DE68926504T2

DE68926504T2 - Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE68926504T2
Application number: DE68926504T
Authority: DE
Inventors: David Segev
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-07-20
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: EP0425563A1; JP2955759B2; EP0425563A4; JPH03505971A; WO1990001069A1; ATE138106T1; DE68926504D1; EP0425563B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren und Nachweisen von bestehenden Nukleinsäuresequenzen, wenn sie in einer Testprobe vorhanden sind. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zum Erzeugen jeder besonderen Nukleinsäuresequenz einer gegebenen DNA- oder RNA- Sequenz in Mengen, die im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Menge groß sind. Die DNA oder RNA kann einzel- oder doppelsträngig sein und kann eine relative reine Species oder ein Bestandteil einer Mischung von Nukleinsäuren sein. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet eine sich wiederholende Reaktion, um die Amplifizierung der gewünschten Nukleinsäuresequenz zu bewirken.

Hintergrund der Erfindung

Insbesondere für diagnostische Anwendungen kann die Zielnukleinsäuresequenz nur ein ganz geringer Teil des gesamten DNA- oder RNA-Pools in einer Probe sein, die durchmustert werden soll, so daß es schwierig sein kann, die Anwesenheit der Zielnukleinsäuresequenz unter Verwendung nicht-Isotopenmarkierter oder End-markierter Oligonukleotidsonden nachzuweisen. Diagnostische Tests, die DNA-Sonden zum Nachweis seltener Nukleinsäurespecies verwenden, sind daher für eine praktische Verwendung außerhalb des Forschungslabors oft nicht empfindlich genug.
Ein Ansatz, das Empfindlichkeitsproblem zu überwinden, ist das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR), das in den US-Patenten Nrn. 4 683 195 und 4 683 202 (den Patenten '195 und '202) beschrieben ist. Dieses Verfahren verläuft im wesentlichen wie folgt:
a) Behandeln einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die interessierende Zielnukleinsäuresequenz enthält, mit einem Oligonukleotidprimer für jeden Strang der Zielnukleinsäuresequenz unter Hybridisierungsbedingungen und in Gegenwart einer Polymerase, z.B. des Klenow-Fragmentes der Escherichia coli-DNA-Polymerase I, so daß ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, wenn die Zielnukleinsäuresequnz vorhanden ist;
b) Anwenden von denaturierenden Bedingungen auf die Probe nach Schritt (a), um jedes Primer-Verlängerungsprodukt, das synthetisiert worden ist, von der Matrize, an der es synthetisiert worden ist, zu trennen, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen;
c) Behandeln der in Schritt (b) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern aus Schritt (a) unter den Bedingungen von (a), so daß die neuen Primer-Verlängerungsprodukte unter Verwendung sowohl von ursprünglichen Zielsequenzen als auch von Primer-Verlängerungsprodukten, die in Schritt (a) erzeugt worden sind, als Matrizen synthetisiert werden, was zu einer Amplifizierung der Zielnukleinsäuresequenz führt.
Die Schritte (a) bis (c) können aufeinander folgend oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zusätzlich können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Amplifikation der Sequenz erhalten ist. Wie in den US-Patenten Nrn. 4 683 195 und 4 683 202 diskutiert wird, kann das Produkt des Schrittes (c) unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden.
Das PCR-Verfahren hat den Nachteil, daß es das Empfindlichkeitsproblem nicht vollständig löst. Das PCR-Verfahren verwendet alle vier Nukleotidbasen, um die Primer-Fragmente zu verlängern. Daher können die Verlängerungsprodukte von anderen, nicht-Zielnukleinsäurematrizen erzeugt werden, die in der Probe vorhanden sind, beispielsweise doppelsträngige DNA mit Einzelstrangbrüchen. Die Verwendung des PCR-Verfahrens führt zu einem erheblichen Hintergrund von amplifizierter DNA, die von der Zielsequenz bzw. den Zielsequenzen verschieden ist.
Wie später im einzelnen erklärt wird, verwendet die vorliegende Erfindung mindestens zwei Oligonukleotide für jeden Strang der Zielnukleinsäuresequenz und verwendet weniger als alle vier Basen, was das Problem der unspezifischen Hintergrundamplifikation aus einer Anzahl von Gründen vermindert. Beispielsweise wird, wenn markierte Nukleotide verwendet werden, die Lücke mit markierten Nukleotiden gefüllt, wenn die Nukleinsäurezielsequenz in der Probe vorhanden ist, und irrelevante Sequenzen werden nicht kopiert oder markiert.
Das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren erfordert außerdem hitzestabile Enzyme, um das Verfahren zu automatisieren, während das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit von der jeweiligen Ausführungsform unter Verwendung hitzelabiler Enzyme oder überhaupt ohne Enzyme durchgeführt werden kann. Zusätzlich erfordert der Nachweis amplifizierter Nukleinsäuresequenzen, die im PCR-Verfahren erzeugt werden, auch die Verwendung von Gelen oder eines Einfangsystemes, was mühsame Nachweisverfahren sind. Im Gegensatz dazu ist der Nachweis amplifizierter Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung relativ einfach. Beispielsweise kann zur Trennung der miteinander verbundenen Oligonukleotidprodukte, die gebildet werden, wenn die Zielsequenz vorhanden ist, von den einzelnen Nukleotiden eine Sephadex- Säule verwendet werden. Die europäische Patentanmeldung 0 246 864 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure, wobei das Verfahren die Hybridisierung von zwei Nukleinsäuresondenmolekülen an den Nukleinsäurezielstrang involviert, wobei die Nukleinsäuresondenmoleküle so beschaffen sind, daß sie nach Hybridisierung auf eine Weise benachbart sind, daß die Lücke zwischen den Sondenmolekulen durch eine zielgerichtete Polymerisation der Lücke gefüllt werden kann, beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase, mit anschließender Verbindung, beispielsweise durch DNA-Ligase.
Zum Erzeugen von großen Mengen von Nukleinsäuren aus ursprünglich kleinen Mengen gibt es neben dem PCR-Verfahren weitere Verfahren. Beispielsweise gibt es das Verfahren der Subklonierung einer Nukleinsäure in einem entsprechenden Wirtssystem, wo die gewünschte Nukleinsäure in einen geeigneten Vektor insertiert wird, der zur Transformation des Wirtes verwendet wird. Wenn der Wirt kultiviert wird, wird der Vektor repliziert und daher mehr Kopien der gewünschten Nukleinsäure erzeugt. Für eine kurze Beschreibung der Subklonierung von Nukleinsäurefragmenten siehe Maniatis, T., et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 390-401 (1982). Siehe außerdem die in den US-Patenten Nrn. 4 416 988 und 4 403 036 beschriebenen Verfahren.
Weitere Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäuren umfassen die organische Synthese einer Nukleinsäure aus Nukleotidderivaten, beispielsweise die in dem US-Patent Nr. 4 356 270 beschriebenen Verfahren. Ein weiteres Beispiel eines Verfahrens zum Synthetisieren von Nukleinsäure wird in dem US-Patent Nr. 4 293 652 zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren ein Hybrid aus organischer Synthese und molekularer Klonierung darstellt. Die Diskussion dieses und anderer Verfahren in den Patenten '195 und '202 sowie die zuvor aufgeführten Patente werden hier durch Verweis einbezogen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Zielnukleinsäuresequenzen, die in einer Probe vorhanden sind.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Amplifizierung erreicht, indem zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare verwendet werden, wobei mindestens ein Strang dieser Oligonukleotidpaare eine Nukleotidsequenz hat, die zu mindestens einem Teil der Zielsequenz komplementär ist. Die Oligonukleotide werden so ausgewählt, daß es eine Lücke von mindestens einer Base gibt, wenn die komplementären Stränge der "Oligonukleotidkomplementpaare" und die Zielnukleotide miteinander hybridisiert werden. Die Lücke zwischen den Oligonukleotidkomplementsequenzen wird durch eine Mischung aus Polymerase und Ligase, die ein Oligonukleotidreparaturprodukt erzeugen, gefüllt. Die resultierende Mischung hybridisierter Moleküle wird dann denaturierenden Bedingungen ausgesetzt.
Nachdem die Stränge sich während der Denaturierung trennen, kann das ligierte Oligonukleotidprodukt an dazu komplementäre Stränge aus anderen Oligonukleotidkomplementpaaren hybridisieren, und dann wird die Lücke erneut geschlossen. Dieses Verfahren wird so oft wie notwendig wiederholt, um die gewünschte Menge an Oligonukleotidreparaturprodukten zu erzeugen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Enzyme auf einem polymeren Träger immobilisiert.
Das vorliegende Verfahren ist insbesondere zum Amplifizieren von Sequenzen nützlich, die eine genetische Erkrankung anzeigen, und für seltene Species von Nukleinsäuren, die in einer Nukleinsäuremischung vorhanden sind, und erlaubt weiter den wirksamen Nachweis solcher Nukleinsäuresequenzen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Amplifizieren mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe einer Nukleinsäure oder einer Mischung von Nukleinsäuren zur Verfügung. Jede Nukleinsäurezielsequenz könnte aus einem Strang (RNA) oder zwei getrennten komplementären Strängen (DNA) gleicher oder ungleicher Länge bestehen.
Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
a) Behandeln der Probe mit Oligonukleotidkomplementpaaren A, A' und B, B' unter Hybridisierungsbedingungen und Bedingungen zum Füllen der Lücke. A ist ein Oligonukleotid und A' ist ein Oligonukleotid, das zu A komplementär ist. B ist ein Oligonukleotid und B' ist ein Oligonukleotid, das zu B komplementär ist. Wenn die Sätze der beiden Paare, A, A' und B, B', mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden, bilden A und B, die mit einem Strang der Zielsequenz hybridisieren, eine Lücke von einer oder mehreren Basen zwischen sich. A' und B' formen ebenso eine Lücke von einer oder mehreren Base zwischen sich. Die Lücke wird mit einer oder mehreren markierten oder unmarkierten Basen so gefüllt, daß A und B zu einem Strang mit einer kontinuierlichen Basensequenz mit einer oder mehreren markierten oder unmarkierten Extrabasen (A-Q-B) werden, wobei Q die Base(n) ist (sind), die die Lücke füllt (füllen). Q könnte ebenso eine Base sein, die so modifiziert ist, daß sie gegenüber einem von der 3' T 5'-Exonukleaseaktivität der zum Füllen der Lücke verwendeten Polymerase verursachten Abbau resistent ist. Ebenso sind A' und B' nun ein Strang mit einer kontinuierlichen Basensequenz mit einer oder mehreren, markierten oder unmarkierten Extrabasen, (A'-Q'-B'), wobei Q' eine Base ist oder mehrere Basen sind, die die Lücke füllt (füllen). Q' könnte auf gleiche Weise eine modifizierte Base sein, die gegen einen von der 3',5'-Exonukleaseaktivität der Polymerase verursachten Abbau resistent ist. In jeder kontinuierlichen Basensequenz A-Q-B oder A'-Q'-B' können Q oder Q' aus nur einem Satz von Basenpaaren für jede spezifische Sequenz zusammengesetzt sein, d.h. A-T, A-U, G-C oder Derivate dieser Basen. A-Q-B und A'-Q'-B' sind nun miteinander verbundene Oligonukleotidprodukte und können als Zielsequenzen für andere Oligonukleotidkomplementpaare dienen. Wenn das verbundene Oligonukleotidprodukt durch dieses lückenfüllende, ligierende Verfahren gebildet wird, wird als ein "Oligonukleotidreparaturprodukt" bezeichnet.
b) Behandeln der Probe unter denaturierenden Bedingungen, um die Oligonukleotidreparaturprodukte von ihren Zielsequenzen zu trennen, wenn die Nukleinsäurezielsequenz(en) vorhanden ist (sind).
c) Behandeln der Probe wie in Schritt (a) mit den Oligonukleotidkomplementpaaren A, A' und B, B' unter Hybridisierungsbedingungen und Bedingungen zum Füllen der Lücke, so daß ein Oligonukleotidreparaturprodukt erhalten wird, wobei jeder der in Schritt (b) erzeugten Einzelstränge verwendet wird, was zur Amplifikation der Nukleinsäurezielsequenz(en) führt, wenn diese vorhanden ist (sind).
Die Schritte können aufeinander folgend oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zusätzlich können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Sequenzamplifizierung erreicht ist.
Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zum Nachweis der amplifizierten spezifischen Nukleinsäuresequenz und auf diagnostische Kits, die dafür verwendbar sind.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt eine 48 Basenpaare lange Sequenz aus dem HIV-GAG- Bereich, deren Amplifizierung gewünscht wird. Die Basenpaare, die die Lücke füllen, sind über und unter den 48 Basenpaaren gezeigt.
Abb. 2 zeigt ein 12 % Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gel, in dem jede Spur aus einem Zyklus besteht, der umfaßt: das Kochen der Mischung von humanen Immundefizienzvirus-(HIV)-Plasmidzielsequenzen mit markierten Oligonukleotiden, die an photoreaktive Verbindungen angeheftet sind, rasches Abkühlen der Mischung auf 37ºC und Bestrahlen der Mischung für 5 Minuten.
Abb. 3 zeigt eine Vorrichtung zum Durchführen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die verwendeten Enzyme auf einem polymeren Träger immobilisiert werden.

Eingehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Definitionen

Der Ausdruck "Oligonukleotid", so wie er hier verwendet wird, ist definiert als ein Molekül, das drei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfaßt, bevorzugt mehr als fünf.
Der Ausdruck "glattes Ende" ist definiert als zwei Oligonukleotide, die einander komplementäre Sequenzen haben und mindestens ein Ende mit gleicher Länge, wenn sie miteinander hybridisiert werden.
Ein "überstehendes Ende", so wie es in dieser Anmeldung definiert ist, bezeichnet zwei Oligonukleotide, die einander komplementäre Sequenzen haben und mindestens ein Ende ungleicher Länge haben, wenn sie miteinander hybridisiert werden. Die Kategorien der glatten und überstehenden Enden sind unten veranschaulicht.
Der Ausdruck "zwei Oligonukleotidkomplementpaare" umfaßt mindestens vier verschiedene Oligonukleotide, die beispielsweise mit A, A' und B, B' bezeichnet werden, wobei das Oligonukleotid A eine Basensequenz hat, die A' komplementär ist, und das Oligonukleotid B hat eine Basensequenz, die B' komplementär ist. Jedes Paar kann gleiche oder ungleiche Länge haben, was wie folgt veranschaulicht wird:

Kategorie 1.

Oligonukleotid-Komplementpaare mit glatten Enden

Kategorie 2.

Oligonukleotid-Komplementaare mit jeweils einem glatten und einem überstehenden Ende

Zwei Oligonukleotidkomplementpaare mit einem überhängenden Ende an einem Ende jedes Paares sind als die die Sammlung erfindungsgemäßer amplifizierter Oligonukleotide bildenden Basen bevorzugt. Es versteht sich von selbst, daß mehr als zwei Oligonukleotidpaare im erfindungsgemäben Verfahren verwendet werden könnten.
Der Ausdruck "Lücke", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Abwesenheit einer oder mehrerer Basen zwischen A und B, E und F, oder zwischen A' und B', E' und F'. Wenn mehr als zwei Paare verwendet werden, dann kann mehr als eine Lücke vorhanden sein. Die Lücke wird erzeugt, wenn die Paare mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden, beispielsweise: Zeile 1: Zeile 2: (die Lücke)
Zeile 1 ist die Sequenz der Nukleinsäurezielsequenz und Zeile 2 stellt die Oligonukleotidkomplementpaare A' und B' dar, wie sie mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisieren. Wenn die Zielsequenz doppelsträngig ist, werden die Oligonukleotide A und B ein Hybrid mit der Sequenz bilden, die der oben in Zeile 1 gezeigten Zielsequenz komplementär ist.

A. Füllen der Lücke, Ligation und Amplifikation

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Amplifizieren von Nukleinsäuresequenzen werden mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaare mit der Probe, von der angenommen wird oder bekannt ist, daß sie die interessierende Nukleinsäurezielsequenz enthält, unter hybridisierenden Bedingungen zusammengebracht. Die Oligonukleotidkomplementpaare werden so ausgewählt, daß eine Lücke in der Nukleotidsequenz von mindestens einer Base zwischen den beiden Komplementen ist, wenn die beiden Komplemente mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden. Die Lücke wird dann gefüllt und die beiden Oligonukleotide miteinander ligiert, wodurch ein Oligonukleotidreparaturprodukt erzeugt wird. Das Verfahren des Füllens der Lücke einschließlich der Ligation ist der Reparatur fehlgepaarter Basen und anderer Fehler, die während der DNA-Replikation, der Reparatur von UV-Schäden und anderen Prozessen in vivo auftritt, analog. Die Nukleinsäurezielsequenz und die Oligonukleotidreparaturproduktsequenz können dann getrennt werden und das Verfahren immer wieder wiederholt werden, bis der gewünschte Amplifikationsgrad erreicht worden ist. Um das Problem einer Hintergrundsynthese, die während des Lückenfüllschrittes auftritt, zu vermeiden, werden die zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare so ausgewählt, daß das Füllen der Lücken zwischen ihnen weniger als alle vier Basen erfordert, bevorzugt ein Satz komplementärer Basen, nämlich A-T, A-U oder G-C. Ohne alle vier Basen wird keine zufällige Synthese von Nukleinsäuresequenzen, die Einzelstrangbrüche haben oder im Replikations- oder Transkriptionsprozeß sind, initiiert werden.

1. Nukleinsäurezielsequenzen

Das erfindungsgemäße Verfahren kann exponentielle Mengen mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz relativ zu der Anzahl involvierter Reaktionsschritte erzeugen, vorausgesetzt, daß (a) mindestens ein Teil der Nukleinsäurezielsequenz ausreichend genau bekannt ist, so daß Oligonukleotidpaare synthetisiert werden können, die damit hybridisieren können, oder (b) die Zielsequenz in Mengen isoliert werden kann, die groß sind, um genug Oligonukleotidkomplementpaare für die Verwendung in dem Verfahren zu erzeugen. Jede Quelle von Nukleinsäuren kann in gereinigter oder nicht-gereinigter Form als Quelle für die Nukleinsäurezielsequenz verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren entweder einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA verwenden. Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid, das einen Strang jeder Sorte enthält, verwendet werden. Eine Mischung jeder dieser Nukleinsäuren kann verwendet werden. Die besondere Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, kann nur ein Teil eines größeren Moleküls sein. Es kann eine kleine Fraktion einer komplexen Mischung sein, beispielsweise ein Teil des HIV(humanen Immundefizienzvirus-)Genes, das in die genomische DNA einer infizierten Person integriert ist, oder eine bakterielle Nukleinsäure, die in sehr geringen Mengen in besonderen biologischen Proben vorhanden sind.
Um die Sequenz der Zielsequenz(en) zu bestimmen, oder als zu untersuchende Probe, kann die Nukleinsäure oder -säuren von Interesse aus jeder Quelle erhalten werden, beispielsweise aus DNA oder RNA, die aus Bakterien, Viren, Hefe und höheren Organismen, beispielsweise Pflanzen oder Tieren, aus Plasmiden, wie pBR322 und M13, aus klonierter DNA oder RNA durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert vorhanden ist. DNA kann mittels Verfahren, wie sie z.B. von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), Seiten 280-281, beschrieben sind, aus in Gewebekultur gewachsenen Zellen extrahiert werden.

2. Oligonukleotidkomplementpaare

Die Oligonukleotidkomplementpaare sind bevorzugt Oligodesoxyribonukleotide. Zusätzlich müssen die Paare lang genug sein, um mit der Nukleinsäurezielsequenz (den Nukleinsäurezielsequenzen) zu hybridisieren. Die Länge der Komplementpaare kann von vier bis zu Hunderten von Basen variieren. Ein kurzes Oligonukleotid erfordert im allgemeinen kühlere Temperaturen zur Bildung stabiler Hybridkomplexe. Die synthetisierten Oligonukleotidsequenzen werden so ausgewählt, daß zwei Oligonukleotidkomplementpaare beide an die Zielsequenz hybridisieren würden und doch eine Lücke von einer oder mehreren Basen lassen. Wenn die Zielsequenz einzelsträngig ist, würde nur eine Hälfte eines solchen Oligonukleotidpaares mit dem Ziel hybridisieren. Mehr als zwei Oligonukleotidkomplementpaare können im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, solange die Amplifikation für die Nukleinsäurezielsequenz(en) spezifisch bleibt.
Die Oligonukleotidkomplementpaare können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, z.B. können Phosphoramidite (Applied Biosystems, Inc.) als Ausgangsmaterialien verwendet und, wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-62 (1981) beschrieben, synthetisiert und an ihren 5'- Enden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren phosphoryliert werden.

