DE68926504T2 - Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen - Google Patents
Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzenInfo
- Publication number
- DE68926504T2 DE68926504T2 DE68926504T DE68926504T DE68926504T2 DE 68926504 T2 DE68926504 T2 DE 68926504T2 DE 68926504 T DE68926504 T DE 68926504T DE 68926504 T DE68926504 T DE 68926504T DE 68926504 T2 DE68926504 T2 DE 68926504T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- oligonucleotides
- target sequence
- nucleic acid
- bases
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 92
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 177
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 91
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 37
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 31
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 25
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 22
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 14
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 11
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 15
- 108091069025 single-strand RNA Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 18
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 101710200526 DNA polymerase 2 Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- CCPIKNHZOWQALM-DLQJRSQOSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=S)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CCPIKNHZOWQALM-DLQJRSQOSA-N 0.000 description 2
- IYKNGWWPNRDDHK-ONEGZZNKSA-N [[5-[2,4-dioxo-5-[(e)-3-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]prop-1-enyl]pyrimidin-1-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)CC1N1C(=O)NC(=O)C(\C=C\CNC(=O)CCCCC2C3NC(=O)NC3CS2)=C1 IYKNGWWPNRDDHK-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEKHORVJMXDXNE-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidic acid Chemical class NP(O)(=O)OCCC#N VEKHORVJMXDXNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical class NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- PXHHTOSRELKWOE-MXWQNOQOSA-N [hydroxy-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=S)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 PXHHTOSRELKWOE-MXWQNOQOSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol Chemical compound OC.ClCCl WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUEQTAOZRRATBS-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol;pyridine Chemical compound OC.ClCCl.C1=CC=NC=C1 MUEQTAOZRRATBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren und Nachweisen von bestehenden Nukleinsäuresequenzen, wenn sie in einer Testprobe vorhanden sind. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zum Erzeugen jeder besonderen Nukleinsäuresequenz einer gegebenen DNA- oder RNA- Sequenz in Mengen, die im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Menge groß sind. Die DNA oder RNA kann einzel- oder doppelsträngig sein und kann eine relative reine Species oder ein Bestandteil einer Mischung von Nukleinsäuren sein. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet eine sich wiederholende Reaktion, um die Amplifizierung der gewünschten Nukleinsäuresequenz zu bewirken.
- Insbesondere für diagnostische Anwendungen kann die Zielnukleinsäuresequenz nur ein ganz geringer Teil des gesamten DNA- oder RNA-Pools in einer Probe sein, die durchmustert werden soll, so daß es schwierig sein kann, die Anwesenheit der Zielnukleinsäuresequenz unter Verwendung nicht-Isotopenmarkierter oder End-markierter Oligonukleotidsonden nachzuweisen. Diagnostische Tests, die DNA-Sonden zum Nachweis seltener Nukleinsäurespecies verwenden, sind daher für eine praktische Verwendung außerhalb des Forschungslabors oft nicht empfindlich genug.
- Ein Ansatz, das Empfindlichkeitsproblem zu überwinden, ist das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR), das in den US-Patenten Nrn. 4 683 195 und 4 683 202 (den Patenten '195 und '202) beschrieben ist. Dieses Verfahren verläuft im wesentlichen wie folgt:
- a) Behandeln einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die interessierende Zielnukleinsäuresequenz enthält, mit einem Oligonukleotidprimer für jeden Strang der Zielnukleinsäuresequenz unter Hybridisierungsbedingungen und in Gegenwart einer Polymerase, z.B. des Klenow-Fragmentes der Escherichia coli-DNA-Polymerase I, so daß ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, wenn die Zielnukleinsäuresequnz vorhanden ist;
- b) Anwenden von denaturierenden Bedingungen auf die Probe nach Schritt (a), um jedes Primer-Verlängerungsprodukt, das synthetisiert worden ist, von der Matrize, an der es synthetisiert worden ist, zu trennen, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen;
- c) Behandeln der in Schritt (b) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern aus Schritt (a) unter den Bedingungen von (a), so daß die neuen Primer-Verlängerungsprodukte unter Verwendung sowohl von ursprünglichen Zielsequenzen als auch von Primer-Verlängerungsprodukten, die in Schritt (a) erzeugt worden sind, als Matrizen synthetisiert werden, was zu einer Amplifizierung der Zielnukleinsäuresequenz führt.
- Die Schritte (a) bis (c) können aufeinander folgend oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zusätzlich können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Amplifikation der Sequenz erhalten ist. Wie in den US-Patenten Nrn. 4 683 195 und 4 683 202 diskutiert wird, kann das Produkt des Schrittes (c) unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden.
- Das PCR-Verfahren hat den Nachteil, daß es das Empfindlichkeitsproblem nicht vollständig löst. Das PCR-Verfahren verwendet alle vier Nukleotidbasen, um die Primer-Fragmente zu verlängern. Daher können die Verlängerungsprodukte von anderen, nicht-Zielnukleinsäurematrizen erzeugt werden, die in der Probe vorhanden sind, beispielsweise doppelsträngige DNA mit Einzelstrangbrüchen. Die Verwendung des PCR-Verfahrens führt zu einem erheblichen Hintergrund von amplifizierter DNA, die von der Zielsequenz bzw. den Zielsequenzen verschieden ist.
- Wie später im einzelnen erklärt wird, verwendet die vorliegende Erfindung mindestens zwei Oligonukleotide für jeden Strang der Zielnukleinsäuresequenz und verwendet weniger als alle vier Basen, was das Problem der unspezifischen Hintergrundamplifikation aus einer Anzahl von Gründen vermindert. Beispielsweise wird, wenn markierte Nukleotide verwendet werden, die Lücke mit markierten Nukleotiden gefüllt, wenn die Nukleinsäurezielsequenz in der Probe vorhanden ist, und irrelevante Sequenzen werden nicht kopiert oder markiert.
- Das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren erfordert außerdem hitzestabile Enzyme, um das Verfahren zu automatisieren, während das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit von der jeweiligen Ausführungsform unter Verwendung hitzelabiler Enzyme oder überhaupt ohne Enzyme durchgeführt werden kann. Zusätzlich erfordert der Nachweis amplifizierter Nukleinsäuresequenzen, die im PCR-Verfahren erzeugt werden, auch die Verwendung von Gelen oder eines Einfangsystemes, was mühsame Nachweisverfahren sind. Im Gegensatz dazu ist der Nachweis amplifizierter Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung relativ einfach. Beispielsweise kann zur Trennung der miteinander verbundenen Oligonukleotidprodukte, die gebildet werden, wenn die Zielsequenz vorhanden ist, von den einzelnen Nukleotiden eine Sephadex- Säule verwendet werden. Die europäische Patentanmeldung 0 246 864 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure, wobei das Verfahren die Hybridisierung von zwei Nukleinsäuresondenmolekülen an den Nukleinsäurezielstrang involviert, wobei die Nukleinsäuresondenmoleküle so beschaffen sind, daß sie nach Hybridisierung auf eine Weise benachbart sind, daß die Lücke zwischen den Sondenmolekulen durch eine zielgerichtete Polymerisation der Lücke gefüllt werden kann, beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase, mit anschließender Verbindung, beispielsweise durch DNA-Ligase.
- Zum Erzeugen von großen Mengen von Nukleinsäuren aus ursprünglich kleinen Mengen gibt es neben dem PCR-Verfahren weitere Verfahren. Beispielsweise gibt es das Verfahren der Subklonierung einer Nukleinsäure in einem entsprechenden Wirtssystem, wo die gewünschte Nukleinsäure in einen geeigneten Vektor insertiert wird, der zur Transformation des Wirtes verwendet wird. Wenn der Wirt kultiviert wird, wird der Vektor repliziert und daher mehr Kopien der gewünschten Nukleinsäure erzeugt. Für eine kurze Beschreibung der Subklonierung von Nukleinsäurefragmenten siehe Maniatis, T., et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 390-401 (1982). Siehe außerdem die in den US-Patenten Nrn. 4 416 988 und 4 403 036 beschriebenen Verfahren.
- Weitere Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäuren umfassen die organische Synthese einer Nukleinsäure aus Nukleotidderivaten, beispielsweise die in dem US-Patent Nr. 4 356 270 beschriebenen Verfahren. Ein weiteres Beispiel eines Verfahrens zum Synthetisieren von Nukleinsäure wird in dem US-Patent Nr. 4 293 652 zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren ein Hybrid aus organischer Synthese und molekularer Klonierung darstellt. Die Diskussion dieses und anderer Verfahren in den Patenten '195 und '202 sowie die zuvor aufgeführten Patente werden hier durch Verweis einbezogen.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Zielnukleinsäuresequenzen, die in einer Probe vorhanden sind.
- In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Amplifizierung erreicht, indem zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare verwendet werden, wobei mindestens ein Strang dieser Oligonukleotidpaare eine Nukleotidsequenz hat, die zu mindestens einem Teil der Zielsequenz komplementär ist. Die Oligonukleotide werden so ausgewählt, daß es eine Lücke von mindestens einer Base gibt, wenn die komplementären Stränge der "Oligonukleotidkomplementpaare" und die Zielnukleotide miteinander hybridisiert werden. Die Lücke zwischen den Oligonukleotidkomplementsequenzen wird durch eine Mischung aus Polymerase und Ligase, die ein Oligonukleotidreparaturprodukt erzeugen, gefüllt. Die resultierende Mischung hybridisierter Moleküle wird dann denaturierenden Bedingungen ausgesetzt.
- Nachdem die Stränge sich während der Denaturierung trennen, kann das ligierte Oligonukleotidprodukt an dazu komplementäre Stränge aus anderen Oligonukleotidkomplementpaaren hybridisieren, und dann wird die Lücke erneut geschlossen. Dieses Verfahren wird so oft wie notwendig wiederholt, um die gewünschte Menge an Oligonukleotidreparaturprodukten zu erzeugen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Enzyme auf einem polymeren Träger immobilisiert.
- Das vorliegende Verfahren ist insbesondere zum Amplifizieren von Sequenzen nützlich, die eine genetische Erkrankung anzeigen, und für seltene Species von Nukleinsäuren, die in einer Nukleinsäuremischung vorhanden sind, und erlaubt weiter den wirksamen Nachweis solcher Nukleinsäuresequenzen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Amplifizieren mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe einer Nukleinsäure oder einer Mischung von Nukleinsäuren zur Verfügung. Jede Nukleinsäurezielsequenz könnte aus einem Strang (RNA) oder zwei getrennten komplementären Strängen (DNA) gleicher oder ungleicher Länge bestehen.
- Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
- a) Behandeln der Probe mit Oligonukleotidkomplementpaaren A, A' und B, B' unter Hybridisierungsbedingungen und Bedingungen zum Füllen der Lücke. A ist ein Oligonukleotid und A' ist ein Oligonukleotid, das zu A komplementär ist. B ist ein Oligonukleotid und B' ist ein Oligonukleotid, das zu B komplementär ist. Wenn die Sätze der beiden Paare, A, A' und B, B', mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden, bilden A und B, die mit einem Strang der Zielsequenz hybridisieren, eine Lücke von einer oder mehreren Basen zwischen sich. A' und B' formen ebenso eine Lücke von einer oder mehreren Base zwischen sich. Die Lücke wird mit einer oder mehreren markierten oder unmarkierten Basen so gefüllt, daß A und B zu einem Strang mit einer kontinuierlichen Basensequenz mit einer oder mehreren markierten oder unmarkierten Extrabasen (A-Q-B) werden, wobei Q die Base(n) ist (sind), die die Lücke füllt (füllen). Q könnte ebenso eine Base sein, die so modifiziert ist, daß sie gegenüber einem von der 3' T 5'-Exonukleaseaktivität der zum Füllen der Lücke verwendeten Polymerase verursachten Abbau resistent ist. Ebenso sind A' und B' nun ein Strang mit einer kontinuierlichen Basensequenz mit einer oder mehreren, markierten oder unmarkierten Extrabasen, (A'-Q'-B'), wobei Q' eine Base ist oder mehrere Basen sind, die die Lücke füllt (füllen). Q' könnte auf gleiche Weise eine modifizierte Base sein, die gegen einen von der 3',5'-Exonukleaseaktivität der Polymerase verursachten Abbau resistent ist. In jeder kontinuierlichen Basensequenz A-Q-B oder A'-Q'-B' können Q oder Q' aus nur einem Satz von Basenpaaren für jede spezifische Sequenz zusammengesetzt sein, d.h. A-T, A-U, G-C oder Derivate dieser Basen. A-Q-B und A'-Q'-B' sind nun miteinander verbundene Oligonukleotidprodukte und können als Zielsequenzen für andere Oligonukleotidkomplementpaare dienen. Wenn das verbundene Oligonukleotidprodukt durch dieses lückenfüllende, ligierende Verfahren gebildet wird, wird als ein "Oligonukleotidreparaturprodukt" bezeichnet.
- b) Behandeln der Probe unter denaturierenden Bedingungen, um die Oligonukleotidreparaturprodukte von ihren Zielsequenzen zu trennen, wenn die Nukleinsäurezielsequenz(en) vorhanden ist (sind).
- c) Behandeln der Probe wie in Schritt (a) mit den Oligonukleotidkomplementpaaren A, A' und B, B' unter Hybridisierungsbedingungen und Bedingungen zum Füllen der Lücke, so daß ein Oligonukleotidreparaturprodukt erhalten wird, wobei jeder der in Schritt (b) erzeugten Einzelstränge verwendet wird, was zur Amplifikation der Nukleinsäurezielsequenz(en) führt, wenn diese vorhanden ist (sind).
- Die Schritte können aufeinander folgend oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zusätzlich können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Sequenzamplifizierung erreicht ist.
- Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zum Nachweis der amplifizierten spezifischen Nukleinsäuresequenz und auf diagnostische Kits, die dafür verwendbar sind.
- Abb. 1 zeigt eine 48 Basenpaare lange Sequenz aus dem HIV-GAG- Bereich, deren Amplifizierung gewünscht wird. Die Basenpaare, die die Lücke füllen, sind über und unter den 48 Basenpaaren gezeigt.
- Abb. 2 zeigt ein 12 % Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gel, in dem jede Spur aus einem Zyklus besteht, der umfaßt: das Kochen der Mischung von humanen Immundefizienzvirus-(HIV)-Plasmidzielsequenzen mit markierten Oligonukleotiden, die an photoreaktive Verbindungen angeheftet sind, rasches Abkühlen der Mischung auf 37ºC und Bestrahlen der Mischung für 5 Minuten.
- Abb. 3 zeigt eine Vorrichtung zum Durchführen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die verwendeten Enzyme auf einem polymeren Träger immobilisiert werden.
- Der Ausdruck "Oligonukleotid", so wie er hier verwendet wird, ist definiert als ein Molekül, das drei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfaßt, bevorzugt mehr als fünf.
- Der Ausdruck "glattes Ende" ist definiert als zwei Oligonukleotide, die einander komplementäre Sequenzen haben und mindestens ein Ende mit gleicher Länge, wenn sie miteinander hybridisiert werden.
- Ein "überstehendes Ende", so wie es in dieser Anmeldung definiert ist, bezeichnet zwei Oligonukleotide, die einander komplementäre Sequenzen haben und mindestens ein Ende ungleicher Länge haben, wenn sie miteinander hybridisiert werden. Die Kategorien der glatten und überstehenden Enden sind unten veranschaulicht.
- Der Ausdruck "zwei Oligonukleotidkomplementpaare" umfaßt mindestens vier verschiedene Oligonukleotide, die beispielsweise mit A, A' und B, B' bezeichnet werden, wobei das Oligonukleotid A eine Basensequenz hat, die A' komplementär ist, und das Oligonukleotid B hat eine Basensequenz, die B' komplementär ist. Jedes Paar kann gleiche oder ungleiche Länge haben, was wie folgt veranschaulicht wird:
- Zwei Oligonukleotidkomplementpaare mit einem überhängenden Ende an einem Ende jedes Paares sind als die die Sammlung erfindungsgemäßer amplifizierter Oligonukleotide bildenden Basen bevorzugt. Es versteht sich von selbst, daß mehr als zwei Oligonukleotidpaare im erfindungsgemäben Verfahren verwendet werden könnten.
- Der Ausdruck "Lücke", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Abwesenheit einer oder mehrerer Basen zwischen A und B, E und F, oder zwischen A' und B', E' und F'. Wenn mehr als zwei Paare verwendet werden, dann kann mehr als eine Lücke vorhanden sein. Die Lücke wird erzeugt, wenn die Paare mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden, beispielsweise: Zeile 1: Zeile 2: (die Lücke)
- Zeile 1 ist die Sequenz der Nukleinsäurezielsequenz und Zeile 2 stellt die Oligonukleotidkomplementpaare A' und B' dar, wie sie mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisieren. Wenn die Zielsequenz doppelsträngig ist, werden die Oligonukleotide A und B ein Hybrid mit der Sequenz bilden, die der oben in Zeile 1 gezeigten Zielsequenz komplementär ist.
