DE69132813T2

DE69132813T2 - Genetisches igfbp-5 rodierendes material

Info

Publication number: DE69132813T2
Application number: DE69132813T
Authority: DE
Inventors: C. Kiefer; Frank Masiarz
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-08-28
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2011-08-29
Also published as: JPH06503947A; EP0546074A1; DE69132813D1; PT98806B; WO1992003470A1; ATE208815T1; CA2090705A1; EP0546074B1; IE913035A1; PT98806A; EP0546074A4

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilung der U.S.-Anmeldung Seriennummer 07/574,613, eingereicht am 28. August 1990 (Anwaltsregister-Nummer CHIR-007/00 US).

EINFÜHRUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die gentechnische Herstellung natürlich vorkommender Proteine und die entsprechenden rekombinanten Proteine, Gene und Gensegmente und insbesondere solche Proteine und genetischen Elemente, die von einem insulinähnlichen, Wachstumsfaktor-bindenden Protein abgeleitet sind, Verfahren und Zusammensetzungen, welche die genetischen Elemente einsetzen, und Gensegmente, die bei der Diagnose nützlich sind.

Hintergrund

Insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) sind Polypeptidhormone von niedrigem Molekulargewicht mit struktureller Homologie zu Proinsulin. Es sind zwei verschiedene IGFs bekannt, nämlich IGF-I und IGF-II, welche in vitro für eine breite Vielfalt von Zellen in Gewebekulturen mitogen sind. Beide IGFs stimulieren in vitro das Wachstum verschiedener Gewebe und besonders induzieren sie die Collagensynthese. IGF-I vermittelt die wachstumsfördernde Wirkung des Wachstumshormons bei der Chondrogenese und der Knochenbildung und ist daher für das normale Wachstum eines Individuums unentbehrlich. Dies zeigt sich an der Tatsache, dass Pygmäen und Zwerghunde einen Mangel an IGF-I haben, jedoch in ihrem Serum einen normalen Wachstumshormonspiegel aufweisen. Vom IGF-II wird angenommen, dass es eine Schlüsselrolle bei der fötalen Entwicklung und beim Nervenwachstum spielt.
Zusätzlich zu ihrer primären Wirkung auf das Skelettgewebe zeigen sie auch bei anderen Geweben wachstumsfördernde Wirkungen. Von Wundfibroblasten ist bekannt, dass sie IGFs produzieren, weiche Fibroblasten zum Wachsen und Aufbau von Collagen anregen, ein strukturelles Protein, welches normalerweise für die Heilung von Wunden benötigt wird. Die Gefäßbildung des Wundgewebes wird ebenfalls eingeleitet. Weiterhin wurde auch gefunden, dass IGFs eine Erythropoetin-ähnliche Wirkung haben, indem sie die Hämopoese einleiten.
Neueste Untersuchungen haben auch gezeigt, dass von bestimmten Krebszellen, z.B. Brust- und Nierenkrebszellen, erzeugte IGFs eine Autostimulierung der Vermehrung der Krebszellen und von vaskulären und fibrösen Geweben bewirken, die zur Unterstützung des Wachstums der Krebsgewebe notwendig ist:
Außerdem zeigen beide IGFs ein Spektrum metabolischer Wirkungen, die denjenigen von Insulin ähnlich sind, indem sie insbesondere den Transport und die Metabolisierung der Glucose stimulieren. Die biologischen Wirkungen der IGFs und von Insulin werden durch ihre Bindung an spezifische Rezeptoren vermittelt. Vor allem haben beide IGFs die Fähigkeit, sich an den Insulinrezeptor mit annähernd 100-fach geringerer Affinität zu binden als Insulin.
Beide IGFs weisen im Blut eine annähernd 100-fach größere Konzentration als Insulin auf. Die Hypoglycämie wird durch einen Regulationsmechanismus verhindert, welcher Trägerproteine umfasst, die im Blut vorhanden und zur Bildung von Komplexen mit den IGFs befähigt sind. Auf diese Weise zirkulieren die IGFs im Blut in Form eines Komplexes, der keine insulinähnliche Wirkung hat. Durch ihre Anlagerung an das Trägerprotein (hier nachfolgend als IGF-Bindungsproteine oder IGFBPs bezeichnet) wird die Bindung der IGFs an die Zelloberflächenrezeptoren unterbunden. Es ist auch gezeigt worden, dass eine andere Funktion der IGF-Bindungsproteine in der Verlängerung der kurzen Halbwertszeit der IGFs liegt, welche einem schnellen protoelytischen Abbau unterworfen sind, wenn sie im Blut in freier Form vorliegen.
In Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden können IGFs in vitro nützlich sein zur Stimulierung a) des Wachstums von Tieren und Menschen mit einem Mangel an Wachstumshormon, b) der Geweberegenerierung wie Erythropoese und Chondrogenese, c) der Wundheilung und d) der Funktionen verschiedener Organe, z.B. Leber und Nieren. Als ein Ergebnis ihrer die Chondrogenese stimulierenden Wirksamkeit sind IGFs besonders für eine Verwendung zur Knochenbildung geeignet, z.B. bei der Behandlung der Osteoporose. IGFs für die eine Verwendung bei den vorstehend angegebenen Behandlungen werden einer Person vorteilhafterweise in Verbindung mit mindestens einem IGF-Bindungsprotein verabreicht. Die Verabreichung dieser Kombination anstelle von IGF alleine hat günstige Wirkungen, einschließlich der Verhinderung der Hypoglycämie und möglicher mitogener Auswirkungen an den Injektionsstellen und der Verlängerung der IGF-Halbwertszeit. Weiter wurde gefunden, dass Bindungsproteine auch für die Verstärkung der Erythropoetinähnlichen Wirkung von IGF-I nützlich sind. Die Bindungsproteine können auch nützlich sein, um IGFs zu spezifischen Geweben zu leiten.
Allein verabreicht, d.h. ohne jegliches IGF, können die Bindungsproteine ebenfalls zur Blockierung nachteiliger Wirkungen der IGFs therapeutisch nützlich sein, wie diejenigen, die auftreten, wenn IGFs im Überschuss produziert werden, z.B. von bestimmten Krebszellen, z.b. Hormon erzeugenden Krebszellen wie Brust- oder Nierenkrebszellen, abgesonderte freie IGFs. Die IGF-Bindungsprotein-Therapie kann auch die Erblindung als Sekundärwirkung einer diabetischen proliferativen Retinopathie verhindern. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass IGF einer der Faktoren sein kann, die die Endothel- und Fibroblastenvermehrung bei der diabetischen Retinopathie anregen.
Eine andere therapeutische Verwendung der IGFBPs ist die Kontrolle des übermäßigen Wachstums bei Personen mit IGF-Bindungsproteinmangel, da es sehr wahrscheinlich ist, dass hohe IGF-Spiegel, die mit abnormal niedrigen Spiegeln des Bindungsproteins kombiniert sind, für übermäßiges Wachstum verantwortlich sind.
In den letzten Jahren sind im Serum von Nagetieren und Menschen drei Hauptarten von IGF-Bindungsproteinen entdeckt worden, die sich in Größe und anderen Eigenschaften unterscheiden.
Das erste entdeckte Bindungsprotein, nun IGFBP-3 genannt, ist ein Glycoprotein von annähernd 150 kD und aus verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt. Seine Bildung ist im Gegensatz zu derjenigen des zweiten, kleineren IGF-Bindungsproteins Wachstumshormon-abhängig.
Das zweite entdeckte Bindungsprotein, nun IGFBP-1 genannt, hat beim Menschen und bei der Ratte ein Molekulargewicht von annähernd 30-40 kD. Das menschliche IGFBP- 1 ist bereits aus verschiedenen Quellen gereinigt worden, eingeschlossen amniotische Flüssigkeit (Provoa; G. et al., Eur. J. Biochem (1984) 144: 199, (deshalb auch als amniotisches Flüssigkeits-Bindungsprotein bezeichnet)), Plazenta (Koistenen, R. et al Endocrinology (1986) 118: 1375) und konditioniertes Medium von Hepatoma-G2-Zellen (Powell, D.R. et al., J. Chromatogr. (1987) 420: 163). Die ersten beiden Bindungsproteine sind charakterisiert worden durch ihren Aminosäuregehalt und ihre N-terminalen Aminosäuresequenzen, und es wurde gefunden, dass diese identisch oder mindestens sehr ähnlich sind. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen des IGF-Bindungsproteins, das aus Hepatoma-G2-Zellen isoliert wurde (Lee, Y.L. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5): 404) und dem IGF-Bindungsprotein, das aus einer Plazenta-cDNA-Genbank cloniert wurde (Brinkman, A. et al., The EMBO Journal (1988) 7 (8): 2417) zeigt 99% Homologie. Desweiteren zeigen diese beiden Aminosäuresequenzen mit dem IGF-Bindungsprotein, wie es durch eine cDNA-Genbank codiert wird, eine Homologie von 94% (Brewer, M.T. et al., Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152 (3): 1289).
Zusätzlich zu den zwei im Serum vorliegenden Hauptformen von IGF- Bindungsproteinen sind in verschiedenen menschlichen Gewebeextrakten und Zellkulturmedien durch Westernblot-Verfahren und Affinitätsmarkierungen mit [I¹²&sup5;]-IGF noch andere IGF-Bindungsproteine identifiziert worden. Ihre Molekulargewichte reichen von 15 bis 150 kD, und einige dieser Proteine scheinen durch proteolytischen Abbau der größeren IGF-Bindungsproteine gebildet zu werden. Insbesondere stellt ein 53 kD-IGF- Bindungsprotein, das aus menschlichem Serum gereinigt wurde, eine Untereinheit des 150 kD-IGFBP-1 dar (Baxter, R.C. Biochem. Biophys. Res. Com. (1966) 139 (3): 1256).
Eine andere Form des IGF-Bindungsproteins ist ebenfalls im konditionierten Medium aus Ratten-BRL-3A-Zellen gefunden worden; es hat ein Molekulargewicht von annähernd 33 -36 kD. Eine partielle aminoterminale Proteinsequenz des Ratten-BRL-3A-Bindungsproteins wurde bestimmt (Mottolla, C. et al., J. Biol. Chem. (1986) 261: 11180; Lyons, R.M., Smith G.L., Mol. Cell. Endocrinol. (1986) 45: 263). Der Homologiegrad von 33%,- den die terminalen Sequenzen von Ratte und Mensch zeigen, ist nicht hoch genug, um die jeweiligen Bindungsproteine als Äquivalente anzusehen.
Ein weiteres IGFBP, nun IGFBP-2 genannt, das mit dem BRL-3A-Bindungsprotem verwandt ist, ist ebenfalls gefunden und seine Aminosäuresequenz vollständig bestimmt worden. Die Aminosäuresequenz von IGFBP-2 unterscheidet sich von derjenigen der vorher bekannten Bindungsproteine.
Die Existenz einer Anzahl verschiedener IGF-Bindungsproteine zeigt, dass diese Proteine verschiedene Funktionen haben. Da es möglich ist, Krankheitszustände zu diagnostizieren und die biologische Wirksamkeit der IGFs unter Verwendung der zur Zeit bekannten Bindungsproteine auf verschiedenen Wegen zu modifizieren, gibt es ein bedeutendes Interesse an der Entdeckung zusätzlicher IGF-Bindungsproteine mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften.
Relevante Literatur
1. Daughaday, W.H., und Rotwein, P. (1989) Endocrine Reviews 10, 68-91.
2. Nissley, S.P., und Rechler, M.M. (1984). In: Hormonal Proteins and Peptides (C.H. Li, Hrsg.). S. 127-203. Academic Press, New York und London.
3. Cohen, K.L., und Nissley, S.P. (1976) Acta Endocr. (Kbh.) 83, 243-258. 4. Zapf, J., Hauri, Ch., Waldvogel, M. und Froesch, E.R. (1986) J. Clin. Invest. 77, 1768-1775.
5. Guler, H.P., Zapf, J., Schmid, Ch., und Froesch, E.R. (1989) Acta Endocr. (Kbh.) 121, 753-758.
6. Zapf, J., Hauri, C., Waldvogel, M., Futo, E., Hasler, H., Binz, K., Guler, H.P. Schmid, C., und Froesch, E.R. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3813- 3817.
7. Schmid, C., Zapf, J., und Froesch, E.R. (1989) FEBS Letters 244, 328-332.
8. Schmid, Ch, Ernst, M., Zapf, J., und Froesch, E.R. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 788-794.
9. Elgin, R.G., Busby, W.H., und Clemmons, D.R. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3254-3258.
10. De Mellow, J.S.M., und Baxter, R.C. (1988) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 156, 199-204.
11. Knauer, D.J., und Smith, G.L. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7252- 7256.
12. Zapf, J., Waldvogel, M., und Froesch, E.R. (1975) Arch. Biochem. Biophys. 168, 638-645.
13. Hintz, R.L., Liu, F., Rosenfeld, R.G. und Kemp, S.F. (1981) J. Clin. Endocrinol. Metab., 53: 100-104.
14. Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1981) J. Clin. Endocrinol. Metab. 61, 799-801.
15. Baxter, R.C., und Martin, J.L. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6898- 6902.
16. Wood, W.I., Cachianes, G., Henzel, W.J., Winslow, G.A., Spencer, S. A., Hellmiss, R., Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1988) Molecular Endocrinology 2, 1176-1185.
17. Zapf, J., Schmid, Ch., Guler, H.P., Waldvogel, M., Hauri, Ch., Futo, E., Hossenlopp, P., Binoux, M., und Froesch, E.R. (1990) J. Clin. Invest.; im Druck.
18. Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1986) J. Biol. Chem. 261, 8754-8760.
19. Zapf, J., Born, W., Chang, J.-Y., James P., Froesch, E.R., und Fischer, J.A. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 1187-1194.
20. Nilson, B.L., und Brown, L.R. (1984) Anal. Biochem. 141, 311-315.
21. Hossenlopp, P., Seurin, D., Segovia-Quinson, B., Hardouin, S., und Binoux, M. (1986) Anal. Biochem. 154, 138-143.
22. Zapf, J., Walter, H., und Froesch, E.R. (1981) J. Clin. Invest. 68, 1321-1330.
23. Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.
24. Yuen, S.W., Chui, A.H., Wilson, K.J., und Yuan, P.M. (1988) Applied Biosystems, User Bulletin Nr. 36, 1-17.
25. Hunkapiller, M.W., Hewick, R.M., Dreyer, W.J., und Hood, L.E. (1983) Methods in Enzymology 91, 399-413.
26. Friedman, M., Krull, L.G., und Cavins, J.F. (1980) J. Biol. Chem. 245, 3868- 3871.
27. Chirgwin, J.M., Przbyla, A.E., MacDonald, R.J., und Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299.
29. Aviv, H., und Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412.
30. Maniatis, T., Fritsch, E.F., und Sambrook, J.(1982) Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY).
31. Binkert, C., Land vehr, J., Mary, J.-L., Schwander, J., und Heinrich G. (1989) EMBO Journal 8, 2497-2502.
32. Margot, J.B., Binkert, C., Mary, J.-L., Landwehr, J., Heinrich, G., und Schwander, J. (1989) Molecular Endocrinology 3, 1053-1060.
33. Okayama, H., und Berg, P. (1983) Mol. und Cell. Biol. 3, 280-289.
34. Aruffo, A., und Seed, B. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577.
35. Pfeiffer, B.H., und Zimmerman, S.B. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 7853-7871.
36. Benton, W.D., und Davis, R.W. (1977) Science 196, 180-???
37. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., und Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119.
38. Sanger, F., Nicklen, 5., und Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 5463-5467.
39. Barr, P.J., Thayer, R.M., Laybourn, P., Najarian, R.C., Seela, F., und Tolan, D. (1986) Biotechniques 4, 428-432.
40. Lehrach, H., Diamond, D., Wozney, J.M., und Boedtker, H. (1977) Biochemistry 16, 4743-4751.
41. Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205.
42. Feinberg, A.P., und Vogelstein, B. (1984) Anal. Biochem. 137, 266-267.
43. Laron, Z. (1974) Isr. J. Med. Sci. 10, 1247-1253.
44. Ballard, J., Baxter, R.C., Binoux, M., Clemmons, D., Drop, S., Hall, K., Hintz, R.L., Reeller, M.M., Rutanen, E., und Schwander, J.J. (1989) Acta Endocr. (Kbh.) 121, 751-752.
45. Roghani, M., Hossenlopp, P., Lepage, P., Balland, A., und Binoux, M. (1989) FEBS Letters 255, 253-258.
46. Martin, J.L., Willetts, K.E., und Baxter, R.C. (1990) J. Biol., Chem. 265, 4124- 4130.
47. Ruoslahti, E., und Pierschbacher, M.D. (1987) Science 238, 491-497.
48. Obara, M., Chang, M.S., und Yamada, K.M. (1988) Cell 53, 649-657.
49. Mottola, C., MacDonald, R.G., Brackett, J.L., Mole, J.E., Anderson, J.K., und Czech, M.P. (1986) J. Biol. Chem. 261, 11180-11188.
50. Brown, A.L., Chiariotti, L., Orlowski, C.C., Mehiman, T., Burgess, W.H., Ackerman, E.J., Bruni, C.B., und Rechler, M.M. (1989) J. Biol. Chem. 264, 5148-5154.
51. Albiston, A.L. und A.C. Herington (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 166, 892-897.
52. Wang, J.F., Hampton, B., Mehlman, T., Burgess, W.H., und Rechler, M.M. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 718-726.
53. Huhtala, M.L., Koistinen, R., Palomaki, P.,Partanen, P., Bohn, H., und Seppala, M. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 263-270.
54. Lee, Y.L., Hintz, R.L., James, P.M., Lee, P.D.K., Shivley, J.E., und Powell, D.R. (1988) Molecular Endocrinology 2, 404-411.
55. Brewer, M.T., Stetler, G.L., Squires, Ch.H.,Thompson, R.C., Busby, W.H., und Clemmons, D.R. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, 1289-1297.
56. Brinkman, A., Groffen, C., Kortleve, D.J., Van Kessel, A.G., und Drop, S.L.S. (1988) EMBO Journal 7, 2417-2423.
57. Julkunen, M., Koistinen, R., Aalto-Setala, M., Janne, O.A., und Kontula, K. (1988) FEBBS Letters 236, 295-302.
58. Luthman, H., Soderling-Barros, 3., Persson, B., Engberg, C., Stern, L, Lake, M., Franzen, S.-A., Israelsson, M., Rad n, B., Lindgren.B., Hjelmqvist, L., Enerb ck. S., Carlsson, P., Bjursell, G., Povoa, G., Hall, K., und J rnvall, H. (1989) Eur. J. Biochem. 180, 259-265.
59. Mohan, S., Bautista, C.M., Wergedal, J., und Baylink, D.J., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8338-8342.
60. Szabo, L., Mottershead, D.G., Ballard, F.J., und Wallace, J.C. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 151, 207-214.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Herstellung eines IGF-Bindungsproteins durch gentechnische Verfahren bereitzustellen, wobei das Bindungsprotein biologische Eigenschaften aufweist, die von denjenigen von IGFBP-1, IGFBP-2 und IGFBP-3 verschieden sind.
Weiter ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, rekombinante DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die dazu fähig sind, das neue IGF-Bindungsprotein zu exprimieren, damit das Bindungsprotein leichter verfügbar wird.
Diese und andere Ziele der Erfindung sind durch die Bereitstellung des rekombinanten DNA-Moleküls von Anspruch 1 erreicht worden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen eines menschliches IGFBP-5 codierenden Clons zeigt.
Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm, in dem die Aminosäuresequenzen eines menschlichen Bindungsproteins der Erfindung, menschliches IGFBP-5, mit den bekannten Sequenzen der drei vorstehend besprochenen menschlichen Bindungsproteine und mit IGFBP-4, einem anderen kürzlich entdeckten IGF-Bindungsprotein, verglichen werden. Homologiebereiche können in diesen Sequenzen erkannt werden. Diese Homologiebereiche sind von besonderem Interesse, weil sie Gebiete anzeigen, von denen DNA-Sonden erhalten werden können, denen eine hohe Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Auffindung verwandter Moleküle zukommt. Zwei derartige Homologiebereiche sind durch Klammern angezeigt, obwohl andere Homologiebereiche ebenfalls vorhanden sind.

BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGFORMEN

IGFBP-5-cDNA wurde ursprünglich aus einer menschlichen Osteosarcom/λZAPcDNA-Genbank unter Verwendung eines Zweistufenverfahrens isoliert. Zuerst wurden kleine Fragmente der die Aminosäuren 1 bis 15 von BP5 codierenden cDNAs aus der Osteosarcom- DNA mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, über Gel gereinigt und sequenziert. Zweitens wurden perfekt gepaarte Oligonucleotide basierend auf der BP5-Nucleotidsequenz zwischen den PCR-Primern synthetisiert und als Sonden zum Isolieren der cDNA-Clone benutzt. Die BP5-cDNA-Clone, die bei der Agarosegelelektrophorese die größte DNA- Insertionsgröße zeigten, wurden sequenziert. Die Nucleotid- und codierten Aminosäuresequenzen sind in Fig. 1 gezeigt.
Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren werden in diesen Figuren und anderswo in dieser Beschreibung verwendet.
Eine Reihe von Begriffen, die in der Gentechnik und Proteinchemie verwendet werden, werden hier mit den folgenden definierten Bedeutungen verwendet.
Zwei Nucleinsäurefragmente sind "homolog", wenn sie unter den in Maniatis et al., cit., S. 320-323 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren können. Unter Verwendung der folgenden Waschbedingungen - 2 · SCC, 0,1% SDS, Raumtemperatur - zweimal, jeweils 30 Minuten; dann 2 · SCC, 0,1% SDS, 50ºC - einmal, 30 Minuten; dann 2 · SCC, Raumtemperatur - zweimal, jeweils 10 Minuten - können jedoch homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchtens etwa 25-30% Basen-Fehlpaarungen enthalten. Mehr bevorzugt enthalten homologe Nucleinsäurestränge 15-25% Basen- Fehlpaarungen, noch mehr bevorzugt 5-15% Basen-Fehlpaarungen. Diese Homologiegrade können durch Verwendung stärker stringenter Waschbedingungen für die Identifizierung von Clonen aus Genbanken (oder anderen Quellen genetischen Materials), wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, gewählt werden.
Ein DNA-Fragment ist "abgeleitet von" einer IGFBP-5-codierenden DNA-Sequenz, wenn es die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Basenpaarsequenz aufweist, wie eine Region der codierenden Sequenz für das ganze IGFBP-5-Molekül.
Im wesentlichen der/die/das gleiche bedeutet, bezogen auf die biologischen Wirkungen, dass die Wirkungen von gleicher Art sind, auch wenn sie sich in Ihrem Ausmaß unterscheiden können. Wenn man es auf Aminosäuresequenzen bezieht, bedeutet im wesentlichen der/die/das gleiche, dass die fraglichen Moleküle ähnliche biologische Eigenschaften haben und vorzugsweise mindestens 85% Homologie bei den Aminosäuresequenzen haben. Mehr bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen zu mindestens 90% identisch. Bei anderen Verwendungen hat im wesentlichen der/die/das gleiche eine Bedeutung, wie sie in der englischen Sprache üblich ist.
Ein Protein ist "abgeleitet von" einem IGFBP-5-Molekül, wenn es die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz aufweist, wie eine Region des IGFBP-5- Moleküls.
Sowohl das glycosylierte als auch das nicht glycosylierte IGFBP-5 oder Polypeptidderivate davon können zur Herstellung von Antikörpern, entweder monoclonale oder polyclonale, die spezifisch für IGFBP-5 sind, verwendet werden. Mit Polypeptidderivaten dieser IGFBPs sind Polypeptide gemeint, die sich in der Länge von natürlichem IGFBP-5 unterscheiden und fünf oder mehr Aminosäuren aus IGFBP-5 in der gleichen Primäranordnung enthalten, wie sie in IGFBP-5 natürlicher Herkunft gefunden wird. Polypeptidmoleküle mit im wesentlichen dergleichen Aminosäuresequenz wie IGFBP-5, die jedoch kleinere Aminosäuresubstitutionen besitzen, die die Fähigkeit der IGFBP-5- Polypeptidderivate der Wechselwirkung mit IGFBP-5 spezifischen Molekülen wie Antikörper und IGF-Moleküle nicht beeinflussen, insbesondere IGF-I und IGF-II, liegen innerhalb der Definition von IGFBP-5. Derivate schließen glycosylierte Formen, Aggregationskonjugate mit anderen IGFBP-Molekülen und kovalente Konjugate mit nicht verwandten chemischen Einheiten ein. Kovalente Derivate werden durch Bindung von Funktionalitäten an Gruppen hergestellt, welche in der Aminosäurekette der IGFBPs oder an den N- oder C-terminalen Resten mit in der Technik bekannten Mitteln gefunden werden.
Experimente mit N-Glycanase legen nahe, dass IGFBP-5 glycosyliert ist. Die Behandlung von IGFBP-5 mit N-Glycanase zeigt eine Verschiebung im Molekulargewicht von 30 kD zu 24 kD für IGFBP-5, ein starker Hinweis darauf, dass dieses Bindungsprotein glycosyliert ist. Dies stimmt mit der codierten Sequenz überein.
IGFBP-5-spezifische Moleküle schließen Polypeptide wie Antikörper, die spezifisch sind für IGFBP-5-Polypeptide, die die natürlich vorkommende IGFBP-5-Aminosäuresequenz enthalten, ein. Mit "spezifisch bindendes Polypeptid" sind Polypeptide gemeint, die sich mit IGFBP-5 und seinen Derivaten verbinden und welche eine messbar höhere Bindungsaffinität für das Ziel-Polypeptid, d.h. für IGFBP-5 und Polypeptidderivate von IGFBP-5 als für andere, hinsichtlich einer Bindung geprüfte Polypeptide haben. Eine höhere Affinität mit einem Faktor von 10 wird bevorzugt, mehr bevorzugt ist ein Faktor von 100. Die Bindungsaffinität für Antikörper bezieht sich auf ein einzelnes Bindungsereignis (d.h. einwertige Bindung an ein Antikörpermolekül). Spezifisches Binden durch Antikörper bedeutet auch, dass die Bindung an einer normalen Bindungsstelle des Antikörpermoleküls stattfindet (am Ende der Arme des variablen Bereichs).
Wie vorstehend besprochen, werden kleinere Aminosäureabweichungen von der natürlichen Aminosäuresequenz des IGFBP-5 als vom Begriff IGFBP-5 umfasst betrachtet; insbesondere ist an konservative Aminosäure-Austausche zu denken. Konservative Austausche sind diejenigen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren mit zueinander verwandten Seitenketten stattfinden. Genetisch codierte Aminosäuren werden im allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) saure = Aspartat, Glutamat; (2) basische = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolare = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polare = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal miteinander als aromatische Aminosäuren bezeichnet. Beispielsweise kann vernünftigerweise erwartet werden, dass ein isolierter Austausch eines Leucins gegen ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats gegen ein Glutamat, eines Threonins gegen ein Serin oder ein ähnlicher Austausch einer Aminosäure gegen eine strukturell verwandte Aminosäure keine größere Auswirkung auf die Bindungseigenschaften des erhaltenen Moleküls haben wird, insbesondere, wenn der Austausch keine Aminosäure an einer Bindungsstelle, die an der Wechselwirkung des IGFBP-5 oder seiner Derivate mit einem IGF-Molekül beteiligt ist, einbezieht. Ob aus einem Aminosäureaustausch ein funktionelles Peptid resultiert, kann leicht durch Prüfung der spezifischen Bindungseigenschaften des IGFBP-5-Polypeptidderivats bestimmt werden. Ein Bindungstest ist nachfolgend in Einzelheiten beschrieben.
IGFBP-5-spezifische Antikörper werden durch Immunisierung eines geeigneten Vertebratenwirts, z.B. Kaninchen, mit gereinigtem IGFBP-5 oder Polypeptidderivaten von IGFBP-5 für sich oder in Verbindung mit einem herkömmlichen Adjuvans hergestellt. Üblicherweise sind zwei oder mehr Immunisierungen einbezogen, und Blut oder Milz werden wenige Tage nach der letzten Injektion geerntet. Für polyclonale Antiseren können die Immunglobuline mit einer Vielzahl von Standard-Techniken, eingeschlossen Affinitätsreinigung unter Verwendung von IGFBP-5, das in einer Affinitätssäule an einer festen Oberfläche wie einem Gel oder Perlen gebunden ist, gefällt, isoliert und gereinigt werden. Für monoclonale Antikörper werden die Splenocyten normalerweise mit einem immortalisierten Lymphocyten, z.B. einer Myeloid-Zelllinie, unter für die Hybridomerzeugung selektiven Bedingungen fusioniert. Die Hybridome können dann unter begrenzenden Verdünnungsbedingungen cloniert werden und ihre Überstände auf Antikörper mit der gewünchten Spezifität getestet werden. Techniken zur Herstellung von Antikörpern sind aus der Literatur gut bekannt und sind in der Veröffentlichung Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Hrsg. Harlow und Lane, Cold Spring Harbor Laboratories Press, und in den U.S.-Patenten Nr. 4,381,292, 4,451,570 und 4,618,577 veranschaulicht.
IGFBP-5 kann leicht aus Blut und seinen Bestandteilen wie Serum und Plasma und aus genetisch zur Herstellung von IGFBP-5 oder deren Peptidderivaten modifizierten Zellen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines für IGFBP-5 spezifischen monoclonalen Antikörpers gereinigt werden. Außer durch Einsatz der Antikörperaffinitätschromatographie können IGFBP-5 und seine Polypeptidderivate durch eine Vielzahl anderer allgemein bekannter Proteinreinigungstechniken (entweder allein oder in Kombination) gereinigt werden, einschließlich Immunfällung, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, chromatographisches Fokussieren, isoelektrisches Fokussieren, selektives Fällen, Elektrophorese und ähnliche. Während der Reinigungsverfahren isolierte Fraktionen können auf Anwesenheit von IGFBP-5 oder von IGFBP-5-Polypeptidderivate durch IGFBP-5-spezifische Antikörper verwendende Immuntests oder IGFBP-5-spezifische Biotests analysiert werden. Detaillierte Beispiele sind nachfolgend angegeben.
Die Isolierung der IGFBP-5 codierenden Nucleotidsequenzen umfasst die Erzeugung einer genomischen Genbank, hergestellt aus IGFBP-5 codierenden Zellen, oder die Herstellung einer cDNA-Genbank aus RNA, isoliert aus IGFBP-5 exprimierenden Zellen. Im allgemeinen wird es vorzuziehen sein, eine cDNA-Genbank für die Isolierung von IGFBP-5 codierenden Nucleotidsequenzen herzustellen, um damit alle möglichen Schwierigkeiten zu vermeiden, die bei Versuchen zur Bestimmung der Intron/Exongrenzen entstehen. Genbanken können entweder in eukaryotischen oder prokaryontischen Wirtszellen hergestellt werden. Allgemein erhältliche Clonierungsvektoren wie Plasmide, Cosmide, Phagen, YACs und ähnliche können zur Erzeugung von Genbanken, die für die Isolierung von IGFBP-5 oder Teilen davon codierenden Sequenzen nützlich sind, verwendet werden.
Brauchbare Methoden zum Durchsuchen der Genbanken auf das Vorhandensein von IGFBP-5-Nucleotidsequenzen schließen die Herstellung von Oligonucleotidsonden ein, die auf der Information der N-terminalen Aminosäuresequenz aus gereinigtem IGFBP-5 oder gereinigten inneren Fragmenten von gereinigtem IGFBP-5 beruhen. Durch Anwendung des genetischen Standard-Triplettcodes können Oligonucleotidsequenzen von etwa 17 Basenpaaren oder länger mittels konventioneller in vitro-Syntheseverfahren so hergestellt werden, dass sie den Teilen von IGFBP-5 entsprechen, für die die Aminosäuresequenz durch Analyse des N-Terminus bestimmt worden war. Die sich ergebenden Nucleinsäuresequenzen können daraufhin mit Radionucliden, Enzymen, Biotin, fluoreszierenden Stoffen oder ähnlichen markiert und als Sonden zum Durchsuchen der Genbanken verwendet werden.
Zusätzliche Verfahren von Interesse für die Isolierung von IGFBP-5 codierenden Nucleinsäuresequenzen schließen das Durchsuchen der Genbanken hinsichtlich der Expression von IGFBP-5 oder dessen Fragmente mittels IGFBP-5-spezifischer, entweder polyclonaler oder monoclonaler Antikörper ein. Ein besonders bevorzugtes Verfahren umfasst die Verwendung degenerierter Primer, die auf Teilen der Aminosäuresequenz von gereinigtem IGFBP-5 oder auf Sequenzen bekannter verwandter Moleküle beruhen, und der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Gensegmenten zwischen den Primern. Das Gen kann dann unter Verwendung einer spezifischen Hybridisierungssonde isoliert werden, die auf dem amplifizierten Gensegment beruht, welches dann auf eine geeignete Proteinexpression analysiert wird. Eine ins Detail gehende Beschreibung dieser bevorzugten Verfahrensweise ist in den folgenden Beispielen dargelegt.
IGFBP-5 codierende Nucleotidsequenzen können aus rekombinanten DNA- Molekülen, die aus den IGFBP-5-Isolaten der Genbanken gewonnen wurden, erhalten werden. Die IGFBP-5 codierende Nucleotidsequenz kann durch Sequenzieren der nicht- Vektor- Nucleotidsequenzen dieser rekombinanten Moleküle erhalten werden. Die Nucleotidsequenzinformation kann durch Anwendung der allgemein benutzten DNA- Sequenzierungsprotokolle wie die Sequenzierung nach Maxim und Gilbert, Didesoxynucleotid-Sequenzierung und ähnliche erhalten werden. Beispiele für geeignete Nucleotid-Sequenzierungsprotokolle können in Berger und Kimmel, Methods in Enzymology Bd.52, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987) Academic Press, gefunden werden. Die Nucleotidsequenzinformation aus verschiedenen rekombinanten DNA-Isolaten, einschließlich Isolate von sowohl cDNA- als auch genomischen Genbänken, kann so kombiniert werden, dass sie die gesamte codierende Aminoäuresequenz von IGFBP-5 ebenso wie die Nucleotidsequenzen der Introns innerhalb der IGFBP-5-Gene, der stromaufwärts und der stromabwärts liegenden Nucleotidsequenzen liefert.
Die durch Sequenzierung der IGFBP-5-spezifischen Genbank-Isolate erhaltenen Nucleotidsequenzen werden einer Analyse unterzogen, um interessante Regionen in den IGFBP-5-Genen zu identifizieren. Diese interessanten Regionen schließen offene Leseraster, Introns, Promotorsequenzen, Terminationsequenzen und ähnliche ein. Die Analyse der Nucleotidsequenzinformation wird bevorzugt mittels Computer durchgeführt. Geeignete Software für die Analyse der Nucleotidsequenzen auf Bereiche von Interesse ist im Handel erhältlich und schließt zum Beispiel DNASISTM (LKB) ein. Ebenfalls von Interesse ist die Verwendung der Aminoäuresequenzinformation, die durch Sequenzieren des N-Terminus von gereinigtem IGFBP-5 erhalten wird, wenn die Nucleotidsequenzinformation von IGFBP-5 analysiert wird, so dass die Genauigkeit der Nucleotidsequenzanalyse verbessert wird.
Isolierte Nucleotidsequenzen, die IGFBP-5 codieren, können zur Herstellung von gereinigtem IGFBP-5 oder dessen Fragmenten entweder durch DNA-Rekombinationtechnik oder durch in vitro-Techniken der Polypeptidsynthese verwendet werden. Mit "gereinigt" oder "isoliert" ist bezogen auf ein Polypeptid oder eine Nucleotidsequenz gemeint, dass das betreffende Molekül bei beträchtlicher Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle des selben Typs vorliegt. Der Ausdruck "gereinigt" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, dass vorzugsweise mindestens 95 Gewichts-%, mehr bevorzugt mindestens 99 Gewichts-% und am meisten bevorzugt mindestens 99,8 Gewichts-% biologischer Makromoleküle des selben Typs vorhanden sind (wobei jedoch Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 anwesend sein können).
Ein bedeutsamer Vorteil der Herstellung von IGFBP-5 durch DNA- Rekombinationstechniken anstelle einer Isolierung von IGFBP-5 aus natürlichen Quellen liegt darin, dass äquivalente Mengen IGFBP-5 bei Verwendung von weniger Ausgangsmaterial hergestellt werden können, als sie für die Isolierung des Bindungsproteins aus einer natürlichen Quelle benötigt würden. Die Herstellung von IGFBP-5 mittels Rekombinationstechniken ermöglicht auch, IGFBP-5 in Abwesenheit einiger Moleküle zu isolieren, die normalerweise in Zellen vorhanden sind, die IGFBP-5 auf natürlichem Weg produzieren. Tatsächlich können IGFBP-5-Zusammensetzungen leicht hergestellt werden, die von jeder Spur von Verunreinigungen menschlicher Proteine frei sind, weil das einzige mit dem rekombinanten nicht menschlichen Wirt hergestellte menschliche Protein rekombinantes IGFBP ist. Mögliche virale Substanzen aus natürlichen Quellen werden ebenfalls vermieden. Offensichtlich können DNA-Rekombinationstechniken auch dazu verwendet werden, IGFBP- 5-Polypeptidderivate herzustellen, die in der Natur nicht gefunden werden, wie die vorstehend beschriebenen Variationen.
IGFBP-5 und Polypeptidderivate von IGFBP-5 können mit Rekombinationtechniken exprimiert werden, wenn eine das relevante Molekül codierende DNA-Sequenz in einen Vektor funktionsfähig eingefügt wurde. Mit "funktionsfähig eingefügt" ist in passendem Leseraster und passender Orientierung gemeint, so wie dies für den Durchschnittsfachmann gut verständlich ist. Wird ein genetisches Konstrukt hergestellt, das ein vollständiges IGFBP- 5-Leseraster enthält, so ist das bevorzugte Ausgangsmaterial ein Isolat aus einer cDNA- Genbank, das IGFBP-5 codiert, eher als ein Isolat aus einer genomischen Genbank. Typischerweise wird das IGFBP-5-Gen stromabwärts von einem Promotor eingefügt sein, gefolgt von einem Stopcodon, obwohl die Herstellung als Hybridprotein, gefolgt von einer Spaltung, falls gewünscht, verwendet werden kann. Im allgemeinen werden Wirtszellenspezifische Sequenzen, die die Ausbeute bei der Herstellung von IGFBP-5 und IGFBP-5- Polypeptidderivaten verbessern, verwendet, und dem Expressionsvektor werden passende Kontrollsequenzen wie Enhancersequenzen, Polyadenylierungssequenzen und Ribosomenbindungsstellen hinzugefügt.
Ist die passende codierende Sequenz einmal isoliert, kann sie in einer Vielzahl verschiedener Expressionssysteme exprimiert werden.