3. Denaturierung

Die Strangtrennung kann durch jedes geeignete Denaturierungsverfahren, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, erreicht werden. Ein physikalisches Verfahren zum Trennen der Stränge der Nukleinsäure umfaßt das Erwärmen der Nukleinsäure, bis sie vollständig (mehr als 99 %) denaturiert ist. Eine typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen im Bereich von ungefähr 80ºC bis 105ºC umfassen, für Zeiträume im Bereich von ungefähr 1 bis 10 Minuten. Die Strangtrennung kann außerdem durch ein Enzym aus der Enzymklasse induziert werden, die als Helikasen bekannt sind, oder durch das Enzym RecA, das Helikaseaktivität hat und von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart von riboATP DNA denaturiert. Die Reaktionsbedingungen, die zum Trennen der Stränge von Nukleinsäuren mit Helikasen geeignet sind, sind im Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Band XLIII "DNA Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978), B. Kuhn et al., "DNA Helicases", Seiten 63-67, beschrieben, und Verfahren zur Verwendung von RecA sind von C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-37 (1982), übersichtsartig zusammengefaßt.

4. Lückenfüllungs-/Ligationsschritte

Im allgemeinen werden die Lückenfüllungs- und Ligationsschritte in einer gepufferten wäßrigen Lösung, bevorzugt bei einem pH von 7 bis 9, besonders bevorzugt bei pH 7,5 durchgeführt. Die Oligonukleotidkomplementpaare sollen in einem molaren Überschuß von ungefähr 10&sup5; bis 10¹&sup5; Paaren pro Nukleinsäurezielsequenz vorhanden sein. Die genaue Menge der für diagnostische Zwecke zu verwendenden Paare kann in Folge der Unsicherheit hinsichtlich der Menge der Nukleinsäurezielsequenz in einer Probe unbekannt sein. Jedoch ist eine durchschnittliche Menge von 10¹&sup5; Oligonukleotidkomplementpaaren in einem typischen diagnostischen Test verwendbar. Ein großer molarer Überschuß ist in jedem Fall bevorzugt, um die Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verbessern.
Im erfindungsgemäßen Verfahren würden typischerweise nur zwei komplementäre Desoxyribonukleosidtriphosphate für den Lückenfüllungsschritt verwendet werden, dATP und TTP, oder alternativ dCTP und dGTP. Es können Oligonukleotidkomplementpaare mit überhängenden Enden ausgewählt werden, so daß zum Füllen jeder Lücke nur ein Typ von Desoxyribonukleosidtriphosphat erforderlich ist. Komplementpaare mit überhängenden Enden können jedoch auch so ausgewählt werden, daß zwei komplementäre Nukleotide und ein weiteres anderes Nukleotid zum Füllen der Lücke verwendet werden.
Es ist bevorzugt, modifizierte Nukleosidtriphosphate zu verwenden, von denen im Stand der Technik bekannt ist, daß sie gegen die Exonukleaseaktivität von Polymerasen resistent sind, wie beschrieben von D. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-92 (1982); T.A. Kunkel, ibid, 78: 6734-38 (1981); F.R. Bryant et al., Biochemistry 18: 2825-28 (1979). Solche Moleküle könnten sein Thymidin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (TTP[αS]), 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (dATP [αS]) und die Thioderivate von Desoxycytidin, Desoxyguanidin, Desoxyuridin und von Cytidin, Guanidin, Adenosin, Thymidin und Uracil. Andere Derivate dieser Basen, die gegen Nukleaseaktivität resistent sind, sind geeignet, wie beispielsweise ein α- Imido-Derivat von Triphosphatbasen.
Der Lückenfüllungs-/Ligationsmischung werden in adäquaten Mengen ausreichend Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt und die resultierende Lösung wird ungefähr 1 bis 5 Minuten auf ungefähr 90ºC bis 100ºC erwärmt, bevorzugt 1 bis 3 Minuten. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, um die Hybridisierung zu erlauben. Zur abgekühlten Lösung werden geeignete Katalysatoren zugefügt, um das Füllen und Schließen der Lücke unter Bedingungen zu induzieren, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise können bekannte DNA-Polymerasen zum Lückenfüllen verwendet werden, und bekannte DNA-Ligasen können das resultierende Produkt verbinden, nachdem die Polymerase die Lücke gefüllt hat. Der Lückenfüllungs-/Ligationsprozeß kann bei 4ºC bis zu einer Temperatur geschehen, bei der die katalytischen Mittel nicht länger effizient funktionieren; die Temperatur ist im allgemeinen nicht höher als ungefähr 40ºC. Daher ist beispielsweise die Temperatur, wenn T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase verwendet werden, im allgemeinen nicht höher als ungefähr 40ºC (am günstigsten ist es, die Reaktion bei Raumtemperatur oder sogar bei 4ºC ablaufen zu lassen). Wenn hitzeunempfindliche Enzyme verwendet werden, dann könnte das Verfahren bei Schmelztemperatur der Hybridmatrizen stattfinden.
Das katalytische Mittel kann jede Verbindung oder jedes System sein, das das Füllen der Lücke zwischen den zwei oder mehr Oligonukleotiden, die an die Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert sind, bewirkt. Für diesen Zweck geeignete Enzyme umfassen E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase, und reverse Transkriptase zum Zufügen von Basen zum Füllen der Lücke sowie T4-DNA-Ligase zur Verbindung des Oligonukleotids (der Oligonukleotide), außerdem von der Polymerase den anderen Oligonukleotidkomplementen zugefügte Nukleotide, wodurch ein verbundenes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das in dieser Ausführungsform ein Oligonukleotidreparaturprodukt genannt wird.
Die Oligonukleotidreparaturprodukte, die mit den Nukleinsäurezielsequenzen hybridisiert sind, liegen in einer doppelsträngigen Form vor. Im nächsten Schritt werden die Stränge der doppelsträngigen Moleküle erneut getrennt, wie oben beschrieben, um einzelsträngige Moleküle zu bilden.
Um eine Amplifikation zu erzeugen, können die verbundenen Oligonukleotidmoleküle an zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare hybridisieren. Falls es notwendig ist, können zusätzliche Enzyme, entsprechende Desoxyribonukleotidtriphosphate und Oligonukleotide zugefügt werden, damit die Reaktion weiterläuft.
Die Schritte der Strangtrennung, des Lückenfüllens und der Ligation können so oft, wie erforderlich, wiederholt werden, um die gewünschte Menge des spezifischen verbundenen Oligonukleotidproduktes zu erzeugen, wobei angenommen wird, daß eine Kopie der einzelsträngigen Nukleinsäurezielsequenz zu Beginn in der Mischung vorhanden war. Solange diese Schritte wiederholt werden, wird die Amplifikation der spezifischen Nukleinsäurezielsequenz exponentiell stattfinden. Dieses Verfahren könnte verwendet werden, um andere Nukleinsäurezielsequenzen zu amplifizieren, indem verschiedene Oligonnukleotidpaare (oder Triplets, usw.), die an unterschiedliche spezifische Nukleinsäurezielsequenzen hybridisieren, zugefügt werden, ohne andere Bedingungen zu ändern.
Diese besondere Ausführungsform der Erfindung könnte schrittweise durchgeführt werden, wobei neue Reagenzien nach jedem Schritt zugefügt werden, oder gleichzeitig, wobei alle Reagenzien auf einmal zugesetzt werden. Die Reagenzien können außerdem nach einem gegebenen Schritt zugefügt werden. Jeder Schritt der Ausführungsform, der hitzestabile Enzyme involviert, wird aufeinanderfolgend auftreten, ungeachtet der ursprünglichen Konzentration all dieser Reagenzien. Wenn hitzeempfindliche Enzyme verwendet werden, ist es notwendig, die Lückenfüllungs- und Verknüpfungsmittel nach jedem Strangtrennungs- (Denaturierungs-)schritt zuzufügen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die katalytischen Mittel auf polymeren Trägern immobilisiert. Nach dem Lückenfüllungs- und Ligationsschritt können die Produkte von den immobilisierten Enzymen eluiert werden und zu Einzelsträngen denaturiert werden. An diesem Punkt stehen die Nukleinsäurezielsequenz(en) und das (die) verbundenen Oligonukleotidprodukt(e) zur Bildung von Hybriden mit zusätzlichen Oligonukleotidkomplementpaaren zur Verfügung. Diese neuen Hybride werden dann zu den immobilisierten Enzymen zurückgeführt, um verbundene Produkte zu bilden. Die Reaktionsschritte können schrittweise oder gleichzeitig ausgeführt werden, und können so oft wie gewünscht wiederholt werden.
Für kleinere Oligonukleotidkomplemente, beispielsweise 6 bis 10 Basen, könnten hitzeempfindliche Enzyme in einem gleichzeitigen Verfahren verwendet werden, da die Schmelztemperatur doppelsträngiger Oligonukleotide dieses Bereiches bei ungefähr 40ºC liegt, und die hitzeempfindlichen Enzyme bei diesen Temperaturen aktiv sind.
Wenn hitzestabile Lückenfüllungs- und Verknüpfungsmittel verwendet werden, beispielsweise thermostabile Polymerase und Ligase, dann könnte das Verfahren bei einer erhöhten Temperatur, bevorzugt 60 bis 90ºC, in Abhängigkeit von den hitzestabilen Enzymen, durchgeführt werden. Die Temperatur wird außerdem durch die Temperatur bestimmt, bei der ein Gleichgewicht zwischen einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren vorliegt. Eine solche hitzestabile Polymerase wird von A.D. Kaledin et al., Biokhimiya, 45, 644-51 (1980), beschrieben. Eine hitzestabile Polymerase und Ligase könnte aus Thermus thermophilus extrahiert werden.
Nachdem der angemessene Zeitraum zum Durchführen des Verfahrens verstrichen ist, und sich die gewünschte Menge des Oligonukleotidreparaturprodukts akkumuliert hat, kann die Reaktion durch Inaktivieren der Enzyme auf jede bekannte Weise oder Trennen der Bestandteile der Reaktion auf zu zentrifugierenden Säulen oder Sephadex-Säulen, durch Filtration oder durch Gelelektrophorese inaktiviert werden, wie es in der Technik bekannt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ein automatisiertes Verfahren verwendet werden. Dazu umfaßt der Reaktionszyklus einen Denaturierungsschritt, einen Reagenzzusatzschritt und einen Reaktionsschritt. Außerdem kann das Verfahren kontinuierlich durch automatisches Zufügen der Reagenzien mittels einer Pumpe nach dem Denaturierungsschritt durchgeführt werden, während der Schritt des Erwärmens und Abkühlens durch einen speziell dafür entworfenen, gesteuerten Wärmeblock durchgeführt werden könnte.
Die vorliegende Erfindung ist unten zeichnerisch unter Verwendung von zwei Oligonukleotidkomplementpaaren, die jeweils ein überhängendes Ende haben, dargestellt (Kategorie 2).
Zwei Paare mit überhängenden Enden
N ist ein Nukleotid, das so modifiziert ist, daß es die Stränge vor einem Abbau durch 3'-Exonukleasen, wie sie beispielsweise als Teil der T4-DNA-Polymerase gefunden werden, schützt. Die Oligonukleotidkomplementpaare E, E' und F, F' werden so ausgewählt oder synthetisiert, daß sie Abschnitten der vollständigen Nukleinsäurezielsequenz R entsprechen. R ist eine doppelsträngige DNA, umfassend die komplementären Stränge R&spplus; und R&supmin;, dargestellt als:
Wenn [R] mit einem molaren Überschuß an Oligonukleotiden der Komplementpaare E, E' und F, F' unter Bedingungen gemischt wird, bei denen doppelsträngige Moleküle denaturiert werden und dann rehybridisieren können, bildet R&spplus; stabile doppelsträngige Hybride mit E' und F', während R Hybride mit E und F bildet, wie im folgenden dargestellt:
A* bedeutet das modifizierte Nukleotid N aus Schema [1], beispielsweise [NTP's αS].
Als nächstes werden der Mischung TTP, dATP, E. coli Klenow- Fragment und T4-DNA-Ligase zugesetzt, was das Füllen und Verschließen der Lücke in den Doppelsträngen erlaubt, wodurch erzeugt wird: verbundenes Nukleotidprodukt verbundenes Nukleotidprodukt
In diesem besonderen Beispiel fügt das Klenow-Fragment die Nukleotide an das 3'-Ende von F' und die Ligase verbindet die zugefügten Nukleotide mit dem 5'-Ende von E'. E und F werden auf die gleiche Weise verbunden.
Im ersten Zyklus sind zwei neue einzelsträngige DNAs erzeugt worden. Nach dem folgenden Denaturierungsschritt kann der molare Überschuß der beiden Oligonukleotidkomplementpaare mit den ursprünglichen Nukeinsäurezielsequenzen sowie mit den Oligonukleotidreparaturprodukten hybridisieren, die im ersten Zyklus gebildet worden sind; daher werden im zweiten Zyklus vier weitere Oligonukleotidreparaturprodukte gebildet. Die Bildung neuer verbundener Oligonukleotidprodukte nimmt exponentiell zu.
In diesem Verfahren könnten dATP und TTP mit radioaktiven Markern, beispielsweise ³²P, ³&sup5;S oder ¹²&sup5;I, markiert werden. Nicht-radioaktive Marker können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise könnte TTP durch Biotin-dUTP (Enzo Biochem) ersetzt werden und dATP könnte durch Biotin-dATP ersetzt werden, wie es von G. Gebeyehu et al., Nucleic Acid Res. 15, 4513-34 (1987), beschrieben worden ist.
In dem Fall, wenn Oligonukleotidpaare mit glatten Enden in Lösung verwendet werden (Kategorie 1), kann eine Ligation glatter Enden zwischen den Sätzen der beiden Paare in Lösung auftreten. Da jedoch nur die Basen, die die Lücken füllen, markiert sind, werden die Produkte der Ligation glatter Enden im Nachweisschritt nicht gezählt.