- In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Amplifizieren von Nukleinsäuresequenzen werden mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaare mit der Probe, von der angenommen wird oder bekannt ist, daß sie die interessierende Nukleinsäurezielsequenz enthält, unter hybridisierenden Bedingungen zusammengebracht. Die Oligonukleotidkomplementpaare werden so ausgewählt, daß eine Lücke in der Nukleotidsequenz von mindestens einer Base zwischen den beiden Komplementen ist, wenn die beiden Komplemente mit der Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert werden. Die Lücke wird dann gefüllt und die beiden Oligonukleotide miteinander ligiert, wodurch ein Oligonukleotidreparaturprodukt erzeugt wird. Das Verfahren des Füllens der Lücke einschließlich der Ligation ist der Reparatur fehlgepaarter Basen und anderer Fehler, die während der DNA-Replikation, der Reparatur von UV-Schäden und anderen Prozessen in vivo auftritt, analog. Die Nukleinsäurezielsequenz und die Oligonukleotidreparaturproduktsequenz können dann getrennt werden und das Verfahren immer wieder wiederholt werden, bis der gewünschte Amplifikationsgrad erreicht worden ist. Um das Problem einer Hintergrundsynthese, die während des Lückenfüllschrittes auftritt, zu vermeiden, werden die zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare so ausgewählt, daß das Füllen der Lücken zwischen ihnen weniger als alle vier Basen erfordert, bevorzugt ein Satz komplementärer Basen, nämlich A-T, A-U oder G-C. Ohne alle vier Basen wird keine zufällige Synthese von Nukleinsäuresequenzen, die Einzelstrangbrüche haben oder im Replikations- oder Transkriptionsprozeß sind, initiiert werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann exponentielle Mengen mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz relativ zu der Anzahl involvierter Reaktionsschritte erzeugen, vorausgesetzt, daß (a) mindestens ein Teil der Nukleinsäurezielsequenz ausreichend genau bekannt ist, so daß Oligonukleotidpaare synthetisiert werden können, die damit hybridisieren können, oder (b) die Zielsequenz in Mengen isoliert werden kann, die groß sind, um genug Oligonukleotidkomplementpaare für die Verwendung in dem Verfahren zu erzeugen. Jede Quelle von Nukleinsäuren kann in gereinigter oder nicht-gereinigter Form als Quelle für die Nukleinsäurezielsequenz verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren entweder einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA verwenden. Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid, das einen Strang jeder Sorte enthält, verwendet werden. Eine Mischung jeder dieser Nukleinsäuren kann verwendet werden. Die besondere Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, kann nur ein Teil eines größeren Moleküls sein. Es kann eine kleine Fraktion einer komplexen Mischung sein, beispielsweise ein Teil des HIV(humanen Immundefizienzvirus-)Genes, das in die genomische DNA einer infizierten Person integriert ist, oder eine bakterielle Nukleinsäure, die in sehr geringen Mengen in besonderen biologischen Proben vorhanden sind.
- Um die Sequenz der Zielsequenz(en) zu bestimmen, oder als zu untersuchende Probe, kann die Nukleinsäure oder -säuren von Interesse aus jeder Quelle erhalten werden, beispielsweise aus DNA oder RNA, die aus Bakterien, Viren, Hefe und höheren Organismen, beispielsweise Pflanzen oder Tieren, aus Plasmiden, wie pBR322 und M13, aus klonierter DNA oder RNA durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert vorhanden ist. DNA kann mittels Verfahren, wie sie z.B. von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), Seiten 280-281, beschrieben sind, aus in Gewebekultur gewachsenen Zellen extrahiert werden.
- Die Oligonukleotidkomplementpaare sind bevorzugt Oligodesoxyribonukleotide. Zusätzlich müssen die Paare lang genug sein, um mit der Nukleinsäurezielsequenz (den Nukleinsäurezielsequenzen) zu hybridisieren. Die Länge der Komplementpaare kann von vier bis zu Hunderten von Basen variieren. Ein kurzes Oligonukleotid erfordert im allgemeinen kühlere Temperaturen zur Bildung stabiler Hybridkomplexe. Die synthetisierten Oligonukleotidsequenzen werden so ausgewählt, daß zwei Oligonukleotidkomplementpaare beide an die Zielsequenz hybridisieren würden und doch eine Lücke von einer oder mehreren Basen lassen. Wenn die Zielsequenz einzelsträngig ist, würde nur eine Hälfte eines solchen Oligonukleotidpaares mit dem Ziel hybridisieren. Mehr als zwei Oligonukleotidkomplementpaare können im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, solange die Amplifikation für die Nukleinsäurezielsequenz(en) spezifisch bleibt.
- Die Oligonukleotidkomplementpaare können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, z.B. können Phosphoramidite (Applied Biosystems, Inc.) als Ausgangsmaterialien verwendet und, wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-62 (1981) beschrieben, synthetisiert und an ihren 5'- Enden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren phosphoryliert werden.
- Die Strangtrennung kann durch jedes geeignete Denaturierungsverfahren, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, erreicht werden. Ein physikalisches Verfahren zum Trennen der Stränge der Nukleinsäure umfaßt das Erwärmen der Nukleinsäure, bis sie vollständig (mehr als 99 %) denaturiert ist. Eine typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen im Bereich von ungefähr 80ºC bis 105ºC umfassen, für Zeiträume im Bereich von ungefähr 1 bis 10 Minuten. Die Strangtrennung kann außerdem durch ein Enzym aus der Enzymklasse induziert werden, die als Helikasen bekannt sind, oder durch das Enzym RecA, das Helikaseaktivität hat und von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart von riboATP DNA denaturiert. Die Reaktionsbedingungen, die zum Trennen der Stränge von Nukleinsäuren mit Helikasen geeignet sind, sind im Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Band XLIII "DNA Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978), B. Kuhn et al., "DNA Helicases", Seiten 63-67, beschrieben, und Verfahren zur Verwendung von RecA sind von C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-37 (1982), übersichtsartig zusammengefaßt.
- Im allgemeinen werden die Lückenfüllungs- und Ligationsschritte in einer gepufferten wäßrigen Lösung, bevorzugt bei einem pH von 7 bis 9, besonders bevorzugt bei pH 7,5 durchgeführt. Die Oligonukleotidkomplementpaare sollen in einem molaren Überschuß von ungefähr 10&sup5; bis 10¹&sup5; Paaren pro Nukleinsäurezielsequenz vorhanden sein. Die genaue Menge der für diagnostische Zwecke zu verwendenden Paare kann in Folge der Unsicherheit hinsichtlich der Menge der Nukleinsäurezielsequenz in einer Probe unbekannt sein. Jedoch ist eine durchschnittliche Menge von 10¹&sup5; Oligonukleotidkomplementpaaren in einem typischen diagnostischen Test verwendbar. Ein großer molarer Überschuß ist in jedem Fall bevorzugt, um die Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verbessern.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren würden typischerweise nur zwei komplementäre Desoxyribonukleosidtriphosphate für den Lückenfüllungsschritt verwendet werden, dATP und TTP, oder alternativ dCTP und dGTP. Es können Oligonukleotidkomplementpaare mit überhängenden Enden ausgewählt werden, so daß zum Füllen jeder Lücke nur ein Typ von Desoxyribonukleosidtriphosphat erforderlich ist. Komplementpaare mit überhängenden Enden können jedoch auch so ausgewählt werden, daß zwei komplementäre Nukleotide und ein weiteres anderes Nukleotid zum Füllen der Lücke verwendet werden.
- Es ist bevorzugt, modifizierte Nukleosidtriphosphate zu verwenden, von denen im Stand der Technik bekannt ist, daß sie gegen die Exonukleaseaktivität von Polymerasen resistent sind, wie beschrieben von D. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-92 (1982); T.A. Kunkel, ibid, 78: 6734-38 (1981); F.R. Bryant et al., Biochemistry 18: 2825-28 (1979). Solche Moleküle könnten sein Thymidin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (TTP[αS]), 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (dATP [αS]) und die Thioderivate von Desoxycytidin, Desoxyguanidin, Desoxyuridin und von Cytidin, Guanidin, Adenosin, Thymidin und Uracil. Andere Derivate dieser Basen, die gegen Nukleaseaktivität resistent sind, sind geeignet, wie beispielsweise ein α- Imido-Derivat von Triphosphatbasen.
- Der Lückenfüllungs-/Ligationsmischung werden in adäquaten Mengen ausreichend Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt und die resultierende Lösung wird ungefähr 1 bis 5 Minuten auf ungefähr 90ºC bis 100ºC erwärmt, bevorzugt 1 bis 3 Minuten. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, um die Hybridisierung zu erlauben. Zur abgekühlten Lösung werden geeignete Katalysatoren zugefügt, um das Füllen und Schließen der Lücke unter Bedingungen zu induzieren, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise können bekannte DNA-Polymerasen zum Lückenfüllen verwendet werden, und bekannte DNA-Ligasen können das resultierende Produkt verbinden, nachdem die Polymerase die Lücke gefüllt hat. Der Lückenfüllungs-/Ligationsprozeß kann bei 4ºC bis zu einer Temperatur geschehen, bei der die katalytischen Mittel nicht länger effizient funktionieren; die Temperatur ist im allgemeinen nicht höher als ungefähr 40ºC. Daher ist beispielsweise die Temperatur, wenn T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase verwendet werden, im allgemeinen nicht höher als ungefähr 40ºC (am günstigsten ist es, die Reaktion bei Raumtemperatur oder sogar bei 4ºC ablaufen zu lassen). Wenn hitzeunempfindliche Enzyme verwendet werden, dann könnte das Verfahren bei Schmelztemperatur der Hybridmatrizen stattfinden.
- Das katalytische Mittel kann jede Verbindung oder jedes System sein, das das Füllen der Lücke zwischen den zwei oder mehr Oligonukleotiden, die an die Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert sind, bewirkt. Für diesen Zweck geeignete Enzyme umfassen E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase, und reverse Transkriptase zum Zufügen von Basen zum Füllen der Lücke sowie T4-DNA-Ligase zur Verbindung des Oligonukleotids (der Oligonukleotide), außerdem von der Polymerase den anderen Oligonukleotidkomplementen zugefügte Nukleotide, wodurch ein verbundenes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das in dieser Ausführungsform ein Oligonukleotidreparaturprodukt genannt wird.
- Die Oligonukleotidreparaturprodukte, die mit den Nukleinsäurezielsequenzen hybridisiert sind, liegen in einer doppelsträngigen Form vor. Im nächsten Schritt werden die Stränge der doppelsträngigen Moleküle erneut getrennt, wie oben beschrieben, um einzelsträngige Moleküle zu bilden.
- Um eine Amplifikation zu erzeugen, können die verbundenen Oligonukleotidmoleküle an zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaare hybridisieren. Falls es notwendig ist, können zusätzliche Enzyme, entsprechende Desoxyribonukleotidtriphosphate und Oligonukleotide zugefügt werden, damit die Reaktion weiterläuft.
- Die Schritte der Strangtrennung, des Lückenfüllens und der Ligation können so oft, wie erforderlich, wiederholt werden, um die gewünschte Menge des spezifischen verbundenen Oligonukleotidproduktes zu erzeugen, wobei angenommen wird, daß eine Kopie der einzelsträngigen Nukleinsäurezielsequenz zu Beginn in der Mischung vorhanden war. Solange diese Schritte wiederholt werden, wird die Amplifikation der spezifischen Nukleinsäurezielsequenz exponentiell stattfinden. Dieses Verfahren könnte verwendet werden, um andere Nukleinsäurezielsequenzen zu amplifizieren, indem verschiedene Oligonnukleotidpaare (oder Triplets, usw.), die an unterschiedliche spezifische Nukleinsäurezielsequenzen hybridisieren, zugefügt werden, ohne andere Bedingungen zu ändern.
- Diese besondere Ausführungsform der Erfindung könnte schrittweise durchgeführt werden, wobei neue Reagenzien nach jedem Schritt zugefügt werden, oder gleichzeitig, wobei alle Reagenzien auf einmal zugesetzt werden. Die Reagenzien können außerdem nach einem gegebenen Schritt zugefügt werden. Jeder Schritt der Ausführungsform, der hitzestabile Enzyme involviert, wird aufeinanderfolgend auftreten, ungeachtet der ursprünglichen Konzentration all dieser Reagenzien. Wenn hitzeempfindliche Enzyme verwendet werden, ist es notwendig, die Lückenfüllungs- und Verknüpfungsmittel nach jedem Strangtrennungs- (Denaturierungs-)schritt zuzufügen.
- In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die katalytischen Mittel auf polymeren Trägern immobilisiert. Nach dem Lückenfüllungs- und Ligationsschritt können die Produkte von den immobilisierten Enzymen eluiert werden und zu Einzelsträngen denaturiert werden. An diesem Punkt stehen die Nukleinsäurezielsequenz(en) und das (die) verbundenen Oligonukleotidprodukt(e) zur Bildung von Hybriden mit zusätzlichen Oligonukleotidkomplementpaaren zur Verfügung. Diese neuen Hybride werden dann zu den immobilisierten Enzymen zurückgeführt, um verbundene Produkte zu bilden. Die Reaktionsschritte können schrittweise oder gleichzeitig ausgeführt werden, und können so oft wie gewünscht wiederholt werden.
- Für kleinere Oligonukleotidkomplemente, beispielsweise 6 bis 10 Basen, könnten hitzeempfindliche Enzyme in einem gleichzeitigen Verfahren verwendet werden, da die Schmelztemperatur doppelsträngiger Oligonukleotide dieses Bereiches bei ungefähr 40ºC liegt, und die hitzeempfindlichen Enzyme bei diesen Temperaturen aktiv sind.
- Wenn hitzestabile Lückenfüllungs- und Verknüpfungsmittel verwendet werden, beispielsweise thermostabile Polymerase und Ligase, dann könnte das Verfahren bei einer erhöhten Temperatur, bevorzugt 60 bis 90ºC, in Abhängigkeit von den hitzestabilen Enzymen, durchgeführt werden. Die Temperatur wird außerdem durch die Temperatur bestimmt, bei der ein Gleichgewicht zwischen einzel- und doppelsträngigen Nukleinsäuren vorliegt. Eine solche hitzestabile Polymerase wird von A.D. Kaledin et al., Biokhimiya, 45, 644-51 (1980), beschrieben. Eine hitzestabile Polymerase und Ligase könnte aus Thermus thermophilus extrahiert werden.
- Nachdem der angemessene Zeitraum zum Durchführen des Verfahrens verstrichen ist, und sich die gewünschte Menge des Oligonukleotidreparaturprodukts akkumuliert hat, kann die Reaktion durch Inaktivieren der Enzyme auf jede bekannte Weise oder Trennen der Bestandteile der Reaktion auf zu zentrifugierenden Säulen oder Sephadex-Säulen, durch Filtration oder durch Gelelektrophorese inaktiviert werden, wie es in der Technik bekannt ist.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ein automatisiertes Verfahren verwendet werden. Dazu umfaßt der Reaktionszyklus einen Denaturierungsschritt, einen Reagenzzusatzschritt und einen Reaktionsschritt. Außerdem kann das Verfahren kontinuierlich durch automatisches Zufügen der Reagenzien mittels einer Pumpe nach dem Denaturierungsschritt durchgeführt werden, während der Schritt des Erwärmens und Abkühlens durch einen speziell dafür entworfenen, gesteuerten Wärmeblock durchgeführt werden könnte.
- Die vorliegende Erfindung ist unten zeichnerisch unter Verwendung von zwei Oligonukleotidkomplementpaaren, die jeweils ein überhängendes Ende haben, dargestellt (Kategorie 2).
- Zwei Paare mit überhängenden Enden
- N ist ein Nukleotid, das so modifiziert ist, daß es die Stränge vor einem Abbau durch 3'-Exonukleasen, wie sie beispielsweise als Teil der T4-DNA-Polymerase gefunden werden, schützt. Die Oligonukleotidkomplementpaare E, E' und F, F' werden so ausgewählt oder synthetisiert, daß sie Abschnitten der vollständigen Nukleinsäurezielsequenz R entsprechen. R ist eine doppelsträngige DNA, umfassend die komplementären Stränge R&spplus; und R&supmin;, dargestellt als:
- Wenn [R] mit einem molaren Überschuß an Oligonukleotiden der Komplementpaare E, E' und F, F' unter Bedingungen gemischt wird, bei denen doppelsträngige Moleküle denaturiert werden und dann rehybridisieren können, bildet R&spplus; stabile doppelsträngige Hybride mit E' und F', während R Hybride mit E und F bildet, wie im folgenden dargestellt:
- A* bedeutet das modifizierte Nukleotid N aus Schema [1], beispielsweise [NTP's αS].