Säuger-Expressionssysteme

Ein Säuger-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Säuger-RNA- Polymerase befähigt ist und die die stromabwärts (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. strukturelles Gen) in mRNA einleitet. Ein Promotor wird eine die Transkription einleitende Region aufweisen, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz gelegen ist, und eine TATA-Box, die sich gewöhnlich 25-30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Region befindet, die die Transkription einleitet. Von der TATA-Box wird angenommen, dass sie die RNA-Polymerase 11 an die richtige Stelle zum Beginnen der RNA- Synthese lenkt. Ein Säuger-Promotor wird auch ein stromaufwärts-Promotorelement enthalten, das typischerweise innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box gelegen ist. Ein Promotorelement stromaufwärts bestimmt die Geschwindigkeit, mit der die Transkription eingeleitet wird, und kann in beiden Richtungen wirken [Sambrook et al., (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.].
Virusgene von Säugern sind oftmals hoch exprimiert und haben einen breiten Wirtsbereich; deshalb liefern Sequenzen, die Virusgene von Säugern codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen ein: den frühen SV40-Promotor, den Virus-LTR-Promotor vom Maus-Brustkrebs, den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad MLP) und den Promotor des Herpes-Simplex-Virus. Außerdem liefern von nicht-viralen Genen wie dem murinen Metallihionein-Gen abgeleitete Sequenzen ebenfalls brauchbare Promotorsequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, abhängig von einem Promotor, der mit Glucocorticoid in auf Hormon reagierenden Zellen induziert werden kann.
Die Anwesenheit eines mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen kombinierten Enhancerelements (Enhancer) wird typischerweise den Expressionsgrad erhöhen. Ein Enhancer ist eine Regulations-DNA-Sequenz, die, wenn sie an homologe oder heterologe Promotoren gebunden ist, die Transkription bis zum 1000-fachen stimulieren kann, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts der Initiierungsstelle der Transkription angeordnet sind, entweder in normaler oder umgekehrter Orientierung oder in einer Entfernung von mehr als 1000 Nucleotiden vom Promotor [Maniatis et al., (1987) Science 236: 1237; Alberts et al., (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Aufl.]. Von Viren abgeleitete Enhancerelemente können besonders nützlich sein, weil sie typischerweise einen breiten Wirtsbereich haben. Beispiele schließen ein: den frühen SV-40-Gen-Enhancer [Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4: 761] und die von den langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTR) des Rous-Sarcom- Virus [Gorman et al., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] und vom menschlichen Cytomegalievirus [Boshard et al 1985 Cell 41: 521] abgeleiteten Enhancer/Promotoren. Darüberhinaus sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Gegenwart eines Inducers wie einem Hormon oder Metallion aktiv [Sassone-Corsi und Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al., (1987) Science 236: 1237].
Ein DNA-Molekül kann in Säugerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an das DNA-Molekül gebunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-terminalen Ende des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann das N- terminale Ende vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Fragment einer Leadersequenz umfasst, das für die Sekretion des Fremdproteins in die Säugerzellen sorgt. Vorzugsweise gibt es zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, welches die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenkt. Der Adenovirus-Tripartitleader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die für eine Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen sorgt.
Typischerweise sind die von Säugerzellen erkannten Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen Regulationsbereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und somit zusammen mit den Promotorelementen die codierende Sequenz flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch ortsspezifische Spaltung nach der Transkription und Polyadenylierung gebildet [Birnstiel et al., (1985) Cell 41: 349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3'end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (Hrsg. B.D. Hames und D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele für Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssignale schließen die von SV40 abgeleiteten ein [Sambrook et al., (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Einige Gene können besser exprimiert werden, wenn Introns (auch intervenierende Sequenzen genannt) vorhanden sind. Verschiedene cDNAs sind jedoch von Vektoren mit fehlenden Spleißsignalen (auch Spleißdonor- und -akzeptorstellen genannt) wirksam exprimiert worden [vgl. zum Beispiel Gothing und Sambrook (1981) Nature 293: 620]. Introns sind intervenierende, nicht-codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleißdonor- und -akzeptorstellen enthalten. Sie werden entfernt durch ein "Spleißen" genanntes Verfahren, gefolgt von der Polyadenylierung des Primärtranskripts [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20: 671; Padgett et al., (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 1119; Krainer und Maniatis (1988) "RNA splicing". In Transcription and Splicing (Hrsg. B.D. Hames und D.M. Glover)].
Typischerweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Sequenz enthalten, die die Transkription beendet, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Enhancer, Introns mit funktionellen Spleißdonor- und -akzeptorstellen und Leadersequenzen können, falls gewünscht, im Expressionskonstrukt ebenfalls enthalten sein. Die Expressionskonstrukte werden oftmals in einem Replikon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide), das stabil in einem Wirt wie Säugerzellen oder Bakterien aufrechterhalten werden kann. Replikationssysteme von Säugern schließen die von tierischen Viren abgeleiteten ein, welche zur Replikation trans-wirkende Faktoren benötigen. Zum Beispiel replizieren Plasmide, die die Replikationssysteme der Papovaviren wie SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175] oder Polyomavirus enthalten, in Gegenwart des passenden Virus-T-Antigens zu einer extrem hohen Anzahl von Kopien. Weitere Beispiele für Replikationseinheiten von Säugern schließen die vom Rinder-Papillomvirus und vom Epstein-Barr-Virus abgeleiteten ein. Darüberhinaus kann das Replikon zwei Replikationsysteme aufweisen, die somit deren Aufrechterhaltung in Säugerzellen für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation erlauben. Beispiele für solche Säugerbakterien-Shuttle- Vektoren schließen ein: pMT2 [Kaufman et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] und pHEBO [Shimizu et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074].

Baculovirus-Expressionssysteme

Ein Baculovirus-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Baculovirus- RNA-Polymerase befähigt ist und die die Stromabwärts(3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. strukturelles Gen) in mRNA einleitet. Ein Promotor wird eine Transkriptionsinitiationsregion aufweisen, welche üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz gelegen ist. Diese Transkriptionsinitiationsregion umfasst typischerweise eine RNA- Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Ein Baculovirus- Promotor kann auch eine zweite Enhancer genannte Domäne enthalten, die, wenn sie vorhanden ist, üblicherweise distal zum strukturellen Gen ist. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Sequenzen, die Gene codieren, die spät im Infektionszyklus abundant transkribiert werden, liefern besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen die vom Polyhedrin- [Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); E.P.O.-Veröffentl. Nr. 127,839 und 155,476] und p10-Gen [Vlak et al., (1988) J. Gen. Virol. 69: 765] abgeleiteten Sequenzen ein.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an das DNA-Molekül gebunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N- terminalen Ende des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert ist. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-terminalen Ende vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Fusionsproteine liefern eine Alternative zur direkten Expression. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuren liefern. Zum Beispiel kann das N-terminale Ende des Polyhedringens mit dem 5'-Ende eines Fremdgens verknüpft sein und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder nicht. Vgl. z.B. Luckow et al., (1988) Bio/Technology 6: 47.
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment umfasst, welches für die Sekretion des Fremdproteins in Insekten sorgt. Das Leadersequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, welches die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenkt.
DNAs, die geeignete Signalsequenzen codieren, können von Genen für sekretierte Insekten- oder Baculovirusproteine wie das Baculovirus-Polyhedringen [Carbonell et al., (1988) Gene 73: 409] abgeleitet sein. Alternativ führen Leader, die nicht von Baculovirus- Ursprung sind, wie diejenigen, die abgeleitet sind von Genen, die menschliches alpha- Interferon [Maeda et al., (1985) Nature 315: 592], menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid [Lebacq-Verheyden et al., (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3129], menschliches IL-2 [Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8404], Maus-IL-3 [Miyajima et al., (1987) Gene 58: 273] und menschliche Glucocerebrosidase [Martin et al., (1988) DNA 7: 99] codieren, ebenfalls zur Sekretion in Insekten.
Typischerweise sind von Insekten erkannte Transkriptionsterminationssequenzen Regulationsbereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele schließen die vom Polyhedringen abgeleiteten Transkriptionsterminationssequenzen ein [Miller et al., (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177].
Vor der Insertion des Fremdgens in das Baculovirusgenom werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), eine codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptionsterminationssequenz enthalten, typischerweise in einem intermediären Transplacement-Konstrukt zusammengefügt. Intermediäre Transplacement-Konstrukte werden oftmals in einem Replikon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide), die zur stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt wie Bakterien befähigt ist. Das Replikon wird ein Replikationssystem aufweisen, das somit dessen Aufrechterhaltung in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation erlaubt. Die Promotor- und Transkriptionsterminationssequenz des Konstrukts wird typischerweise einen 2,5 kb-Abschnitt des Baculovirusgenoms zur Integration des Fremdgens in das Baculovirusgenom durch doppelte Crossover- Rekombinationsvorgänge umfassen, wobei ein Baculovirus-Expressionsvektor erzeugt wird [Miller et al., (1989) Bioessavs 4: 91]. Der Baculovirus-Expressionsvektor ist typischerweise in einem infektiösen rekombinanten Baculovirus verpackt.
Wenn man Baculovirus-Expressionvektoren verwendet, werden selektierbare Marker wie Antibiotika-Resistenzgene im allgemeinen nicht verwendet. Die Selektion erfolgt typischerweise durch visuelle Inspektion der Einschlusskörper. Beispiele für die Verwendung selektierbarer Marker werden an einer anderen Stelle dieser Beschreibung gegeben.
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren sind für die Infektion in verschiedene Insektenzellen entwickelt worden. Beispielsweise sind rekombinante Baculoviren entwickelt worden unter anderem für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Heliothis zea, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni [P.C.T. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; Wright (1986) Nature 321: 718; vgl. allgemein, Fraser et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225].
Verfahren zur Einführung exogener DNA in Insektenwirte sind dem Fachmann gut bekannt; sie schließen typischerweise entweder die Transfektion der Wirtsinsektenzellen mit DNA oder die Infektion von Insektenzellen oder von lebenden Insekten, üblicherweise Larven, mit einem Virus ein. Transfektionsverfahren beruhen auf dem Calciumphosphatverfahren, das ursprünglich für Säugerzellen entwickelt wurde [Graham et al.,(1973) Virology 52: 456]. DNA-Transfektions- und Virusinfektionsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Insektengattung. Vgl. z.B. Autographa [Carstens et al., (1980) Virology 101: 311], Heliothis (virescens) [P.C.T.-Veröffentl. Nr. WO 88/02030], Spodoptera [Kang (1988) "Baculovirus Vectors for Expression of Foreign Genes," in: Advances in Virus Research, Band 35].