B. Nachweis des verbundenen Oligonukleotidproduktes

Das verbundene Oligonukleotidprodukt kann durch eine Anzahl von Verfahren zum Nachweisen markierter Moleküle und/oder von Molekülen mit einer besonderen Länge oder Sequenz nachgewiesen werden. Beispielsweise kann die Reaktionsmischung durch eine Sephadex-Säule gegeben werden, um die markierten NTPs und die verbundenen Oligonukleotidprodukte zu trennen. Da Einzelnukleotide viel kleiner sind als die Länge von zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaaren, sollte der Nachweis von amplifiziertem Material allein auf der Grundlage der Größe relativ einfach sein.
Ein weiteres Verfahren zum Nachweis amplifizierter Sequenzen würde die Konstruktion oder Isolierung von Sonden erfordern, die ausreichend komplementäre Sequenzen zu jedem Oligonukleotidkomplementpaar hätten, um das verbundene Produkt bevorzugt zu binden und festzuhalten. Solche Sonden können auf jedem geeigneten Substrat immobilisiert werden. Sie können auch unterschiedlich markiert werden, wenn das gewünscht ist.
Die vorliegende Erfindung kann für in vitro-Diagnostika verwendet werden. Der Prozeß der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen ermöglicht den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die mit infektiösen Krankheiten, genetischen Erkrankungen oder zellulären Erkrankungen, beispielsweise Krebs, in Zusammenhang stehen. Die Amplifikation ist besonders nützlich, wenn die Menge der Nukleinsäurezielsequenz, die für die Diagnose verfügbar ist, in sehr kleinen Mengen vorliegt, wie beispielsweise bei der pränatalen Diagnose der Sichelzellenanämie, die erfordert, daß DNA aus fetalen Zellen erhalten wird. Weiterhin liegt es im Können des Fachmanns, die Länge und Sequenzen der Oligonukleotidkomplemente zu variieren, um Deletionen und/oder Mutationen in der genomischen DNA eines jeden Organismus nachzuweisen. Diese kleinen Veränderungen sind für die Diagnose solcher Krankheiten, wie zystischer Fibrose, α-Thalassemie, β-Thalassämie und ähnlicher bedeutsam.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch die Gegenwart unterschiedlicher Agentien, beispielsweise pathogener Viren, einschließlich des humanen Immundefizienzvirus (HIV), Herpes, Hepatitis B und Bakterien, einschließlich Salmonella und Chlamydia, anzeigen.
Das US-Patent Nr. 4 358 535 (Falkow) beschreibt die Verwendung spezifischer DNA-Hybridisierungssonden für die Diagnose von infektiösen Krankheiten. Ein dem Falkow-Verfahren inhärentes Problem ist es, daß eine relativ kleine Anzahl pathogener Organismen in einer klinischen Probe eines infizierten Patienten vorhanden sein kann, und die DNA, die aus dem Pathogen extrahiert ist, kann eine nur sehr kleine Fraktion der gesamten DNA in der Probe darstellen. Die spezifische Amplifikation von vermuteten Sequenzen in einer Probe vor der Hybridisierung mit den Sonden und die Immobilisierung auf Filtern könnte die Empfindlichkeit und Spezifität dieser Verfahren stark verbessern.
In einer weiteren Ausführungsform könnte die amplifizierte Art durch ein einfaches Verfahren wie folgt nachgewiesen werden: Eine Fänger-Oligonukleotidsonde, die eine Nukleinsäuresequenz hat, die sowohl zu E und F als auch zu E' und F' oder zu jedem davon getrennt komplementär ist, könnte verwendet werden, um die amplifizierten markierten Produkte zu fangen.
In einer weiteren Ausführungsform könnten die in das Verfahren involvierten Desoxyribonukleotidtriphosphate radioaktiv markiert werden, beispielsweise mit ³²P, ³&sup5;S, ¹²&sup5;I und andere mit nicht-radioaktiven Markern.
Ein weiteres Mittel, um die klinische Verwendung der DNA-Sonden zur Diagnose von infektiösen Krankheiten zu erleichtern, ist der Ersatz radioaktiver Marker durch nicht-radioaktive Marker. Wie in EP 63 879 (Ward) beschrieben, werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch chromogene Enzyme nachgewiesen, die an Avidin oder Biotin-spezifische Antikörper gebunden sind. Dieser Typ des Nachweises ist bequem, aber relativ unempfindlich. Die Kombination der erfindungsgemäßen DNA-Amplifikation und die Verwendung von Bio-dUTP zum Markieren der Basen, die die Lücke füllen, könnte die Bequemlichkeit und Empfindlichkeit zur Verfügung stellen, die erforderlich ist, um nützliche diagnostische Kits herzustellen und die Schwierigkeiten zu überwinden, die sowohl mit den Verfahren von Falkow als auch von Ward verbunden sind, wenn diese Verfahren in klinischen Routineansätzen verwendet werden.
Die Verwendung der Verfahren von Falkow und Ward, die Synthese der Oligonukleotide, die Berechnung der Anzahl von Sequenzen, die pro Zyklus amplifiziert werden, und andere Dinge, die allgemein die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen betreffen, sind in den Anmeldungen '195 und '202 beschrieben; diese Anmeldungen werden hier durch Verweis einbezogen.
Die Erfindung wird nun durch Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken. In Verbindung mit der allgemeinen und eingehenden Beschreibung oben tragen die Beispiele zum weiteren Verständnis der vorliegenden Erfindung bei und führen einige Aspekte der bevorzugten erfingungsgemäßen Ausführungsformen aus.

Beispiel 1

Die gewünschte Sequenz, die unter Verwendung der Lückenfüllungs-/Ligationsausführungsform der Verbindung von Oligonukleotiden amplifiziert werden soll, ist eine Sequenz von 48 Basenpaaren, die für den GAG-Bereich 2106-2153 von HIV kodiert. Diese Sequenz wird wegen ihres G-C-Gehaltes ausgewählt, der ungefähr 52 % beträgt, und hat die folgende Sequenz:
Die folgenden 4 Oligodesoxyribonukleotide sind Beispiele für die vielen glattendigen Sequenzen, die erfindungsgemäß für die Amplifikation verwendet werden können.
Die glatten Enden werden nach Einbau von 2'-Desoxyadenosin-5'- O-(1-thiotriphosphat) (dATP[αS]) am 3'-Ende jeder Sequenz erzeugt. Es existiert eine Lücke von fünf Basenpaaren zwischen Oligonukleotiden A und B oder A' und B', wenn diese Stränge mit ihren komplementären Strängen der oben gezeigten Zielsequenz hybridisieren.
Auf ähnliche Weise sind die folgenden vier Oligodesoxyribonukleotide geeignete Sequenzen mit überhängenden Enden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. 22 Basen 22 Basen 21 Basen 21 Basen
Alle oben beschriebenen Oligodesoxyribonukleotide werden gemäß dem folgenden Verfahren synthetisiert und gereinigt.