- Als nächstes werden der Mischung TTP, dATP, E. coli Klenow- Fragment und T4-DNA-Ligase zugesetzt, was das Füllen und Verschließen der Lücke in den Doppelsträngen erlaubt, wodurch erzeugt wird: verbundenes Nukleotidprodukt verbundenes Nukleotidprodukt
- In diesem besonderen Beispiel fügt das Klenow-Fragment die Nukleotide an das 3'-Ende von F' und die Ligase verbindet die zugefügten Nukleotide mit dem 5'-Ende von E'. E und F werden auf die gleiche Weise verbunden.
- Im ersten Zyklus sind zwei neue einzelsträngige DNAs erzeugt worden. Nach dem folgenden Denaturierungsschritt kann der molare Überschuß der beiden Oligonukleotidkomplementpaare mit den ursprünglichen Nukeinsäurezielsequenzen sowie mit den Oligonukleotidreparaturprodukten hybridisieren, die im ersten Zyklus gebildet worden sind; daher werden im zweiten Zyklus vier weitere Oligonukleotidreparaturprodukte gebildet. Die Bildung neuer verbundener Oligonukleotidprodukte nimmt exponentiell zu.
- In diesem Verfahren könnten dATP und TTP mit radioaktiven Markern, beispielsweise ³²P, ³&sup5;S oder ¹²&sup5;I, markiert werden. Nicht-radioaktive Marker können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise könnte TTP durch Biotin-dUTP (Enzo Biochem) ersetzt werden und dATP könnte durch Biotin-dATP ersetzt werden, wie es von G. Gebeyehu et al., Nucleic Acid Res. 15, 4513-34 (1987), beschrieben worden ist.
- In dem Fall, wenn Oligonukleotidpaare mit glatten Enden in Lösung verwendet werden (Kategorie 1), kann eine Ligation glatter Enden zwischen den Sätzen der beiden Paare in Lösung auftreten. Da jedoch nur die Basen, die die Lücken füllen, markiert sind, werden die Produkte der Ligation glatter Enden im Nachweisschritt nicht gezählt.
- Das verbundene Oligonukleotidprodukt kann durch eine Anzahl von Verfahren zum Nachweisen markierter Moleküle und/oder von Molekülen mit einer besonderen Länge oder Sequenz nachgewiesen werden. Beispielsweise kann die Reaktionsmischung durch eine Sephadex-Säule gegeben werden, um die markierten NTPs und die verbundenen Oligonukleotidprodukte zu trennen. Da Einzelnukleotide viel kleiner sind als die Länge von zwei oder mehr Oligonukleotidkomplementpaaren, sollte der Nachweis von amplifiziertem Material allein auf der Grundlage der Größe relativ einfach sein.
- Ein weiteres Verfahren zum Nachweis amplifizierter Sequenzen würde die Konstruktion oder Isolierung von Sonden erfordern, die ausreichend komplementäre Sequenzen zu jedem Oligonukleotidkomplementpaar hätten, um das verbundene Produkt bevorzugt zu binden und festzuhalten. Solche Sonden können auf jedem geeigneten Substrat immobilisiert werden. Sie können auch unterschiedlich markiert werden, wenn das gewünscht ist.
- Die vorliegende Erfindung kann für in vitro-Diagnostika verwendet werden. Der Prozeß der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen ermöglicht den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die mit infektiösen Krankheiten, genetischen Erkrankungen oder zellulären Erkrankungen, beispielsweise Krebs, in Zusammenhang stehen. Die Amplifikation ist besonders nützlich, wenn die Menge der Nukleinsäurezielsequenz, die für die Diagnose verfügbar ist, in sehr kleinen Mengen vorliegt, wie beispielsweise bei der pränatalen Diagnose der Sichelzellenanämie, die erfordert, daß DNA aus fetalen Zellen erhalten wird. Weiterhin liegt es im Können des Fachmanns, die Länge und Sequenzen der Oligonukleotidkomplemente zu variieren, um Deletionen und/oder Mutationen in der genomischen DNA eines jeden Organismus nachzuweisen. Diese kleinen Veränderungen sind für die Diagnose solcher Krankheiten, wie zystischer Fibrose, α-Thalassemie, β-Thalassämie und ähnlicher bedeutsam.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch die Gegenwart unterschiedlicher Agentien, beispielsweise pathogener Viren, einschließlich des humanen Immundefizienzvirus (HIV), Herpes, Hepatitis B und Bakterien, einschließlich Salmonella und Chlamydia, anzeigen.
- Das US-Patent Nr. 4 358 535 (Falkow) beschreibt die Verwendung spezifischer DNA-Hybridisierungssonden für die Diagnose von infektiösen Krankheiten. Ein dem Falkow-Verfahren inhärentes Problem ist es, daß eine relativ kleine Anzahl pathogener Organismen in einer klinischen Probe eines infizierten Patienten vorhanden sein kann, und die DNA, die aus dem Pathogen extrahiert ist, kann eine nur sehr kleine Fraktion der gesamten DNA in der Probe darstellen. Die spezifische Amplifikation von vermuteten Sequenzen in einer Probe vor der Hybridisierung mit den Sonden und die Immobilisierung auf Filtern könnte die Empfindlichkeit und Spezifität dieser Verfahren stark verbessern.
- In einer weiteren Ausführungsform könnte die amplifizierte Art durch ein einfaches Verfahren wie folgt nachgewiesen werden: Eine Fänger-Oligonukleotidsonde, die eine Nukleinsäuresequenz hat, die sowohl zu E und F als auch zu E' und F' oder zu jedem davon getrennt komplementär ist, könnte verwendet werden, um die amplifizierten markierten Produkte zu fangen.
- In einer weiteren Ausführungsform könnten die in das Verfahren involvierten Desoxyribonukleotidtriphosphate radioaktiv markiert werden, beispielsweise mit ³²P, ³&sup5;S, ¹²&sup5;I und andere mit nicht-radioaktiven Markern.
- Ein weiteres Mittel, um die klinische Verwendung der DNA-Sonden zur Diagnose von infektiösen Krankheiten zu erleichtern, ist der Ersatz radioaktiver Marker durch nicht-radioaktive Marker. Wie in EP 63 879 (Ward) beschrieben, werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch chromogene Enzyme nachgewiesen, die an Avidin oder Biotin-spezifische Antikörper gebunden sind. Dieser Typ des Nachweises ist bequem, aber relativ unempfindlich. Die Kombination der erfindungsgemäßen DNA-Amplifikation und die Verwendung von Bio-dUTP zum Markieren der Basen, die die Lücke füllen, könnte die Bequemlichkeit und Empfindlichkeit zur Verfügung stellen, die erforderlich ist, um nützliche diagnostische Kits herzustellen und die Schwierigkeiten zu überwinden, die sowohl mit den Verfahren von Falkow als auch von Ward verbunden sind, wenn diese Verfahren in klinischen Routineansätzen verwendet werden.
- Die Verwendung der Verfahren von Falkow und Ward, die Synthese der Oligonukleotide, die Berechnung der Anzahl von Sequenzen, die pro Zyklus amplifiziert werden, und andere Dinge, die allgemein die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen betreffen, sind in den Anmeldungen '195 und '202 beschrieben; diese Anmeldungen werden hier durch Verweis einbezogen.
- Die Erfindung wird nun durch Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken. In Verbindung mit der allgemeinen und eingehenden Beschreibung oben tragen die Beispiele zum weiteren Verständnis der vorliegenden Erfindung bei und führen einige Aspekte der bevorzugten erfingungsgemäßen Ausführungsformen aus.
- Die gewünschte Sequenz, die unter Verwendung der Lückenfüllungs-/Ligationsausführungsform der Verbindung von Oligonukleotiden amplifiziert werden soll, ist eine Sequenz von 48 Basenpaaren, die für den GAG-Bereich 2106-2153 von HIV kodiert. Diese Sequenz wird wegen ihres G-C-Gehaltes ausgewählt, der ungefähr 52 % beträgt, und hat die folgende Sequenz:
- Die folgenden 4 Oligodesoxyribonukleotide sind Beispiele für die vielen glattendigen Sequenzen, die erfindungsgemäß für die Amplifikation verwendet werden können.
- Die glatten Enden werden nach Einbau von 2'-Desoxyadenosin-5'- O-(1-thiotriphosphat) (dATP[αS]) am 3'-Ende jeder Sequenz erzeugt. Es existiert eine Lücke von fünf Basenpaaren zwischen Oligonukleotiden A und B oder A' und B', wenn diese Stränge mit ihren komplementären Strängen der oben gezeigten Zielsequenz hybridisieren.
- Auf ähnliche Weise sind die folgenden vier Oligodesoxyribonukleotide geeignete Sequenzen mit überhängenden Enden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. 22 Basen 22 Basen 21 Basen 21 Basen
- Alle oben beschriebenen Oligodesoxyribonukleotide werden gemäß dem folgenden Verfahren synthetisiert und gereinigt.
- Die 2-Cyanoethylphosphoramidate werden von Applied Biosystems Inc. erworben. Das Verfahren umfaßt die Kondensation von Nukleosidphosphoramiditen mit einem Nukleosid-derivatisierten Träger, 30 mg, aus Glasperlen mit kontrollierter Porengröße (controlled Pore glass bead support) (500 Å) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems Inc., Typ 380B-02. Die Zyklen umfassen die Detritylierung mit 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan, eine Kondensierung unter Verwendung von Tetrazol als aktivierendem Protonendonor, einen Schutz mit Essigsäureanhydrid und Dimethylaminopyridin, eine Oxidation des Phosphites zu Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detritylierung unter Verwendung von 2 % Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten. Die Ausbeuten bei jedem Schritt sind im wesentlichen quantitativ und werden durch Sammeln und spektroskopische Untersuchung von Dimethoxytritylalkohol, der während der Detritylierung freigesetzt wird, bestimmt.
- Der feste Träger wird aus der Säule entfernt und einem ml konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 60ºC 16 Stunden in einem geschlossenen Rohr ausgesetzt. Der Ammoniak wird entfernt und der Rückstand wird auf ein präparatives 12 %iges Polyacrylamidgel unter Verwendung von Tris-Borat-Puffer (pH 8), enthaltend 7 M Harnstoff, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt; nach dieser Zeit wird die das Produkt enthaltende Bande durch UV-Schattenbildung auf einer fluoreszierenden Platte identifiziert. Die Bande wird ausgeschnitten und mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser über Nacht bei Raumtemperatur eluiert. Diese Lösung wird filtriert und der Überstand mit n-Butanol extrahiert (3 x 300 µl). Die wäßrige Phase wird auf eine Sephadex G50-Säule (Pharmacia) (1 x 10 cm) aufgebracht. Die Elution wird durch UV-Absorption bei 260 nm überwacht und die entsprechenden Fraktionen gesammelt, durch UV- Absorption in einem fixierten Volumen quantifiziert und bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge bis zur Trockne evaporiert.
- Um die 5'-Enden von A', B, E' und F zu phosphorylieren, wird ein neues phosphorylierendes Reagens, beschrieben von T. Horn et al., Tetrahedron Letters 27, 4705-08 (1986), verwendet. Es werden nur die Enden der Nukleotide, die miteinander verbunden werden sollen, phosphoryliert.
- Die Synthese von A', B, E' und F wird wie in "I. Automatisierte Syntheseverfahren" beschrieben, durchgeführt, aber nach dem letzten Zyklus wird das phosphorylierende Reagens
- DMT-O-CH&sub2;CH&sub2;- -CH&sub2;CH&sub2;-O-P-N (iPr)&sub2; (O-CH&sub2;CH&sub2;CN)
- (Glen Corp. Inc.) (DMT ist eine Dimethoxytritylgruppe; iPr ist Isopropyl) mit jeder der Sequenzen A', B, E' und F unter Verwendung von Tetrazol aus einem aktivierenden Protonendonor kondensiert, gefolgt von Schutz durch Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin, Oxidation des Phosphits zum Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detrityherung unter Verwendung von 2 % Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten.
- Die 5'-phosphorylierten A', B, E' und F werden nach dem in II, oben, beschriebenen Verfahren gereinigt und quantifiziert.
- Dieses Experiment veranschaulicht die Amplifizierung der 48 Basenpaarsequenz von Beispiel 1 durch Verwendung eines Satzes von zwei glattendigen Oligonukleotidkomplementpaaren, bei denen eine Lücke von fünf Basen (A, T) zwischen den Paaren existiert. Im ersten Schritt wird die Polymerase dATP[αS] einbauen, um die Komplementpaare vor der 3'-Exonukleaseaktivität von DNA-Polymerase I zu schützen und um glatte Enden zu bilden.
- Die Amplifizierung der 48 Basenpaare beginnt bei Schritt 2.
- 50 µl, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml, 0,1 mM ATP und 0,1 mM dATP[αS] (Sigma) werden zu 60 µl einer Pufferlösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zugefügt.
- Dieser Lösung werden 5 µl einer Lösung, enthaltend jeweils 100 pmol A und B' und phosphoryliertes A' und B und 0,1 pmol der 48 Basenpaare, die amplifiziert werden sollen, zugefügt. Die resultierende Lösung wird 2 Minuten auf 100ºC erhitzt, was die Trennung der Stränge und die Hybridisierung von A, A', B und B' an die Zielsequenz erlaubt. Dann werden vier Einheiten Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase-I zugefügt und die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Die beiden Paare sind nun glattendig und gegen die Exonukleaseaktivität der Polymerase geschützt.
- Um die verbundenen Oligonukleotidprodukte zu erzeugen und zu amplifizieren, werden die folgenden Unterschritte angewendet.
- a. Füge jeweils 1 nmol dATP und TTP und 100 pmol jeweils von α-³²P-dATP und α-³²P-TTP (spezifische Aktivität 1000 cpm/pmol) zu;
- b. Erwärme 2 Minuten auf 100ºC,
- c. Kühle 2 Minuten auf Raumtemperatur ab,
- d. Füge eine Mischung von 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzu,
- e. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Der Unterschritt (a) in dem Zyklus kann weggelassen werden, wenn eine ausreichende Menge von Nukleotidtriphosphaten am Anfang anwesend ist. Der Zyklus wird 22-mal wiederholt. 2 µl Aliquots aus Zyklus 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19 und 22 werden auf ein 12 %iges Polyacrylamid-7-M-Harnstoff-Gel unter Verwendung von 0,089 M Tris-Boratpuffer, pH 8,3, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt. Das Gel wird einem empfindlichen Film (Kodak) 5 Stunden ausgesetzt.
- Die resultierende Reaktionsmischung wird auf eine Sephadex G40/50-Säule (1 x 10 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Zwei unterschiedliche Peaks werden getrennt und mit einem Geigerzähler verfolgt. Der erste Peak, der nach Elution mit 5 bis 7 ml Wasser auftritt, besteht aus den amplifizierten 48 Basenpaaren, und der zweite Peak, der nach Elution mit 14 bis 18 ml Wasser auftritt, besteht aus α³²-P-dATP und α-³²P-TTP.
- In diesem Beispiel werden die Schritte 1 und 2 getrennt voneinander durchgeführt. Diese beiden Schritte können jedoch in einen Schritt zusammengefaßt werden, so daß der Zyklus unmittelbar durch Verwendung einer Mischung von dATP[αS] beginnen könnte, die in Schritt 2, Unterschritt (a) des Zyklus, zugesetzt werden könnte, oder alternativ könnten die geschützten, glattendigen Paare separat hergestellt, gereinigt, quantifiziert und wie gewünscht verwendet werden.
- Dieses Beispiel veranschaulicht eine nicht-radioaktive Markierung während des erfindungsgemäßen Amplifikationsprotokolls. 100 µl Lösung, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). 5 µl einer Lösung, enthaltend jeweils 1 nmol A, A', B, B', wobei B und A' an ihren 5'-Enden phosphoryliert sind, und 10 pmol der 48 Basenpaare, wie in Beispiel 1 hergestellt, wurden zugefügt. Je 1 nmol dATP und Bio-11-dUTP (Enzo Biochem) und 100 pmol dATP[αS] wurden ebenfalls zugesetzt. Die Zahl 11 bezeichnet einen Verbindungsarm von 11 Atomen.
- Die resultierende Lösung wird, wie oben beschrieben, Zyklen unterworfen, z.B. wird die Mischung 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und wird 2 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, woraufhin vier Einheiten Klenow-Fragment der E. coli -DNA-Polymerase-I und zwei Einheiten T4-DNA-Ligase zugefügt werden. Die Reaktionsmischung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zyklus wird 20-mal wiederholt, wie im vorigen Experiment beschrieben.