Bakterielle Expressionssyteme

Ein bakterieller Promotor ist jede DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Bakterien- RNA-Polymerase befähigt ist und die die Stromabwärts(3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. strukturelles Gen) in mRNA einleitet. Ein Promotor wird eine Transkriptionsinitiationsregion aufweisen, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz gelegen ist. Diese Transkriptionsinitiationsegion umfasst typischerweise eine RNA- Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationstelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite, Operator genannte Domäne aufweisen, die mit einer angrenzenden RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, indem ein Gen- Repressorprotein den Operator binden kann und dadurch die Transkription eines spezifischen Gens verhindert. Eine konstitutive Expression kann in Abwesenheit von negativ regulatorischen Elementen wie dem Operator eintreten. Außerdem kann eine positive Regulation durch eine ein Gen-Aktivatorprotein bindende Sequenz erreicht werden, welche, wenn vorhanden, gewöhnlich proximal (5') zur RNA-Polymerase bindenden Sequenz liegt.
Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das Katabolit-Aktivatorprotein (CAP), welches hilft, die Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli.) [Raibaud et al., (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173] einzuleiten. Die regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein und dadurch die Transkription steigern oder vermindern.
Sequenzen, die Enzyme des Stoffwechselgens codieren, liefern besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen die von Zuckerstoffwechselenzymen wie Galactose, Lactose (lac) [Chang et al., (1977), Nature 198: 1056] und Maltose abgeleiteten Promotorsequenzen ein. Zusätzliche Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (ip) [Goeddel et al., (1980) Nucl. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al., (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; U.S.-Patent Nr. 4,738,921; E.P.O.- Veröffentl. Nr. 36,776 und 121,775] abgeleitet sind. Das γ-Lactamase-(bla)-Promotorsystem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)], und die Bacteriophage lambda PL-[Shimatake et 4:, (1981) Nature 292: 128] und T5-Promotorsysteme [U.S.-Patent Nr. 4,689,406], stellen ebenfalls brauchbare Promotorsequenzen zur Verfügung.
Außerdem fungieren auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können Transkriptions-aktivierende Sequenzen eines Bakterien- oder Bacteriophagenpromotors mit den Operonsequenzen eines anderen Bakterien- oder Bacteriophagenpromotors vereinigt werden, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird [U.S.-Patent 4,551,433]. Zum Beispiel ist der tac- Promotor ein Hybrid-trp-lac-Promotor, bestehend aus sowohl dem t-Promotor als auch lac- Operonsequenzen, der durch den lac-Repressor reguliert wird [Amann et al., (1983) Gene 25: 167; de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Desweiteren kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht bakterieller Herkunft umfassen, die die Fähigkeit besitzen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einzuleiten.
Ein natürlich vorkommender Promotor nicht bakterieller Herkunft kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt sein, um von einigen Genen in Prokaryonten einen hohen Grad der Expression zu erzeugen. Das Bacteriophage T7-RNA-PolymeraselPromotorsystem [Studier et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 8 : 1074] ist ein Beispiel für ein gekoppeltes Promotorsystem. Darüberhinaus kann ein Hybridpromotor auch aus einem Bakteriophagenpromotor und einer E.coli-Operatorregion zusammengesetzt sein (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 267,851).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist für die Expression eines Fremdgens in Prokaryonten auch eine wirksame Ribosomen-Bindungsstelle von Nutzen. In E.coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz genannt; sie schließt ein Startcodon (ATG) und eine Sequenz einer Länge von 3-9 Nucleotiden, die 3-11 Nucleotide stromaufwärts des Startcodons lokalisiert ist, ein [Shine et al., (1975) Nature 254 : 34]. Von der SD-Sequenz wird angenommen, dass sie die Bindung der mRNA an das Ribosom durch Basenpaarung zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E.coli 16S- rmA unterstützt [Steitz et al., (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R.F. Goldberger)]. Um eukaryontische Gene und prokaryontische Gene mit schwacher Ribosomen-Bindungsstelle zu exprimieren [Sambrook et al., (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an das DNA-Molekül gebunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N- terminalen Ende immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann Methionin vom N-terminalen Ende vom Protein durch in vitro- Inkubation mit Bromcyan oder durch in vivo- oder durch in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen N-terminalen Methionin-Peptidase abgespalten werden (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 219,237).
Fusionsproteine liefern eine Alternative zur direkten Expression. Typischerweise wird eine den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codierende DNA-Sequenz mit dem 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird das Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen liefern. Zum Beispiel kann das Bakteriophagen Lambda-Zeugen mit dem 5'-Ende eines Fremdgens gekoppelt sein und in Bakterien exprimiert werden. Das erhaltene Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Schnittstelle eines Prozessierungsenzyms (Faktor Xa) für eine Abspaltung des Bakteriophagenproteins vom Fremdgen [Nagai et al., (1984) Nature 309: 810]. Fusionsproteine können auch hergestellt werden mit Sequenzen von den lacZ- [Jia et al (1987) Gene 60: 197], trpE- [Allen et al., (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al., (1989) J. Gen. Microbiol. 135 11] und Chey- [E.P.O.-Veröffentl. Nr. 324,647] Genen. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin- Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitinregion hergestellt, die vorzugsweise eine Spaltstelle eines Prozessierungsenzyms (z.B. Ubiquitin-spezifische Prozessierungsprotease) zur Abspaltung des Ubiquitins vom Fremdprotein beibehält. Mit diesem Verfahren kann natives Fremdprotein isoliert werden [Miller et al., (1989) Bio/Technology 7: 698].
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Signalpeptidsequenzfragment zusammengesetzt ist, das für die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien sorgt (U.S.-Patent 4,336,336). Das Signalsequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle (Gram-negative Bakterien) sekretiert. Vorzugsweise gibt es zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen codierte Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen von sekretierten bakteriellen Proteinen wie dem Gen des äußeren Membranproteins von E.coli (ompA) [Masui et al., (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al., (1984) EMBO J. 3: 2437) und der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz von E.coli (vhoA) [Oka et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212] abgeleitet sein. Als zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylasegens aus verschiedenen Bacillusstämmen verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis [Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; E.P.O.-Veröffentl. Nr. 244,042] zu sekretieren.
Typischerweise sind die von Bakterien erkannten Transkriptionsterminationssequenzen Regulationsbereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Die Transkriptionsterminationssequenzen umfassen häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die zur Bildung von Stamm-Schleifen-Strukturen befähigt sind, die beim Transkriptionsabbruch hilfreich sind. Beispiele schließen Transkriptionsterminationssequenzen ein, die abgeleitet sind von Genen mit starken Promotoren wie das trp-Gen in E.coli ebenso wie andere biosynthetische Gene.
Typischerweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signalsequenz (falls erwünscht), eine codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptionsterminationssequenz enthalten, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Die Expressionskonstrukte werden oftmals in einem Replikon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide), die zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt wie Bakterien befähigt sind. Das Replikon wird ein Replikationssystem aufweisen, das somit dessen Aufrechterhaltung in einem prokaryontischen Wirt entweder für die Expression oder für die Clonierung und Amplifikation ermöglicht. Außerdem kann das Replikon ein Plasmid entweder mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl von etwa 5 bis etwa 200 aufweisen, typischerweise von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Es kann entweder ein Vektor hoher oder niedriger Kopienzahl gewählt werden, abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten typischerweise wenigstens eine zum Bakterienchromosom homologe Sequenz, die das Integrieren des Vektors erlaubt. Integrationen scheinen sich aus Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Bakterienchromosom zu ergeben. Zum Beispiel integrieren Integrationsvektoren, die aus DNA verschiedener Bacillus-Stämmen konstruiert sind, in das Bacillus-Chromosom (E.P.O.- Veröffentl. Nr. 127,328). Integrationsvektoren können auch aus Bakteriophagen- oder Transposonsequenzen zusammengesetzt sein.
Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion der transformierten Bakterienstämme zu ermöglichen. Selektierbare Marker können im bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene umfassen, welche die Bakterien gegenüber Arzneistoffen wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin resistent machen [Davies et al., (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene wie die der biosynthetischen Histidin-, Tryptophan- und Leucin- Stoffwechselwege einschließen.
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengefügt werden. Transformationsvektoren sind typischerweise zusammengesetzt aus einem selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten wird oder, wie vorstehend beschrieben, zu einem Integrationsvektor entwickelt wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder Integrationsvektoren, sind für die Transformation in viele Bakterien entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren unter anderem für folgende Bakterien entwickelt worden: Bacillus subtilis [Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; E.P.O.- Veröffentl. Nr. 36,259 und 63,953; P.C.T. Nr. WO 84/04541 J, Escherichia coli [Shimatake et al., (1981) Nature 292: 128; Amann et al., (1985) Gene 40: 183; Studier et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; E.P.O.-Veröffentl. Nr. 36,776, 136,829 und 136,907, U.K.-Patentanmeldung Serienummer 8418273], Streptococcus cremoris [Powell et al., (1988) Apnl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [U.S.-Patent Nr. 4,745,056].
Methoden zur Einführung exogener DNA in bakterielle Wirte sind in der Technik gut bekannt und schließen typischerweise die Transformation von Bakterien ein, die mit CaCl&sub2; oder andere Agenzien behandelt wurden, wie zweiwertige Kationen und DMSO. Die DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Transformationsverfahren variieren gewöhnlich mit der zu transformierenden Bakterienart. Vgl. z.B. [Masson et al., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al., (1982 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; E.P.O.-Veröffentl. Nr. 36,259 und 63,953; P.C.T. WO 84/04541, Bacillus]; [Miller et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 856; Wang et al., (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter]; [Cohen et al (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived Plasmids". In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H.W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al., (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia]; [Chassy et al., (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler et al., (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin et al., (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus]; [Barany et al., (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streutococcal Genetics (Hrsg. J. Ferreti und R. Curtiss III); Perry et al., (1981) Infec. Immun. 32: 1295; Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al., (1987) Proc. 4rh Evr. Cong. Biotechnologv 1: 412, Streptococcus].