I. Automatisierte Syntheseverfahren

Die 2-Cyanoethylphosphoramidate werden von Applied Biosystems Inc. erworben. Das Verfahren umfaßt die Kondensation von Nukleosidphosphoramiditen mit einem Nukleosid-derivatisierten Träger, 30 mg, aus Glasperlen mit kontrollierter Porengröße (controlled Pore glass bead support) (500 Å) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems Inc., Typ 380B-02. Die Zyklen umfassen die Detritylierung mit 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan, eine Kondensierung unter Verwendung von Tetrazol als aktivierendem Protonendonor, einen Schutz mit Essigsäureanhydrid und Dimethylaminopyridin, eine Oxidation des Phosphites zu Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detritylierung unter Verwendung von 2 % Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten. Die Ausbeuten bei jedem Schritt sind im wesentlichen quantitativ und werden durch Sammeln und spektroskopische Untersuchung von Dimethoxytritylalkohol, der während der Detritylierung freigesetzt wird, bestimmt.

II. Oligodesoxyribonukleotid-Schutzgruppenentfernung und Reinigungsverfahren

Der feste Träger wird aus der Säule entfernt und einem ml konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 60ºC 16 Stunden in einem geschlossenen Rohr ausgesetzt. Der Ammoniak wird entfernt und der Rückstand wird auf ein präparatives 12 %iges Polyacrylamidgel unter Verwendung von Tris-Borat-Puffer (pH 8), enthaltend 7 M Harnstoff, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt; nach dieser Zeit wird die das Produkt enthaltende Bande durch UV-Schattenbildung auf einer fluoreszierenden Platte identifiziert. Die Bande wird ausgeschnitten und mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser über Nacht bei Raumtemperatur eluiert. Diese Lösung wird filtriert und der Überstand mit n-Butanol extrahiert (3 x 300 µl). Die wäßrige Phase wird auf eine Sephadex G50-Säule (Pharmacia) (1 x 10 cm) aufgebracht. Die Elution wird durch UV-Absorption bei 260 nm überwacht und die entsprechenden Fraktionen gesammelt, durch UV- Absorption in einem fixierten Volumen quantifiziert und bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge bis zur Trockne evaporiert.

III. 5'-Phosphorylierung von A'-, B-, E'- und F-Sequenzen

Um die 5'-Enden von A', B, E' und F zu phosphorylieren, wird ein neues phosphorylierendes Reagens, beschrieben von T. Horn et al., Tetrahedron Letters 27, 4705-08 (1986), verwendet. Es werden nur die Enden der Nukleotide, die miteinander verbunden werden sollen, phosphoryliert.
Die Synthese von A', B, E' und F wird wie in "I. Automatisierte Syntheseverfahren" beschrieben, durchgeführt, aber nach dem letzten Zyklus wird das phosphorylierende Reagens
DMT-O-CH&sub2;CH&sub2;- -CH&sub2;CH&sub2;-O-P-N (iPr)&sub2; (O-CH&sub2;CH&sub2;CN)
(Glen Corp. Inc.) (DMT ist eine Dimethoxytritylgruppe; iPr ist Isopropyl) mit jeder der Sequenzen A', B, E' und F unter Verwendung von Tetrazol aus einem aktivierenden Protonendonor kondensiert, gefolgt von Schutz durch Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin, Oxidation des Phosphits zum Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detrityherung unter Verwendung von 2 % Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten.
Die 5'-phosphorylierten A', B, E' und F werden nach dem in II, oben, beschriebenen Verfahren gereinigt und quantifiziert.

Beispiel 2

Dieses Experiment veranschaulicht die Amplifizierung der 48 Basenpaarsequenz von Beispiel 1 durch Verwendung eines Satzes von zwei glattendigen Oligonukleotidkomplementpaaren, bei denen eine Lücke von fünf Basen (A, T) zwischen den Paaren existiert. Im ersten Schritt wird die Polymerase dATP[αS] einbauen, um die Komplementpaare vor der 3'-Exonukleaseaktivität von DNA-Polymerase I zu schützen und um glatte Enden zu bilden.
Die Amplifizierung der 48 Basenpaare beginnt bei Schritt 2.

Schritt 1:

50 µl, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml, 0,1 mM ATP und 0,1 mM dATP[αS] (Sigma) werden zu 60 µl einer Pufferlösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zugefügt.
Dieser Lösung werden 5 µl einer Lösung, enthaltend jeweils 100 pmol A und B' und phosphoryliertes A' und B und 0,1 pmol der 48 Basenpaare, die amplifiziert werden sollen, zugefügt. Die resultierende Lösung wird 2 Minuten auf 100ºC erhitzt, was die Trennung der Stränge und die Hybridisierung von A, A', B und B' an die Zielsequenz erlaubt. Dann werden vier Einheiten Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase-I zugefügt und die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die beiden Paare sind nun glattendig und gegen die Exonukleaseaktivität der Polymerase geschützt.

Schritt 2:

Um die verbundenen Oligonukleotidprodukte zu erzeugen und zu amplifizieren, werden die folgenden Unterschritte angewendet.
a. Füge jeweils 1 nmol dATP und TTP und 100 pmol jeweils von α-³²P-dATP und α-³²P-TTP (spezifische Aktivität 1000 cpm/pmol) zu;
b. Erwärme 2 Minuten auf 100ºC,
c. Kühle 2 Minuten auf Raumtemperatur ab,
d. Füge eine Mischung von 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzu,
e. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Der Unterschritt (a) in dem Zyklus kann weggelassen werden, wenn eine ausreichende Menge von Nukleotidtriphosphaten am Anfang anwesend ist. Der Zyklus wird 22-mal wiederholt. 2 µl Aliquots aus Zyklus 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19 und 22 werden auf ein 12 %iges Polyacrylamid-7-M-Harnstoff-Gel unter Verwendung von 0,089 M Tris-Boratpuffer, pH 8,3, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt. Das Gel wird einem empfindlichen Film (Kodak) 5 Stunden ausgesetzt.
Die resultierende Reaktionsmischung wird auf eine Sephadex G40/50-Säule (1 x 10 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Zwei unterschiedliche Peaks werden getrennt und mit einem Geigerzähler verfolgt. Der erste Peak, der nach Elution mit 5 bis 7 ml Wasser auftritt, besteht aus den amplifizierten 48 Basenpaaren, und der zweite Peak, der nach Elution mit 14 bis 18 ml Wasser auftritt, besteht aus α³²-P-dATP und α-³²P-TTP.
In diesem Beispiel werden die Schritte 1 und 2 getrennt voneinander durchgeführt. Diese beiden Schritte können jedoch in einen Schritt zusammengefaßt werden, so daß der Zyklus unmittelbar durch Verwendung einer Mischung von dATP[αS] beginnen könnte, die in Schritt 2, Unterschritt (a) des Zyklus, zugesetzt werden könnte, oder alternativ könnten die geschützten, glattendigen Paare separat hergestellt, gereinigt, quantifiziert und wie gewünscht verwendet werden.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht eine nicht-radioaktive Markierung während des erfindungsgemäßen Amplifikationsprotokolls. 100 µl Lösung, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). 5 µl einer Lösung, enthaltend jeweils 1 nmol A, A', B, B', wobei B und A' an ihren 5'-Enden phosphoryliert sind, und 10 pmol der 48 Basenpaare, wie in Beispiel 1 hergestellt, wurden zugefügt. Je 1 nmol dATP und Bio-11-dUTP (Enzo Biochem) und 100 pmol dATP[αS] wurden ebenfalls zugesetzt. Die Zahl 11 bezeichnet einen Verbindungsarm von 11 Atomen.
Die resultierende Lösung wird, wie oben beschrieben, Zyklen unterworfen, z.B. wird die Mischung 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und wird 2 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, woraufhin vier Einheiten Klenow-Fragment der E. coli -DNA-Polymerase-I und zwei Einheiten T4-DNA-Ligase zugefügt werden. Die Reaktionsmischung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zyklus wird 20-mal wiederholt, wie im vorigen Experiment beschrieben.
Die Reaktionsmischung wird dann mit 100 µl 2 M Ammoniumacetatpuffer, pH 7,5, verdünnt. Die Mischung wird in einer Verdünnungsreihe vierfach verdünnt, wobei 1 M Ammoniumacetat als Verdünnungsmittel verwendet wird. Aliquots (50 µl) der amplifizierten DNA-Lösung werden zu den Vertiefungen von Dynatech Immulon II-Mikrotiterplatten (Dynatech) mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Die Platten werden verschlossen und 90 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die amplifizierte DNA an die Platten zu binden. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen bei Raumtemperatur zweimal mit 200 µl Aliquots 0,3 M NaCl und 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0, und einmal mit 200 µl des gleichen Puffers, enthaltend 0,1 % Triton X-100, gewaschen. Die Vertiefungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Aliquots (200 µl) einer Lösung, die 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 0,5 M NaCl, 2 % BSA, 0,1 % Triton X-100 und 5 mM EDTA (Blockierungslösung) enthält, behandelt.
Nach dem Entfernen der Blockierungslösung aus den Vertiefungen werden Aliquots (50 µl) einer Lösung, die Meerrettichperoxidase-markiertes Avidin (Vektor Labs) enthält, jeder Vertiefung zugesetzt. Das Peroxidase-markierte Avidin wird in PBS, 0,1 % Triton X-100 im Einklang mit den Vorschriften des Herstellers verdünnt.
Die Platten werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit einer Lösung aus 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 0,5 M Natriumchlorid, 0,1 % Triton X-100 und 5 mM EDTA (4 x 200 µl) und dann mit PBS, enthaltend 1 mM EDTA (1 x 200 µl) gewaschen.
Die Komplexe aus DNA, biotinylierter Sonde und markiertem Avidin werden nachgewiesen, indem jeder Vertiefung 150 µl einer Substratreaktionsmischung zugesetzt werden, die 1,6 mg/ml o- Phenylendiamin (Sigma) und 0,0125 % Wasserstoffperoxid in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, eingestellt auf pH 6,0, mit 0,05 M Zitronensäurelösung, enthält. Die Platten werden 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und dann wird die Reaktion durch Zusetzen von 4 N Schwefelsäure (50 µl) beendet.
Der Inhalt der Platten wurde auf einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät (Intermed Immuno Reader NJ-2000) bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Absorption (O.D. 490) [Amplifizierte DNA] Kontrolle (a) über
(a) Kontrolle bedeutet, daß 100 pmol Bio-dUTP in den Vertiefungen unter Verwendung von Ammoniumacetat fixiert wurden.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotidkomplementpaaren mit überstehenden Enden (E, E', F und F', wie beschrieben). Die Sequenz, die zu amplifizieren gewünscht ist, ist die gleiche 48 Basenpaare-Sequenz, die in Beispiel 1 hergestellt wurde. In diesem Experiment finden der Einbau von dATP[αS], der Lückenfüllungs- und der Ligationsschritt gleichzeitig statt.
Zu 100 Mikrolitern Pufferlösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, wurden 1 mol MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml, jeweils 1,0 mikromolar dATP[αS], TTP[αS], dATP und dTTP und jeweils 100 Picomol α-³²P-dATP und α³²P-TTP (spezifische Aktivität 1000 cpm/Picomol) zugefügt.
Dieser Lösung werden 5 Mikroliter einer Lösung, enthaltend jeweils 100 Picomol E und F' und jeweils phosphoryliertes F und E' und 0,1 Picomol der zu amplifizierenden 48 Basenpaare zugefügt. Die resultierende Lösung wird 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann 2 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, was die Trennung der Stränge und die Hybridisierung des Satzes aus zwei Paaren an die Zielsequenz erlaubt. Dann werden 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und der Reaktionsansatz 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Um diesen Prozeß zyklisch zu wiederholen, werden die folgenden Schritte angewendet:
1. 3 Minuten Erwärmen auf 100ºC;
2. 2 Minuten Abkühlen auf Raumtemperatur;
3. Zufügen einer Mischung von 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase;
4. 4 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur.
Der Zyklus wird 22 mal wiederholt.
Die resultierende Reaktionsmischung wird auf eine Sephadex G40/50-Säule (1 x 10 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Zwei unterschiedliche Peaks werden getrennt und in einem Geigerzähler gemessen. Der erste Peak tritt nach Elution mit 5 bis 7 ml Wasser auf und besteht aus den amplifizierten 48 Basenpaaren, der zweite Peak tritt nach Elution mit 14 bis 18 ml Wasser auf und besteht aus α-³²P- dATP und α-³²P-TTP.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Kopplung von T4-DNA-Ligase und Polymerase-I an polymere Träger.