- Die Reaktionsmischung wird dann mit 100 µl 2 M Ammoniumacetatpuffer, pH 7,5, verdünnt. Die Mischung wird in einer Verdünnungsreihe vierfach verdünnt, wobei 1 M Ammoniumacetat als Verdünnungsmittel verwendet wird. Aliquots (50 µl) der amplifizierten DNA-Lösung werden zu den Vertiefungen von Dynatech Immulon II-Mikrotiterplatten (Dynatech) mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Die Platten werden verschlossen und 90 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die amplifizierte DNA an die Platten zu binden. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen bei Raumtemperatur zweimal mit 200 µl Aliquots 0,3 M NaCl und 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0, und einmal mit 200 µl des gleichen Puffers, enthaltend 0,1 % Triton X-100, gewaschen. Die Vertiefungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Aliquots (200 µl) einer Lösung, die 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 0,5 M NaCl, 2 % BSA, 0,1 % Triton X-100 und 5 mM EDTA (Blockierungslösung) enthält, behandelt.
- Nach dem Entfernen der Blockierungslösung aus den Vertiefungen werden Aliquots (50 µl) einer Lösung, die Meerrettichperoxidase-markiertes Avidin (Vektor Labs) enthält, jeder Vertiefung zugesetzt. Das Peroxidase-markierte Avidin wird in PBS, 0,1 % Triton X-100 im Einklang mit den Vorschriften des Herstellers verdünnt.
- Die Platten werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit einer Lösung aus 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 0,5 M Natriumchlorid, 0,1 % Triton X-100 und 5 mM EDTA (4 x 200 µl) und dann mit PBS, enthaltend 1 mM EDTA (1 x 200 µl) gewaschen.
- Die Komplexe aus DNA, biotinylierter Sonde und markiertem Avidin werden nachgewiesen, indem jeder Vertiefung 150 µl einer Substratreaktionsmischung zugesetzt werden, die 1,6 mg/ml o- Phenylendiamin (Sigma) und 0,0125 % Wasserstoffperoxid in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, eingestellt auf pH 6,0, mit 0,05 M Zitronensäurelösung, enthält. Die Platten werden 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und dann wird die Reaktion durch Zusetzen von 4 N Schwefelsäure (50 µl) beendet.
- Der Inhalt der Platten wurde auf einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät (Intermed Immuno Reader NJ-2000) bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Absorption (O.D. 490) [Amplifizierte DNA] Kontrolle (a) über
- (a) Kontrolle bedeutet, daß 100 pmol Bio-dUTP in den Vertiefungen unter Verwendung von Ammoniumacetat fixiert wurden.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotidkomplementpaaren mit überstehenden Enden (E, E', F und F', wie beschrieben). Die Sequenz, die zu amplifizieren gewünscht ist, ist die gleiche 48 Basenpaare-Sequenz, die in Beispiel 1 hergestellt wurde. In diesem Experiment finden der Einbau von dATP[αS], der Lückenfüllungs- und der Ligationsschritt gleichzeitig statt.
- Zu 100 Mikrolitern Pufferlösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, wurden 1 mol MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml, jeweils 1,0 mikromolar dATP[αS], TTP[αS], dATP und dTTP und jeweils 100 Picomol α-³²P-dATP und α³²P-TTP (spezifische Aktivität 1000 cpm/Picomol) zugefügt.
- Dieser Lösung werden 5 Mikroliter einer Lösung, enthaltend jeweils 100 Picomol E und F' und jeweils phosphoryliertes F und E' und 0,1 Picomol der zu amplifizierenden 48 Basenpaare zugefügt. Die resultierende Lösung wird 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann 2 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, was die Trennung der Stränge und die Hybridisierung des Satzes aus zwei Paaren an die Zielsequenz erlaubt. Dann werden 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt und der Reaktionsansatz 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Um diesen Prozeß zyklisch zu wiederholen, werden die folgenden Schritte angewendet:
- 1. 3 Minuten Erwärmen auf 100ºC;
- 2. 2 Minuten Abkühlen auf Raumtemperatur;
- 3. Zufügen einer Mischung von 4 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase-I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase;
- 4. 4 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur.
- Der Zyklus wird 22 mal wiederholt.
- Die resultierende Reaktionsmischung wird auf eine Sephadex G40/50-Säule (1 x 10 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Zwei unterschiedliche Peaks werden getrennt und in einem Geigerzähler gemessen. Der erste Peak tritt nach Elution mit 5 bis 7 ml Wasser auf und besteht aus den amplifizierten 48 Basenpaaren, der zweite Peak tritt nach Elution mit 14 bis 18 ml Wasser auf und besteht aus α-³²P- dATP und α-³²P-TTP.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Kopplung von T4-DNA-Ligase und Polymerase-I an polymere Träger.
- Hexaethylenglycol (Aldrich), (28,23 g, 100 mmol) wird in trokkenem Pyridin (200 ml) gelöst und eine Dimethoxytritylchloridlösung (16,95 g, 50 mmol) in trockenem Pyridin (100 ml) wird tropfenweise unter Argon zugesetzt. Die Mischung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck (2 mm Hg) entfernt. Der ölige gelbe Rückstand wird mit Ethylacetat (300 ml) extrahiert und mit Wasser (200 ml) und Salzlösung (2 x 200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird erneut in Dichlormethan (30 ml) gelöst, das etwas Pyridin (0,5 ml) enthält. Diese Mischung wird weiter durch Säulenchromatographie auf Silicagel (5,5 x 45 cm) gereinigt und mit einer Mischung aus Dichlormethan-Methanol-Pyridin (95:4:1 Vol/Vol) eluiert. Das Produkt (23,3 g, gelbes Öl) hat einen RF = 0,42 in den oben genannten Lösungsmitteln. Die Ausbeute beträgt 80%.
- NMR = 7,46-7,20 (m, 9H, aromatische Hs), 6,80 (d, J=9,0 Hz, 4H, aromatische Hs), 3,77 (s, 6H, Methoxy-Hs), 3,66, 3,63 (2s, 22H, CH&sub2;-CH&sub2;) 3,56 (t, J=5 Hz, sH, CH&sub2;-OH), 3,21 (t, J=6,0 Hz, 2H, CH&sub2;-DMT), 2,49 (weites s, 1H, OH) Massenspektrum: m/e 584 (Molekularion), 553, 507, 477, 303 (DMT-Gruppe).
- O'-DMT-hexaethylenglycol (1) (5,84 g, 10 mmol) wird unter Argon in trockenem Dichlormethan (30 ml) gelöst. Trockenes N,N-Diisopropylethylamin (5,16 g, 40 mmol) wird zugesetzt, gefolgt von tropfenweisen Zusatz von N,N-Di-isopropyl-O-methylchlorphosphoramidit (Applied Biosystems) (1,97 g, 10 mmol). Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt, mit einer gesättigten Lösung Natriumbicarbonat (100 ml) und mit Salzlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter verringertem Druck (15 mm Hg) entfernt. Weiteres Trocknen wird durch Coevaporation mit Toluol (2 x 100 ml) und durch Lyophilisieren in trockenem Benzol erreicht.
- Das Produkt (7,21 g, gelbes Öl) hat RF=0,63 in Dichlormethan- Methanol (95:5). Die Ausbeute beträgt 95%. NMR = 7,47-7,23 (m, 9H, aromatische Hs), 6,83 (d, J=9,0 Hz, 4H, aromatische Hs), 3,77 (s, 6H, Methoxy), 3,77-3,59 (weites s, 22H, O-CH&sub2;CH&sub2;-O), 3,55 (d, J-12 Hz, 3H, CH&sub3;-O-P), 3,21 (t, J=6,0 Hz, 2H, CH&sub2;-O- DMT), 1,62 (d, 2H, CH&sub3;-CH), 1,24 (d, J=7Hz, 12H). Massenspektrum 744 (Molekularion).
- "Controlled pore glass" (CPG) (Pierce) (500 Å) (1 g) mit langkettigem Alkylamin wird in ein (mittleres) Sinterglas (50 ml) gesetzt und mit trockenem Acetonitril (3 x 10 ml) unter Argon gewaschen. Dem getrockneten Gel wird eine Lösung aus 1H- Tetrazol (Aldrich) (0,5 g) in trockenem Acetonitril (12 ml) zugefügt, gefolgt vom Zusetzen einer Lösung von O'-DMT-hexaethylenglycol-O-methyl-methyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (2 g) in trockenem Acetonitril (13 ml) unter Argon. Die Reaktionsmischung wird 10 Minuten bewegt, gefolgt von Waschen mit Tetrahydrofuran (3 x 25 ml). Zu dem resultierenden Gel wird eine schützende Lösung, enthaltend Essigsäureanhydrid:Tetrahydrofuran (1:1 Vol/Vol) (10 ml) und eine Lösung von N,N-Dimethylaminopyridin (0,5 g) in Tetrahydrofuran (10 ml) zugefügt und die Mischung wird 6 Minuten geschüttelt, gefolgt von Waschschritten mit Tetrahydrofuran (3 x 20 ml). Der resultierenden Lösung wird eine Oxidationslösung, enthaltend 12 (0,1 Molar) in Tetrahydrofuran: Wasser : 2,6-Lutidin (1:0,4:1) (10 ml) zugefügt, und die Mischung wird 5 Minuten geschüttelt, gefolgt vom Waschen mit Acetonitril (3 x 20 ml). Die Messung der Beladung des Linker-Armes auf dem "controlled-pore-glass" wird durch Zufügen einer Lösung (1 ml) von para-Toluolsulfonsäure in Acetonitril (0,1 Molar) zu 10 mg des derivatisierten Trägers, gefolgt vom Messen der Absorption bei 498 nm, durchgeführt. Die Beladung beträgt 185 Mikromole des Linker-Armes pro 1 g des Trägers. Die Dimethoxytritylgruppe wird vom Träger durch eine Lösung aus Trichloressigsäure in Trichlormethan (3%) entfernt. Mit dem vorher ungeschützten Linker-Arm könnte ein neuer Linker-Arm kondensiert werden, um, wenn gewünscht, einen längeren Linker- Arm zu erhalten.
- Der getrocknete Träger mit Linker-Arm (1 g) wird wie oben in ein Sinterglas gesetzt und mit trockenem Aceton (3 x 50 ml) gewaschen, gefolgt vom Zusatz von trockenem Aceton (5 ml) und 20 Mikrolitern trockenen Pyridines. Der Suspension wird 1 Minute lang tropfenweise unter Schütteln Tresylchlorid (180 Mikroliter) (Fluka) zugefügt. Nach 15 Minuten Reaktion bei 0ºC wird das Gel zweimal mit den folgenden Lösungen (20 ml) gewaschen: 5 mM HCl:Aceton 30:70, 50:50 und 70:30 (Vol/Vol) und schließlich mit Wasser, 50:50 Wasser:Aceton und Aceton (jeweils 20 ml), getrocknet und in einem Trockner bis zur Verwendung gelagert.
- 40 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL) werden in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,5, enthaltend 1 mM EDTA, 50 Mikromolar ATP, 10% Glycerin bis zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern gelöst und bei 40ºC aufbewahrt. 100 mg des trockenen tresylierten CPG-Linker-Armes werden in die Enzymlösung überführt. Die resultierende Gelaufschlämmung wird bei 4ºC 16 Stunden "end-over-end" gemischt. Die restlichen reaktiven Tresylgruppen auf den Linker-Armen werden durch Zufügen von 0,1 M Dithiotreit (2 Stunden, 4ºC) entfernt. Nach dem Koppeln wird das Gel von nicht-gekoppeltem Enzym durch viermaliges Waschen in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM Dithiothreit (DTT), 0,5 M NaCl befreit, gefolgt von zweimal Waschen in 0,1 M NaAc, pH 5,0. Schließlich wird das Gel in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 10 Glycerin equilibriert und bei 4ºC gelagert.
- 40 Einheiten Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (Bethesda Research Labs.) werden in 200 Mikrolitern Puffer, bestehend aus 1,5 mM ATP, 30 mM Trisacetatpuffer pH 7,9, 60 mM Natriumacetat, 10 mM Magnesiumacetat gelöst und einer lyophilisierten Mischung aus 80 Mikrogramm Poly(dA) - 20 Mikrogramm oligo(dT) zugefügt. Dieser Mischung werden 100 Milligramm des trockenen tresylierten CPG-Linker-Armes zugefügt. Die resultierende Gelaufschlämmung wird bei 4ºC 10 Stunden "end-over-end" gemischt. Restliche reaktive Tresylgruppen an den Linker-Armen werden durch Zufügen von 0,1 mM Dithiothreit (DTT) (2 Stunden, 4ºC) entfernt. Nach dem Koppeln wird das Gel von nicht-gekoppeltem Enzym durch Waschen (4 x 0,5 ml) in einem Puffer, der aus 60 mM Natriumacetat, 30 mM Trisacetat, 10 mM Magnesiumacetat pH 8,0 und 0,25 mM Dithiotreit besteht, gewaschen.
- Das Gel wird schließlich in 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 10% Glycerin equilibriert und bei 4ºC gelagert.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung dieser immobilisierten Enzyme im erfindungsgemäßen Verfahren.
- Die gewünschte Sequenz, die unter Verwendung des Lückenfüllungs/Ligationssystemes unter Verbinden der Oligonukleotide amplifiziert werden soll, ist eine 88 Basenpaarsequenz, die für ein kryptisches Plasmid aus Clamydia trachomatis kodiert. Diese besondere Sequenz ist eine vierfach wiederholte Sequenz von 22 Basenpaaren, die durch Sequenzieren des 6,5 Kilobasenplasmides erhalten worden ist, das aus Chlamydia trachomatis (Serotyp L) abgeleitet ist; das Plasmid wurde in die einmal vorhandene BamH1/Sst1-Stelle des Plasmides pUC18 insertiert. Die 6,6 kB sind unter Verwendung des Didesoxykettenterminationsverfahrens von Sänger et al., P.N.A.S., 83, 1911 (1986) sequenziert worden.
- Die wiederholten 22 Basenpaare haben die folgende Sequenz:
- Die Konstruktion der beiden Paare geschieht wie folgt:
- Y stellt in diesem Fall Oligonukleotide A und B in den Oligonukleotidkomplementpaaren dar. Z stellt in diesem Fall Oligonukleotide A' und B' in den Oligonukleotidkomplementpaaren dar. Wenn sie an die Zielsequenz hybridisiert werden, bilden Y und Z eine Lücke von zwei komplementären Basenpaaren, A-T.
- Die beiden oben beschriebenen Oligodesoxyribonukleotide werden mit dem folgenden Verfahren synthetisiert und gereinigt.
- Die 2-Cyanoethylphosphoramidite werden von Applied Biosystems Inc. erworben. Das Verfahren umfaßt die Kondensation von Nukleosidphosphoramiditen mit Nukleosid-derivatisierten "controlled pore glass"-Perlen-Träger (500 Å), 30 mg, unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems Inc., Typ 380B-02. Die Zyklen umfassen eine Detritylierung mit 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan; eine Kondensation unter Verwendung von Tetrazol als einem aktivierenden Protonendonor, das Schützen mit Essigsäureanhydrid und Dimethylaminopyridin und die Oxidation des Phosphites zum Phosphat mit 0,1 M I&sub2;/H&sub2;O/Lutidin/Tetrahydrofuran im Anschluß an die Detritylierung unter Verwendung von 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan. Die Zykluszeit beträgt ungefähr 30 Minuten. Die Ausbeuten in jeder Stufe sind im wesentlichen quantitativ und werden durch Sammeln und spektroskopische Untersuchung des Dimethoxytritylalkoholes, der während der Detritylierung freigesetzt wurde, bestimmt.
- Der feste Träger wird von der Säule entfernt und 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid 16 Stunden bei 60ºC in einem geschlossenen Rohr ausgesetzt. Der Ammoniak wird entfernt und der Rückstand auf ein präparatives 12%-iges Polyacrylamidgel unter Verwendung von Tris-Borat-Puffer (pH 8), enthaltend 7 M Harnstoff, aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 Volt/cm 5 Stunden durchgeführt; nach dieser Zeit wird die das Produkt enthaltende Bande durch UV-Schattenbildung auf einer fluoreszierenden Platte identifiziert. Die Bande wird ausgeschnitten und mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser über Nacht bei Raumtemperatur eluiert. Diese Lösung wird filtriert und der Überstand mit n-Butanol extrahiert (3 x 300 Mikroliter). Die Wasserphase wird auf eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia) (1 x 10 cm) aufgetragen. Die Elutionen werden durch Verfolgen der UV- Absorption bei 260 nm überprüft und die geeigneten Fraktionen gesammelt, durch UV-Absorption in einem fixierten Volumen quantifiziert und bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge zur Trockne evaporiert.
