigen Bedingungen gebunden sind, daß Follistatinprotein an den Heparinresten adsorbiert wird, anschließend Eluieren des Follistatinproteins von den Heparinresten, Gelfiltrieren des eluierten Follistatinproteins und Auswählen von Fraktionen, welche Follistatinwirksamkeit zeigen, und Fraktionieren dieser gelfiltrierten Fraktionen auf wenigstens einer Umkehrphasen-Hochleistungs - Flüssigkeitschromatographiesäule umfaßt.