I. Synthese des "Linker-Armes"

1. O-(Di-p-methoxytritylhexaethylenglycol

Hexaethylenglycol (Aldrich), (28,23 g, 100 mmol) wird in trokkenem Pyridin (200 ml) gelöst und eine Dimethoxytritylchloridlösung (16,95 g, 50 mmol) in trockenem Pyridin (100 ml) wird tropfenweise unter Argon zugesetzt. Die Mischung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck (2 mm Hg) entfernt. Der ölige gelbe Rückstand wird mit Ethylacetat (300 ml) extrahiert und mit Wasser (200 ml) und Salzlösung (2 x 200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird erneut in Dichlormethan (30 ml) gelöst, das etwas Pyridin (0,5 ml) enthält. Diese Mischung wird weiter durch Säulenchromatographie auf Silicagel (5,5 x 45 cm) gereinigt und mit einer Mischung aus Dichlormethan-Methanol-Pyridin (95:4:1 Vol/Vol) eluiert. Das Produkt (23,3 g, gelbes Öl) hat einen RF = 0,42 in den oben genannten Lösungsmitteln. Die Ausbeute beträgt 80%.
NMR = 7,46-7,20 (m, 9H, aromatische Hs), 6,80 (d, J=9,0 Hz, 4H, aromatische Hs), 3,77 (s, 6H, Methoxy-Hs), 3,66, 3,63 (2s, 22H, CH&sub2;-CH&sub2;) 3,56 (t, J=5 Hz, sH, CH&sub2;-OH), 3,21 (t, J=6,0 Hz, 2H, CH&sub2;-DMT), 2,49 (weites s, 1H, OH) Massenspektrum: m/e 584 (Molekularion), 553, 507, 477, 303 (DMT-Gruppe).

2. O'-DMT-hexaethylenglycol-O-methyl-N,N-diisopropylphosophoramidit

O'-DMT-hexaethylenglycol (1) (5,84 g, 10 mmol) wird unter Argon in trockenem Dichlormethan (30 ml) gelöst. Trockenes N,N-Diisopropylethylamin (5,16 g, 40 mmol) wird zugesetzt, gefolgt von tropfenweisen Zusatz von N,N-Di-isopropyl-O-methylchlorphosphoramidit (Applied Biosystems) (1,97 g, 10 mmol). Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt, mit einer gesättigten Lösung Natriumbicarbonat (100 ml) und mit Salzlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter verringertem Druck (15 mm Hg) entfernt. Weiteres Trocknen wird durch Coevaporation mit Toluol (2 x 100 ml) und durch Lyophilisieren in trockenem Benzol erreicht.
Das Produkt (7,21 g, gelbes Öl) hat RF=0,63 in Dichlormethan- Methanol (95:5). Die Ausbeute beträgt 95%. NMR = 7,47-7,23 (m, 9H, aromatische Hs), 6,83 (d, J=9,0 Hz, 4H, aromatische Hs), 3,77 (s, 6H, Methoxy), 3,77-3,59 (weites s, 22H, O-CH&sub2;CH&sub2;-O), 3,55 (d, J-12 Hz, 3H, CH&sub3;-O-P), 3,21 (t, J=6,0 Hz, 2H, CH&sub2;-O- DMT), 1,62 (d, 2H, CH&sub3;-CH), 1,24 (d, J=7Hz, 12H). Massenspektrum 744 (Molekularion).

II. Anheften des Linker-Armes an "controlled pore glass"

"Controlled pore glass" (CPG) (Pierce) (500 Å) (1 g) mit langkettigem Alkylamin wird in ein (mittleres) Sinterglas (50 ml) gesetzt und mit trockenem Acetonitril (3 x 10 ml) unter Argon gewaschen. Dem getrockneten Gel wird eine Lösung aus 1H- Tetrazol (Aldrich) (0,5 g) in trockenem Acetonitril (12 ml) zugefügt, gefolgt vom Zusetzen einer Lösung von O'-DMT-hexaethylenglycol-O-methyl-methyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (2 g) in trockenem Acetonitril (13 ml) unter Argon. Die Reaktionsmischung wird 10 Minuten bewegt, gefolgt von Waschen mit Tetrahydrofuran (3 x 25 ml). Zu dem resultierenden Gel wird eine schützende Lösung, enthaltend Essigsäureanhydrid:Tetrahydrofuran (1:1 Vol/Vol) (10 ml) und eine Lösung von N,N-Dimethylaminopyridin (0,5 g) in Tetrahydrofuran (10 ml) zugefügt und die Mischung wird 6 Minuten geschüttelt, gefolgt von Waschschritten mit Tetrahydrofuran (3 x 20 ml). Der resultierenden Lösung wird eine Oxidationslösung, enthaltend 12 (0,1 Molar) in Tetrahydrofuran: Wasser : 2,6-Lutidin (1:0,4:1) (10 ml) zugefügt, und die Mischung wird 5 Minuten geschüttelt, gefolgt vom Waschen mit Acetonitril (3 x 20 ml). Die Messung der Beladung des Linker-Armes auf dem "controlled-pore-glass" wird durch Zufügen einer Lösung (1 ml) von para-Toluolsulfonsäure in Acetonitril (0,1 Molar) zu 10 mg des derivatisierten Trägers, gefolgt vom Messen der Absorption bei 498 nm, durchgeführt. Die Beladung beträgt 185 Mikromole des Linker-Armes pro 1 g des Trägers. Die Dimethoxytritylgruppe wird vom Träger durch eine Lösung aus Trichloressigsäure in Trichlormethan (3%) entfernt. Mit dem vorher ungeschützten Linker-Arm könnte ein neuer Linker-Arm kondensiert werden, um, wenn gewünscht, einen längeren Linker- Arm zu erhalten.

III. Aktivierung des CPG-Linker-Armes mit Tresylchlorid

Der getrocknete Träger mit Linker-Arm (1 g) wird wie oben in ein Sinterglas gesetzt und mit trockenem Aceton (3 x 50 ml) gewaschen, gefolgt vom Zusatz von trockenem Aceton (5 ml) und 20 Mikrolitern trockenen Pyridines. Der Suspension wird 1 Minute lang tropfenweise unter Schütteln Tresylchlorid (180 Mikroliter) (Fluka) zugefügt. Nach 15 Minuten Reaktion bei 0ºC wird das Gel zweimal mit den folgenden Lösungen (20 ml) gewaschen: 5 mM HCl:Aceton 30:70, 50:50 und 70:30 (Vol/Vol) und schließlich mit Wasser, 50:50 Wasser:Aceton und Aceton (jeweils 20 ml), getrocknet und in einem Trockner bis zur Verwendung gelagert.

IV. Koppeln von T4-DNA-Ligase an tresylierte CPG-Linker-Arme

40 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL) werden in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,5, enthaltend 1 mM EDTA, 50 Mikromolar ATP, 10% Glycerin bis zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern gelöst und bei 40ºC aufbewahrt. 100 mg des trockenen tresylierten CPG-Linker-Armes werden in die Enzymlösung überführt. Die resultierende Gelaufschlämmung wird bei 4ºC 16 Stunden "end-over-end" gemischt. Die restlichen reaktiven Tresylgruppen auf den Linker-Armen werden durch Zufügen von 0,1 M Dithiotreit (2 Stunden, 4ºC) entfernt. Nach dem Koppeln wird das Gel von nicht-gekoppeltem Enzym durch viermaliges Waschen in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM Dithiothreit (DTT), 0,5 M NaCl befreit, gefolgt von zweimal Waschen in 0,1 M NaAc, pH 5,0. Schließlich wird das Gel in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 10 Glycerin equilibriert und bei 4ºC gelagert.

V. Kopplung von Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase-I an tresylierte CPG-Linker-Arme

40 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (Bethesda Research Labs.) werden in 200 Mikrolitern Puffer, bestehend aus 1,5 mM ATP, 30 mM Trisacetatpuffer pH 7,9, 60 mM Natriumacetat, 10 mM Magnesiumacetat gelöst und einer lyophilisierten Mischung aus 80 Mikrogramm Poly(dA) - 20 Mikrogramm oligo(dT) zugefügt. Dieser Mischung werden 100 Milligramm des trockenen tresylierten CPG-Linker-Armes zugefügt. Die resultierende Gelaufschlämmung wird bei 4ºC 10 Stunden "end-over-end" gemischt. Restliche reaktive Tresylgruppen an den Linker-Armen werden durch Zufügen von 0,1 mM Dithiothreit (DTT) (2 Stunden, 4ºC) entfernt. Nach dem Koppeln wird das Gel von nicht-gekoppeltem Enzym durch Waschen (4 x 0,5 ml) in einem Puffer, der aus 60 mM Natriumacetat, 30 mM Trisacetat, 10 mM Magnesiumacetat pH 8,0 und 0,25 mM Dithiotreit besteht, gewaschen.
Das Gel wird schließlich in 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 10% Glycerin equilibriert und bei 4ºC gelagert.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung dieser immobilisierten Enzyme im erfindungsgemäßen Verfahren.