Beschreibung: Hefe-Expressionssystem

Ein Hefe-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Hefe-RNA- Polymerase befähigt ist und die die Stromabwärts(3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. strukturelles Gen) in mRNA einleitet. Ein Promotor wird eine Transkriptioninitiierende Region aufweisen, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz gelegen ist. Diese die Transkriptionsinitiationsregion umfasst typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle ("die TATA Box") und eine die Transkriptionsinitiationsstelle. Ein Hefe-Promotor kann auch eine zweite, stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenz (UAS) genannte Domäne aufweisen, die, wenn sie vorhanden ist, gewöhnlich distal zum strukturellen Gen liegt. Die UAS ermöglich eine regulierte (induzierbare) Expression. Eine konstitutive Expression tritt in Abwesenheit einer UAS ein. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder vermindert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselweg; daher liefern Sequenzen, die Enzyme des Stoffwechselwegs codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen ein: Alkoholdehydrogenase (ADH) (E.P.O.- Veröffentl. Nr. 284044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (Pyk) (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 329203). Das saure Phosphatase codierende Hefe-PHO5-Gen liefert ebenfalls nützliche Promotorsequenzen (Myanohara et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1].
Darüberhinaus wirken auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als Hefepromotoren. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen eines Hefepromotors mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines anderen Hefepromotors zusammengefügt werden, wobei ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird. Beispiele für solche Hybridpromotoren schließen die mit der GAP-Transkripfions-Aktivierungsregion verbundene ADH-Regulatorsequenz ein (U.S.-Patente Nr. 4,876,197 und 4,880,734). Andere Beispiele von Hybridpromotoren schließen Promotoren ein, die aus den Regulatorsequenzen von entweder ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Genen bestehen, kombiniert mit dem transkriptionalen Aktivierungsbereich eines glycolytischen Enzymgens wie GAP oder PyK (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 164556). Desweiteren kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende Promotoren einschließen, die nicht von Hefe abstammen und die Fähigkeit aufweisen Hefe- RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einzuleiten. Beispiele für solche Promotoren schließen unter anderen ein: [Cohen et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al., (1981) Nature 283: 835; Hollenberg et al., (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg et al., (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccaromyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Enviromental and Commercial Importance (Hrsg. K.N. Timmis und A. Puhler); Mercerau- Puigalon et al., (1980) Gene 11: 163; Panthier et al., (1980) Curr. Genet. 2: 109; ].
Ein DNA-Molekül kann in Hefe intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an das DNA-Molekül gebunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-terminalen Ende des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-terminalen Ende vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Fusionsproteine liefern eine Alternative zur direkten Expression. Typischerweise wird eine den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codierende DNA-Sequenz mit dem 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion dieser beiden Aminosäuren liefern. Zum Beispiel kann das Hefe- oder das menschliche Superoxid-Dismutase (SOD)-Gen mit dem 5'- Ende eines Fremdgens gekoppelt werden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Vgl. z.B. E.P.O.-Veröffentl. Nr. 196056. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitinregion hergestellt, die vorzugsweise eine Spaltstelle eines Prozessierungsenzyms (z.B. Ubiquitinspezifische Prozessierungsprotease) zur Abspaltung des Ubiquitins vom Fremdprotein beibehält. Mit diesem Verfahren kann natives Fremdprotein isoliert werden (P.C.T. WO 88/024066; gleichzeitig im Besitz befindliche U.S.-Patentanmeldung, Seriennummer 359,599, eingereicht am 7. August 1989, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist). Dieses System wird gegenwärtig zur Herstellung von IGFPB-5 bevorzugt.
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Leadersequenzfragment zusammengesetzt ist, das für die Sekretion des Fremdproteins in der Hefe sorgt. Vorzugsweise gibt es zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann abgeleitet sein von Genen für sekretierte Hefeproteine, wie dem Hefe-Invertasegen (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 12876; J.P.O.- Veröffentl. Nr. 62,096,098) und dem A-Faktor-Gen (U.S.-Patent 4,588,684). Als Alternative existieren Leader, die nicht von der Hefe stammen, wie Interferon-Leader, die ebenfalls für eine Sekretion in Hefe sorgen (E.P.O.-Veröffentl. Nr. 60057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind diejenigen, die ein Genfragment des Hefe-alpha-Faktors einsetzen, welches sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch eine "pro"-Region enthält. Diese Typen von einsetzbaren alpha-Faktorfragmenten umfassen sowohl den prä-pro-alpha-Faktor-Leader in voller Länge (etwa 83 Aminosäurereste) als auch verkürzte alpha-Faktor-Leader (typischerweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (U.S.- Patente Nr. 4,546,083 und 4,870,008; E.P.O.-Veröffentl. Nr. 324274). Weitere Leader, die ein alpha-Faktor-Leaderfragment einsetzen, das für die Sekretion sorgt, schließen alpha-Faktor- Hybridleader ein, hergestellt mit einer prä-Sequenz einer ersten Hefe, jedoch mit einer pro- Region aus einem zweiten Hefe-alpha-Faktor (vgl. z.B. P.C.T. WO 89/02463).
Typischerweise sind von Hefe erkannte Transkriptionsterminationssequenzen Regulationsbereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele schließen Transkriptionsterminationssequenzen und andere von Hefe erkannte Terminationssequenzen ein, wie diejenigen, die glycolytische Enzyme codieren.
Typischerweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (falls erwünscht), eine codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptionsterminationssequenz enthalten, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Die Expressionskonstrukte werden oftmals in einem Replikon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide), die zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie Hefe oder Bakterien, befähigt sind. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme aufweisen, die somit dessen Aufrechterhaltung zum Beispiel in Hefe für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation ermöglichen. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren schließen ein: YEp24 [Botstein et al., (1979) Gene 8: 17-24], pCl/l [Brake et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646] und YRpl7 [Stinchcomb et al., (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Außerdem kann die Replikationseinheit ein Plasmid entweder mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl von etwa 5 bis etwa 200 aufweisen, typischerweise von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 haben. Es kann entweder ein Vektor hoher oder niedriger Kopienzahl gewählt werden, abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt. Vgl. z.B. Brake et al., a.a.0..
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Hefe-Genom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten typischerweise mindestens eine zum Hefechromosom homologe Sequenz, die das Integrieren des Vektors ermöglicht, und sie enthalten vorzugsweise zwei homologe, das Expressionskonstrukt flankierende Sequenzen. Integrationen scheinen sich durch Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefe-Chromosom zu ergeben [Orr-Weaver et al., (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245]. Ein Integrationsvektor kann auf einen spezifischen Ort in der Hefe ausgerichtet sein, indem eine passende homologe Sequenz für den Einschluss in dem Vektor ausgewählt wird. Vgl. Orr-Weaver, et al., a.a.0.. Eines oder mehrere Expressionskonstrukte können integriert werden, wodurch möglicherweise die Mengen des erzeugten Proteins beeinflusst werden [Rine et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die im Vektor eingeschlossenen chromosomalen Sequenzen können entweder als einzelnes Segment im Vektor auftreten, was zur Integration des ganzen Vektors führt, oder es können zwei Segmente vorliegen, die zu den anliegenden Segmenten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was zur stabilen Integration nur von dem Expressionskonstrukt führen kann.
Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von transformierten Hefestämmen zu ermöglichen. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene einschließen, die im Hefewirt exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, und das G418-Resistenzgen, die in Hefezellen Resistenz gegen Tunamycin beziehungsweise G418 übertragen. Darüberhinaus kann ein geeigneter selektierbarer Marker auch Hefe liefern, die die Fähigkeit hat, in Gegenwart von toxischen Verbindungen wie Metall zu wachsen. Zum Beispiel ermöglicht das Vorhandensein von CUP1, dass Hefe in Gegenwart von Kupferionen wächst [Butt et al., (1987) Microbiol. Rev. 51: 351].
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengefügt werden. Transformationsvektoren sind typischerweise aus einem selektierbaren Marker zusammengesetzt, der entweder in einem Replikon beibehalten oder zu einem Integrationsvektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder Integrationsvektoren, sind für die Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Beispielsweise sind Expressionsvektoren unter anderem für die folgenden Hefen entwickelt worden: Caudida albicans [Kurtz et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze et al.; (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al., (1986) J. Gen Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das et al., (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al., (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al., (1990) Bio/Technolouy 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; U.S.-Patent Nr. 4,837,148 und 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al., (1978) Proc. Natl. Acad: Sci. USA 75: 1929; Ito et al., (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706] und Yarrowia lipolytica [Davidow et al., (1985) Curr. Genet. 10: 380471; Gaillardin et al., (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren zur Einführung exogener DNA in Hefewirte sind dem Fachmann gut bekannt; sie schließen typischerweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt wurden, ein. Die Methoden für die Transformation variieren gewöhnlich je nach der zu transformierenden Hefeart. Vgl. z.B. [Kunz et al (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142, Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson et al., (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das et al., (1984) J. Bacteriol. 158 1165; De Louvencourt et al., (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al., (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; ; U.S.-Patent Nr. 4,837,148 und 4,929,555, Pichia]; [Hinnen et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al., (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706 Schizosaccharomyces]; [Davidow et al., (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin et al., (1985) Curr. Genet. 10: 49 Yarrowia].