- Die Oligodesoxyribonukleotide Y und Z (jeweils 5 Nanomol) werden getrennt zur Trockne lyophilisiert und in (50 Mikroliter) 50 nM HEPES (Aldrich) pH 7,6, 10 nM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiotreit und [³²P]-ATP (10 nM) aufgelöst. Spezifische Aktivität = 2,5 x 10³ cpm/pmol. Jedes Röhrchen wird mit 2 Einheiten T4-Polynukleotidkinase 40 Minuten bei 37ºC inkubiert, 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, auf eine Sephadex-G50-Säule aufgetragen und mit Wasser eluiert. Die Eluate werden mit einem Gammazähler (Beckman) überwacht und zur Trockne lyophilisiert.
- Chlamydia trachomatis Stamm LGV2 wird in McCoy-Zellen in Gegenwart von 1 Mikrogramm Cycloheximid/ml bis zu ungefähr 1,0 IFU (inclusion forming unit - Einschlußkörper bildende Einheiten) pro Zelle wachsengelassen. Die Zellen werden 3 Tage wachsengelassen; nach dieser Zeit zeigen 80 bis 90% der Zellen sichtbare Einschlüsse und werden geerntet und, bis sie getestet werden, bei -70ºC gelagert. Die mikrobiellen Kontrollstämme werden durch Routineisolierungen erhalten (Department of Microbiology, Ben-Gurion Universitat) und mit üblichen Verfahren (Lennette et al., Manual of Clinical Microbiology, 3. Auflage, Washington (1980)) identifiziert. Die Stämme umfassen E. coli- und Streptococcus agalactiae-Isolate.
- Die mikrobiellen Stämme werden auf Platten oder auf flüssigem Medium wachsengelassen. Für den Test wird eine Suspension jeder Mikrobe bei alkalischem pH gekocht (0,3 M NaOH), auf Eis gekühlt und mit HCl neutralisiert.
- Die Ernten von 100 ml Chlamydien-Zellkulturen werden mit einem Glas-Teflon-Homogenisator aufgebrochen und 5 Minuten bei 1400 g zentrifugiert, um den Zelldebris zu entfernen. Der Überstand wird auf 30% (Vol/Vol) Renographin-76 (E.R. Squibb, Princeton, USA), verdünnt mit 20 mM Tris-150 mM HCl (THCl) (pH 7,5) aufgetragen; Renographin-76 ist eine Lösung aus Diatrizoatmeglumin und Diatrizoatnatrium in Citratpuffer. Nach 45 Minuten Zentrifugation bei 50000 x g wurden die Niederschläge in 1,0 ml THCl resuspendiert, auf 30 bis 60% (Vol/Vol) Renographin-76-Gradienten in THCl aufgetragen und 2 Stunden bei 50000 x g zentrifugiert.
- Im mittleren Bereich des Gradienten sind zwei diffuse Banden sichtbar; diese Fraktionen werden gesammelt, mit THCl verdünnt und 45 Minuten bei 50000 x g zentrifugiert. Die Niederschläge werden in 0,5 ml THCl gelöst.
- Das folgende Verfahren beruht auf einem von Wenman et al. (Nature, 296:68-70 (1982)) beschriebenen Verfahren.
- Die Chlamydien-Suspension wird vor Zusetzen von 50 mM Tris, enthaltend 20 mM Na&sub2;/EDTA, 20% (Gew./Vol.) Saccharose, 0,7 (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 200 Mikrogramm Proteinase K homogenisiert. Die Mischung wird 15 Minuten bei 55ºC inkubiert und dann 45 Minuten bei 37ºC. Ein gleiches Volumen von Phenol/Chloroform wird zugefügt und die Mischung heftig gemischt und 10 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. Die Nukleinsäuren werden aus der wäßrigen Phase durch Zusetzen von 1/20 Volumen 5 M NaCl und 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Nach zwei weiteren Zyklen aus Zentrifugation und Präzipitation wird die DNA spektrophotometrisch gemessen, einmal mehr präzipitiert und in 10 mM Tris mit 1 mM EDTA (pH 7,0) bei einer Konzentration von 200 Mikrogramm/ml wieder aufgelöst.
- Die DNA wird in Mengen von 4 bis 10 Mikrogramm bei einer Konzentration von 80 Mikrogramm/ml mit 4 Einheiten BamH1 (B1) pro Mikrogramm DNA 2 bis 3 Stunden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen abgebaut.
- Diese Beispiel veranschaulicht die Lückenfüllungs/Ligations/Amplifikationsschritte unter Verwendung immobilisierter Enzyme und der in Abbildung 3 gezeigten Vorrichtung.
- Eine Mischung aus Polymerperlen 1 (10 mg Perlen) der CPG-T&sub4;- DNA-Ligase aus Beispiel 12(5).IV und 10 mg Perlen des CPG- Klenow-Fragmentes von E. coli DNA-Polymerase-I aus Beispiel 5.V werden in Plastikzylinder 2 (inneres Volumen ca. 0,5 ml) gesetzt, wobei die Ränder des Zylinders 2 Kunststoffdeckel 3a, 3b mit einer Zuleitung 4 und einer Auslaßöffnung 5 enthalten, die mit dem Plastikrohr 6, 7 verbunden ist. Der Boden von Zylinder 2 ist mit silikonisierter Glaswolle 8 gefüllt, die die Perlen 1 hält.
- Die Zuleitung 4 und der Auslaß 5 sind an Kunststoffrohre 6 und 7 angeheftet, wobei diese einen Durchmesser von 0,5 mm haben. Das Kunststoffrohr 7 ist mit der Spirale 9 aus rostfreiem Stahl verbunden, die in ein heißes Ölbad 10 eingetaucht ist, das Silikonöl von 90ºC enthält. Die rostfreie Stahlspirale 9 ist über das Rohr 11 mit einer zweiten rostfreien Stahlspirale 12 verbunden. Die Spirale 12 ist im Wasserbad 13 eingetaucht, das bei Raumtemperatur gehalten wird. Die Spiralen 9 und 12 haben ebenfalls einen Durchmesser von 0,5 mm. Die Spirale 12 ist mit dem Plastikrohr 14, das einen Durchmesser von 0,5 mm hat, verbunden. Das Rohr 14 ist mit der peristaltischen Pumpe 15 verbunden und führt anschließend durch den Auslaß 4 zur Zelle 2. Die Pumpe drückt die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 2 Tropfen pro Minute durch das System.
- Je 100 Picomol der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide Y und Z werden miteinander gemischt und in 1 Milliliter 1 mM MgCl&sub2;, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mg Rinderserumalbumin pro ml und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,1 mM dATP[αSl und TTP[αS] (Sigma) gelöst.
- Die resultierende Lösung wird 2 Minuten auf 100ºC erwärmt, was die Strangtrennung und die Hybridisierung von Y und Z auf die Zielsequenz erlaubt. Dann werden 5 Einheiten des Klenow- Fragmentes der E. coli DNA-Polymerase-I zugefügt und die Reaktion wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Paare sind nun glattendig und gegen die Exonukleaseaktivitäten der Polymerase geschützt.
- Schritt 2. 1 Mikrogramm der mit BamHI abgebauten DNA aus Beispiel 7.II oben wird in dem aus Schritt 1 resultierenden Puffer gelöst. Diesem Puffer wird 1 Nanomol dATP und TTP und je 100 pmol α-³²P[dATP] und α-³²P[TTP] zugefügt. Die spezifische Aktivität beträgt 1000 cpm/Picomol.
- Diese Lösung wird durch die Zuleitung 4 der Vorrichtung injiziert und der Zyklus wird durch Inbetriebnahme der peristaltischen Pumpe 15 gestartet.
- Nach 3 Stunden Zyklisieren der Lösung durch die Zelle 2, die die immobilisierten Enzyme enthält, wird die Lösung auf eine Sephadex-G-40/50-Säule (1 x 10 cm) aufgetragen und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt und mit einem Geigerzähler überprüft.
- Zwei getrennte Banden werden nachgewiesen, wobei die erste in einem Pool von 4-7 ml, der mittels des Lückenfüllungs/Ligationsverfahrens erhaltene markierte amplifizierte verbundene Oligonukleotidprodukte enthält, eluiert. Dieser Pool hat ungefähr 115000 cpm, während der zweite Pool, der bei 14-17 ml eluiert, 80000 cpm hat.
Claims (36)
1. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von
mindestens einer spezifischen Nukleinsäurezielsequenz oder
einem Teil davon durch Amplifizierender
Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon in einer Probe, von
der vermutet wird, daß sie die Zielsequenz(en) enthält,
umfassend die folgenden Schritte:
(a) Behandeln der Probe mit mindestens zwei Oligonukleotiden
für jeden Strang einer Zielsequenz unter
Hybridisierungsbedingungen,
(i) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
sie jedem Strang der Zielsequenz(en) oder einem Teil
(Teilen) davon ausreichend komplementär sind, um
damit zu hybridisieren; und
(ii) wobei eine Lücke von einer oder mehreren Basen
zwischen den Oligonukleotiden vorhanden ist, wenn die
Oligonukleotide mit der (den) Zielsequenz(en) oder
einem Teil (Teilen) davon hybridisiert werden; und
(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
das Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als
alle vier Basen erfordert;
(b) Auffüllen der in Schritt (a) gebildeten Lücke mit einer
oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der
Lücke komplementär sind, und Verbinden der Base oder Basen,
die die Lücke füllen, miteinander und mit den beiden
benachbarten hybridisierten Oligonukleotiden, wodurch ein
verbundenes Oligonukleotidprodukt gebildet wird;
(c) Behandeln des hybridisierten verbundenen
Oligonukleotidproduktes aus Schritt (b) unter denaturierenden Bedingungen,
um das verbundene Oligonukleotidprodukt (die verbundenen
Oligonukleotidprodukte) von der (den) Zielsequenz(en) oder
einem Teil (Teilen) davon zu trennen, um einzelsträngige
Moleküle zu erzeugen;
(d) Behandeln der in Schritt (c) erzeugten einzelsträngigen
Moleküle mit mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaaren
unter hybridisierenden Bedingungen,
(i) wobei jedes Oligonukleotidkomplementpaar zwei
Oligonukleotide umfaßt, die so ausgewählt sind, daß sie
ausreichend komplementär zueinander, zu jedem Strang
der Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon
und zu den verbundenen Oligonukleotidprodukt(en) oder
einem Teil (Teilen) davon sind, um damit zu
hybridisieren; und
(ii) wobei eine Lücke von einer oder mehreren Basen
zwischen den Oligonukleotiden vorhanden ist, wenn die
Oligonukleotide mit der (den) Zielsequenz(en) oder
einem Teil (Teilen) davon hybridisiert werden; und
(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
zum Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als
alle vier Basen erforderlich sind;
(e) Auffüllen der in Schritt (d) gebildeten Lücke mit einer
oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der
Lücke komplementär sind, und Verbinden der Basen, die die
Lücke füllen, miteinander und mit den beiden benachbarten
hybridisierten Oligonukleotiden oder
Oligonukleotidkomplementpaaren, wodurch ein zusätzliches verbundenes
Oligonukleotidprodukt (Oligonukleotidprodukte) gebildet wird
(werden), was zu einer Amplifikation der Zielsequenz(en)
oder eines Teiles (von Teilen) davon führt; und
(f) Nachweisen des verbundenen Oligonukleotidproduktes (der
Oligonukleotidprodukte).
2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt
(e') des Behandelns der hybridisierten Oligonukleotide aus
Schritt (e) unter denaturierenden Bedingungen, um die
hybridisierten Oligonukleotide zu trennen und
einzelsträngige Moleküle zu erzeugen, wobei die Schritte (d), (e) und
(e') eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Nukleotidzielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon doppelsträngige DNA ist
(sind) und ihre Stränge vor oder während Schritt (a) getrennt
werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon einzelsträngige DNA oder
RNA ist (sind).
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotide
Oligodesoxyribonukleotide sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
Oligonukleotidkomplementpaare in einem molaren Überschuß im Bereich von 10&sup5; bis 10¹&sup5;
Paare pro Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen)
davon vorhanden sind.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lücke durch
katalytische Mittel gefüllt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die katalytischen Mittel
eine Kombination sind, die eine DNA-Polymerase und eine DNA-
Ligase umfassen.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die katalytischen Mittel
auf polymeren Trägern immobilisiert sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA-Polymerase aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow-
Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase,
reverser Transkriptase besteht und die Ligase aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Ligase oder T4-DNA-Ligase
besteht.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polymerase und Ligase
wärmestabil sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die wärmestabile
Polymerase und Ligase aus einem thermophilen Bakterium isoliert
werden.
13. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Probenmischung in den
Schritten (a) und (d) Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt
werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Oligonukleotide
und/oder Desoxyribonukleotidtriphosphate modifiziert sind, um
gegen 3' T 5'-Exonukleaseaktivität resistent zu sein.
15. Verfahren zum Amplifizieren mindestens einer spezifischen
Nukleinsäurezielsequenz oder eines Teiles davon in einer Probe,
die eine Nukleinsäure oder eine Mischung von Nukleinsäuren
enthält, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Behandeln der Probe mit mindestens zwei Oligonukleotiden
für jeden Strang einer Zielsequenz unter
Hybridisierungsbedingungen,
(i) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
sie jedem Strang der Zielsequenz(en) oder einem Teil
(Teilen) davon ausreichend komplementär sind, um
damit zu hybridisieren; und
(ii) wobei eine Lücke von einer oder mehreren Basen
zwischen den Oligonukleotiden vorhanden ist, wenn die
Oligonukleotide mit der (den) Zielsequenz(en) oder
einem Teil (Teilen) davon hybridisiert werden; und
(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
das Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als
alle vier Basen erfordert;
(b) Auffüllen der in Schritt (a) gebildeten Lücke mit einer
oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der
Lücke komplementär sind, und Verbinden der Base oder Basen,
die die Lücke füllen, miteinander und mit den beiden
benachbarten hybridisierten Oligonukleotiden, wodurch ein
verbundenes Oligonukleotidprodukt gebildet wird;
(c) Behandeln der hybridisierten Oligonukleotidprodukte aus
Schritt (b) unter denaturierenden Bedingungen, um das
verbundene Oligonukleotidprodukt (die verbundenen
Oligonukleotidprodukte) von der (den) Zielsequenz(en) oder einem Teil
(Teilen) davon zu trennen, um einzelsträngige Moleküle zu
erzeugen;
(d) Behandeln der in Schritt (c) erzeugten einzelsträngigen
Moleküle mit mindestens zwei Oligonukleotidkomplementpaaren,
(i) wobei jedes Oligonukleotidkomplementpaar zwei
Oligonukleotide umfaßt, die so ausgewählt sind, daß sie
ausreichend komplementär zueinander, zu jedem Strang
der Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon
und zu den verbundenen Oligonukleotidprodukt(en) oder
einem Teil (Teilen) davon sind, um damit zu
hybridisieren; und
(ii) wobei eine Lücke von einer oder mehreren Basen
zwischen den Oligonukleotiden vorhanden ist, wenn die
Oligonukleotide mit der (den) Zielsequenz(en) oder
einem Teil (Teilen) davon hybridisiert werden; und
(iii) wobei die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß
zum Auffüllen der Lücken zwischen ihnen weniger als
alle vier Basen erforderlich sind;
(e) Auffüllen der in Schritt (d) gebildeten Lücke mit einer
oder mehreren Basen, die der Base oder den Basen in der
Lücke komplementär sind, und Verbinden der Basen, die die
Lücke füllen, miteinander und mit den beiden benachbarten
hybridisierten Oligonukleotiden oder
Oligonukleotidkomplementpaaren, wodurch ein zusätzliches verbundenes
Oligonukleotidprodukt (Oligonukleotidprodukte) gebildet wird
(werden), was zu einer Amplifikation der Zielsequenz(en)
oder eines Teiles (von Teilen) davon führt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend den Schritt
(e') des Behandelns der hybridisierten Oligonukleotide aus
Schritt (e) unter denaturierenden Bedingungen, um die
hybridisierten Oligonukleotide zu trennen und
einzelsträngige Moleküle zu erzeugen, wobei die Schritte (d), (e) und
(e') eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die
Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon doppelsträngige DNA ist
(sind) und ihre Stränge vor oder während Schritt (a) getrennt
werden.
18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die
Nukleinsäurezielsequenz(en) oder ein Teil (Teile) davon einzelsträngige DNA oder
RNA ist (sind).
19. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Oligonukleotide
Oligodesoxyribonukleotide sind.