BEISPIEL 6

Schritt 1: Die Synthese der Chlamydia-Sequenz.

Die gewünschte Sequenz, die unter Verwendung des Lückenfüllungs/Ligationssystemes unter Verbinden der Oligonukleotide amplifiziert werden soll, ist eine 88 Basenpaarsequenz, die für ein kryptisches Plasmid aus Clamydia trachomatis kodiert. Diese besondere Sequenz ist eine vierfach wiederholte Sequenz von 22 Basenpaaren, die durch Sequenzieren des 6,5 Kilobasenplasmides erhalten worden ist, das aus Chlamydia trachomatis (Serotyp L) abgeleitet ist; das Plasmid wurde in die einmal vorhandene BamH1/Sst1-Stelle des Plasmides pUC18 insertiert. Die 6,6 kB sind unter Verwendung des Didesoxykettenterminationsverfahrens von Sänger et al., P.N.A.S., 83, 1911 (1986) sequenziert worden.
Die wiederholten 22 Basenpaare haben die folgende Sequenz:
Die Konstruktion der beiden Paare geschieht wie folgt:
Y stellt in diesem Fall Oligonukleotide A und B in den Oligonukleotidkomplementpaaren dar. Z stellt in diesem Fall Oligonukleotide A' und B' in den Oligonukleotidkomplementpaaren dar. Wenn sie an die Zielsequenz hybridisiert werden, bilden Y und Z eine Lücke von zwei komplementären Basenpaaren, A-T.
Die beiden oben beschriebenen Oligodesoxyribonukleotide werden mit dem folgenden Verfahren synthetisiert und gereinigt.

I. Automatisiertes Syntheseverfahren (gemäß Matteucci et al., J. Am. Chem. oc., 103, 31-5 (1981)).

Die 2-Cyanoethylphosphoramidite werden von Applied Biosystems Inc. erworben. Das Verfahren umfaßt die Kondensation von Nukleosidphosphoramiditen mit Nukleosid-derivatisierten "controlled pore glass"-Perlen-Träger (500 Å), 30 mg, unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems Inc., Typ 380B-02. Die Zyklen umfassen eine Detritylierung mit 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan; eine Kondensation unter Verwendung von Tetrazol als einem aktivierenden Protonendonor, das Schützen mit Essigsäureanhydrid und Dimethylaminopyridin und die Oxidation des Phosphites zum Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detritylierung unter Verwendung von 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten. Die Ausbeuten in jeder Stufe sind im wesentlichen quantitativ und werden durch Sammeln und spektroskopische Untersuchung des Dimethoxytritylalkoholes, der während der Detritylierung freigesetzt wurde, bestimmt.

II. Oligodesoxyribonukleotid-Schutzgruppenentfernung und Reinigungsverfahren.

Der feste Träger wird von der Säule entfernt und 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid 16 Stunden bei 60ºC in einem geschlossenen Rohr ausgesetzt. Der Ammoniak wird entfernt und der Rückstand auf ein präparatives 12%-iges Polyacrylamidgel unter Verwendung von Tris-Borat-Puffer (pH 8), enthaltend 7 M Harnstoff, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt; nach dieser Zeit wird die das Produkt enthaltende Bande durch UV-Schattenbildung auf einer fluoreszierenden Platte identifiziert. Die Bande wird ausgeschnitten und mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser über Nacht bei Raumtemperatur eluiert. Diese Lösung wird filtriert und der Überstand mit n-Butanol extrahiert (3 x 300 Mikroliter). Die Wasserphase wird auf eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia) (1 x 10 cm) aufgetragen. Die Elutionen werden durch Verfolgen der UV- Absorption bei 260 nm überprüft und die geeigneten Fraktionen gesammelt, durch UV-Absorption in einem fixierten Volumen quantifiziert und bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge zur Trockne evaporiert.

III. 5'-Phosphorylierung von A, B, A' und B'

Die Oligodesoxyribonukleotide Y und Z (jeweils 5 Nanomol) werden getrennt zur Trockne lyophilisiert und in (50 Mikroliter) 50 nM HEPES (Aldrich) pH 7,6, 10 nM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiotreit und [³²P]-ATP (10 nM) aufgelöst. Spezifische Aktivität = 2,5 x 10³ cpm/pmol. Jedes Röhrchen wird mit 2 Einheiten T4-Polynukleotidkinase 40 Minuten bei 37ºC inkubiert, 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, auf eine Sephadex-G50-Säule aufgetragen und mit Wasser eluiert. Die Eluate werden mit einem Gammazähler (Beckman) überwacht und zur Trockne lyophilisiert.

BEISPIEL 7

I. Reinigung von Chlamydien-DNA

Chlamydia trachomatis Stamm LGV2 wird in McCoy-Zellen in Gegenwart von 1 Mikrogramm Cycloheximid/ml bis zu ungefähr 1,0 IFU (inclusion forming unit - Einschlußkörper bildende Einheiten) pro Zelle wachsengelassen. Die Zellen werden 3 Tage wachsengelassen; nach dieser Zeit zeigen 80 bis 90% der Zellen sichtbare Einschlüsse und werden geerntet und, bis sie getestet werden, bei -70ºC gelagert. Die mikrobiellen Kontrollstämme werden durch Routineisolierungen erhalten (Department of Microbiology, Ben-Gurion Universitat) und mit üblichen Verfahren (Lennette et al., Manual of Clinical Microbiology, 3. Auflage, Washington (1980)) identifiziert. Die Stämme umfassen E. coli- und Streptococcus agalactiae-Isolate.
Die mikrobiellen Stämme werden auf Platten oder auf flüssigem Medium wachsengelassen. Für den Test wird eine Suspension jeder Mikrobe bei alkalischem pH gekocht (0,3 M NaOH), auf Eis gekühlt und mit HCl neutralisiert.
Die Ernten von 100 ml Chlamydien-Zellkulturen werden mit einem Glas-Teflon-Homogenisator aufgebrochen und 5 Minuten bei 1400 g zentrifugiert, um den Zelldebris zu entfernen. Der Überstand wird auf 30% (Vol/Vol) Renographin-76 (E.R. Squibb, Princeton, USA), verdünnt mit 20 mM Tris-150 mM HCl (THCl) (pH 7,5) aufgetragen; Renographin-76 ist eine Lösung aus Diatrizoatmeglumin und Diatrizoatnatrium in Citratpuffer. Nach 45 Minuten Zentrifugation bei 50000 x g wurden die Niederschläge in 1,0 ml THCl resuspendiert, auf 30 bis 60% (Vol/Vol) Renographin-76-Gradienten in THCl aufgetragen und 2 Stunden bei 50000 x g zentrifugiert.
Im mittleren Bereich des Gradienten sind zwei diffuse Banden sichtbar; diese Fraktionen werden gesammelt, mit THCl verdünnt und 45 Minuten bei 50000 x g zentrifugiert. Die Niederschläge werden in 0,5 ml THCl gelöst.

II. DNA-Extraktion

Das folgende Verfahren beruht auf einem von Wenman et al. (Nature, 296:68-70 (1982)) beschriebenen Verfahren.
Die Chlamydien-Suspension wird vor Zusetzen von 50 mM Tris, enthaltend 20 mM Na&sub2;/EDTA, 20% (Gew./Vol.) Saccharose, 0,7 (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 200 Mikrogramm Proteinase K homogenisiert. Die Mischung wird 15 Minuten bei 55ºC inkubiert und dann 45 Minuten bei 37ºC. Ein gleiches Volumen von Phenol/Chloroform wird zugefügt und die Mischung heftig gemischt und 10 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. Die Nukleinsäuren werden aus der wäßrigen Phase durch Zusetzen von 1/20 Volumen 5 M NaCl und 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Nach zwei weiteren Zyklen aus Zentrifugation und Präzipitation wird die DNA spektrophotometrisch gemessen, einmal mehr präzipitiert und in 10 mM Tris mit 1 mM EDTA (pH 7,0) bei einer Konzentration von 200 Mikrogramm/ml wieder aufgelöst.
Die DNA wird in Mengen von 4 bis 10 Mikrogramm bei einer Konzentration von 80 Mikrogramm/ml mit 4 Einheiten BamH1 (B1) pro Mikrogramm DNA 2 bis 3 Stunden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen abgebaut.

BEISPIEL 8

Diese Beispiel veranschaulicht die Lückenfüllungs/Ligations/Amplifikationsschritte unter Verwendung immobilisierter Enzyme und der in Abbildung 3 gezeigten Vorrichtung.
Eine Mischung aus Polymerperlen 1 (10 mg Perlen) der CPG-T&sub4;- DNA-Ligase aus Beispiel 12(5).IV und 10 mg Perlen des CPG- Klenow-Fragmentes von E. coli DNA-Polymerase-I aus Beispiel 5.V werden in Plastikzylinder 2 (inneres Volumen ca. 0,5 ml) gesetzt, wobei die Ränder des Zylinders 2 Kunststoffdeckel 3a, 3b mit einer Zuleitung 4 und einer Auslaßöffnung 5 enthalten, die mit dem Plastikrohr 6, 7 verbunden ist. Der Boden von Zylinder 2 ist mit silikonisierter Glaswolle 8 gefüllt, die die Perlen 1 hält.
Die Zuleitung 4 und der Auslaß 5 sind an Kunststoffrohre 6 und 7 angeheftet, wobei diese einen Durchmesser von 0,5 mm haben. Das Kunststoffrohr 7 ist mit der Spirale 9 aus rostfreiem Stahl verbunden, die in ein heißes Ölbad 10 eingetaucht ist, das Silikonöl von 90ºC enthält. Die rostfreie Stahlspirale 9 ist über das Rohr 11 mit einer zweiten rostfreien Stahlspirale 12 verbunden. Die Spirale 12 ist im Wasserbad 13 eingetaucht, das bei Raumtemperatur gehalten wird. Die Spiralen 9 und 12 haben ebenfalls einen Durchmesser von 0,5 mm. Die Spirale 12 ist mit dem Plastikrohr 14, das einen Durchmesser von 0,5 mm hat, verbunden. Das Rohr 14 ist mit der peristaltischen Pumpe 15 verbunden und führt anschließend durch den Auslaß 4 zur Zelle 2. Die Pumpe drückt die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 2 Tropfen pro Minute durch das System.

Stufe 1. Schutz der Y und Z Oligonukleotide vor der 3'-5'- Exonukleaseaktivität der DNA-Polvmerase-I und zum Bilden glatter Enden

Je 100 Picomol der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide Y und Z werden miteinander gemischt und in 1 Milliliter 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,1 mM dATP[αSl und TTP[αS] (Sigma) gelöst.
Die resultierende Lösung wird 2 Minuten auf 100ºC erwärmt, was die Strangtrennung und die Hybridisierung von Y und Z auf die Zielsequenz erlaubt. Dann werden 5 Einheiten des Klenow- Fragmentes der E. coli DNA-Polymerase-I zugefügt und die Reaktion wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Paare sind nun glattendig und gegen die Exonukleaseaktivitäten der Polymerase geschützt.
Schritt 2. 1 Mikrogramm der mit BamHI abgebauten DNA aus Beispiel 7.II oben wird in dem aus Schritt 1 resultierenden Puffer gelöst. Diesem Puffer wird 1 Nanomol dATP und TTP und je 100 pmol α-³²P[dATP] und α-³²P[TTP] zugefügt. Die spezifische Aktivität beträgt 1000 cpm/Picomol.
Diese Lösung wird durch die Zuleitung 4 der Vorrichtung injiziert und der Zyklus wird durch Inbetriebnahme der peristaltischen Pumpe 15 gestartet.
Nach 3 Stunden Zyklisieren der Lösung durch die Zelle 2, die die immobilisierten Enzyme enthält, wird die Lösung auf eine Sephadex-G-40/50-Säule (1 x 10 cm) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt und mit einem Geigerzähler überprüft.
Zwei getrennte Banden werden nachgewiesen, wobei die erste in einem Pool von 4-7 ml, der mittels des Lückenfüllungs/Ligationsverfahrens erhaltene markierte amplifizierte verbundene Oligonukleotidprodukte enthält, eluiert. Dieser Pool hat ungefähr 115000 cpm, während der zweite Pool, der bei 14-17 ml eluiert, 80000 cpm hat.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von mindestens einer spezifischen Nukleinsäurezielsequenz oder einem Teil davon durch Amplifizierender Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die Zielsequenz(en) enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Behandeln der Probe mit mindestens zwei Oligonukleotiden für jeden Strang einer Zielsequenz unter Hybridisierungsbedingungen,

(i) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß sie jedem Strang der Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon ausreichend komplementär sind, um damit zu hybridisieren; und

(ii) wobei eine Lücke von einer oder mehreren Basen zwischen den Oligonukleotiden vorhanden ist, wenn die Oligonukleotide mit der (den) Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon hybridisiert werden; und

(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß das Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als alle vier Basen erfordert;

(b) Auffüllen der in Schritt (a) gebildeten Lücke mit einer oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der Lücke komplementär sind, und Verbinden der Base oder Basen, die die Lücke füllen, miteinander und mit den beiden benachbarten hybridisierten Oligonukleotiden, wodurch ein verbundenes Oligonukleotidprodukt gebildet wird;

(c) Behandeln des hybridisierten verbundenen Oligonukleotidproduktes aus Schritt (b) unter denaturierenden Bedingungen, um das verbundene Oligonukleotidprodukt (die verbundenen Oligonukleotidprodukte) von der (den) Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon zu trennen, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen;

(d) Behandeln der in Schritt (c) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaaren unter hybridisierenden Bedingungen,

(i) wobei jedes Oligonukleotidkomplementpaar zwei Oligonukleotide umfaßt, die so ausgewählt sind, daß sie ausreichend komplementär zueinander, zu jedem Strang der Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon und zu den verbundenen Oligonukleotidprodukt(en) oder einem Teil (Teilen) davon sind, um damit zu hybridisieren; und

(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß zum Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als alle vier Basen erforderlich sind;

(e) Auffüllen der in Schritt (d) gebildeten Lücke mit einer oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der Lücke komplementär sind, und Verbinden der Basen, die die Lücke füllen, miteinander und mit den beiden benachbarten hybridisierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotidkomplementpaaren, wodurch ein zusätzliches verbundenes Oligonukleotidprodukt (Oligonukleotidprodukte) gebildet wird (werden), was zu einer Amplifikation der Zielsequenz(en) oder eines Teiles (von Teilen) davon führt; und

(f) Nachweisen des verbundenen Oligonukleotidproduktes (der Oligonukleotidprodukte).

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt

(e') des Behandelns der hybridisierten Oligonukleotide aus Schritt (e) unter denaturierenden Bedingungen, um die hybridisierten Oligonukleotide zu trennen und einzelsträngige Moleküle zu erzeugen, wobei die Schritte (d), (e) und (e') eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidzielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon doppelsträngige DNA ist (sind) und ihre Stränge vor oder während Schritt (a) getrennt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon einzelsträngige DNA oder RNA ist (sind).

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotide Oligodesoxyribonukleotide sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Oligonukleotidkomplementpaare in einem molaren Überschuß im Bereich von 10&sup5; bis 10¹&sup5; Paare pro Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon vorhanden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lücke durch katalytische Mittel gefüllt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die katalytischen Mittel eine Kombination sind, die eine DNA-Polymerase und eine DNA- Ligase umfassen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die katalytischen Mittel auf polymeren Trägern immobilisiert sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow- Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase, reverser Transkriptase besteht und die Ligase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Ligase oder T4-DNA-Ligase besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polymerase und Ligase wärmestabil sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die wärmestabile Polymerase und Ligase aus einem thermophilen Bakterium isoliert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Probenmischung in den Schritten (a) und (d) Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Oligonukleotide und/oder Desoxyribonukleotidtriphosphate modifiziert sind, um gegen 3' T 5'-Exonukleaseaktivität resistent zu sein.

15. Verfahren zum Amplifizieren mindestens einer spezifischen Nukleinsäurezielsequenz oder eines Teiles davon in einer Probe, die eine Nukleinsäure oder eine Mischung von Nukleinsäuren enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(c) Behandeln der hybridisierten Oligonukleotidprodukte aus Schritt (b) unter denaturierenden Bedingungen, um das verbundene Oligonukleotidprodukt (die verbundenen Oligonukleotidprodukte) von der (den) Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon zu trennen, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen;

(d) Behandeln der in Schritt (c) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaaren,

(e) Auffüllen der in Schritt (d) gebildeten Lücke mit einer oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der Lücke komplementär sind, und Verbinden der Basen, die die Lücke füllen, miteinander und mit den beiden benachbarten hybridisierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotidkomplementpaaren, wodurch ein zusätzliches verbundenes Oligonukleotidprodukt (Oligonukleotidprodukte) gebildet wird (werden), was zu einer Amplifikation der Zielsequenz(en) oder eines Teiles (von Teilen) davon führt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend den Schritt

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon doppelsträngige DNA ist (sind) und ihre Stränge vor oder während Schritt (a) getrennt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon einzelsträngige DNA oder RNA ist (sind).

19. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Oligonukleotide Oligodesoxyribonukleotide sind.

20. Verfahren nach Anspruch 15, wobei Oligonukleotidkomplementpaare als molarer Überschuß im Bereich von 10&sup5; bis 10¹&sup5; Paaren pro Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon vorliegen.

21. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Lücke durch katalytische Mittel gefüllt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die katalytischen Mittel eine Kombination sind, die eine DNA-Polymerase und eine DNA- Ligase umfassen.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die katalytischen Mittel auf polymeren Trägern immobilisiert sind.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow- Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase, reverser Transkriptase besteht und die Ligase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Ligase und T4-DNA-Ligase besteht.

25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Polymerase und Ligase wärmestabil sind.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die wärmestabile Polymerase und Ligase aus einem thermophilen Bakterium isoliert werden.

27. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Probenmischung in den Schritten (a) und (d) Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt werden.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Oligonukleotide und/oder Desoxyribonukleotidtriphosphate modifiziert sind, um gegen 3' T 5'-Exonukleaseaktivität resistent zu sein.

29. Kit zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von mindestens einer spezifischen Nukleinsäurezielsequenz oder einem Teil (Teilen) davon in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die Zielsequenz(en) enthält, gemäß dem Verfahren von Anspruch 1, umfassend:

mindestens einen Behälter, der mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaare enthält, wobei ein Oligonukleotidkomplementpaar zwei Oligonukleotide umfaßt, die so ausgewählt sind, daß sie ausreichend komplementär zueinander und zu jedem Strang der Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon sind, um damit zu hybridisieren;

ein Mittel zum Mischen der Probe mit den Oligonukleotidkomplementpaaren unter Hybridisierungsbedingungen;

ein Mittel zum Verbinden eines Oligonukleotides von einem ersten Oligonukleotidkomplementpaar mit einem Oligonukleotid von einem zweiten Oligonukleotidkomplementpaar, wenn beide Oligonukleotide an den gleichen Strang einer Nukleinsäure hybridisiert sind, um ein verbundenes Oligonukleotidprodukt zu bilden, nachdem die Probe und die Oligonukleotidkomplementpaare gemischt sind, wobei das Mittel zum Verbinden des Oligonukleotids aus dem ersten Oligonukleotidkomplementpaar mit dem Oligonukleotid aus dem zweiten Komplementpaar eine DNA-Polymerase, eine DNA- Ligase und Desoxyribonukleotidtriphosphate umfaßt;

und ein Mittel zum Nachweisen der verbundenen Oligonukleotidprodukte.

30. Kit nach Anspruch 29, weiter umfassend einen Behälter, der eine positive Kontrolle für die Oligonukleotidkomplementpaare enthält, die die spezifischen Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einen Teil (Teile) davon enthält; und

einen Behälter, der eine negative Kontrolle für die Oligonukleotidkomplementpaare enthält, die nicht die spezifischen Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einen Teil (Teile) davon enthält.

31. Kit nach Anspruch 29, wobei die Oligonukleotide Oligodesoxyribonukleotide sind.

32. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow- Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase, reverser Transkriptase besteht und die DNA-Ligase ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus E. coli-DNA-Ligase und T4-DNA-Ligase besteht.

33. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase und DNA- Ligase wärmestabil sind.

34. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase und DNA- Ligase auf polymeren Trägern immobilisiert sind.

35. Kit nach Anspruch 29, wobei die Desoxyribonukleotidtriphosphate markiert sind.

36. Kit nach Anspruch 29, wobei das Mittel zum Nachweisen des verbundenen Oligonukleotidproduktes die markierten Desoxyribonukleotidtriphosphate nachweist.