Antigene verwendende diagnostische Verfahren

Die sowohl die Antigene der Erfindung als auch das genetische Material umfassenden Zusammensetzungen können bei diagnostischen Tests verwendet werden. Unter den biologisch nützlichen Informationen, die erhalten werden können, ist das außergewöhnlich hohe Ausmaß an Bindungsprotein infolge vorhandener Tumore, die zu einer gesteigerten Bildung von IGF oder eines der IGFBP-Bindungsproteine führen (zumal die Bindungsproteine in Gegenwart von überschüssigem IGF gebildet werden). Darüberhinaus können eine Anzahl bekannter Erkrankungen mit IGF-Konzentrationen in Verbindung gebracht werden. Zum Beispiel besteht ein Zusammenhang zwischen einigen Osteoporose- Typen und IGF-Konzentrationen. Darüberhinaus können die Bindungsproteine zur Identifizierung, Herstellung und Reinigung von durch Rekombination hergestellten IGFs verwendet werden. Verfahren zum Nachweis von IGFBP-5 umfassen das Analysieren einer biologischen Probe wie einer Blutprobe, cerobrospinaler Flüssigkeit oder Tumor- oder Knochengewebe.
Typischerweise beruhen Verfahren zum Nachweis eines Analyten wie Bindungsproteine der Erfindung auf Immuntests. Solche Verfahren sind gut bekannt und brauchen hier nicht in Einzelheiten beschrieben werden. Beispiele schließen sowohl heterogene als auch homogene Immuntestverfahren ein. Beide Verfahren beruhen auf der Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Bindungsprotein und einem entsprechenden spezifischen Antikörper. Heterogene Tests für IGFPB-5 verwenden typischerweise einen an eine feste Oberfläche gebundenen spezifischen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper. Sandwich-Tests werden zunehmend beliebter. Homogene Tests, die in Lösung ausgeführt werden, ohne dass eine feste Phase vorhanden ist, können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel durch Bestimmung der durch Bindung eines freien Antikörpers an ein Enzym- Antigen-Konjugat auftretenden Differenz in der Enzymaktivität. Eine Anzahl geeigneter Tests ist in den U.S.-Patenten Nr. 3,8I7,837, 4,006,360, 3,996,345 offenbart.
Das Reagens auf fester Oberfläche im vorstehenden Test wird mittels bekannter Verfahren für die Befestigung von Proteinmaterial an einem festen Trägermaterial wie Polymerperlen, Eintauchstäbchen oder Filtermaterial hergestellt. Diese Befestigungsmethoden schließen im allgemeinen eine unspezifische Adsorption des Proteins am Träger oder eine kovalente Bindung des Proteins typischerweise durch eine freie Aminogruppe an eine chemisch reaktionsfähige Gruppe am festen Träger, wie eine aktivierte Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aldehydgruppe ein.
Bei einer zweiten diagnostischen Ausführung, bekannt als homogener Test, erzeugt die Bindung des Antikörpers an den Analyten eine gewisse Veränderung im Reaktionsmedium, welche im Medium direkt nachgewiesen werden kann. Bekannte bisher vorgeschlagene Haupttypen homogener Tests schließen ein: (a) Spin-markierte Reporter, wobei die Antikörperbindung an das Antigen durch die Veränderung der aufgezeichneten Beweglichkeit (Verbreiterung des Spin aufspaltenden-Signals) nachgewiesen wird, (b) Fluoreszenz-Reporter, wobei die Bindung durch eine Veränderung des Fluoreszenzwirkungsgrads nachgewiesen wird, (c) Enzym-Reporter, bei denen die Antikörperbindung EnzymlSubstrat-Wechselwirkungen hervorruft und (d) Liposomen gebundene Reporter, wobei die Bindung zur Liposomenlyse und zur Freisetzung des verkapselten Reporters führt. Die Adaptierung dieser Verfahren an das Proteinantigen der vorliegenden Erfindung folgt den herkömmlichen Verfahren zur Herstellung homogener Test- Reagentien.

Genetische Sonden verwendende diagnostische Anwendungen

Das genetische Material der Erfindung kann selbst in zahlreichen Tests als Sonde für in natürlich vorkommenden Materialien vorhandenes genetisches Material verwendet werden. Der Analyt kann eine Nucleotidsequenz sein, die mit einer Sonde hybridisiert, die (üblicherweise) mindestens etwa 16 aufeinanderfolgende Nucleotide, üblicherweise 30 bis 200 Nucleotide, bis zu der im wesentlichen vollständigen Sequenz der vorstehend gezeigten Sequenzen (cDNA-Sequenzen) umfasst. Der Analyt kann RNA oder cDNA sein. Die Probe ist typischerweise so, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Ein positives Ergebnis ist im allgemeinen dadurch charakterisiert, dass ein genetisches Material identifiziert wird, das eine Sequenz umfasst, die mindestens zu etwa 70% homolog ist zu einer Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der hierin angegebenen Sequenzen, üblicherweise zu mindestens etwa 80% homolog ist zu mindestens etwa 60 aufeinanderfolgenden Nucleotiden innerhalb der Sequenzen, und es kann eine Sequenz umfassen, die im wesentlichen zu den Sequenzen voller Länge homolog ist. Um einen Analyten an der Stelle nachzuweisen, wo der Analyt mit der Sonde hybridisiert, kann die Sonde eine nachweisbare Markierung enthalten. Besonders nützliche Sonden für den Nachweis von Bindungsproteinen beruhen auf konservierten Regionen dieser Proteine, insbesondere aus den Aminosäuren PNCD und den Aminosäuren CWCV von BP5, wie in Fig. 1 in Klammern gezeigt ist. Diese Aminosäuren sind in allen verwandten IGF- Bindungsproteinen hoch konserviert. Nur IGFBP-1 weist einen Unterschied auf, ein N anstelle eines D an Position 191.
Ein Verfahren zur Amplifikation von Ziel-Nucleinsäuren zur späteren Analyse durch Hybridisierungstests ist als Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-Technik bekannt. Die PCR- Technik kann angewendet werden, um IGFBP-5 der Erfindung in verdächtigen Proben nachzuweisen, indem Oligonucleotidprimer verwendet werden, die voneinander räumlich getrennt sind und auf der hierin dargelegten genetischen Sequenz beruhen. Die Primer sind komplementär zu entgegengesetzten Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls und sind üblicherweise durch etwa 50 bis 450 nt oder mehr (üblicherweise nicht mehr als 2000 nt) getrennt. Dieses Verfahren ist mit der Herstellung der spezifischen Oligonucleotidprimer und dann sich wiederholenden Zyklen von Denaturieren der Ziel-DNA, Primerbindung und Extension mit einer DNA-Polymerase verbunden, um auf Grundlage des Primerabstands ein DNA-Fragment der erwarteten Länge zu erhalten. Die von einem Primer erzeugten Extensionprodukte dienen als weitere Zielsequenzen für den anderen Primer. Der Grad der Amplifikation einer Zielsequenz wird durch die Anzahl der durchgeführten Zyklen kontrolliert und wird theoretisch mit der einfachen Formel 2n berechnet, wobei n die Anzahl der Zyklen ist. Angenommen der durchschnittliche Wirkungsgrad pro Zyklus reicht von etwa 65% bis 85%, so produzieren 25 Zyklen 0,3 bis 4,8 Millionen Kopien der Zielsequenz. Das PCR-Verfahren ist in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, eingeschlossen Saiki et al., Science (1985) 230: 1350-1354; Saiki et al., Nature (1986) 324: 163-166 und Scharf et al., Science (1986) 233: 1076-1078. Vgl. auch U.S.-Patent Nr. 4,683,194; 4,683,195 und 4,683,202.
Die Erfindung umfasst ein spezifisches diagnostisches Verfahren zur Bestimmung von IGFBP-5, das auf der selektiven Amplifikation von IGFBP-5 codierenden DNA-Fragmenten beruht. Dieses Verfahren verwendet ein Paar einzelsträngiger Primer, die von nicht homologen Bereichen entgegengesetzter Stränge eines DNA-Duplexfragmentes abgeleitet sind, das aus den in Abb. 1 dargelegten Sequenzen ausgewählt ist. Diese "Primerfragmente", welche einen Aspekt der Erfindung bilden, werden aus IGFBP-5- Fragmenten wie den vorstehend beschriebenen hergestellt. Das Verfahren folgt dem Verfahren für die Amplifikation ausgewählter Nucleinsäuresequenzen, wie es im U.S.-Patent Nr. 4,683,202 offenbart ist, wie vorstehend erörtert.

Monoclonale Antikörper

Sowohl für die in vivo Verwendung von IGFBP-5-Antikörpern und anti-Idiotyp- Antikörpern als auch für den diagnostischen Gebrauch, kann eine Verwendung von monoclonalen Antikörpern zu bevorzugen sein. Monoclonale anti-Viruspartikel-Antikörper oder anti-Idiotyp-Antikörper können folgendermaßen hergestellt werden: Die Milz oder oder Lymphocyten eines immunisierten Tieres werden entfernt und immortalisiert oder zur Herstellung von Hybridomen mittels dem Fachmann bekannter Verfahren verwendet. Um ein Mensch-Mensch-Hybridom herzustellen, wird ein menschlicher Lymphocytendonor ausgewählt. Um für die Herstellung von Mensch-Mensch-Hybridomen menschliche Lymphocyten oder einen menschlichen Fusionspartner zu immortalisieren, kann das Epstein- Barr-Virus (EBV) verwendet werden. Eine primäre in vitro-Immunisierung mit Peptiden kann zur Erzeugung menschlicher monoclonaler Antikörper ebenfalls verwendet werden. Von immortalisierten Zellen sekretierte Antikörper werden durchmustert, um die Clone zu bestimmen, die Antikörper der gewünschten Spezifität sekretieren.

Test für biologische Eigenschaften von IGFBP-5

Die Eigenschaft, sich an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor zu binden, ist eine der biologischen Aktivitäten der Proteine der Erfindung. Diese Proteine können zweckmäßig in einem IGF-I [Rinderknecht, E. und Humbel, R.E., J. Biol. Chem. (1978) 253 2769] oder IGF-II [Rinderknecht, E. und Humbel, R.E., FEBS (1978) 89: 283], vorzugsweise IGF-II in einer markierten, z.B. iodierten Form, verwendenden Bindungstest überprüft werden. Zum Beispiel kann ein derartiger Test zweckmäßigerweise die Ausführung einer Gelelektrophorese (SDS-PAGE) der Proteine der Erfindung einschließen, gefolgt von einem Western-Blot des Gels, dann Inkubation des Blots in Gegenwart von (¹²&sup5;I)-IGF-I oder -II, Waschen des Blots, um freies IGF-I oder -II zu entfernen und Nachweis der Radioaktivität auf dem Blot.

Quellen für IGFBP-5

Während mit IGFBPs der Erfindung ursprünglich menschliche IGFBPs gemeint waren, sind IGFBPs von Säugern, z.B. Nagern, Schweinen, Pferden oder Rindern, innerhalb der Definition der IGFBPs eingeschlossen, solange sie dem notwendigen Grad der Homologie entsprechen.
Die IGFBPs der Erfindung schließen die aus Gewebeextrakten oder aus einem konditionierten Kulturmedium isolierten ebenso wie die mittels Rekombinationsverfahren erhaltenen ein.

Verwendunzen von IGFBP-5

Therapeutische Anwendungen der Bindungsproteine der Erfindung schließen eine Verwendung als einzelnes therapeutisches Mittel und eine Verwendung in Kombination mit einem IGF ein, wobei letztere bevorzugt ist.
Bei einer Verwendung in Kombination mit einem IGF, ist ein Bindungsprotein der Erfindung für eine Verwendung bei den vorstehend erwähnten Indikationen geeignet, in erster Linie als wachstumsinduzierendes, geweberegenerierendes und wundheilendes Mittel.