20. Verfahren nach Anspruch 15, wobei
Oligonukleotidkomplementpaare als molarer Überschuß im Bereich von 10&sup5; bis 10¹&sup5; Paaren
pro Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon
vorliegen.
21. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Lücke durch
katalytische Mittel gefüllt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die katalytischen Mittel
eine Kombination sind, die eine DNA-Polymerase und eine DNA-
Ligase umfassen.
23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die katalytischen Mittel
auf polymeren Trägern immobilisiert sind.
24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA-Polymerase aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow-
Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase,
reverser Transkriptase besteht und die Ligase aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Ligase und T4-DNA-Ligase
besteht.
25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Polymerase und Ligase
wärmestabil sind.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die wärmestabile
Polymerase und Ligase aus einem thermophilen Bakterium isoliert
werden.
27. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Probenmischung in den
Schritten (a) und (d) Desoxyribonukleotidtriphosphate zugefügt
werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Oligonukleotide
und/oder Desoxyribonukleotidtriphosphate modifiziert sind, um
gegen 3' T 5'-Exonukleaseaktivität resistent zu sein.
29. Kit zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von
mindestens einer spezifischen Nukleinsäurezielsequenz oder einem
Teil (Teilen) davon in einer Probe, von der vermutet wird, daß
sie die Zielsequenz(en) enthält, gemäß dem Verfahren von
Anspruch 1, umfassend:
mindestens einen Behälter, der mindestens zwei
Oligonukleotidkomplementpaare enthält, wobei ein Oligonukleotidkomplementpaar
zwei Oligonukleotide umfaßt, die so ausgewählt sind, daß sie
ausreichend komplementär zueinander und zu jedem Strang der
Zielsequenz(en) oder einem Teil (Teilen) davon sind, um damit
zu hybridisieren;
ein Mittel zum Mischen der Probe mit den
Oligonukleotidkomplementpaaren unter Hybridisierungsbedingungen;
ein Mittel zum Verbinden eines Oligonukleotides von einem
ersten Oligonukleotidkomplementpaar mit einem Oligonukleotid von
einem zweiten Oligonukleotidkomplementpaar, wenn beide
Oligonukleotide an den gleichen Strang einer Nukleinsäure hybridisiert
sind, um ein verbundenes Oligonukleotidprodukt zu bilden,
nachdem die Probe und die Oligonukleotidkomplementpaare gemischt
sind, wobei das Mittel zum Verbinden des Oligonukleotids aus
dem ersten Oligonukleotidkomplementpaar mit dem Oligonukleotid
aus dem zweiten Komplementpaar eine DNA-Polymerase, eine DNA-
Ligase und Desoxyribonukleotidtriphosphate umfaßt;
und ein Mittel zum Nachweisen der verbundenen
Oligonukleotidprodukte.
30. Kit nach Anspruch 29, weiter umfassend einen Behälter, der
eine positive Kontrolle für die Oligonukleotidkomplementpaare
enthält, die die spezifischen Nukleinsäurezielsequenz(en) oder
einen Teil (Teile) davon enthält; und
einen Behälter, der eine negative Kontrolle für die
Oligonukleotidkomplementpaare enthält, die nicht die spezifischen
Nukleinsäurezielsequenz(en) oder einen Teil (Teile) davon
enthält.
31. Kit nach Anspruch 29, wobei die Oligonukleotide
Oligodesoxyribonukleotide sind.
32. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus E. coli-DNA-Polymerase-I, Klenow-
Fragmenten von E. coli-DNA-Polymerase-I, T4-DNA-Polymerase,
reverser Transkriptase besteht und die DNA-Ligase ausgewählt ist
aus der Gruppe, die aus E. coli-DNA-Ligase und T4-DNA-Ligase
besteht.
33. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase und DNA-
Ligase wärmestabil sind.
34. Kit nach Anspruch 29, wobei die DNA-Polymerase und DNA-
Ligase auf polymeren Trägern immobilisiert sind.
35. Kit nach Anspruch 29, wobei die
Desoxyribonukleotidtriphosphate markiert sind.
36. Kit nach Anspruch 29, wobei das Mittel zum Nachweisen des
verbundenen Oligonukleotidproduktes die markierten
Desoxyribonukleotidtriphosphate nachweist.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22175088A | 1988-07-20 | 1988-07-20 | |
PCT/US1989/003125 WO1990001069A1 (en) | 1988-07-20 | 1989-07-19 | Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE68926504D1 DE68926504D1 (de) | 1996-06-20 |
DE68926504T2 true DE68926504T2 (de) | 1996-09-12 |
Family
ID=22829207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE68926504T Expired - Lifetime DE68926504T2 (de) | 1988-07-20 | 1989-07-19 | Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0425563B1 (de) |
JP (1) | JP2955759B2 (de) |
AT (1) | ATE138106T1 (de) |
DE (1) | DE68926504T2 (de) |
WO (1) | WO1990001069A1 (de) |
Families Citing this family (347)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856092A (en) * | 1989-02-13 | 1999-01-05 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
JP3021036B2 (ja) * | 1989-02-13 | 2000-03-15 | ジェネコ・ピーティーワイ・リミテッド | 核酸配列又はその中の変化の検出 |
EP0439182B1 (de) * | 1990-01-26 | 1996-04-24 | Abbott Laboratories | Verbessertes Verfahren zur Amplifikation von Nuklein säurezielsequenz, einsetzbar für die Polymerase und Ligasekettenreaktion |
US5427930A (en) * | 1990-01-26 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction |
US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
US5695926A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support |
US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
DE4129653A1 (de) * | 1991-09-06 | 1993-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren |
US5846717A (en) * | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
US6872816B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-03-29 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection kits |
US5994069A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
DK0534640T3 (de) * | 1991-09-23 | 1997-03-17 | Pfizer | |
US6100099A (en) * | 1994-09-06 | 2000-08-08 | Abbott Laboratories | Test strip having a diagonal array of capture spots |
US5869252A (en) * | 1992-03-31 | 1999-02-09 | Abbott Laboratories | Method of multiplex ligase chain reaction |
AU4387193A (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-30 | Abbott Laboratories | Ligase chain reaction starting with rna sequences |
AU4788493A (en) * | 1992-07-21 | 1994-02-14 | Imclone Systems Incorporated | Gap-filling nucleic acid amplification and detection |
US6207368B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-03-27 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions |
US6180338B1 (en) * | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Beckman Coulter, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
US20060035257A1 (en) | 1992-12-07 | 2006-02-16 | Dahlberg James E | Cleavage of nucleic acids |
US6372424B1 (en) | 1995-08-30 | 2002-04-16 | Third Wave Technologies, Inc | Rapid detection and identification of pathogens |
US6673616B1 (en) | 1992-12-07 | 2004-01-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Methods and compositions for characterizing nucleic acids |
EP0682716A4 (de) * | 1993-01-15 | 1999-10-27 | New York Health Res Inst | Rna-assays mittels binären rna proben und ribozym-ligase. |
DE69434688T2 (de) * | 1993-01-15 | 2007-01-11 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase |
EP0688366B1 (de) * | 1993-01-15 | 2002-05-22 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Empfindlicher nukleinsäure-sandwichhybridisierungs-assay und kits |
WO1994017210A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Oncor, Inc. | Amplification of nucleic acid sequences |
WO1994017206A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Oncor, Inc. | Method for amplifying nucleic acid sequences |
US6495676B1 (en) | 1993-04-13 | 2002-12-17 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
US6277570B1 (en) | 1993-04-13 | 2001-08-21 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
US5767259A (en) * | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
US5846709A (en) * | 1993-06-15 | 1998-12-08 | Imclone Systems Incorporated | Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
ES2240970T3 (es) * | 1993-11-03 | 2005-10-16 | Orchid Biosciences, Inc. | Polimorfismos de nucleotido simple y su uso en analisis geneticos. |
WO1995021270A2 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | Beckman Instruments, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
WO1995021271A1 (en) * | 1994-02-07 | 1995-08-10 | Molecular Tool, Inc. | Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysistm of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis |
FR2726277B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
US5606043A (en) * | 1994-11-03 | 1997-02-25 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis of glaucoma |
US5849879A (en) * | 1994-11-03 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis of glaucoma |
US5789169A (en) * | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis of glaucoma |
US6015660A (en) * | 1995-01-06 | 2000-01-18 | The Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
US6113905A (en) * | 1995-01-06 | 2000-09-05 | The Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
US6077510A (en) * | 1995-01-06 | 2000-06-20 | Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
EP0832280A2 (de) * | 1995-06-07 | 1998-04-01 | Abbott Laboratories | Maskierungsmethode von proben zur reduktion des hintergrundes in der amplifikationsreaktion |
US5728526A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-17 | Oncor, Inc. | Method for analyzing a nucleotide sequence |
AT402203B (de) * | 1995-06-13 | 1997-03-25 | Himmler Gottfried Dipl Ing Dr | Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren |
US7195871B2 (en) | 1996-01-24 | 2007-03-27 | Third Wave Technologies, Inc | Methods and compositions for detecting target sequences |
US7122364B1 (en) | 1998-03-24 | 2006-10-17 | Third Wave Technologies, Inc. | FEN endonucleases |
US6090606A (en) * | 1996-01-24 | 2000-07-18 | Third Wave Technologies, Inc. | Cleavage agents |
US6875572B2 (en) | 1996-01-24 | 2005-04-05 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection assays |
US6706471B1 (en) | 1996-01-24 | 2004-03-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
US5985557A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
AU2320597A (en) | 1996-03-19 | 1997-10-10 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
DE19644248A1 (de) * | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Primer und Probes zum Nachweis von HIV |
EP0966542B1 (de) | 1996-11-29 | 2008-11-12 | Third Wave Technologies, Inc. | Fen-1 endonukleasen, gemische und spaltmethoden |
US7138511B1 (en) | 1997-01-28 | 2006-11-21 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
US6475724B1 (en) | 1997-01-28 | 2002-11-05 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
US6171788B1 (en) | 1997-01-28 | 2001-01-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
US7008766B1 (en) † | 1997-07-28 | 2006-03-07 | Medical Biosystems, Ltd. | Nucleic acid sequence analysis |
US8182991B1 (en) | 1997-11-26 | 2012-05-22 | Third Wave Technologies, Inc. | FEN-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods |
DE19850186A1 (de) * | 1998-10-30 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV |
EP1141409B2 (de) | 1998-12-14 | 2009-05-27 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Kit und methode zur nukleinsäuresequenzierung einzelner moleküle durch polymerase synthese |
WO2000063437A2 (en) | 1999-04-20 | 2000-10-26 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
US8481268B2 (en) | 1999-05-21 | 2013-07-09 | Illumina, Inc. | Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays |
AU1325201A (en) | 1999-07-16 | 2001-02-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Detection system based on an analyte reactive particle |
US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
US7285384B2 (en) | 2000-02-16 | 2007-10-23 | Illuminia, Inc. | Parallel genotyping of multiple patient samples |
US20040106112A1 (en) * | 2000-04-11 | 2004-06-03 | Nilsson Mats Bo Johan | Nucleic acid detection medium |
US7608393B2 (en) | 2000-04-20 | 2009-10-27 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Methods of predicting a benefit of antioxidant therapy for prevention of cardiovascular disease in hyperglycemic patients |
US7846733B2 (en) | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
US6858412B2 (en) | 2000-10-24 | 2005-02-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct multiplex characterization of genomic DNA |
US6858413B2 (en) | 2000-12-13 | 2005-02-22 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
JP4542312B2 (ja) | 2001-03-09 | 2010-09-15 | ニューゲン テクノロジーズ, インコーポレイテッド | Rna配列の増幅のための方法および組成物 |
US7060441B2 (en) | 2001-05-04 | 2006-06-13 | Biomerieux | Method for fragmenting and labeling DNA involving abasic sites and phosphate labeling |
US7338805B2 (en) | 2001-05-04 | 2008-03-04 | Bio Merieux | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules |
EP2246438B1 (de) | 2001-07-12 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Multiplex-nukleinsäurereaktionen |
CN100360722C (zh) | 2001-11-21 | 2008-01-09 | 艾普勒拉公司 | 数字化分析 |
ATE503845T1 (de) | 2001-12-10 | 2011-04-15 | Novartis Pharma Gmbh | Verfahren zur behandlung von psychosen und schizophrenie auf der basis eines polymorphismus im cntf gen |
JP4148900B2 (ja) | 2002-01-08 | 2008-09-10 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 増幅反応におけるシリカ物質の使用 |
EP2108707A3 (de) | 2002-05-17 | 2010-04-14 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Molekulare Identifizierung der Aspergillus-Species |
US9394332B2 (en) | 2002-08-29 | 2016-07-19 | Epigenomics Ag | Method for bisulfite treatment |
WO2004027041A2 (en) | 2002-09-19 | 2004-04-01 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | P. ariasi polypeptides, p. perniciosus polypeptides and methods of use |
AU2003287267A1 (en) | 2002-10-29 | 2004-05-25 | Centro De Pesquisas Goncalo Moniz | Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use |
US7560231B2 (en) | 2002-12-20 | 2009-07-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Mannitol and glucitol derivatives |
ATE373673T1 (de) | 2003-01-29 | 2007-10-15 | Hoffmann La Roche | Verbessertes verfahren zur behandlung durch bisulfit |
CA2463719A1 (en) | 2003-04-05 | 2004-10-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide analogs with six membered rings |
WO2004092418A2 (en) | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Nugen Technologies, Inc. | Global amplification using a randomly primed composite primer |
FR2855832B1 (fr) | 2003-06-03 | 2007-09-14 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique |
AU2004253882B2 (en) | 2003-06-20 | 2010-06-10 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
US20040259100A1 (en) | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
FR2857375B1 (fr) | 2003-07-10 | 2007-11-09 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus |
ATE489481T1 (de) | 2003-09-12 | 2010-12-15 | Univ Cincinnati | Verfahren zur risikobeurteilung, überlebensvorhersage und behandlung von herzversagen und anderen leiden auf der grundlage von polymorphismen adrenerger rezeptoren |
CA2482097C (en) | 2003-10-13 | 2012-02-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for isolating nucleic acids |
JP4435174B2 (ja) | 2003-12-02 | 2010-03-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 |
FR2868071B1 (fr) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
FR2868433B1 (fr) | 2004-04-06 | 2008-01-18 | Biomerieux Sa | Procede pour le pronostic et/ou le diagnostic d'un cancer |
EP1804059A2 (de) | 2004-05-21 | 2007-07-04 | Atonomics A/S | Oberflächenschallwellensensor mit einem Hydrogel |
US7399614B2 (en) | 2004-06-30 | 2008-07-15 | Applera Corporation | 5-methylcytosine detection, compositions and methods therefor |
EP1632578A1 (de) | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Roche Diagnostics GmbH | Methode zur Dekontamination der DNA |
ES2345993T3 (es) | 2004-09-14 | 2010-10-07 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Metodo para el tratamiento con bucindolol basado en direccionamiento genetico. |
FR2881437B1 (fr) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique |
US9127305B2 (en) | 2005-02-28 | 2015-09-08 | Bioquest, Inc. | Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules |
EP1856257B1 (de) | 2005-03-05 | 2011-10-19 | Seegene, Inc. | Verfahren unter verwendung eines oligonukleotids mit doppelspezifität und oligonukleotid mit doppelspezifität |
WO2006095941A1 (en) | 2005-03-05 | 2006-09-14 | Seegene, Inc. | Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide |
US7759469B2 (en) | 2005-03-10 | 2010-07-20 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Labeling reagent |
EP1700922B1 (de) | 2005-03-10 | 2016-08-24 | Roche Diagnostics GmbH | 3-Substituierte 5-Nitroindolderivate und diese enthaltende markierte Oligonukleotidsonden |
FR2886735B1 (fr) | 2005-06-01 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | Procede de marquage ou de traitement d'un echantillon biologique contenant des molecules biologiques d'interet, notamment des acides nucleiques |
EP1929046B1 (de) | 2005-09-07 | 2012-07-11 | Nugen Technologies, Inc. | Verbessertes nukleinsäureamplifikationsverfahren |
IL172297A (en) | 2005-10-03 | 2016-03-31 | Compugen Ltd | Soluble vegfr-1 variants for the diagnosis of preeclampsia |
EP2351843B1 (de) | 2005-10-14 | 2013-06-12 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Vektoren-Systeme aus Tollwut-Viren und deren Zusammensetzungen und Methoden |
KR20080073748A (ko) | 2005-11-16 | 2008-08-11 | 노파르티스 아게 | 척수 손상에서의 항-nogo-a 항체 치료를 위한바이오마커 |
FR2902430B1 (fr) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence des genes h5 et n1 du virus d'influenza a |