Dementsprechend wird durch die Erfindung bereitgestellt:

(i) Verwendung eines Bindungsproteins der Erfindung zusammen mit einem IGF in freier oder festgelegter Kombination zur Wachstumsstimulierung eines Individuums zur Gewebe- oder Organ-Regenerierung oder Wundheilung oder
(ii) ein Verfahren zur Wachstumsstimulierung eines Individuums, zur Gewebe oder Organ-Regenerierung oder Wundheilung in einem Individuum, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Bindungsproteins der Erfindung zusammen mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines IGFs an einen Patienten umfasst, der eine solche Behandlung benötigt.
(iii) ein Arzneimittel zur Stimulierung des Wachstums eines Individuums, zur Gewebe- oder Organ-Regenerierung oder Wundheilung, welches ein Bindungsprotein der Erfindung zusammen mit einem IGF und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält, oder
(iv) eine Abpackung, die getrennte bis hin zu Dosierungsformen eines Bindungsproteins der Erfindung und eines IGFs zusammen mit Anweisungen zum Vermischen oder zur gleichzeitigen Verabreichung enthält.
In Verbindung mit einem IGF ist ein Bindungsprotein der Erfindung zur Bewirkung der Chondrogenese oder von Hämopoesen von besonderem Interesse. Dies kann in den folgenden Versuchen A bis C gezeigt werden.
A) Ein IGF steigert die Knochenbildung, wie sich dies z.B. an einem zunehmenden Einbau von [3H]-Prolin in Collagen- und nicht-Collagen-Proteine in fötaler Ratten- Calvaria zeigt. Es tritt ein synergistischer Effekt ein, wenn ein IGF in Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung verwendet wird. Organkulturen von Ratten- Calvaria werden durch Zerlegen frontaler und parietaler Knochen von 21 Tage alten Ratten, Spalten entlang der sagittalen Sutur und Kultivieren gemäß der Methode von Kream et al., (Endocrinology (1985) 116: 296) hergestellt. Ein Bindungsprotein oder IGF wird in Dosen von 10 bis 200 ng/ml den Kulturen zugesetzt. Wenn sie zur Kombination miteinander zugesetzt sind, beträgt das molare Verhältnis 1 : 1. Das Züchten erfolgt in 24 bis 48 Stunden. Um die Einbau des [3H]-Prolins in das Collagenase-verdaubare Protein und nicht-Collagen-Protein zu quantifizieren, werden Knochenhomogenate mit Bakterien-Collagenase gemäß der Methode von Diegelman R. und Peterkofsky (Dev. Biol. (1972) 28: 443), modifiziert von Kream et al., (Endicrinology (1985) 116: 296), verdaut.
B) Ein IGF vermindert die Knochenresorption, wie sich dies in der Abnahme der Freisetzung von [45]Ca aus den Knochen zeigt. Es tritt ein synergistischer Effekt ein, wenn ein IGF in Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung verwendet wird. Der Test wird gemäß den Prinzipien von Raisz (J. Clin. Invest. (1965) 44: 103) durchgeführt. Trächtigen Ratten wird am 18. Tag der Trächtigkeit [45]Ca injiziert. Ein IGF allein oder in Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung wird in einer Dosis von 10 ng bis 200 ng pro Tier injiziert. Das Bindungsprotein wird so zugesetzt, dass das molare Verhältnis des IGF 1 : 1 beträgt. Am Tag 19 werden die Tiere geopfert und die Föten entfernt. Die mineralisierten Schäfte der Radü und Ulnae werden zerlegt und in Kultur überführt. Die Resorption wird auf der Grundlage der Freisetzung des [45]Ca aus dem Knochenexplantat quantifiziert.
C) Sowohl die IGF-Bindungsproteine der Erfindung als auch andere IGF- Bindungsproteine verstärken die Erythropoetin-ähnliche Wirkung von IGF-I. Dies kann insbesondere durch Testen von IGF-I, z.B. 10 ng/ml IGF-I, allein und in Kombination mit dem reifen IGF-Bindungsprotein von Abb. 1, z.B. einem 50 ul-Aliquot eines Überstandes, erhalten von einer Kultur einer CHO-Zelllinie, die das reife IGF-Bindungsprotein von Abb. 1 exprimiert, in einem CFV-E-Test, wie in Fagg, B. Roitsch, C.A. Cell, Physiol. (1986) 126: 1 beschrieben, gezeigt werden. Während das mit dem IGF-Bindungsprotein allein erhaltene Ergebnis von dem der Kontrolle nicht signifikant verschieden ist, sieht man beim Vergleich mit IGF-I allein bei der Kombination einen synergistischen Effekt.
Weiterhin kann die mitogene Wirkung eines mit einem Bindungsprotein der Erfindung kombinierten IGF folgendermaßen getestet werden: Es wird der Einbau eines [³H]- Methylthymidins in CCL 39-Zellen (Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters) in Kultur gemessen, wie von Plouet et al., Cell. Biol. (1984) 30: 105 beschrieben. Bei diesem Test wird die Zelllinie CCI 39 in eine Platte mit 40 000 Zellen pro Vertiefung in 0,5 ml MEM-Kulturmedium (Gibco), das 10% fötales Kälberserum, 0,1% Penicillin, 0,4% Streptomycin und 0,5% Fungizone enthält, ausgesät. Nach 72 Stunden Inkubation bei 37ºC in einer mit 5% CO&sub2; beladenen Atmosphäre werden die Zellen in Abwesenheit von fötalem Kälberserum mit MEM-Medium gewaschen und dann in diesem Medium 20 Stunden gezüchtet. In diesem Stadium ist die Zellkultur konfluent, und ein IGF oder ein Bindungsprotein oder beide werden jeweils mit einer Dosierung von 10 ng auf 200 ng Kulturmedium angeimpft. Wenn zusammen zugegeben, muss das molare Verhältnis 1 : 1 sein. Die Testprobe wird 24 h bei 37ºC inkubiert und dann mit luCi [³H]Methylthymidin in 10 gl PPS versetzt. Nach 4 Stunden Inkubation wird das Einbringen des Methylthymidins durch Waschen der Zellen mit PBS beendet. Die Zellen werden 30 Minuten mit 0,5 ml Trichloressigsäure (5%) fixiert, mit Wasser gewaschen und abschließend mit 0,5 ml 0,1 M NaOH 2 Stunden bei 37ºC lysiert. 0,5 ml des Lysates werden in einen Scintillationskolben überführt und zur Messung der β-Radioaktivität mit 3 ml Scintillationsflüssigkeit vermischt. Das Bindungsprotein verstärkt die mitogene Wirkung des IGFs, obwohl sich der gemessene Grad der Radioaktivität bei alleiniger Verwendung eines Bindungsproteins nicht wesentlich von der der Kontrollprobe unterscheidet.
Insbesondere ist ein Bindungsprotein der Erfindung in Kombination mit einem IGF nützlich a) zur Behandlung der Hypophysenvorderlappen-Insuffizienz, des Laron-Typ- Zwergwuchs, von Osteoporose, von Anämien, insbesondere Komplikationen als Folge von chronischem Nierenversagen und Leber- oder Nierenschädigungen und b) zur Förderung der Wundheilung bei Geschwüren und Verbrennungen oder denjenigen, die bei Unfällen eintreten oder sich bei Operationen ergeben.
Für eine Verwendung in Verbindung mit einem Bindungsprotein der Erfindung wird IGF vorzugsweise ausgewählt aus IGF-I, wie beschrieben in Rinderknecht, E. und Humbel, R.E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769; IGF-II wie beschrieben in Rinderknecht, E. und Humbel, R.E., FEBS (1978) 89: 283 und jedes Derivat oder Fragment von IGF-I und IGF-II mit der Wirkung eines insulinähnlichen Wachstumsfaktors. Am meisten bevorzugt ist IGF-II.
Für eine Verwendung in Verbindung mit einem IGF ist das Bindungsprotein der Erfindung vorzugsweise ein Protein, das 85% bis 100% homolog mit prä-IGF-BP oder IGF- BP ist, wie in Abb. 1 gezeigt ist.
Nicht in Verbindung mit IGFs finden die Bindungsproteine der Erfindung weitere therapeutische Verwendungen bei jeder physiologischen Erkrankung, die aus einer übermäßigen Erzeugung von freien IGFs, z.B. IGF-erzeugende Krebsarten wie Brust- oder Nierenkrebs, fortschreitende diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum großer Kinder mit einem hohen Serumspiegel an freiem IGF, herrühren.
Dementsprechend wird durch die Erfindung auch bereitgestellt:
(i) Die Verwendung eines Bindungsprotein der Erfindung zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die von einer übermäßigen Erzeugung von freiem IGF bei Säugern zum Beispiel im menschlichen Körper, z.B. IGFerzeugende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, herrühren, oder
(ii) ein Verfahren zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die von einer übermäßigen Erzeugung von freiem IGF herrühren, z.B. IGF-erzeugende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Bindungsproteins der Erfindung an ein Individuum umfasst, das eine solche Behandlung benötigt, oder
(iii) ein Arzneimittel zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die von einer übermäßigen Erzeugung von freiem IGF herrühren, z.B. IGF-erzeugende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, welches ein Bindungsprotein der Erfindung in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, oder
(iv) ein Verfahren der Zuführung von IGFs zu speziellen Organen oder Geweben, das auf den unterschiedlichen Bindungseigenschaften des IGFBP-5 beruht, wie es sich bei biologischen Tests zeigt.
Fragmente von mutierten Formen des prä-IGF-BP oder IGF-BP, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, sind von besonderem Wert für die Behandlung physiologischer Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Erzeugung von freiem IGF im menschlichen Körper herrühren.
Ein Bindungsprotein der Erfindung allein oder in Kombination mit einem IGF kann auf jedem für Peptide geeigneten herkömmlichen Weg verabreicht werden, insbesondere enteral z.B. in Form von Tabletten oder Kapseln oder vorzugsweise parenteral z.B. subkutan oder intravenös in Form von Injektionen oder Infusionen. Desweiteren kann es auch topisch z.B. in Form von Salben oder Suspensionen angewendet werden, wenn es z.B. als Wundheilungsmittel verwendet wird.
Für alle vorstehend genannten Indikationen wird die passende Dosierung selbstverständlich schwanken, z.B. mit der Natur und der Schwere der zu behandelnden Erkrankung und der Art und Weise der Verabreichung. Zum Beispiel können zufriedenstellende Ergebnisse bei der Behandlung der Osteoporose oder Anämie mit täglichen Dosierungen von etwa 0,1 ug/kg Körpergewicht bis 40 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,5 ug/kg Körpergewicht bis etwa 20 ug/kg Körpergewicht eines Bindungsproteins der Erfindung erhalten werden. Bei größeren Säugern, zum Beispiel Menschen, ist als tägliche Dosierung eine Dosis von etwa 5 ug angezeigt, die praktischerweise parenteral zum Beispiel einmal am Tag verabreicht wird. Für die Wundheilung wird eine tägliche Dosis von 0,1 ug bis 10 ug des Proteins der Erfindung pro cm² Wundfläche bei größeren Säugern, zum Beispiel Menschen, als geeignet angesehen. Diese wird vorteihaft einmal am Tag verabreicht. Bei einer Verwendung in Kombination mit einem IGF ist das molare Verhältnis von Bindungsprotein zu IGF vorzugsweise von 0,1 : 1 bis 5 : 1, mehr bevorzugt von 0,5 : 1 bis 2 : 1 und am meisten bevorzugt 1 : 1.
Die Arzneimittel der Erfindung können in herkömmlicher Weise hergestellt werden.
Andere Verwendungen der Bindungsproteine der Erfindung schließen verschiedene Anwendungen bei der Herstellung von IGF-Molekülen durch Rekombinatioristechniken ein. Die Bindungsproteine der Erfindung können zum Nachweis von Hefe-produziertem IGF in nativer (aktiver) Konformation (im Gegensatz zu inaktivierten Formen) verwendet werden. Darüberhinaus können die Proteine der Erfindung als Träger (möglicherweise in Form von co-exprimierten Proteinen) bei der Herstellung von IGF verwendet werden. Da das Bindungsprotein IGF in vivo stabilisiert, wird von ihm erwartet, dass es das selbe in vitro tut. Die Bindungsproteine können auch zur Reinigung von in Hefe erzeugtem IGF verwendet werden, indem sie an einer festen Oberfläche befestigt werden (so wie bei der Affinitäts- Chromatographie).
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf besondere Ausführungsformen, Verfahren, Strukturen und Verwendungen beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne dass von der Erfindung abgewichen wird.

Beispiel 1

Sepharose-IGF I-Affinitätssäule

60 mg rekombinanter menschlicher IGF-I (Ciba-Geigy AG, Basel, Schweiz) wurden in 20 ml 0,5 M NaCl enthaltendes 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,3 gelöst und entsprechend dem Lieferantenprotokoll (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) an CNBr-aktivierte Sepharose 48 (4 g trockenes Gel) gekoppelt. Das Gel wurde mit 500 ml 0,05 M Natriumphosphatpuffer/0,5 M NaCl, pH 6,5 in einer 1,5 · 15 cm-Glassäule äquilibriert (Gelbettvolumen 15 ml).

Reinigung der Serum-IGFBPs

Dieses Verfahren wurde durchgeführt gemäß einer Modifikation des Verfahrens von Martin und Baxter (18, 19). Man beachte, dass sich die Dokumente, die in den Beispielen in Klammern gezeigt sind, auf die Dokumente beziehen, die im Abschnitt Relevante Literatur dieser Beschreibung mit Nummern aufgelistet sind. Ein Liter gealtertes menschliches Citrat- Plasma wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 50 U (1 ml) Thrombin-Calcium gerührt, durch ein Presstuch gefiltert und angesäuert. Dissoziierter IGF wurde mit SF-Sephadex C-25 entfernt. Der pH-Wert wurde anschließend auf 6,5 eingestellt und das Präzipitat durch eine Zentrifugation von 30 Minuten bei 20000 UpM entfernt. Der Überstand wurde durch die vorstehend beschriebene Sepharose-IGF I-Affinitätssäule mit 34 ml/min gepumpt und die Säule mit 500 ml 0,05 M Natriumphosphatpuffer/0,5 M NaCl, pH 6,5 gewaschen. Das Bindungsprotein (d.h. IGFBP) wurde mit 40 ml 0,5 M Essigsäure eluiert, 3 mal gegen zwei Liter 0,1 M Ammoniumacetat dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Material (40 mg) wurde in 4 ml 0,1 M Heptafluorbuttersäure gelöst, die 20% (Vol./Vol.) Acetonitril enthielt, und das unlösliche Material wurde durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 10000 UpM entfernt. Der klare Überstand wurde einer HPLC (zwei Durchläufe mit je 2 ml) auf einer Nucleosil C¹&sup8;-Säule (Macherey-Nagel, D ren, BRD) (19) unterworfen. Die durchgelaufenen Fraktionen wurden in einer Speed-Vac (Savant Instruments, Hicksville, NY) getrocknet, in 1 ml 0,01 M Essigsäure aufgenommen und nochmals getrocknet. Das resultierende Material wurde für die Liganden-Blotanalyse (vgl. nachstehend) und Silber-Anfärbung (20) in 250 ul H&sub2;O gelöst.

¹²&sup5;I-IGF-Liganden-Blotanalvse

Es wurde das Verfahren von Hossenlopp et al. (21) mit geringfügigen Modifikationen (6, 19) verwendet. Fünf ul-Aliquots der durchgelaufenen Fraktionen der HPLC wurden einer Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamidplattengelen unter nichtreduzierenden Bedingungen unterworfen. Der ¹&sup4;C-markierte Molekulargewichtsmarker (Rainbow Marker, Amersham, UK) war reduziert. Die Gele wurden einem Blotverfahren mit Nitrocellulosemembranen unterworfen und, wie beschrieben (21), weiterverarbeitet. Die Membranen wurden 6 h bei Raumtemperatur in einer verschweißten Plastiktüte mit 3 · 10&sup6; CpM ¹²&sup5;I-markiertem IGF II (22) inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurden die luftgetrockneten Membranen 12-48 h bei -70ºC gegen einen Röntgenfilm (Kodak, X-OMAT, AR) in einer Kodak X-OMATIC-Kassette (Eastman, Rochester, NY) exponiert.
¹²&sup5;I-IGF 11 wurde als Markierungssubstanz für die Durchmusterung gewählt, weil mit ¹²&sup5;I-LGF I nicht alle Banden nachgewiesen wurden (vgl. Ergebnisse).

Elektro-Blotverfahren auf Pol vinylidendifluorid (Immobilion)-Membran

10 bis 30 ug des HPLC-gereinigeten IGFBP wurden, wie vorstehend beschrieben, einer Elektrophorese (Polyacrylamidplattengele 15 · 15 · 0,15 cm) unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und, wie vorstehend von Matsudaira (23) beschrieben, auf eine Immobilon- Membran (Millipore Corp., Bedford, MA) elektrogeblottet (2 h bei 0,8 A). Die Membran wurde 5 sec mit 0,1% Coomassie Blue R-250 in 50% Methanol gefärbt, in 50% Methanob/10% Essigsäure 5 min bei Raumtemperatur entfärbt und gründlich mit H&sub2;O gespült. Die Membran wurde luftgetrocknet, und die Proteinbanden wurden ausgeschnitten und bei 20ºC aufbewahrt.
Die Aminosäureanalyse wurde mittels des automatisierten Edman-Abbaus unter Verwendung des Proteinsequenziergeräts Modell 470A von Applied Biosystems (Poster City, CA) durchgeführt (25).

Gewebe- und RNA-Isolierung

Menschliches Osteosarcom-Gewebe wurde von Dr. Marshall Urist, UCLA erhalten. Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des Guadiniumthiocyanat-Verfahrens (27) isoliert. Ein Osterisator wurde verwendet, um das Gewebe zu homogenisieren. Poly(A)&spplus;-RNA wurde durch eine einzelne Fraktionierung über Oligo(dT)-Cellulose (29) gereinigt.

Oligonucleotidsynthese

Oligonucleotidadaptoren, -sonden, und Sequenz- und PCR-Primer wurden nach dem Phosphoramiditverfahren mit einem Synthesegerät Modell 380A von Applied Biosystems (Foster City, CA) synthetisiert, mittels Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt und auf SEP-PAK C&sub1;&sub8;-Patronen (Waters; Milford, MA) entsalzt.
Ein 14-mer Oligonucleotid (5' CCTGTAGATCTCCG 3') und ein 18-mer Oligonucleotid (5' AATTCGGAGATCTACAGG 3') wurden synthetisiert und als EcoRI- Adaptoren für eine menschliche Osteocarcinom-cDNA-Genbank, konstruiert in XZAP, verwendet. Das 14-mer wurde phosphoryliert (30), dann unmittelbar für 15 min auf 95ºC erhitzt, um die Polynucleotidkinase zu inaktivieren. Der Adaptor enthält auch eine interne BglII-Schnittstelle und wird im folgenden Abschnitt, in dem die Konstruktion der cDNA- Genbank beschrieben wird, vollständiger beschrieben.
Die zwei PCR-Primer für BP5 waren: (1) Ein "Sense"-Primer, bestehend aus einem Gemisch von 48 26-meren [5' AGATCTGAATTCGA(CIT)GA(A/G)GCXAT(AIT/C)CA 3'] und (2) einem "Antisense"-Primer, bestehend aus einem Gemisch von 64 26-meren [5' AGATCTGAATTCGC(T/C)A(G/A)(T/C)TTXGC(T/C)TC 3'], wobei X alle vier Desoxynucleotide bezeichnet. EcoRI-Schnittstellen sind in den Primern eingeschlossen, um ein Subclonieren in den M13-Sequenzierungsvektor zu ermöglichen. Die BP5-Sonde besteht aus einem 20-mer-(5' TCGGAGCAGGGCGGGCAGTG 3') und einem 7-mer-Primer (5' CACTGCC 3').

PCR-Amplifikation der BP5-Sequenzen

Die PCR-Reaktionen wurden entsprechend dem Lieferanten des PCR-Kits (Perkin/Elmer/Cetus) unter Verwendung der beschriebenen PCR-Primer (vgl. Abschnitt Oligonucleotidsynthese) bei einer Endkonzentration von 8 uM ausgeführt. Die MatrizencDNA wurde synthetisiert aus 2,5 ug menschlicher Osteosarcom (Ost2)-poly(A)&spplus;-RNA. Die Bedingungen der cDNA-Synthese waren die gleichen wie diejenigen, die nachfolgend für die Synthese des ersten Stranges der cDNA beschrieben sind (vgl. Konstruktion der cDNA- Genbank). Die cDNA wurde auf Biogel A-15 m fraktioniert, durch Ethanolfällung wiedergewonnen und in 100 ul sterilem Wasser resuspendiert. 2,5 bis 5 ul cDNA-Matrize wurden für jede PCR-Reaktion verwendet. 35 Zyklen der PCR wurden in einem Perkin/Elmer/Cetus-DNA-Thermal-Cycler ausgeführt. Die ersten 10 Zyklen bestanden aus einem Denaturierungsschritt von 1 min. 94ºC; einem Annelierungsschritt von 1 min. 40ºC und einem Extensionsschritt von 1 min. 40ºC. Die nächsten 25 Zyklen bestanden aus einem Denaturierungsschritt von 1 min., 94ºC; einem Annelierungsschritt von 1 min. 55ºC und einem Extensionsschritt von 1 min. 72ºC. Der abschließende Extensionsschritt beim letzten Zyklus betrug 7 min. Die Proben wurden einmal mit Phenol/Chloroform/IAA (1 : 1 : 0,04), einmal mit Chloroform/IAA (24 : 1) extrahiert, durch Ethanolfällung gewonnen, mit EcoRI verdaut und mittels Elektrophorese auf einem 7% Acrylamid/1xTBE-Gel (30) fraktioniert. Die zwischen 40 und 70 Bp wandernde DNA wurde aus dem Gel ausgeschnitten, mittels eines Elutip-d-Säulen-Durchlaufs gereinigt, an EcoRI-geschnittenen M13mp18 ligiert und für eine DNA-Sequenzierung in DHSaF' eingeführt.

Konstruktion der cDNA-Genbank

Der erste cDNA-Strang wurde aus menschlicher Osteosarcom (Ost2)-poly(A)&spplus;-RNA synthetisiert, wie beschrieben (33), jedoch mit den folgenden Modifikationen: 10 ug poly(A)+RNA wurden in 20 ul 5 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5) 3 min auf 65ºC erhitzt, sofort 1 min auf Eis gestellt und dann (bei Raumtemperatur) so eingestellt, dass 50 mlvi Tris- Hydrochlorid (pH 8,3 bei 42ºC), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 10 mM Dithiothreit, jeweils 2 mM von dATP, dGTP, dTTP und [α³²P]dCTP (300 CpM/pmol), 60 U RNasin und 2,5 ug Oligo[dT]&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; enthalten wurden. 60 U clonierter Maus-Moloney-Leukämievirus-reverser Transkriptase wurden zugesetzt, um die cDNA-Synthese zu beginnen (gesamtes Reaktionsvolumen 40 l), und die Reaktion wurde für 60 min bei 42ºC fortgesetzt. Der zweite cDNA-Strang wurde synthetisiert und, wie beschrieben (34), an die EcoRI-Adaptoren ligiert (vgl. Abschnitt Oligonucleotidsynthese). Die ds-cDNA wurde phosphoryliert (30) und dann auf 0,5 M NaCl/25 ml EDTA eingestellt und zur Inaktivierung der Polynucleotidkinase 15 min bei 75ºC erhitzt. Die ds-cDNA wurde von nicht ligierten Adaptoren durch Chromatographie an Biogel A-15 m abgetrennt und durch Ethanolfällung gewonnen. Die dscDNA wurde, wie vom Lieferanten beschrieben (Stratagene), mit EcoRI geschnittenem λZAP ligiert, wobei jedoch im Reaktionsmedium 15% Polyethylenglycol (PEG) 8000 (Sigma) enthalten waren, eine Modifikation, die kürzlich beschrieben wurde (35). Die ligierte DNA wurde durch Zentrifugation (12000 · g) gewonnen, mit Chloroform gewaschen, getrocknet, in 4 ul H&sub2;O resuspendiert und gemäß dem Lieferanten mit einem in vitro-Verpackungs-Extrakt (Stratagene) inkubiert. Es wurde eine Genbank von 2, 3 · 10&sup7; unabhängigen rekombinanten Clonen erhalten. Rekombinante Phagen wurden in E.coli BB4 (Stratagene) reproduziert.

Durchmustern der cDNA-Genbank

Annähernd 300.000 rekombinante Phagen von der Ost3-cDNA-Genbank wurden (50.000 Phagen/137 mm Durchmesser-Platte) in E.coli BB4 ausplattiert und für 5-6 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Phagen wurden auf Nitrocellulosefilter (Millipore, HATF 137) überführt, verarbeitet (36) und mit den BP4- und BP5-Sonden durchmustert. Die BP4-Sonde wurde mit T4 Polynucleotidkinase und [γ³²P]ATP (28) mit einer spezifischen Aktivität von 1- 2 · 10&sup8; CpM/ug markiert. Die BP5-Sonde war gemäß Feinberg und Vogelstein (42) markiert. Die Filter wurden 1-2 h bei 37ºC in 5 · SSC (1 · SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH 7), 40% Formamid, 5 · Denhardt-Lösung (1 · Denhardt-Lösung = 0,02% Polyvinylpyrrolido/l0,02% Ficoll/0,02% Rinderserumalbumin), 10% Dextransulfat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mlvi Natriumpyrophosphat, 0,1% NaDodSO&sub4; und 50 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Die markierte Sonde wurde bis zu einer Konzentration von 106 CpM/ml zugesetzt, und die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37ºC unter sanftem Schütteln fortgesetzt. Die Filter wurden bei 65ºC in 2 · SSC/0,1% NaDodSO&sub4; gewaschen und über Nacht bei -80ºC gegen Kodak XAR-2-Filme mit einem DuPont- Lightning Plus-Verstärkungsschirm exponiert. Bereiche von Plaques, die doppelte Signale ergaben, wurden entnommen, erneut ausplattiert und durchmustert, bis reine Plaques erhalten wurden.

Plasmidisolierung, Subclonierung und Sequenzierung

Bluescript SK(-), der BP5-cDNA-Insertionen enthielt, wurde aus XZAP mit dem vom Lieferanten (Stratagene) beschriebenen M13 Rettungs/Excisions-Protokoll freigesetzt. Plasmid-DNA wurde mit dem alkalischen Lyse-Verfahren (30) isoliert. Die Insertionen wurden aus dem Bluescript SK(-)-Vektor durch BglII-Verdau heraugeschnitten und durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Die Insertionen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und 12 Stunden unter sanftem Schütteln in 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) passiv eluiert, mit Elutip-D (Schleicher und Schuell), wie vom Lieferanten beschrieben, gereinigt und in einen M13-Sequenzierungsvektor (37) subcloniert. Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (38) unter Verwendung von sowohl M13- Primer als auch spezifischen internen Primern ausgeführt. Mehrdeutige Regionen wurden unter Verwendung von 7-Deaza-2-desoxyguanidintriphosphat (39) und Sequenase (US Biochemicals) aufgelöst.

Hinterlegung der genetischen Information

Die in Fig. 1 dargestellten genetischen Sequenzen sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt, wo sie folgendermaßen identifiziert sind:

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die zu mindestens 85% homolog ist mit der Nucleinsäuresequenz, die in Fig. 1 gezeigt ist, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Protein codiert, das an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor binden kann.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz die Nucleotide 64 - einschließlich 774 von Fig. 1 umfasst.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül im Plasmid pBsBP5.5 enthalten ist, das die ATCC-Hinterlegungsnummer 68387 hat.

4. Rekombinanter Mikroorganismus oder Zelllinie, enthaltend das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Mikroorganismus nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus eine Hefe ist.

6. Zelllinie nach Anspruch 4, wobei die Zelllinie eine Zelllinie vom Ovar des chinesischen Hamsters (CHO) ist.

7. Verfahren zur Expression eines DNA-Moleküls, umfassend das Züchten eines rekombinanten Wirts, der das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Wirt ein Mikroorganismus ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Wirt eine eukaryontische Zelle ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Wirt ein nicht-menschliches transgenes Tier ist.

11. Verfahren zur Produktion des rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Einbringen des rekombinanten DNA- Moleküls in eine Wirtszelle, Wachsenlassen der Wirtszelle und Gewinnen der DNA daraus.

12. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Proteins, umfassend: (a) Bereitstellen eines rekombinanten Mikroorganismus oder einer Zelllinie nach Anspruch 4, (b) Züchten des rekombinanten Mikroorganismus oder der Zelllinie unter Bedingungen, unter denen das von der Nucleinsäuresequenz codierte Protein exprimiert wird, und (c) Isolieren des exprimierten Proteins.