US7981606B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-07-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Control for nucleic acid testing |
WO2007080597A2 (en) | 2006-01-16 | 2007-07-19 | Compugen Ltd. | Polynucleotide and polypeptide sequences and methods for diagnosis |
CA3185510A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-23 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Primers and probes for detection and discrimination of types and subtypes of influenza viruses |
WO2007106536A2 (en) | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Oregon Health & Science University | Methods for producing an immune response to tuberculosis |
WO2007133703A2 (en) | 2006-05-10 | 2007-11-22 | Dxterity Diagnostics | Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes |
FR2906537A1 (fr) | 2006-09-28 | 2008-04-04 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic in vitro du cancer broncho-pulmonaire par detection des transcrits majoritaires alternatifs du gene klk8 codant la kallicreine 8 et son utilisation pour le pronostic de survie |
JP5354894B2 (ja) | 2006-12-11 | 2013-11-27 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ポリドカノールおよび誘導体を用いた核酸単離 |
EP1932913B1 (de) | 2006-12-11 | 2013-01-16 | Roche Diagnostics GmbH | Nukleinsäureisolation mithilfe von Polidocanol und Derivaten davon |
NZ720288A (en) | 2006-12-27 | 2020-02-28 | Harvard College | Compositions and methods for the treatment of infections and tumors |
EP1956097A1 (de) | 2007-02-06 | 2008-08-13 | bioMerieux B.V. | Verfahren zur Unterscheidung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) |
EP2125868B1 (de) | 2007-02-28 | 2015-06-10 | The Govt. Of U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Brachyurie-polypeptide und verwendungsverfahren |
CA2629589C (en) | 2007-04-20 | 2016-03-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Isolation and purification of nucleic acid molecules with a solid phase |
US8993855B2 (en) | 2007-05-02 | 2015-03-31 | Syngenta Participations Ag | Insect resistant plant |
EP1995320A3 (de) | 2007-05-23 | 2009-01-07 | Syngeta Participations AG | Polynukleotidmarker |
FR2917090B1 (fr) | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
EP2016821A1 (de) | 2007-06-13 | 2009-01-21 | Syngeta Participations AG | Neues Hybridsystem für Brassica napus (Raps) |
IL183902A0 (en) | 2007-06-13 | 2007-10-31 | Zeraim Gedera Ltd | Parthenocarpic pepper |
US8008010B1 (en) | 2007-06-27 | 2011-08-30 | Applied Biosystems, Llc | Chimeric oligonucleotides for ligation-enhanced nucleic acid detection, methods and compositions therefor |
JP2010537637A (ja) | 2007-08-27 | 2010-12-09 | アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド | Pcrのための方法および組成物 |
EP2071034A1 (de) | 2007-12-12 | 2009-06-17 | bioMérieux | Verfahren zur Behandlung einer Lösung zum Vernichten von Ribonukleinsäure nach der Amplifikation |
CN101952461B (zh) | 2008-01-14 | 2017-12-05 | 应用生物***有限公司 | 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒 |
US8034568B2 (en) | 2008-02-12 | 2011-10-11 | Nugen Technologies, Inc. | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions |
MX2010010161A (es) | 2008-03-15 | 2011-03-21 | Hologic Inc Star | Composiciones y metodos para el analisis de moleculas de acido nucleico durante reacciones de amplificacion. |
WO2009117698A2 (en) | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Nugen Technologies, Inc. | Methods of rna amplification in the presence of dna |
EP2108699B1 (de) | 2008-04-08 | 2014-06-25 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion |
JP2011517941A (ja) | 2008-04-10 | 2011-06-23 | ジーンニュース・コーポレーション | 被験者における結腸直腸癌の確率を決定するための方法および装置 |
EP2644710B1 (de) | 2008-04-30 | 2016-12-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase-h-basierte assays unter verwendung von modifizierten rna monomeren |
US10227641B2 (en) | 2008-04-30 | 2019-03-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
EP2402462A1 (de) | 2008-06-06 | 2012-01-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Intern gesteuerte Multiplex-Erkennung und Quantifizierung von mikrobiellen Nukleinsäuren |
FR2934595B1 (fr) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
EP2353008A2 (de) | 2008-09-22 | 2011-08-10 | Oregon Health and Science University | Verfahren zum nachweis einer infektion mit mycobacterium tuberculosis |
EP2172563A1 (de) | 2008-09-24 | 2010-04-07 | bioMérieux S.A. | Verfahren zur Verringerung der Abhängigkeit von Sequenzvariationen eines Nukleinsäuretargets in einem diagnostischen Hybridisierungs-Assay |
EP2177271B8 (de) | 2008-10-15 | 2019-12-18 | F. Hoffmann-La Roche AG | Magnetisches Trennsystem mit flexiblen magnetischen Stiften und zugehöriges Verfahren |
EP2189218A1 (de) | 2008-11-12 | 2010-05-26 | F. Hoffmann-Roche AG | Trennung in einer Mikrowell platte unter Zuhilfenahme des Deckels |
WO2010055525A1 (en) | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Method for predicting a patient's responsiveness to anti-folate therapy |
MX2011005691A (es) | 2008-11-28 | 2011-07-20 | Univ Emory | Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores. |
WO2010061393A1 (en) | 2008-11-30 | 2010-06-03 | Compugen Ltd. | He4 variant nucleotide and amino acid sequences, and methods of use thereof |
US8628762B2 (en) | 2008-12-10 | 2014-01-14 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | T-helper cell type 17 lineage-specific adjuvants, compositions and methods |
FR2940805B1 (fr) | 2009-01-05 | 2015-10-16 | Biomerieux Sa | Procede d'amplification et/ou de detection d'acides nucleiques, kits et utilisations de ce procede |
CA2752702A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Murdoch Childrens Research Institute | Assay for determining epigenetic profiles of markers of fragile x alleles |
EP2399131B1 (de) | 2009-02-20 | 2014-08-27 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Verfahren zur diagnose von altersbedingten gefässerkrankung |
CA2757300C (en) | 2009-04-01 | 2018-01-09 | Dxterity Diagnostics Incorporated | Chemical ligation dependent probe amplification (clpa) |
US8835117B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-09-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acids for detection and discrimination of genotypes of Chlamydophila psittaci |
WO2010138908A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Ventana Medical Systems, Inc. | Igfir gene copy number as a prognostic marker in a non-small cell lung cancer |
US20120141472A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-06-07 | Shalini Singh | Methods of scoring gene copy number in a biological sample using in situ hybridization |
EP2272328A1 (de) | 2009-07-06 | 2011-01-12 | Syngenta Participations AG | Gegenüber einem Pathogen resistente Pflanze |
EP2292774A1 (de) | 2009-08-17 | 2011-03-09 | Syngenta Participations AG. | Krankheitsresistente Tomatenpflanzen |
US9512481B2 (en) | 2009-09-11 | 2016-12-06 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Polymorphisms in the PDE3A gene |
FR2950358B1 (fr) | 2009-09-18 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | Dispositif d'amplification d'acides nucleiques simplifie et son procede de mise en oeuvre |
EP2308285A1 (de) | 2009-09-22 | 2011-04-13 | Syngenta Participations AG | Brassica oleracea Pflanzen mit Resistenz gegen Albugo candida |
CN103403026B (zh) | 2009-09-25 | 2016-05-11 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | Hiv-1中和抗体及其用途 |
EP3236264A3 (de) | 2009-10-13 | 2017-11-08 | Nanostring Technologies, Inc | Proteinnachweis über nanoreporter |
US9181306B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-11-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine |
EP3263124A1 (de) | 2009-11-20 | 2018-01-03 | Oregon Health&Science University | Verfahren zum hervorrufen einer immunantwort auf tuberkulose |
KR101151602B1 (ko) * | 2009-12-15 | 2012-06-08 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 클레나우 단편을 이용한 rt-pcr 반응의 성능을 개선시키는 방법 |
EP2515899B1 (de) | 2009-12-23 | 2016-05-25 | ARCA biopharma, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen für herz-kreislauf-erkrankungen und -leiden |
TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對alk抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
US9260762B2 (en) | 2010-04-16 | 2016-02-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Real time PCR assay for detection of bacterial respiratory pathogens |
US9828637B2 (en) | 2010-04-18 | 2017-11-28 | Wake Forest University Health Sciences | Methods of predicting predisposition to or risk of kidney disease |
KR101223660B1 (ko) | 2010-05-20 | 2013-01-17 | 광주과학기술원 | HIF-2α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
KR101176139B1 (ko) | 2010-05-20 | 2012-08-22 | 광주과학기술원 | 관절염 동물모델로서 연골 특이적 HIF?2α 형질전환 마우스 및 이의 용도 |
US8828688B2 (en) | 2010-05-27 | 2014-09-09 | Affymetrix, Inc. | Multiplex amplification methods |
EP2576815B1 (de) | 2010-06-04 | 2018-02-14 | Biomérieux | Verfahren zur prognose von kolorektalkarzinom |
CA2802857C (en) | 2010-06-16 | 2018-09-11 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Antibodies to endoplasmin and their use |
ES2569220T3 (es) | 2010-06-22 | 2016-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Envase de suspensión para partículas de unión para el aislamiento de material biológico |
WO2012006056A2 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-12 | Oregon Health & Science University | Ccr6 as a biomarker of alzheimer's disease |
EP2580325A4 (de) | 2010-07-16 | 2013-11-20 | Tocagen Inc | Retrovirenerkennung |
ES2605303T3 (es) | 2010-07-29 | 2017-03-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos |
ES2617258T5 (es) | 2010-07-29 | 2023-11-15 | Hoffmann La Roche | Preparación de muestras genéricas |
EP2598653B1 (de) | 2010-07-29 | 2017-08-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Generische pcr |
EP2598656B1 (de) | 2010-07-29 | 2017-07-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Kontrollnukleinsäuren für mehrere parameter |
WO2012019235A1 (en) | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Murdoch Childrens Research Institute | Treatment and diagnosis of epigenetic disorders and conditions |
CA2809643C (en) | 2010-08-30 | 2019-09-24 | John P. Davies | Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics |
BR112013004691A2 (pt) | 2010-08-30 | 2017-11-21 | Dow Agrosciences Llc | construto de dna de ativação gênica marcada de milho, população marcada de plantas de milho, método para geração da mesma e método para gerar uma planta de milho marcada |
EP2426222A1 (de) | 2010-09-07 | 2012-03-07 | F. Hoffmann-La Roche AG | Generischer Puffer zur Amplifikation |
US9110079B2 (en) | 2010-09-29 | 2015-08-18 | Biomerieux | Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS |
US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
EP2465945A1 (de) | 2010-12-17 | 2012-06-20 | F. Hoffmann-La Roche AG | Allgemeine Matrix zur Steuerung von Nukleinsäuren |
WO2013082164A1 (en) | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Life Technologies Corporation | Enhanced ligation reactions |
WO2012095841A1 (en) | 2011-01-10 | 2012-07-19 | State Of Israel, Ministry Of Agriculture And Rural Development, A.R.O. - Volcani Center | Improved tomato plants |
AU2012209074A1 (en) | 2011-01-25 | 2013-07-11 | Almac Diagnostics Limited | Colon cancer gene expression signatures and methods of use |
CN103703143B (zh) | 2011-01-31 | 2016-12-14 | 爱普瑞斯生物公司 | 鉴定细胞中的多个表位的方法 |
AU2012212148B8 (en) | 2011-02-02 | 2017-07-06 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel contiguity mapping |
WO2012129758A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer |
US9150644B2 (en) | 2011-04-12 | 2015-10-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II |
EP2514304A1 (de) | 2011-04-20 | 2012-10-24 | Syngenta Participations AG | Gegenüber Potyvirus resistente Kürbispflanze |
KR101291668B1 (ko) | 2011-04-21 | 2013-08-01 | 서울대학교산학협력단 | 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도 |
WO2012151111A1 (en) | 2011-05-04 | 2012-11-08 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements |
JP2014513557A (ja) | 2011-05-17 | 2014-06-05 | ディクステリティー ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | 標的核酸を検出する方法及び組成物 |
EP2535712A1 (de) | 2011-06-15 | 2012-12-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Analytisches System zur Herstellung eines biologischen Materials |
CA2838091C (en) | 2011-07-05 | 2019-08-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Hiv-1 genotyping assay for global surveillance of hiv-1 drug resistance |
US9777322B2 (en) | 2011-07-08 | 2017-10-03 | Keygene N.V. | Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays |
WO2013045505A1 (en) | 2011-09-28 | 2013-04-04 | Novartis Ag | Biomarkers for raas combination therapy |
WO2013049535A2 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Influenza vaccine |
JP6181660B2 (ja) | 2011-11-15 | 2017-08-16 | ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル | 血中のストレプトコッカス・ニューモニエの検出 |
AU2013202941B2 (en) | 2012-02-29 | 2015-06-25 | Dow Agrosciences Llc | Sugarcane bacilliform viral (SCBV) enhancer and its use in plant functional genomics |
WO2013142808A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pathogenic phlebovirus isolates and compositions and methods of use |
US9428813B2 (en) | 2012-03-26 | 2016-08-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services | DNA methylation analysis for the diagnosis, prognosis and treatment of adrenal neoplasms |
EP2830621B1 (de) | 2012-03-29 | 2020-10-21 | Novartis AG | Pharmazeutisches diagnostikum |
WO2013152352A1 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens |
CA2871490C (en) | 2012-04-27 | 2022-10-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of cpg oligonucleotides co-formulated with an antibiotic to accelerate wound healing |
US9803251B2 (en) | 2012-05-03 | 2017-10-31 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods of detecting influenza virus |
US9394574B2 (en) | 2012-06-12 | 2016-07-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods for detecting Legionella nucleic acids in a sample |
US9631243B2 (en) | 2012-06-18 | 2017-04-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for identifying JC virus |
EP2882868B1 (de) | 2012-08-08 | 2019-07-31 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Dynamikbereichssteigerung zur identifikation mehrerer epitope in zellen |
US20150224181A1 (en) | 2012-09-14 | 2015-08-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Se | Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use |
US9181583B2 (en) | 2012-10-23 | 2015-11-10 | Illumina, Inc. | HLA typing using selective amplification and sequencing |
US9775895B2 (en) | 2012-12-12 | 2017-10-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HIV therapeutics and methods of making and using same |
US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
AU2014212230B2 (en) | 2013-02-01 | 2019-07-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Method for generating retinal pigment epithelium (RPE) cells from induced pluripotent stem cells (iPSCs) |
EP2956169B1 (de) | 2013-02-12 | 2018-04-11 | THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by the S | Monoklonale antikörper zur neutralisierung von noroviren |
NL1040073C2 (en) | 2013-02-28 | 2014-09-01 | Agrisemen B V | Lactuca sativa with bremia lactucae (downy mildew) resistance. |
WO2014142831A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Methods and systems for aligning repetitive dna elements |
KR101943623B1 (ko) | 2013-03-13 | 2019-01-30 | 주식회사 씨젠 | 멜팅 피크 분석을 이용한 타겟 핵산서열의 정량 |
EP3919617A1 (de) | 2013-03-13 | 2021-12-08 | Illumina, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur nukleinsäuresequenzierung |
US10612088B2 (en) | 2013-03-14 | 2020-04-07 | The Broad Institute, Inc. | Massively multiplexed RNA sequencing |
KR101403507B1 (ko) | 2013-03-21 | 2014-06-09 | 주식회사 현일바이오 | 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트 |
KR101507505B1 (ko) | 2013-04-18 | 2015-04-07 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 |
JP2016518126A (ja) | 2013-04-19 | 2016-06-23 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ローンスターウイルス |
WO2014183052A1 (en) | 2013-05-09 | 2014-11-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Depart Of Health And Human Services | Single-domain vhh antibodies directed to norovirus gi.1 and gii.4 and their use |
US10072300B2 (en) | 2013-05-21 | 2018-09-11 | Biomerieux | Kit for the prognosis of colorectal cancer |
WO2015061475A2 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | THE GOVERNMENT OF THE USA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEATLH AND HUMAN SERV | Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses |
US20150191707A1 (en) | 2013-11-14 | 2015-07-09 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Dna polymerase mutants having enhanced template discrimination activity |
EP3080268A1 (de) | 2013-12-09 | 2016-10-19 | Illumina, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur gezielten nukleinsäuresequenzierung |
CA2932283A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Illumina, Inc. | Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples |
US10398772B2 (en) | 2014-01-08 | 2019-09-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Ras pathways as markers of protection against HIV and methods to improve vaccine efficacy |
US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
BR112016016546B1 (pt) | 2014-01-16 | 2022-09-06 | Illumina, Inc | Método de preparação de amplicon e métodos para determinação da presença de um gene associado a câncer e de uma variante de sequência de ácidos nucleicos verdadeira |
WO2015127201A1 (en) | 2014-02-21 | 2015-08-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Hiv-2 nucleic acids and methods of detection |
WO2015147370A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
US20170044631A1 (en) | 2014-04-14 | 2017-02-16 | The Unite States of America, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services | Methods for rapid detection and identification of viral nucleic acids |
US20150353989A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-10 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
EP3154696B1 (de) | 2014-06-10 | 2020-04-08 | DxTerity Diagnostics Incorporated | Vorrichtungen und verfahren zur entnahme und stabilisierung biologischer proben |
GB201410420D0 (en) | 2014-06-11 | 2014-07-23 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for estimating cluster numbers |
CN117867071A (zh) | 2014-06-13 | 2024-04-12 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于制备序列文库的方法和组合物 |
WO2015199976A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Target activated microdissection |
CN112430641A (zh) | 2014-06-30 | 2021-03-02 | 亿明达股份有限公司 | 使用单侧转座的方法和组合物 |
WO2016016897A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-04 | Smadar Avigad | Prognostic methods and systems of treatment for acute lymphoblastic leukemia |
JP6811706B2 (ja) | 2014-07-31 | 2021-01-13 | ザ ホンコン ユニヴァーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー | Epha4に対するヒトモノクローナル抗体及びそれらの使用 |
WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
US20160085910A1 (en) | 2014-09-18 | 2016-03-24 | Illumina, Inc. | Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data |
IL299976B1 (en) | 2014-10-17 | 2024-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | Continuity-preserving transposition |
GB201419731D0 (en) | 2014-11-05 | 2014-12-17 | Illumina Cambridge Ltd | Sequencing from multiple primers to increase data rate and density |
WO2016089920A1 (en) | 2014-12-01 | 2016-06-09 | The Broad Institute, Inc. | Method for in situ determination of nucleic acid proximity |
US10072070B2 (en) | 2014-12-05 | 2018-09-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Potent anti-influenza A neuraminidase subtype N1 antibody |
WO2016116935A1 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Use of rasa2 as a prognostic and therapeutic marker for melanoma |
KR101718800B1 (ko) | 2015-01-21 | 2017-03-24 | 주식회사 디알나노 | 약물 및 siRNA의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도 |
WO2016134144A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and reagents for detecting ebola virus |
EP3268462B1 (de) | 2015-03-11 | 2021-08-11 | The Broad Institute, Inc. | Genotyp- und phänotypkupplung |
WO2016156845A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Illumina Cambridge Limited | Surface concatamerization of templates |
WO2016164407A2 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Polyskope Labs | Detection of one or more pathogens |
ES2759477T3 (es) | 2015-05-29 | 2020-05-11 | Hoffmann La Roche | Un procedimiento de inactivación de microbios por anhídrido citracónico |
CN115261468A (zh) | 2015-07-06 | 2022-11-01 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于核酸扩增的样品制备 |
WO2017031370A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains |
CN108431214B (zh) | 2015-10-05 | 2022-03-01 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途 |
KR101651817B1 (ko) | 2015-10-28 | 2016-08-29 | 대한민국 | Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트 |
AU2016356474A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-06-21 | Seegene, Inc. | Method for calibrating a data set of a target analyte |
EP3390665B1 (de) | 2015-12-15 | 2023-12-06 | Seegene, Inc. | Signalextraktion für eine zielnukleinsäuresequenz |
US10978173B2 (en) | 2016-02-05 | 2021-04-13 | Seegene, Inc. | Method for reducing noise level of data set for a target analyte |
KR101845957B1 (ko) | 2016-02-23 | 2018-04-05 | 전남대학교기술지주회사(주) | 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 |
US20170274374A1 (en) | 2016-03-28 | 2017-09-28 | Ilumina, Inc. | Multi-plane microarrays |
WO2017192589A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification |
WO2017200790A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay with modified probe for the diagnosis of rabies viruses and other lyssaviruses |
WO2017221225A1 (en) | 2016-06-19 | 2017-12-28 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Screening for chemotherapy resistance in human haploid cells |
WO2018005284A1 (en) | 2016-06-27 | 2018-01-04 | The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for influenza a virus subtyping |
CN117822128A (zh) | 2016-07-22 | 2024-04-05 | 俄勒冈健康与科学大学 | 单细胞全基因组文库及制备其的组合索引方法 |
US10422012B2 (en) | 2016-10-10 | 2019-09-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Devices comprising bacteriophage PHI6 internal control compositions |
US11031099B2 (en) | 2016-11-09 | 2021-06-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of sequence variants |
BR112019011378A2 (pt) | 2016-12-06 | 2019-10-15 | Univ Oregon State | composições e métodos para a produção potencializada de enduracidina em uma cepa geneticamente modificada de streptomyces fungicidicus |
US10793901B2 (en) | 2016-12-28 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reversibly protected nucleotide reagents with high thermal stability |
KR101936799B1 (ko) | 2017-01-09 | 2019-01-11 | 주식회사 엠이티라이프사이언스 | 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법 |
CA3059839C (en) | 2017-04-23 | 2023-01-03 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
DK3615690T3 (da) | 2017-04-23 | 2021-11-15 | Illumina Cambridge Ltd | Sammensætninger og fremgangsmåder til forbedring af prøveidentificering i indekserede nukleinsyrebiblioteker |
ES2937929T3 (es) | 2017-04-23 | 2023-04-03 | Illumina Inc | Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácido nucleico indexadas |
US11708613B2 (en) | 2017-05-03 | 2023-07-25 | The United States of America, as Represened by the Secretary, Department of Health and Human Services | Rapid detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification |
EP4124862A1 (de) | 2017-05-05 | 2023-02-01 | bioMérieux | Verfahren zum nachweis einer zellulären immunantwort |
US10995104B2 (en) | 2017-05-30 | 2021-05-04 | Roche Molecular System, Inc. | Catalysts for reversing formaldehyde adducts and crosslinks |
US20180355348A1 (en) | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Oregon Health & Science University | Single cell whole genome libraries for methylation sequencing |
US20180363044A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for improving the thermal stability of nucleic acid amplification reagents |
WO2018232028A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Detection of blaimp antibacterial resistance genes |
GB201710838D0 (en) | 2017-07-05 | 2017-08-16 | Ucl Business Plc | Bispecific antibodies |
WO2019017680A2 (ko) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | 국민대학교 산학협력단 | 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트 |
KR101956315B1 (ko) | 2017-07-19 | 2019-03-08 | 국민대학교 산학협력단 | 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트 |
WO2019027767A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Illumina Inc. | SEQUENCING SYSTEM COMPRISING AGGREGATION OF MULTIPLEXED BIOLOGICAL SAMPLES |
CA3067048C (en) | 2017-08-01 | 2024-03-05 | Illumina, Inc. | Hydrogel beads for nucleotide sequencing |
EP4339298A3 (de) | 2017-09-25 | 2024-04-17 | Fred Hutchinson Cancer Center | Hocheffiziente gezielte genomweite in-situ-profilierung |
EP3692152A4 (de) | 2017-10-04 | 2021-12-01 | The Broad Institute, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur veränderung der funktion und struktur von chromatinschleifen und/oder -domänen |
CA3080871C (en) | 2017-10-31 | 2024-05-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved magnetic beads comprising a liquid-glass coating and uses thereof in nucleic acid capture or purification |
US11078534B2 (en) | 2017-11-27 | 2021-08-03 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photocleavable nucleotide reagents with high stability |
WO2019133727A1 (en) | 2017-12-29 | 2019-07-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Universal influenza virus probe set for enrichment of any influenza virus nucleic acid |
WO2019152860A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Random amplification methods for extremely low input nucleic acids |
EP4253562A3 (de) | 2018-02-13 | 2023-10-25 | Illumina, Inc. | Dna-sequenzierung unter verwendung von hydrogelperlen |
US20190292596A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Modified nucleoside phosphates with high thermal stability |
US20190367909A1 (en) | 2018-04-02 | 2019-12-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing |
FR3080185A1 (fr) | 2018-04-16 | 2019-10-18 | Biomerieux | Evaluation du risque de complication chez un patient suspecte d'avoir une infection ayant un score sofa inferieur a deux |
RU2750567C2 (ru) | 2018-04-20 | 2021-06-29 | Иллумина, Инк. | Способы инкапсулирования одиночных клеток, инкапсулированные клетки и способы их применения |
WO2019222688A1 (en) | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Illumina, Inc. | High-throughput single-cell sequencing with reduced amplification bias |
WO2019227056A2 (en) | 2018-05-25 | 2019-11-28 | Arca Biopharma Inc. | Methods and compositions involving bucindolol for the treatment of atrial fibrillation |
US11384376B2 (en) | 2018-05-31 | 2022-07-12 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids |
MX2019015262A (es) | 2018-06-04 | 2023-01-25 | Illumina Inc | Bibliotecas de transcriptomas de celulas individuales de alto rendimiento y metodos de fabricacion y uso. |
EP3829569A4 (de) | 2018-07-27 | 2022-04-27 | Aperta Biosciences, LLC | Spinosyn-formulierungen zur behandlung von demodex-induzierten augen- und gesichtsstörungen |
MX2021003772A (es) | 2018-10-26 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Modulacion de globulos de polimero para procesamiento de adn. |
SG11202102700TA (en) | 2018-11-30 | 2021-04-29 | Illumina Inc | Analysis of multiple analytes using a single assay |
MX2021003746A (es) | 2019-03-01 | 2021-06-23 | Illumina Inc | Genotecas de núcleos únicos y células únicas de alto rendimiento y métodos para elaborarlas y usarlas. |
US20220262462A1 (en) | 2019-04-10 | 2022-08-18 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Computational filtering of methylated sequence data for predictive modeling |
KR20220034716A (ko) | 2019-07-12 | 2022-03-18 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법 |
AU2020312787A1 (en) | 2019-07-12 | 2021-06-17 | Illumina Cambridge Limited | Nucleic acid library preparation using electrophoresis |
JP2022548302A (ja) * | 2019-09-23 | 2022-11-17 | エレメント バイオサイエンシーズ,インク. | 細胞アドレス指定可能な核酸シーケンシングの方法 |
US11844800B2 (en) | 2019-10-30 | 2023-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia |
JP2023505327A (ja) | 2019-12-09 | 2023-02-08 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | ジカチオン性蛍光色素 |
EP3927824A2 (de) | 2019-12-19 | 2021-12-29 | Illumina, Inc. | Einzelzellbibliotheken mit hohem durchsatz und verfahren zur herstellung und verwendung davon |
US20230105642A1 (en) | 2020-03-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Method and compositions for preparing nucleic acid libraries |
EP4150065A2 (de) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Illumina Inc | Erzeugung von nukleinsäuren mit modifizierten basen unter verwendung rekombinanter terminaler deoxynucleotidyltransferase |
WO2021246820A1 (ko) | 2020-06-05 | 2021-12-09 | 주식회사 씨젠 | 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법 |
WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
DE202021100985U1 (de) | 2020-06-26 | 2021-06-18 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Ein diagnostisches Assay-Kit und Mittel zum Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäure |
EP4172364A1 (de) | 2020-06-30 | 2023-05-03 | Illumina, Inc. | Katalytisch gesteuerte sequenzierung durch synthese zur herstellung von narbenfreier dna |
CA3190588A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Illumina, Inc. | Preparation of rna and dna sequencing libraries using bead-linked transposomes |
KR20230051508A (ko) | 2020-08-18 | 2023-04-18 | 일루미나, 인코포레이티드 | 핵산의 서열-특이적 표적화된 전위 및 선택과 분류 |
WO2022053610A1 (en) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Illumina Cambridge Limited | Methods of enriching a target sequence from a sequencing library using hairpin adaptors |
WO2022056078A1 (en) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Rnase h-assisted detection assay for rna (radar) |
AU2021409723A1 (en) | 2020-12-24 | 2023-06-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h2 mutants that reduce primer dimers and off-target amplification in rhpcr-based amplicon sequencing with high-fidelity dna polymerases |
WO2022169972A1 (en) | 2021-02-04 | 2022-08-11 | Illumina, Inc. | Long indexed-linked read generation on transposome bound beads |
IL307177A (en) | 2021-03-29 | 2023-11-01 | Illumina Inc | Compounds and methods for assessing DNA damage in the library and normalizing amplicon size bias |
MX2023010814A (es) | 2021-03-29 | 2023-09-27 | Illumina Inc | Metodos mejorados de preparacion de genotecas. |
MX2023010495A (es) | 2021-03-30 | 2023-09-18 | Illumina Inc | Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos. |
AU2022249289A1 (en) | 2021-03-31 | 2023-08-17 | Illumina Cambridge Limited | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |
KR20240029767A (ko) | 2021-06-24 | 2024-03-06 | 주식회사 씨젠 | 개별적으로 동작되는 생물학적 장치들을 이용한 자동화 분석 시스템, 분석 방법 및 저장 매체 |
CA3227000A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Seegene, Inc. | Assembled analysis system, method, and computer readable recording medium |
KR20240056605A (ko) | 2021-09-30 | 2024-04-30 | 주식회사 씨젠 | 분자진단 시스템의 샘플 처리 및 분석 방법 |
KR20240090267A (ko) | 2021-10-29 | 2024-06-21 | 주식회사 씨젠 | 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법 |
AU2023248405A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
WO2024069581A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use |
WO2024073047A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
WO2024073043A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4710465A (en) * | 1984-04-19 | 1987-12-01 | Yale University | Junction-fragment DNA probes and probe clusters |
US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
GB8612087D0 (en) * | 1986-05-19 | 1986-06-25 | Ici Plc | Hybridisation probes |
CA1323293C (en) * | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
US5449602A (en) * | 1988-01-13 | 1995-09-12 | Amoco Corporation | Template-directed photoligation |
JP2801051B2 (ja) * | 1988-06-24 | 1998-09-21 | アムジエン・インコーポレーテツド | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 |
-
1989
- 1989-07-19 WO PCT/US1989/003125 patent/WO1990001069A1/en active IP Right Grant
- 1989-07-19 DE DE68926504T patent/DE68926504T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-19 AT AT89908607T patent/ATE138106T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-19 JP JP1508126A patent/JP2955759B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-19 EP EP89908607A patent/EP0425563B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0425563A1 (de) | 1991-05-08 |
JP2955759B2 (ja) | 1999-10-04 |
EP0425563A4 (en) | 1992-06-10 |
JPH03505971A (ja) | 1991-12-26 |
WO1990001069A1 (en) | 1990-02-08 |
ATE138106T1 (de) | 1996-06-15 |
DE68926504D1 (de) | 1996-06-20 |
EP0425563B1 (de) | 1996-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE68926504T2 (de) | Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen | |
DE69527392T2 (de) | Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikation | |
DE3750198T3 (de) | Hybridisierungssonden. | |
DE68927373T2 (de) | Verfahren und mittel zum nachweis von nukleinsäuresequenzen | |
DE69327326T2 (de) | Vervielfältigungs- und detektionsprozess | |
DE3689954T2 (de) | Amplifiziertes hybridisierungstestverfahren. | |
DE69432709T2 (de) | Nukleinsäure - Sandwichassay in Lösungsphase mit reduzierten Hintergrundsignalen | |
DE69122457T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotides zur Verwendung bei Einzelprimeramplifikation | |
DE69322266T2 (de) | Proben zusammensetzung und verfahren | |
DE69736667T2 (de) | Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm) | |
DE69231124T2 (de) | Schnelle bestimmungsverfahren für amplifikationsprodukte | |
DE3885027T2 (de) | Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Polynukleotide. | |
DE69219727T2 (de) | Nukleinsäure Zielerzeugung | |
DE3687287T3 (de) | Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen. | |
DE3687537T2 (de) | Verfahren zur amplifikation, zum nachweis und/oder zur klonierung von nukleinsaeuresequenzen. | |
DE3280478T2 (de) | Basenmodifizierte Oligo- und Polynucleotide und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung | |
DE69133574T2 (de) | Verfahren zur Unterscheidung von Sequenz Varianten | |
DE69028325T2 (de) | Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers | |
DE69736668T2 (de) | Nukleinsaeure vervielfaeltigungsverfahren auf basis der ramifikations-extensions-amplifizierung (ram) und der in vitro transkription | |
DE68926484T2 (de) | RNS-Template mit endverbundener Sonde und Verfahren zur Verwendung | |
DE3688931T2 (de) | Arabinonukleinsäure-Sonden für DNS/RNS-Bestimmungen. | |
AT395434B (de) | Verbessertes verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren und reagenzienkombination und besteck zu seiner durchfuehrung | |
DE69516116T2 (de) | Sequenzierung von nukleinsäuren | |
DE69004632T2 (de) | Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren. | |
DE69029740T2 (de) | Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |