ES2605303T3 - Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos - Google Patents

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ES2605303T3 ES11738214.3T ES11738214T ES2605303T3 ES 2605303 T3 ES2605303 T3 ES 2605303T3 ES 11738214 T ES11738214 T ES 11738214T ES 2605303 T3 ES2605303 T3 ES 2605303T3
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Abstract

Un método para detectar y cuantificar simultáneamente un ácido nucleico microbiano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método: a) aislar y purificar dicho ácido nucleico microbiano, b) proporcionar una mezcla de reacción que comprende un primer y un segundo ácido nucleico control en diferentes concentraciones en la que el primer ácido nucleico control es un ácido nucleico patrón cuantitativo presente en una concentración de 20 a 5.000 veces el límite de detección de dicho ácido nucleico microbiano, y el segundo ácido nucleico control es un ácido nucleico control interno cualitativo presente en una concentración de 1 a 10 veces el límite de detección de dicho ácido nucleico microbiano, uno o más pares de cebadores que hibridan específicamente con distintas porciones de secuencia de dicho ácido nucleico microbiano y con distintas porciones de secuencia de dichos ácidos nucleicos control, y sondas que hibridan específicamente con cada una de las secuencias amplificadas por dichos uno o más pares de cebadores, en los que dicho ácido nucleico microbiano y dicho primer ácido nucleico control y dicho segundo ácido nucleico control hibridan con diferentes sondas que llevan diferentes marcadores, c) añadir el ácido nucleico microbiano aislado y purificado a dicha mezcla de reacción, d) realizar una o más etapas de ciclado, en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de amplificación, comprendiendo dicha etapa de amplificación la producción de uno o más productos de amplificación derivados de dicho ácido nucleico microbiano si está presente en dicha muestra y la producción de un producto de amplificación derivado de dicho primer ácido nucleico control y dicho segundo ácido nucleico control, y en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de hibridación, comprendiendo dicha etapa de hibridación la hibridación de las secuencias amplificadas por dicho par cebador con dichas sondas, en donde las sondas están marcadas con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptor y cada una de las sondas lleva un diferente tinte fluorescente, e) detectar y medir señales fluorescentes generadas por los productos de amplificación de dicho primer ácido nucleico control y dicho ácido nucleico microbiano y que son proporcionales a su concentración, y detectar simultáneamente señales fluorescentes generadas por dicho producto de amplificación de dicho segundo ácido nucleico control, en donde la presencia de un producto de amplificación de dicho segundo ácido nucleico control es indicativo de una amplificación que se da en la mezcla de reacción incluso en ausencia de un producto de amplificación para dicho ácido nucleico microbiano, y determinar la cantidad de dicho ácido nucleico microbiano en dicha muestra biológica en comparación con las señales generadas por dicho ácido nucleico microbiano y dicho primer ácido nucleico control.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion cualitativa y cuantitativa de acidos nucleicos microbianos Campo de la Invencion
La presente invencion se refiere a nuevos metodos y usos para la deteccion cualitativa y cuantitativa de acidos nucleicos microbianos que usan al menos un primer acido nucleico control, o un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones. El metodo se basa en la amplificacion de acidos nucleicos, preferentemente la reaccion en cadena de la polimerasa. Ademas, se proporcionan kits que comprenden componentes para la realizacion de dichos metodos y usos.
Antecedentes de la invencion
En el campo del diagnostico molecular, la deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos microbianos usando reacciones de amplificacion de acido nucleico juega un papel significativo. El cribado (screening) rutinario de las donaciones de sangre para la presencia de Virus de la Hepatitis C (VHC), Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), y/o Virus de la Hepatitis B (VHB) es un ejemplo de la aplicacion a gran escala de reacciones de amplificacion y deteccion de acido nucleico. Estas comprenden una diversidad de diferentes tecnicas, siendo la mas frecuentemente usada es la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) introducida por Kary Mullis en 1984. Los sistemas automatizados para el analisis basado en la PCR con frecuencia hacen uso de la deteccion en tiempo real de la amplificacion de producto durante el proceso de PCR. La clave de tales metodos es el uso de oligonucleotidos modificados que llevan grupos indicadores o marcadores.
La deteccion cualitativa de un acido nucleico microbiano en una muestra biologica es crucial, por ejemplo, para reconocer una infeccion de un individuo. De ese modo, un requerimiento importante para un ensayo para la deteccion de una infeccion microbiana es que se eviten los resultados falsos-negativos o falsos-positivos, puesto que tales resultados conducinan casi inevitablemente a consecuencias graves con respecto al tratamiento del respectivo paciente. Por tanto, especialmente en los metodos basados en PCR, se anade un acido nucleico control interno cualitativo a la mezcla de deteccion. Dicho control es particularmente importante para confirmar la validez de un resultado de ensayo: al menos en el caso de un resultado negativo con respecto al acido nucleico microbiano, la reaccion del control interno cualitativo tiene que funcionar como reactivo dentro de los ajustes dados, es decir, el control interno cualitativo se debe detectar, de lo contrario el propio ensayo se considera que es inoperativo. Sin embargo, en un sistema cualitativo, dicho control interno cualitativo no necesariamente tiene que ser detectado en caso de un resultado positivo. Para ensayos cualitativos, es especialmente importante que se garantice la sensibilidad de la reaccion y, por lo tanto, se controle rigurosamente. Como consecuencia, la concentracion del control interno cualitativo debe ser relativamente baja de manera que incluso en una situacion, por ejemplo, de ligera inhibicion el control interno cualitativo no se detecte y, por lo tanto, se invalide el ensayo.
Por otro lado, y ademas de la mera deteccion de la presencia o ausencia de un acido nucleico microbiano en una muestra, con frecuencia es importante determinar la cantidad de dicho acido nucleico. Como ejemplo, se puede valorar la fase y la gravedad de una enfermedad vmca en base a la carga vmca. Ademas, el seguimiento de cualquier terapia requiere informacion sobre la cantidad de un patogeno presente en un individuo para evaluar el exito de la terapia. Para un ensayo cuantitativo, es necesario introducir un acido nucleico patron cuantitativo que sirva como referencia para determinar la cantidad absoluta de un acido nucleico microbiano. La cuantificacion se puede efectuar o bien refiriendose a una calibracion externa o implementando un patron cuantitativo interno.
En el caso de una calibracion externa, se crean curvas patron en reacciones separadas usando cantidades conocidas de acidos nucleicos identicos o comparables. La cantidad absoluta de un acido nucleico microbiano posteriormente se determina en comparacion con el resultado obtenido con la muestra analizada con dicha funcion patron. La calibracion externa, sin embargo, tiene la desventaja de que un posible procedimiento de extraccion, su eficacia variada, y la presencia posible y con frecuencia no predecible de agentes inhibidores de la amplificacion y/o reaccion de deteccion no se reflejan en el control.
La circunstancia se aplica a cualquier efecto relacionado con la muestra. Por lo tanto, podna ser el caso de que una muestra se juzgue como negativa debido a un procedimiento de extraccion fallido u otros factores basados en la muestra, mientras que el acido nucleico microbiano a detectar y cuantificar realmente esta presente en la muestra.
Por estas y otras razones, es ventajoso un patron cuantitativo interno anadido a la propia reaccion de ensayo. El patron cuantitativo interno tiene al menos las siguientes dos funciones en un ensayo cuantitativo:
i) Hace un seguimiento de la validez de la reaccion.
ii) Sirve como referencia en el calculo de tftulo compensando asf los efectos de inhibicion y controlando los procesos de preparacion y amplificacion para permitir una cuantificacion mas exacta. Por lo tanto, a diferencia del acido nucleico control interno cualitativo en un ensayo cualitativo que debe ser positivo solamente en una reaccion diana-negativa, el acido nucleico patron cuantitativo en un ensayo cuantitativo tiene dos funciones:
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control de reaccion y calibracion de reaccion. Por lo tanto, debe ser positivo y valido tanto en reacciones diana- negativas como diana-positivas.
Ademas, tiene que ser adecuado para proporcionar un valor de referencia fiable para el calculo de altas concentraciones de acido nucleico. Por tanto, la concentracion de un acido nucleico patron cuantitativo interno necesita ser relativamente alta.
El acido nucleico control interno cualitativo y/o el acido nucleico patron cuantitativo interno puede ser competitivo, no competitivo o parcialmente competitivo. Un acido nucleico control interno cualitativo competitivo y/o acido nucleico patron cuantitativo interno lleva basicamente los mismos sitios de union a cebador que la diana y, por tanto, compite por los mismos cebadores que la diana. Entre las ventajas de un sistema competitivo es, por ejemplo, que se tienen que introducir en el ensayo conjuntos menores de diferentes cebadores, reduciendo asf su coste y complejidad global. Ademas, se hace un seguimiento de la funcionalidad de los cebadores ya que son efectos de inhibicion que son espedficos al cebador diana. Un acido nucleico control interno cualitativo no competitivo y/o acido nucleico patron cuantitativo interno tiene diferentes sitios de union a cebador que la diana y asf se une a diferentes cebadores. Las ventajas de tal sistema comprenden, entre otras, el hecho de que los sucesos de amplificacion simple de los diferentes acidos nucleicos en la mezcla de reaccion pueden tener lugar independientemente uno de otro sin ningun efecto de competicion. En una PCR que usa un acido nucleico patron cuantitativo interno parcialmente competitivo el respectivo acido nucleico control y al menos uno de los acidos nucleicos diana compiten para los mismos cebadores, mientras que al menos otro acido nucleico diana se une a diferentes cebadores.
Puesto que los principios de un ensayo cuantitativo y uno cualitativo como se han descrito anteriormente muestran diferentes requerimientos cuando se comparan uno con otro, tambien en vista de los requerimientos reguladores en diversos pafses, el enfoque comun usado en la tecnica ha sido el desarrollo de ensayos cuantitativos y cualitativos separados para el mismo acido nucleico diana, vease, por ejemplo, Yang y col., J. Agr. Food Chem. 2005, 53, 6.2226.229.
El documento US2010/0041040 describe un metodo para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano (por ejemplo, VIH) en una muestra biologica usando PCR en tiempo real, en el que la diana y uno o mas acidos nucleicos patrones cuantitativos (QS) se amplifican en la misma mezcla de reaccion.
La presente invencion proporciona una solucion alternativa que muestra varias ventajas.
Descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere a nuevos metodos y usos para la deteccion cualitativa y cuantitativa simultanea de acidos nucleicos microbianos como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ademas, se describe un metodo basado en la amplificacion de acidos nucleicos, preferentemente la reaccion en cadena de la polimerasa. En resumen, las porciones espedficas de secuencia del acido nucleico microbiano y al menos un primer acido nucleico control se amplifican y detectan usando uno o mas pares de cebadores espedficos. Por tanto, un objetivo de la presente descripcion es:
un metodo para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano en una muestra biologica, comprendiendo dicho metodo:
a) aislar y purificar dicho acido nucleico microbiano,
b) proporcionar una mezcla de reaccion que comprende al menos un primer acido nucleico control, uno o mas pares de cebadores que hibridan espedficamente con distintas porciones de secuencia de dicho acido nucleico microbiano y con distintas porciones de secuencia de dicho acido nucleico control, y sondas que hibridan espedficamente con cada una de las secuencias amplificadas mediante dichos uno o mas pares de cebadores, en la que dicho acido nucleico microbiano y dicho acido nucleico control hibridan con diferentes sondas,
c) anadir dicha muestra biologica a dicha mezcla de reaccion,
d) realizar una o mas etapas de ciclado, en donde la etapa de ciclado comprende una etapa de amplificacion, comprendiendo dicha etapa de amplificacion la produccion de uno o mas productos de amplificacion derivados de dicho acido nucleico microbiano si esta presente en dicha muestra y la produccion de un producto de amplificacion derivado de dicho acido nucleico control, y en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de hibridacion, comprendiendo dicha etapa de hibridacion la hibridacion de las secuencias amplificadas por dicho par cebador con dichas sondas, en donde las sondas estan marcadas con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptor y cada una de las sondas lleva un tinte fluorescente diferente,
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e) detectar y medir senales fluorescentes generadas por dichos productos de amplificacion y que son proporcionales a la concentracion de dicho acido nucleico control y dicho acido nucleico microbiano, en donde la presencia de un producto de amplificacion de dicho acido nucleico control es indicativo de una amplificacion que se da en la mezcla de reaccion incluso en ausencia de un producto de amplificacion para dicho acido nucleico microbiano.
La presente descripcion muestra un numero de ventajas sobre la tecnica anterior. En particular, la presente invencion permite asf un diseno comun de ensayos cualitativos y cuantitativos para cualquier acido nucleico microbiano dado usando reactivos identicos.
En algunas realizaciones, el primer acido nucleico control anteriormente descrito sirve tanto como un acido nucleico patron cuantitativo interno como un acido nucleico control interno cualitativo. Por tanto, suprime la necesidad de dos ensayos separados o kits de ensayo, respectivamente. La realizacion de dos ensayos separados pone una carga sobre el paciente debido a las extracciones sangumeas adicionales y potencialmente impone costes adicionales en los sistemas sanitarios en caso de que se reembolse tanto el ensayo cualitativo como el cuantitativo. Ademas, el tiempo para el resultado de tanto un ensayo cualitativo como uno cuantitativo se reduce cuando se compara con los experimentos cualitativos y cuantitativos secuenciales.
Preferentemente, dicho primer acido nucleico control se evalua segun diferentes criterios para obtener un resultado cualitativo y uno cuantitativo. En una realizacion preferida, se analiza el mismo conjunto de datos en bruto obtenidos durante la PCR en tiempo real frente a dos ajustes de parametro de ensayo diferentes. Los ajustes de parametro de ensayo cualitativo aplicados para un acido nucleico control cualitativo valido son mas estrictos en comparacion con los ajustes de parametro aplicados para el patron cuantitativo interno necesario para una produccion de resultado cuantitativo. Los ajustes para el acido nucleico patron cuantitativo interno en una reaccion cuantitativa no puede ser tan estricto ya que la presencia de diana puede afectar a las respectivas curvas de crecimiento del acido nucleico patron cuantitativo interno (vease la Figura 1a).
Por tanto, una realizacion preferida de la presente descripcion es el metodo anteriormente descrito, en el que el primer acido nucleico control se analiza segun diferentes criterios para servir como acido nucleico patron cuantitativo o como acido nucleico control interno cualitativo.
En otras realizaciones, puede ser ventajoso emplear un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones debido a las siguientes razones: normalmente, el acido o acidos nucleicos patrones cuantitativos internos en ensayos cuantitativos tienen una concentracion bastante alta de manera que todavfa se amplifican y detectan en muestras con una alta concentracion de acido nucleico diana. Por lo tanto, a veces no se da su usabilidad como control para la deteccion de muestras bajo positivas cerca del lfmite de deteccion (LD), especialmente si parcialmente se suprime la reaccion de amplificacion. En ese caso, la deteccion de un acido nucleico control altamente concentrado no puede servir como una medida de suficiente sensibilidad del respectivo ensayo.
Por tanto, un aspecto preferido de la presente descripcion es lo siguiente: un metodo para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano en una muestra biologica, comprendiendo dicho metodo:
a) aislar y purificar dicho acido nucleico microbiano,
b) proporcionar una mezcla de reaccion que comprende un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones, uno o mas pares de cebadores que hibridan espedficamente con distintas porciones de secuencia de dicho acido nucleico microbiano y con distintas porciones de secuencia de dichos acidos nucleicos control, y sondas que hibridan espedficamente con cada una de las secuencias amplificadas mediante dichos uno o mas pares de cebadores, en la que dicho acido nucleico microbiano y dicho primer acido nucleico control y dicho segundo acido nucleico control hibridan con diferentes sondas,
c) anadir dicha muestra biologica a dicha mezcla de reaccion,
d) realizar una o mas etapas de ciclado, en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de amplificacion, comprendiendo dicha etapa de amplificacion la produccion de uno o mas productos de amplificacion derivados de dicho acido nucleico microbiano si esta presente en dicha muestra y la produccion de un producto de amplificacion derivado de dicho primer acido nucleico control y dicho segundo acido nucleico control, y en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de hibridacion, comprendiendo dicha etapa de hibridacion la hibridacion de las secuencias amplificadas por dicho par cebador con dichas sondas, en donde las sondas estan marcadas con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptor y cada una de las sondas lleva un tinte fluorescente diferente,
e) detectar y medir senales fluorescentes generadas por los productos de amplificacion de dicho primer acido nucleico control y dicho acido nucleico microbiano y que son proporcionales a su concentracion, y/o detectar simultaneamente senales fluorescentes generadas por dicho producto de amplificacion de dicho segundo
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acido nucleico control, en donde la presencia de un producto de amplificacion de dicho segundo acido nucleico control es indicativo de una amplificacion que se da en la mezcla de reaccion incluso en ausencia de un producto de amplificacion para dicho acido nucleico microbiano.
La explotacion de un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones dentro del mismo reactivo control, segun la presente invencion, supera el problema anteriormente indicado. El acido nucleico con menor o la menor concentracion corresponde a un acido nucleico control interno cualitativo para un ensayo cualitativo y asegura la capacidad de juzgar si un resultado negativo es valido o no, es decir, un resultado negativo no es valido en caso de que no se detecte el acido nucleico control interno.
Segun la presente descripcion, el experto puede tomar ventaja de las sinergias entre el desarrollo de un sistema cuantitativo y uno cualitativo realizando ambos en un ensayo sencillo, reduciendo asf los costes del desarrollo, requiriendo menos material y fuerza de trabajo, reduciendo los costes de produccion y acortando tambien el tiempo requerido para establecer un ensayo. Ademas, se evita el ensayo doble de los pacientes que pone carga sobre el paciente debido a las extracciones de sangre adicionales, asf como que se reducen los costes para los sistemas sanitarios, cuando se reembolsan ambos ensayos cuantitativos y cualitativos.
El acido nucleico control interno cualitativo y/o el acido nucleico patron cuantitativo interno puede ser competitivo, no competitivo o parcialmente competitivo.
“Competitivo” significa que, en una reaccion de amplificacion que comprende cebadores, el respectivo acido nucleico control y el acido o acidos nucleicos diana tienen al menos basicamente los mismos sitios de union a cebador y compiten asf por los mismos cebadores. Entre las ventajas de un sistema competitivo esta, por ejemplo, que se tienen que introducir menos conjuntos de diferentes cebadores en el ensayo, reduciendo asf sus costes y la complejidad global. Ademas, se hace un seguimiento de la funcionalidad de los cebadores ya que son efectos de inhibicion que son espedficos al cebador diana.
“No competitivo” significa que el respectivo acido nucleico control y el acido o acidos nucleicos diana tienen diferentes sitios de union a cebador y asf se unen a diferentes cebadores. Las ventajas de tal sistema comprenden, entre otras, el hecho de que los sucesos de amplificacion simple de los diferentes acidos nucleicos en la mezcla de reaccion pueden tener lugar independientemente uno de otro sin ningun efecto de competicion.
“Parcialmente competitivo” significa que el respectivo acido nucleico control y al menos uno de los acidos nucleicos diana compiten por los mismos cebadores, mientras que al menos otro acido nucleico diana se une a diferentes cebadores.
Al usar un acido nucleico patron cuantitativo interno como primer acido nucleico control segun el metodo o metodos de la invencion, los efectos inhibidores espedficos a muestra, pero tambien los no espedficos a muestra, que posiblemente interfieren con las reacciones de amplificacion y deteccion para el acido nucleico patron cuantitativo y el acido nucleico microbiano simultaneamente (inhibicion independiente de la region diana) se marcan dando como resultado tftulos mas exactos. “Interno” significa que el primer acido nucleico control se amplifica, detecta y cuantifica dentro de la misma mezcla de reaccion que el acido nucleico microbiano en lugar de un experimento separado.
Otro aspecto preferido de la presente descripcion es el metodo descrito anteriormente, en el que el primer acido nucleico control es un acido nucleico patron cuantitativo y el segundo acido nucleico control es un acido nucleico control interno cualitativo.
El experto en la tecnica puede extraer informacion cualitativa fiable, pero opcionalmente tambien cuantitativa igualmente fiable del mismo experimento. Por lo tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a lo siguiente:
el metodo anteriormente descrito, que comprende ademas en la etapa e) determinar la cantidad de dicho acido nucleico microbiano en dicha muestra biologica por comparacion de las senales generadas por dicho acido nucleico microbiano y dicho primer acido nucleico control.
En una realizacion preferida, el primer acido nucleico control y el segundo acido nucleico control tienen basicamente la misma secuencia. Preferentemente, tienen los mismos sitios de union a cebador, pero diferentes sitios de union a sonda.
Esto sostiene la ventaja de que los acidos nucleicos control para las mediciones cualitativas y cuantitativas pueden basarse en la misma secuencia de union seleccionada y compartir las mismas propiedades ventajosas con respecto a la realizacion del ensayo y en vista de la secuencia o secuencias de analito.
Las tecnicas convencionales de la biologfa molecular y la qrnmica de acido nucleico, que estan dentro de la capacidad de la tecnica, estan explicadas en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, J. y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, Gait, M.J., ed., 1984; “Nucleic Acid Hybridization”, Hames, B.D., and Higgins, S.J., eds., 1984; y una serie, “Methods in
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Enzymology”, Academic Press, Inc.
“Simultaneamente”, en el sentido de la presente descripcion, significa que dos acciones, tales como, por ejemplo, la deteccion y cuantificacion de un acido nucleico, se realizan dentro de la misma reaccion o mezcla de reaccion.
“Una mezcla de reaccion” como se usa en la presente invencion comprende al menos todos los componentes para facilitar una reaccion biologica o qrnmica. Es un volumen sencillo sin ningun compartimento de separacion, es decir, todos los componentes presentes en dicha “mezcla de reaccion” estan en contacto inmediato uno con otro.
Una “muestra biologica” puede ser cualquier muestra de origen natural. Preferentemente, una “muestra biologica” esta derivada de un ser humano y es un lfquido corporal. En una realizacion preferida de la invencion, la “muestra biologica” es sangre.
Tal como se conoce en la tecnica, un “nucleosido” es una combinacion de base-azucar. La parte base del nucleosido es normalmente una base heterodclica. Las dos clases mas frecuentes de tales bases heterodclicas son las purinas y las pirimidinas.
“Nucleotidos” son “nucleosidos” que incluyen ademas un grupo fosfato covalentemente unido a la parte azucar del nucleosido. Para aquellos “nucleosidos” que incluyen un azucar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido a o bien el resto 2', 3' o 5' hidroxilo del azucar. Un “nucleotido” es la “unidad monomerica” de un “oligonucleotido”, mas generalmente indicado en el presente documento como “compuesto oligomerico”, o “polinucleotido”, mas generalmente indicado como “compuesto polimerico”. Otra expresion general para lo anteriormente mencionado es acido desoxirribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN).
Segun la presente descripcion, un “compuesto oligomerico” es un compuesto que consiste en “unidades monomericas” que pueden ser “nucleotidos” solos o “compuestos no naturales” (vease mas adelante), mas espedficamente “nucleotidos modificados” (o “analogos de nucleotido”) o “compuestos no nucleotidos”, solos o combinaciones de los mismos. “Oligonucleotidos” y “oligonucleotidos modificados” (o “analogos de oligonucleotido”) son subgrupos de “compuestos oligomericos” en el contexto de la invencion.
En el contexto de esta descripcion, el termino “oligonucleotido” se refiere a “polinucleotidos” formados de una pluralidad de “nucleotidos” como la “unidad monomerica”, es decir, un “oligonucleotido” pertenece a un subgrupo espedfico de un “compuesto oligomerico” o “compuesto polimerico” del acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) con “unidades monomericas”. Los grupos fosfato frecuentemente se refieren como formadores de la cadena principal de internucleosido del “oligonucleotido”. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace de fosfodiester 3' a 5'. “Oligonucleotidos” y “oligonucleotidos modificados” (vease mas adelante) segun la invencion se pueden sintetizar como principalmente se describe en la tecnica y es conocido por el experto en el campo. En la tecnica se conocen metodos para preparar compuestos oligomericos de secuencias espedficas, e incluyen, por ejemplo, clonacion y restriccion de secuencias apropiadas y smtesis qrnmica directa. Los metodos de smtesis qrnmica pueden incluir, por ejemplo, el metodo de fosfotriester descrito por Narang S.A. y col. Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98, el metodo de fosfodiester descrito por Brown E.L., y col., Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151, el metodo de fosforamidita descrito en Beaucage y col., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859, el metodo de H-fosfonato descrito en Garegg y col., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282 y el metodo de soporte solido descrito en el documento US 4.458.066.
Para el metodo anteriormente descrito, los acidos nucleicos pueden estar presentes en forma de doble cadena o cadena sencilla por lo cual los acidos nucleicos de doble cadena se desnaturalizan, es decir, se hacen de cadena sencilla, antes de que se realice el metodo por calentamiento, es decir, desnaturalizacion termica.
En otra realizacion, un cebador y/o la sonda se pueden modificar qmmicamente, es decir, el cebador y/o la sonda comprende un nucleotido modificado o un compuesto no nucleotido. Entonces, la sonda o el cebador es un oligonucleotido modificado.
Los “Nucleotidos modificados” (o “analogos de nucleotido) difieren de un “nucleotido” natural por alguna modificacion pero todavfa consisten en una base, un azucar pentofuranosilo, una parte fosfato, parte similar a base, similar a azucar pentofuranosilo y similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un “marcador” se puede acoplar a la parte base de un “nucleotido” por lo cual se obtiene un “nucleotido modificado”. Una base natural en un “nucleotido” tambien se puede reemplazar por, por ejemplo, una 7-deazapurina por lo cual tambien se obtiene un “nucleotido modificado”. Los terminos “nucleotido modificado” o “analogo de nucleotido” se usan intercambiablemente en la presente solicitud. Un “nucleosido modificado” (“o analogo de nucleosido”) difiere de un nucleosido natural por alguna modificacion de la manera que se resume anteriormente para un “nucleotido modificado” (o un “analogo de nucleotido”).
Un “compuesto no nucleotido” es diferente de un “nucleotido” natural pero es, en el sentido de esta invencion, todavfa capaz - similar a un “nucleotido” - de ser una “unidad monomerica” de un “compuesto oligomerico”. Por lo tanto, un “compuesto no nucleotido” tiene que ser capaz de formar un “compuesto oligomerico” con “nucleotidos”.
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Incluso “compuestos no nucleotidos” pueden contener partes similares a base, similares a azucar pentofuranosilo o similares a fosfato, sin embargo, no todas estan presentes al mismo tiempo en un “compuesto no nucleotido”.
Un “oligonucleotido modificado” (o “analogo de oligonucleotido”), que pertenece a otro subgrupo espedfico de los “compuestos oligomericos”, posee uno o mas “nucleotidos”, uno o mas “compuestos no nucleotidos” o “nucleotidos modificados” como “unidades monomericas”. Por tanto, el termino “oligonucleotido modificado” (o “analogo de oligonucleotido”) se refiere a estructuras que funcionan de una manera basicamente similar a los “oligonucleotidos” y se usa intercambiablemente por toda la solicitud. Desde un punto de vista sintetico, un “oligonucleotido modificado” (o un “analogo de oligonucleotido”), por ejemplo, se puede producir mediante modificacion qmmica de “oligonucleotidos” por modificacion apropiada de la cadena principal de fosfato, unidad de ribosa o las bases de nucleotido (Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S., y Eckstein F., Annu. Rev Biochem.67 (1998) 99-134). Las modificaciones representativas incluyen enlaces internucleosido de fosforotioato, fosforoditioato, metil fosfonato, fosfotriester o fosforamidato en lugar de enlaces internucleosido de fosfodiester; deaza- o aza-purinas y -pirimidinas en lugar de bases de purina y pirimidina natural, bases de pirimidina que tienen grupos sustituyentes en la posicion 5 o 6; bases de purina que tienen grupos sustituyentes alterados en las posiciones 2, 6 u 8 o posicion 7 como 7-deazapurinas; bases que llevan restos alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo, por ejemplo, grupos alquilo inferiores tales como grupos metilo, etilo, propilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo o arilo como fenilo, bencilo, naftilo; azucares que tiene grupos sustituyentes en, por ejemplo, su posicion 2'; o analogos de azucar carbodclico o adclico. Otras modificaciones coherentes con el esprntu de esta invencion son conocidas por los expertos en la tecnica. Tales “oligonucleotidos modificados” (o “analogos de oligonucleotido”) son los mejor descritos como funcionalmente intercambiables con, aun estructuralmente diferentes de, “oligonucleotidos” naturales (o “oligonucleotidos” sinteticos a lo largo de las lmeas naturales). En mas detalle, modificaciones a modo de ejemplo estan descritas en Verma, S., y Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99134 o el documento WO 02/12263. Ademas, la modificacion se puede hacer donde las unidades de nucleosido estan unidas por grupos que sustituyen los enlaces de fosfato de internucleosido o de fosfato de azucar. Tales enlaces incluyen los descritos en Verma, S., y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134. Cuando aparte de los enlaces de fosfato se utilizan para unir las unidades de nucleosido, tales estructuras tambien se han descrito como “oligonucleosidos”.
Un “acido nucleico” asf como el “acido nucleico diana” o el “acido nucleico microbiano” es un compuesto polimerico de “nucleotidos” como los conocidos por el experto en la tecnica. El “acido nucleico diana” o “acido nucleico microbiano” se usa en el presente documento para indicar un “acido nucleico” en una muestra que se debena analizar, es decir, se debena determinar la presencia, no presencia y/o cantidad del mismo en una muestra. Por lo tanto, en este caso el acido nucleico es la diana y, por lo tanto, tambien se puede indicar como “acido nucleico diana”. Puesto que, segun la invencion, el acido nucleico diana es de origen microbiano, el acido nucleico diana tambien se refiere como “acido nucleico microbiano”. Por ejemplo, si se tiene que determinar si la sangre contiene VHC, el “acido nucleico diana” o “acido nucleico microbiano” es el acido nucleico de VHC.
“Microorganismo” significa cualquier virus, bacteria, arquea, hongo o cualquier organismo eucariota unicelular.
“Microbiano” significa derivado de o perteneciente a “microorganismo”.
“Detectar” significa determinar la presencia o ausencia de un objetivo espedfico, tal como una diana, o senal.
“Cuantificar” significa determinar la cantidad de un objetivo espedfico tal como una diana, o senal.
“Medir” significa determinar al menos un valor relativo de un objeto espedfico, tal como una diana, o senal.
En el sentido de ciertas realizaciones de la presente descripcion que usan un primer y un segundo acido nucleico control, el primer acido nucleico control sirve como un “acido nucleico patron cuantitativo interno”. Un “acido nucleico patron cuantitativo interno” es un “acido nucleico” y, por tanto, un compuesto polimerico de “nucleotidos” como los conocidos por el experto en la tecnica. En el caso del “acido nucleico patron cuantitativo interno”, el acido nucleico es apto para ser y usarse simultaneamente como control para la validez de la reaccion y como referencia para “cuantificar”, es decir, para determinar la cantidad del “acido nucleico diana” o “acido nucleico microbiano”. Para este fin, el “acido nucleico patron cuantitativo interno” se somete a todas las etapas posibles de preparacion de muestra junto con el “acido nucleico diana” o el “acido nucleico microbiano”. Ademas, se procesa por todo el metodo dentro de la misma mezcla de reaccion, El “acido nucleico patron cuantitativo interno” debe generar, directa o indirectamente, una senal detectable tanto en presencia como en ausencia del acido nucleico diana. Para este fin, la concentracion del “acido nucleico patron cuantitativo interno” se tiene que optimizar con cuidado en cada ensayo para no interferir con la sensibilidad pero para generar una senal detectable tambien, por ejemplo, a muy altas concentraciones de diana. Preferentemente, la concentracion oscila para el “acido nucleico patron cuantitativo interno”, es decir, el primer acido nucleico control, comprendera un intervalo de 100 copias por reaccion a 100.000 copias por reaccion. Posibles concentraciones del “acido nucleico patron cuantitativo interno” puede ser, por ejemplo, para VIH: 1.000 copias/reaccion, para VHC: 7.500 copias/reaccion, pero estas concentraciones se pueden adaptar al ensayo espedfico conocido por el experto en la tecnica. En terminos del lfmite de deteccion (LD) del ensayo respectivo, el intervalo de concentracion para el “acido nucleico patron cuantitativo interno” es
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preferentemente 20 a 5.000x LD, mas preferentemente 20 a 1.000x LD, lo mas preferentemente 20 a 500x LD. La concentracion final del “acido nucleico patron cuantitativo interno” en la mezcla de reaccion es dependiente del intervalo de medicion cuantitativa conseguida. El “acido nucleico patron cuantitativo interno” puede ser, por ejemplo, ADN, ARN o APN, ADN blindado o ARN blindado y formas modificadas de los mismos.
Ademas, en el sentido de la presente descripcion, el segundo acido nucleico control sirve como “acido nucleico control interno cualitativo”. Un “acido nucleico control interno cualitativo” es particularmente importante para confirmar la validez del resultado de ensayo de un ensayo de deteccion cualitativo: al menos en el caso de un resultado negativo, el acido nucleico control interno cualitativo se debe detectar, de lo contrario el propio ensayo se considera que es inoperativo. Sin embargo, en un sistema cualitativo, el acido nucleico control interno cualitativo no necesariamente tiene que ser detectado en caso de un resultado positivo. Para los ensayos cualitativos, es importante que se garantice la sensibilidad de la reaccion y asf se controle rigurosamente. Como consecuencia, la concentracion del acido nucleico control interno cualitativo debe ser relativamente baja, de modo que incluso en una situacion de ligera inhibicion el ensayo se considera invalido. Se tiene que adaptar con cuidado al ensayo respectivo y su sensibilidad. Preferentemente, el intervalo de concentracion para el “acido nucleico interno cualitativo”, es decir, el segundo acido nucleico control, comprende un intervalo de 1 copia por reaccion a 1.000 copias por reaccion. En relacion al lfmite de deteccion (LD) del ensayo respectivo, su concentracion es preferentemente entre el LD de un ensayo y 25 veces el valor del LD. Mas preferentemente, es entre 2x y 20x LD, o entre 2x y 15x LD, o entre 2x y 10x LD. Incluso mas preferentemente, es entre 3x y 7x LD.
“Lfmite de deteccion o “LD” significa la cantidad o concentracion detectable mas baja de un acido nucleico en una muestra con una tasa de exito predefinida. Un bajo “LD” corresponde a alta sensibilidad y viceversa. El “LD” normalmente se expresa o bien por medio de la unidad “cp/ml”, particularmente si el acido nucleico es un acido nucleico vmco, o como Ul/ml. “Cp/ml” significa “copias por mililitro” en el que “copia” es la copia del respectivo acido nucleico. Ul/ml significa “unidades internacionales/ml”, que se refieren al estandar de la oMs. Dependiendo de la diana, los valores LD en ensayos de diagnostico molecular clmicos estan generalmente por debajo de 1.000 cp/ml. Preferentemente, el LD en los ensayos realizados en el contexto de la invencion esta entre 1 y 500 cp/ml.
Un metodo ampliamente usado para el calculo de un LD es “Analisis Probit”, que es un metodo de analisis de la relacion entre un estfmulo (dosis) y la respuesta cuantal (todo o nada). En un experimento de respuesta cuantal normal, se da a los grupos de animales diferentes dosis de un farmaco. Se registra el porcentaje que muere a cada nivel de dosis. A continuacion, estos datos se pueden analizar usando Analisis Probit. El Modelo Probit asume que la respuesta en porcentaje esta relacionada con dosis logantmica como la distribucion normal acumulativa. Es decir, las dosis logantmicas se pueden usar como variables para leer el porcentaje que muere desde la normal acumulativa. Usar la distribucion normal, a parte de otras distribuciones de probabilidad, influye la tasa de respuesta predicha en los extremos altos y bajos de las dosis posibles, pero tiene poca influencia cerca de la mitad.
El “Analisis Probit” se puede aplicar a distintas “tasas de exito”. Tal como se muestra en la tecnica, “tasas de exito” se expresa frecuentemente en porcentaje [%] e indica el porcentaje de resultados positivos a una concentracion espedfica de un analito. Por tanto, por ejemplo, un LD se puede determinar a tasa de exito al 95 %, lo cual significa que el LD se calcula durante un ajuste en el cual el 95 % de los resultados validos son positivos.
El termino “cebador” (primer) se usa en el presente documento como se conoce por los expertos en la tecnica y se refiere a “compuestos oligomericos”, principalmente a “oligonucleotidos”, pero tambien a “oligonucleotidos modificados” que son capaces de smtesis de ADN “cebador” mediante una polimerasa de ADN dependiente de plantilla, es decir, el extremo 3' del, por ejemplo, oligonucleotido proporciona un grupo 3'-OH libre adonde “nucleotidos” adicionales se pueden acoplar mediante una polimerasa de ADN dependiente de plantilla estableciendo enlace de fosfodiester 3' a 5' por lo cual se usan los trifosfatos de desoxinucleosido y por lo cual se libera pirofosfato.
El termino “sonda”, en el contexto de la presente descripcion, es tambien un oligonucleotido, pero con una funcion espedfica:
hibrida con otros acidos nucleicos en una mezcla de reaccion, preferentemente para posibilitar su deteccion. Por tanto, preferentemente las sondas espedficamente se unen a ciertos acidos nucleicos. Una sonda preferentemente lleva al menos un marcador. Las sondas, por ejemplo, se pueden marcar con diferentes tintes, de modo que las respectivas sondas se pueden detectar y medir independientemente una de otra.
“Marcadores”, con frecuencia referidos como “grupos indicadores”, son generalmente grupos que producen un acido nucleico, en particular el “compuesto oligomerico” o el “oligonucleotido modificado”, asf como algun acido nucleico unido al mismo distinguible del resto de la muestra (acidos nucleicos que tienen acoplado un “marcador” tambien se pueden calificar de compuestos de union a acido nucleico marcado, sondas marcadas o solamente sondas). Los marcadores preferidos segun la invencion son marcadores fluorescentes, los cuales son, por ejemplo, “tintes fluorescentes” como un tinte de fluorescema, un tinte de rodamina, un tinte de cianina y un tinte de cumarina. “Tintes fluorescentes” preferidos segun la invencion son FAM, HEX, CY5, JA270, Cyan, CY5.5, LC-Red 640, LC-Red 705.
Para el metodo anteriormente descrito, los acidos nucleicos pueden estar presentes en forma de doble cadena o
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cadena sencilla por lo cual los acidos nucleicos de doble cadena se desnaturalizan, es dedr, se hacen de cadena sencilla, antes de que se realice el metodo por calentamiento, es decir, desnaturalizacion termica.
En otra realizacion preferida, un cebador y/o la sonda pueden estar qmmicamente modificados, es decir, el cebador y/o la sonda comprenden un nucleotido modificado o un compuesto no nucleotido. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleotido modificado.
Una “senal detectable” es una senal “generada”, por un compuesto tal como el “acido nucleico microbiano”, el “acido nucleico control interno” o el “acido nucleico patron cuantitativo”, que vuelve dicho compuesto distinguible del resto de la muestra. Segun la invencion, dicha “senal detectable” se puede cuantificar o analizar de una manera cualitativa. Una “senal detectable” puede ser, por ejemplo, radioactiva u optica tal como las senales luminiscentes. “Senales detectables” preferidas segun la invencion son senales fluorescentes emitidas por “tintes fluorescentes”.
“Inhibicion” o “supresion” de una reaccion PCR indica una reaccion PCR que es menos eficaz en comparacion con la reaccion estandar observada en la mayona de las muestras. El efecto de “inhibicion” o “supresion” se puede ver o bien en niveles de fluorescencia reducida de las curvas de crecimiento para el control y/o diana, en valores CT retrasados, en cambios de la pendiente de la curva de crecimiento, en cambios en el punto de inflexion u otros rasgos de las caractensticas de reaccion. El efecto de “inhibicion” o “supresion” puede resultar de eficacia de preparacion de muestra variada, efectos relacionados con la muestra, la posible y con frecuencia no predecible presencia de agentes inhibidores de la reaccion de amplificacion y/o deteccion, y otras razones. Por lo tanto, puede ser el caso de que la muestra se juzgue como negativa debido a un procedimiento de extraccion fallido u otros factores basados en la muestra, mientras que el acido nucleico microbiano a detectar y cuantificar esta realmente presente en la muestra.
“Para generar” significa producir, directa o indirectamente. En el contexto de una “senal detectable”, por lo tanto, “para generar” puede significar “producir directamente”, por ejemplo, en el caso de un tinte fluorescente emisor de una senal fluorescente, o “para producir indirectamente” en el sentido de “provocar” o “inducir”, tal como un “acido nucleico microbiano” “generador” de una “senal detectable” por un “marcador” tal como un “tinte fluorescente” o por una sonda de acido nucleico que lleva un “marcador” tal como un “tinte fluorescente”.
Tal como se conocen por el experto en la tecnica, los terminos “espedficos” o “hibridar espedficamente” en el contexto de los cebadores y sondas implica que un cebador o sonda “espedfica” para un acido nucleico distinto se une a dicho acido nucleico bajo condiciones estrictas. Preferentemente, los cebadores y las sondas usados en el metodo segun la invencion son al menos 80 % identicas a porciones de la secuencia del acido nucleico microbiano y/o el primer y segundo acido nucleico control.
La “Reaccion en Cadena de la Polimerasa” (PCR) se describe, entre otras referencias, en la patente U.S. N° 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 y es la tecnica de amplificacion de acido nucleico mas preferida usada para el metodo segun la invencion. La PCR generalmente emplea dos o mas cebadores de oligonucleotido que se unen a una plantilla de acido nucleico seleccionada (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores utiles en la presente invencion incluyen oligonucleotidos capaces de actuar como un punto de iniciacion de la smtesis de acido nucleico dentro de las secuencias de acido nucleico del acido nucleico microbiano o acido nucleico patron cuantitativo. Se puede purificar un cebador a partir de un producto de digestion por restriccion por metodos convencionales, o se puede producir sinteticamente. El cebador preferentemente es de cadena sencilla para la eficacia maxima en la amplificacion, pero el cebador puede ser de doble cadena. Los cebadores de doble cadena primero se desnaturalizan, es decir, se tratan para separar las cadenas. Un metodo de desnaturalizacion de acidos nucleicos de doble cadena es por calentamiento. Una “polimerasa termoestable” es una enzima polimerasa que es estable al calor, es decir, es una enzima que cataliza la formacion de productos de extension de cebador complementarios a una plantilla y no desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar desnaturalizacion de acidos nucleicos plantilla de doble cadena. Generalmente, la smtesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y procede en la direccion 5' a 3' a lo largo de la cadena plantilla. Polimerasas termoestables se han aislado de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. Rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. Sin embargo, las polimerasas que no son termoestables tambien se pueden emplear en ensayos de PCR con tal de que se reponga la enzima. Si el acido nucleico plantilla es de doble cadena, es necesario separar las dos cadenas antes de que se puedan usar como plantilla en PCR. La separacion de cadena se puede conseguir por cualquier metodo de desnaturalizacion adecuado que incluya medios ffsicos, qmmicos o enzimaticos. Un metodo de separacion de las cadenas de acido nucleico implica el calentamiento del acido nucleico hasta que este desnaturalizado en su mayona (por ejemplo, desnaturalizado mas del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el acido nucleico plantilla dependeran, por ejemplo, de la concentracion de sal tampon y la longitud y composicion de nucleotido de los acidos nucleicos que se desnaturalizan, pero generalmente oscilan entre aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo que depende de los rasgos de la reaccion tal como temperatura y la longitud del acido nucleico. La desnaturalizacion generalmente se realiza durante aproximadamente 3 s a 4 min (por ejemplo, 5 s a 2 min 30 s, o 10 sa 1,5 min). Si el acido nucleico plantilla de doble cadena se desnaturaliza por calor, se deja enfriar la mezcla de reaccion a una temperatura que promueve el anillamiento de cada cebador con su secuencia diana sobre el acido nucleico microbiano y/o acido nucleico patron
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interno. La temperatura para el anillamiento es normalmente desde aproximadamente 35 °C a aproximadamente 75 °C (por ejemplo, aproximadamente 40 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 45 °C a aproximadamente 66 °C). Los tiempos de anillamiento pueden ser desde aproximadamente 5 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, aproximadamente 10 s a aproximadamente 50 s; aproximadamente 15 s a aproximadamente 40 s). Entonces, la mezcla de reaccion se ajusta a una temperatura a la cual la actividad de la polimerasa se promueve u optimiza, es decir, una temperatura suficiente para que se de la prolongacion desde el cebador anillado para generar productos complementarios al acido nucleico microbiano y/o acido nucleico patron interno. La temperatura debena ser suficiente para sintetizar un producto de extension desde cada cebador que se anilla a una plantilla de acido nucleico, pero no debena ser tan alta como para desnaturalizar un producto de prolongacion a partir de su plantilla complementaria (por ejemplo, la temperatura para la prolongacion generalmente oscila entre aproximadamente 35 °C y 80 °C (por ejemplo, aproximadamente 40 °C a aproximadamente 75 °C; aproximadamente 45 °C a 72 °C). Los tiempos de prolongacion pueden ser desde aproximadamente 5 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, aproximadamente 10 s a aproximadamente 3 min; aproximadamente 15 s a aproximadamente 2 min; aproximadamente 20 s a aproximadamente 1 min). Las cadenas nuevamente sintetizadas forman una molecula de doble cadena que se puede usar en las sucesivas etapas de la reaccion. Las etapas de separacion de cadena, anillamiento y elongacion se pueden repetir con frecuencia como se sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificacion correspondientes al acido nucleico microbiano y/o acido nucleico patron cuantitativo. Los factores limitantes en la reaccion son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y trifosfatos nucleosido presentes en la reaccion. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalizacion, anillamiento y extension) preferentemente se repiten al menos una vez. Para su uso en la deteccion, el numero de etapas de ciclado dependera, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de acidos nucleicos, se requeriran mas etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana suficiente para la deteccion. Generalmente, se repiten las etapas de ciclado al menos 20 veces, pero se pueden repetir tanto como 40, 60 o incluso 100 veces.
Las reacciones de amplificacion de acido nucleico aparte de la PCR comprenden la Reaccion en Cadena de la Ligasa (LCR; Wu D.Y. y Wallace R.B., Genomics 4 (1989) 560-69; y Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193); Reaccion en Cadena de la Polimerasa Ligasa (Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap- LCR (documento WO 90/01069); Reaccion en Cadena de Reparacion (documento EP 0439182 A2), 3SR (Kwoh, D.Y. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1.173-1.177; Guatelli, J.C., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1.874-1.878; documento WO 92/08808) y NASBA (documento US 5.130.238). Ademas, hay amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion mediada por transcripcion (TMA) y amplificacion Q-beta (para una revision vease, por ejemplo, Whelen A.C. y Persing D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson R.D. y Myers T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47).
Los metodos de deteccion de acido nucleico adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica y estan descritos en libros de texto estandar como Sambrook, J. y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y Ausubel, F. y col.: “Current Protocols in Molecular Biology” 1987, J. Wiley and Sons, NY. Tambien puede haber mas etapas de purificacion antes de que se lleve a cabo la etapa de deteccion de acido nucleico como, por ejemplo, una etapa de precipitacion. Los metodos de deteccion pueden incluir, pero no se limitan, a la union o intercalado de tintes espedficos como bromuro de etidio que se intercala dentro del ADN de doble cadena y, despues de eso, cambia su fluorescencia. El acido nucleico purificado tambien se puede separar por metodos electroforeticos opcionalmente despues de una digestion por restriccion y, despues de eso, se visualiza. Tambien hay ensayos basados en sonda que aprovechan la hibridacion de oligonucleotido con secuencias espedficas y posterior deteccion del hfbrido. Tambien es posible secuenciar el acido nucleico despues de etapas adicionales conocidas por los expertos en el campo. La polimerasa preferida de acido nucleico dependiente de plantilla es la polimerasa de ADN Z05 y mutaciones de la misma. Otras polimerasas de acido nucleico dependiente de plantilla utiles en la invencion son la polimerasa Taq y la polimerasa Tth. Otras polimerasas mas de acido nucleico utiles para los metodos segun la invencion son conocidas por los expertos en la tecnica.
En el contexto de la presente descripcion, el acido nucleico microbiano y cada uno de los acidos nucleicos controles se unen a diferentes sondas que llevan diferentes marcadores para volverlos distinguibles unos de otros durante la deteccion. De ad, dichas diferentes sondas preferentemente llevan diferentes tintes fluorescentes, que emiten luz fluorescente a diferentes longitudes de onda. Estas diferentes senales de fluorescencia se pueden detectar de manera ventajosa independientemente una de otra en diferentes canales de un detector de fluorescencia como se usa en la mayona de los dispositivos para la realizacion de la PCR en tiempo real.
Tambien preferentemente, los resultados para el acido nucleico microbiano, el primer acido nucleico control y el segundo acido nucleico control se visualizan sobre una visualizacion en diferentes mascaras, o en diferentes visualizaciones.
En el sentido de la presente descripcion, “purificacion”, “aislamiento” o “extraccion” de acidos nucleicos se refiere a lo siguiente: antes de que se puedan analizar los acidos nucleicos en uno de los ensayos anteriormente mencionados, se tienen que purificar, aislar o extraer de las muestras biologicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes. Con frecuencia, para las primeras etapas, los procesos que se usan permiten el
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enriquecimiento de los acidos nucleicos. Para liberar los contenidos de celulas o partmulas vmcas, se pueden tratar con enzimas o con productos qmmicos para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes celulares o partmulas vmcas. Este proceso comunmente es referido como lisis. La solucion resultante que contiene tal material sometido a lisis se refiere como lisado. Un problema con frecuencia hallado durante la lisis es que otras enzimas que degradan el componente de interes, por ejemplo, desoxirribonucleasas o ribonucleasas que degradan los acidos nucleicos, se ponen en contacto con el componente de interes durante el proceso de lisis. Estas enzimas degradadoras tambien pueden estar presentes fuera de las celulas o se pueden haber separado espacialmente en diferentes compartimentos celulares antes de la lisis. Ya que tiene lugar la lisis, el componente de interes llega a estar expuesto a dichas enzimas degradadoras. Otros componentes liberados durante este proceso pueden, por ejemplo, ser endotoxinas que pertenecen a la familia de los lipopolisacaridos que son toxicas a las celulas y pueden causar problemas para los productos destinados al uso en terapia humana o animal.
Hay una diversidad de medios para abordar el problema anteriormente mencionado. Es frecuente usar agentes caotropicos tales como tiocianato de guanidinio o detergentes anionicos, cationicos, zwitterionicos cuando se pretende que los acidos nucleicos se liberen. Tambien es una ventaja usar proteasas que rapidamente degradan las enzimas previamente descritas o protemas indeseadas. Sin embargo, esto puede producir otro problema ya que dichas sustancias o enzimas pueden interferir con reactivos o componentes en etapas posteriores.
Enzimas que se pueden usar ventajosamente en dichos procesos de lisis o preparacion de muestra anteriormente mencionados son enzimas que escinden los enlaces de amida en sustratos proteicos y que se clasifican como proteasas, o (intercambiablemente) peptidasas (vease Walsh, 1979, “Enzymatic Reaction Mechanisms” W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capttulo 3). Las proteasas usadas en la tecnica anterior comprenden proteasas alcalinas (documento WO 98/04730) o proteasas acidas (documento US 5.386.024). Una proteasa que se ha usado ampliamente para la preparacion de muestra en el aislamiento de los acidos nucleicos en la tecnica anterior es la proteinasa K de Tritirachium album (vease, por ejemplo, Sambrook, J. y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que es activa alrededor de pH neutro y pertenece a una familia de proteasas conocidas por los expertos en la tecnica como subtilisinas. Especialmente ventajosa para el uso en procesos de lisis o de preparacion de muestra anteriormente mencionados es la enzima esperasa, una proteasa fuerte que conserva su actividad tanto a alta alcalinidad como a altas temperaturas (documento EP 1 201 753).
En las etapas de preparacion de muestra siguientes a la etapa de lisis, el componente de interes se enriquece mas. Si los componentes no proteicos de interes son, por ejemplo, acidos nucleicos, normalmente se extraen de las mezclas de lisis complejas antes de que se usen en un ensayo basado en sonda.
Hay varios metodos para la purificacion de acidos nucleicos:
- Metodos dependientes de secuencia o biospedficos como, por ejemplo:
• cromatograffa de afinidad
• hibridacion con oligonucleotidos de captura inmovilizados.
- Metodos independientes de secuencia o ffsico-qmmicos como, por ejemplo:
• extraccion lfquido-lfquido con, por ejemplo, fenol-cloroformo
• precipitacion con, por ejemplo, etanol puro
• extraccion con papel de filtro
• extraccion con agentes de formacion de micelio como cetil-trimetil-amonio-bromuro
• union a tintes inmovilizados, intercalados, por ejemplo, derivados de acridina
• adsorcion a gel de sflice o tierra de diatomeas
• adsorcion a partfculas de vidrio magneticas (MGP) o partfculas de organosilano caotropicas.
Particularmente interesante para los fines de purificacion es la adsorcion de acidos nucleicos a vidrio, aunque otras superficies son posibles. En los ultimos anos se han propuesto muchos procedimientos para aislar los acidos nucleicos de su ambiente natural mediante el uso de su comportamiento de union a superficies de vidrio. Si los acidos nucleicos no modificados son la diana, se prefiere una union directa de los acidos nucleicos a un material con una superficie de sflice debido a que, entre otras razones, los acidos nucleicos no tienen que ser
bajo condiciones una superficie de
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modificados, e incluso se pueden unir a acidos nucleicos nativos. Estos procesos estan descritos en detalle por diversos documentos. En Vogelstein, B. y col. Proc. Natl. Aca. USA 76 (1979) 615-9, por ejemplo, se propone un procedimiento para la union de acidos nucleicos a partir de geles de agarosa en presencia de yoduro de sodio a vidrio flint esmerilado. La purificacion de ADN plasmido a partir de bacterias sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato de sodio esta descrito en Marko, M.A. y col., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En el documento DE-A 37 34 442, se describe el aislamiento de ADN del fago M13 de cadena sencilla sobre filtros de fibra de vidrio mediante la precipitacion de partmulas de fago usando acido acetico y lisis de las partmulas de fago con perclorato. Los acidos nucleicos unidos a los filtros de fibra de vidrio se lavan y, a continuacion, se eluyen con un tampon Tris/EDTA que contiene metanol. Un procedimiento similar para la purificacion de ADN a partir de fagos lambda esta descrito en Jakobi, R. y col., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. El procedimiento conlleva la union selectiva de acidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones de sal caotropicas y la separacion de los acidos nucleicos de contaminantes tales como agarosa, protemas o residuo celular. Para separar las partmulas de vidrio de los contaminantes, se puede o bien centrifugar las partmulas o sacar los fluidos a traves de filtros de fibra de vidrio. Esto es una etapa limitante, sin embargo, esto impide que el procedimiento se use para procesar grandes cantidades de muestras. El uso de partmulas magneticas para inmovilizar los acidos nucleicos despues de la precipitacion anadiendo sal y etanol es mas ventajoso y esta descrito, por ejemplo, en Alderton R.P. y col., S., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y PCT GB 91/00212. En este procedimiento, los acidos nucleicos se aglutinan junto con las partmulas magneticas. El aglutinado se separa del disolvente original aplicando un campo magnetico y realizando una etapa de lavado. Despues de una etapa de lavado, los acidos nucleicos se disuelven en un tampon Tris. Sin embargo, este procedimiento tiene una desventaja ya que la precipitacion no es selectiva para los acidos nucleicos. Ademas, tambien se aglutina una diversidad de sustancias solidas y disueltas. Como resultado, este procedimiento no se puede usar para separar cantidades significativas de ningun inhibidor de reacciones enzimaticas espedficas que puedan estar presentes. El vidrio poroso, magnetico tambien esta disponible en el mercado, que contiene partmulas magneticas en una matriz de vidrio particular porosa y esta revestido con una capa que contiene estreptavidina. Este producto se puede usar para aislar materiales biologicos, por ejemplo, protemas o acidos nucleicos, si se modifican en una etapa de preparacion compleja de manera que se unen covalentemente a biotina. Los adsorbentes particulares magnetizables demuestran ser muy eficaces y adecuados para la preparacion de muestra automatica. Pigmentos ferrimagneticos y ferromagneticos, asf como superparamagneticos se usan para este fin. Las MGP y metodos mas preferidos que usan partmulas de vidrio magneticas son los descritos en el documento WO 01/37291. Particularmente utiles para el aislamiento de acido nucleico en el contexto de la invencion es el metodo segun R. Boom y col. (J. Clin. Microbiol. 28 (1990), 495-503). Despues de la purificacion o aislamiento de los acidos nucleicos que incluyen el acido nucleico diana a partir de su entorno natural, se puede detectar el acido nucleico diana.
En una realizacion, el metodo de la descripcion incluye las etapas para evitar la contaminacion. Por ejemplo, un metodo enzimatico que utiliza uracilo-ADN glicolasa esta descrito en las Patentes U.S. N° 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminacion entre una corrida del ciclador termico y lo siguiente. Ademas, las practicas y procedimientos de contencion de laboratorio estandar son deseables cuando realizan el metodo de la invencion. Las practicas y procedimientos de contencion incluyen, pero no se limitan a, separar areas de trabajo para diferentes etapas de un metodo, campanas de contencion, puntas de pipeta de filtro de barrera y pipetas de desplazamiento de aire especializadas. Las consecuentes practicas y procedimientos de contencion por el personal son necesarias para la exactitud en un laboratorio de diagnostico que manipula muestras clmicas.
Los metodos presentados anteriormente estan preferentemente basados en la Transferencia de Energfa por Resonancia de Fluorescencia (FRET) entre un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptor. Un resto fluorescente donante representativo es la fluorescema, y restos fluorescentes aceptores correspondientes representativos incluyen LC-Red 640, LC-Red 705, Cry5 y Cy5.5. Generalmente, la etapa de deteccion incluye la excitacion de la muestra a una longitud de onda absorbida por el resto fluorescente donante y la visualizacion y/o medicion de la longitud de onda emitida por el correspondiente resto fluorescente aceptor. Segun la invencion, la deteccion es seguida por la cuantificacion de FRET. Preferentemente, la etapa de deteccion se realiza despues de cada etapa de ciclado. Lo mas preferentemente, la etapa de deteccion se realiza en tiempo real. Al usar instrumentacion de PCR en tiempo real comercialmente disponible (por ejemplo, LightCycle™ o TaqMan®), la amplificacion y deteccion por PCR del producto de amplificacion se puede combinar en un compartimento de reaccion cerrado simple tal como, por ejemplo, una cubeta con tiempo de ciclado radicalmente reducido. Puesto que la deteccion se da al mismo tiempo que la amplificacion, los metodos de PCR en tiempo real obvian la necesidad de manipulacion del producto de amplificacion, y disminuyen el riesgo de contaminacion cruzada entre los productos de amplificacion. La PCR en tiempo real reduce enormemente el tiempo de rotacion y es una alternativa atractiva a tecnicas de PCR convencionales en el laboratorio clmico.
Las siguientes solicitudes de patente describen PCR en tiempo real como se usa en la tecnologfa LightCycler™: documentos 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento de LightCycler™ es un ciclador termico rapido combinado con un fluorometro de microvolumen que utiliza opticas de alta calidad. Esta tecnica de ciclado termico rapido usa cubetas de vidrio finas como recipientes de reaccion. El calentamiento y el enfriamiento de la camara de reaccion estan controlados por aire calentado y ambiente alternante. Debido a la baja masa de aire y a la alta relacion de area superficial y volumen de las cubetas, se puede alcanzar tasas de intercambio de temperatura rapidas dentro de la camara termica.
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La tecnolog^a TaqMan® utiliza una sonda de hibridacion de cadena sencilla marcada con dos restos fluorescentes. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la ene^a absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente segun los principios de FRET. El segundo resto fluorescente generalmente es una molecula desactivadora (quencher). Los tintes fluorescentes normales usados en este formato son, por ejemplo, entre otros, FAM, HEX, CY5, JA270, Cyan y CY5.5. Durante la etapa de anillamiento de la reaccion PCR, la sonda de hibridacion marcada se une al acido nucleico diana (es decir, el producto de amplificacion) y se degrada por la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq u otra adecuada conocida por el experto en la tecnica, tal como la polimerasa Z05 preferida, durante la posterior fase de elongacion. Como resultado, el resto fluorescente excitado y el resto desactivador llegan a estar espacialmente separados uno de otro. Como consecuencia, tras la excitacion del primer resto fluorescente en ausencia del desactivador, se puede detectar la emision de fluorescencia a partir del primer resto fluorescente.
En ambos formatos de deteccion anteriormente descritos, la intensidad de la senal emitida se puede correlacionar con el numero de moleculas de acido nucleico diana original.
Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificacion usando el tinte de union a ADN de doble cadena tal como un tinte de union a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBRGREEN I® o SYBRGOLD® (Molecular Probes)). Tras la interaccion con el acido nucleico de doble cadena, tales tintes de union a ADN fluorescentes emiten una senal de fluorescencia despues de la excitacion con luz a una longitud de onda adecuada. Tambien se pueden usar un tinte de union a ADN de doble cadena tal como un tinte intercalado de acido nucleico. Cuando se usan tintes de union a ADN de doble cadena, normalmente se realiza un analisis de curva de fusion para la conformacion de la presencia del producto de amplificacion.
Las balizas moleculares junto con FRET tambien se pueden usar para detectar la presencia de un producto de amplificacion usando los metodos PCR en tiempo real de la invencion. La tecnologfa de baliza molecular usa una sonda de hibridacion marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente generalmente es un desactivador, y los marcadores fluorescentes estan generalmente localizados en cada extremo de la sonda. La tecnologfa de baliza molecular usa un oligonucleotido de sonda que tiene secuencias que permiten la formacion de estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formacion de estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes estan en proximidad espacial cuando la sonda esta en solucion. Despues de la hibridacion con los productos de amplificacion, la estructura secundaria de la sonda esta interrumpida y los restos fluorescentes llegan a separarse uno de otros de modo que despues de la excitacion con luz de una longitud de onda adecuada, se puede detectar la emision del primer resto fluorescente.
Por tanto, un metodo preferido segun la invencion es el metodo anteriormente descrito que usa FRET, en el que dichas sondas comprenden una secuencia de acido nucleico que permite la proximidad espacial entre dichos primer y segundo resto fluorescente.
FRET eficaz solamente puede tener lugar cuando los restos fluorescentes estan en proximidad local directa y cuando el espectro de emision del resto fluorescente donante se superpone con el espectro de absorcion del resto fluorescente aceptor.
Por tanto, en una realizacion preferida de la invencion, dichos restos fluorescentes donantes y aceptores estan dentro no mas de 5 nucleotidos uno de otro en dicha sonda.
En una realizacion adicional preferida, dicho resto fluorescente aceptor es un desactivador.
Tal como se describio anteriormente, en el formato TaqMan, durante la etapa de anillamiento de la reaccion PCR, la sonda de hibridacion marcada se une al acido nucleico diana (es decir, el producto de amplificacion) y se degrada por la actividad exonucleasa 5' a 3' del Taq u otra polimerasa adecuada conocida por el experto en la tecnica, tal como la polimerasa Z05 preferida, durante la posterior fase de elongacion.
Por tanto, en una realizacion preferida, en el metodo segun la invencion, la amplificacion emplea una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'.
El metodo segun la invencion se puede aplicar ventajosamente sobre acidos nucleicos vmcos. Por tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el acido nucleico microbiano es un acido nucleico vmco.
Entre los acidos nucleicos vmcos, se puede aplicar ventajosamente el metodo segun la invencion sobre VHC. Por tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el acido nucleico microbiano es un acido nucleico de VHC. Sin embargo, se debe entender que la invencion tambien se puede aplicar sobre cualquier otro acido nucleico microbiano.
Un ejemplo de como realizar el calculo de los resultados cuantitativos en el formato TaqMan basado en un patron interno se describe a continuacion. Se calcula un tftulo a partir de los datos de entrada de los valores de fluorescencia corregidos del instrumento a partir de una corrida de PCR completa. Un conjunto de muestras que
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contienen un acido nucleico diana tal como un acido nucleico microbiano y un primer acido nucleico control que sirven como un acido nucleico patron cuantitativo interno se somete a PCR sobre un ciclador termico usando un perfil de temperatura como el especificado. En las temperaturas y tiempos seleccionados durante la PCR las muestras del perfil se iluminan por luz filtrada y los datos de fluorescencia filtrada se recogen para cada muestra para el acido nucleico diana y el acido nucleico patron cuantitativo interno. Despues de que se complete una corrida de PCR, las lecturas de fluorescencia se procesan para producir un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico patron cuantitativo interno y un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico diana. Cada conjunto de datos de concentracion de tinte se procesa de la misma manera. Despues de varias revisiones de verosimilitud, se calculan los valores de codo (CT) para el acido nucleico patron cuantitativo interno y el acido nucleico diana. El valor de codo se define como el punto donde la fluorescencia del acido nucleico diana o el acido nucleico patron cuantitativo interno cruza un umbral predefinido (concentracion de fluorescencia). La determinacion de tftulo se basa en las suposiciones de que el acido nucleico diana y el acido nucleico patron cuantitativo interno se amplifican con la misma eficacia y que en el valor de codo calculado se amplifican y se detectan cantidades iguales de copias de amplicon de acido nucleico diana y acido nucleico patron cuantitativo. Por lo tanto, el (CTQS - CTdiana) es lineal al log (conc. diana/conc. QS), en el que “QS” es para el acido nucleico patron cuantitativo interno. Entonces, el tftulo T se puede calcular, por ejemplo, usando una formula de calibracion polinomial como en la siguiente ecuacion:
T' = 10(a(CTQS - CTdiana)2 + b(CTQS - CTdiana) + c)
Las constantes polimoniales y la concentracion del acido patron cuantitativo interno son conocidas, por lo tanto, la unica variable en la ecuacion es la diferencia (CTQS - CTdiana).
Un ejemplo de como realizar el calculo de resultados cualitativos en el TaqMan esta descrito a continuacion: se analizaron los datos de entrada de los valores de fluorescencia corregidos del instrumento a partir de una corrida de PCR completa. Un conjunto de muestras que posiblemente contienen un acido nucleico diana tal como un acido nucleico microbiano y un acido nucleico control que sirven como un acido nucleico control interno cualitativo se somete a PCR sobre un ciclador termico usando un perfil de temperatura como el especificado. A temperaturas y tiempos seleccionados durante la PCR las muestras del perfil se iluminaron por luz filtrada y se recogieron los datos de fluorescencia filtrada para cada muestra para el acido nucleico diana y el acido nucleico control interno cualitativo. Despues de que se complete una corrida de PCR, las lecturas de fluorescencia se procesan para producir un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico control interno cualitativo y un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico diana. Cada conjunto de datos de concentracion de tinte se procesa de la misma manera. Los valores de codo (CT) se calculan para el acido nucleico control interno cualitativo y, si presenta, el acido nucleico diana. El valor de codo se define como el punto donde la fluorescencia del acido nucleico diana o el acido nucleico patron cuantitativo interno cruza un umbral predefinido (concentracion de fluorescencia). El control interno cualitativo es valido si se obtiene un CT dentro de los intervalos especificados y si la fluorescencia surge por encima de una intensidad de fluorescencia minima predefinida. Si no se obtiene CT de diana, el control interno cualitativo debe ser valido. Si se obtiene un CT de diana que indica la presencia de acido nucleico diana en la muestra, el control interno cualitativo puede ser valido o invalido.
Preferidos en el sentido de la descripcion son cualquiera de los metodos anteriormente descritos, en los que se proporcionan dicho primer y dicho segundo acido nucleico control dentro de un reactivo control.
El concepto de un reactivo control con un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones para deteccion cualitativa fiable y al mismo tiempo para cuantificacion fiable se puede usar ventajosamente para cualquier respectivo ensayo que se dirige a un acido nucleico microbiano.
Por tanto, otro aspecto de la invencion es el uso de un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano por PCR en tiempo real. Mas preferible es el uso anteriormente descrito, en el que dicho primer y segundo acido nucleico control se amplifican por el mismo par cebador o diferentes pares de cebadores pero hibridan con diferentes sondas.
Particularmente favorable es un uso de este concepto en el metodo segun la invencion. Por tanto, en otro aspecto, la invencion hace referencia al uso de un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano segun el metodo o metodos anteriormente descritos.
La descripcion tambien se refiere a un kit para la deteccion y cuantificacion simultanea de un acido nucleico microbiano en una muestra biologica por PCR en tiempo real, comprendiendo dicho kit un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones, uno o mas pares de cebadores que hibridan espedficamente con porciones de secuencia distintas de dicho acido nucleico microbiano y con porciones de secuencia distintas de dicho primer y segundo acido nucleico control, y sondas que hibridan espedficamente con cada una de las secuencias amplificadas por dichos uno o mas pares de cebadores, en las que se proporcionan dichos primeros y segundos acidos nucleicos controles dentro de un reactivo control.
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En una realizacion preferida, la descripcion se refiere a un kit para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano en una muestra biologica segun cualquiera de los metodos descritos anteriormente, comprendiendo dicho kit un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones, uno o mas pares de cebadores que hibridan espedficamente con porciones de secuencia distintas de dicho acido nucleico microbiano y con porciones de secuencia distintas de dicho primer y segundo acido nucleico control, y sondas que hibridan espedficamente con cada una de las secuencias amplificadas por dichos uno o mas pares de cebadores.
Un aspecto adicional preferido de la descripcion es un kit como se describio anteriormente, en el que dicho primer y segundo acido nucleico control se amplifican por el mismo par cebador pero hibridan con diferentes sondas, proporcionando asf un sistema competitivo. Sin embargo, se ha de entender que ensayos y kits no o parcialmente competitivos para llevar a cabo los respectivos metodos tambien estan comprendidos por la descripcion.
Tales kits pueden comprender ademas, como se conoce en la tecnica, objetos de plasticos que se pueden usar durante el procedimiento de preparacion de muestra como, por ejemplo, placas de microtftulo en el formato de 96 o 384 pocillos o tubos de reaccion normales fabricados por, por ejemplo, Eppendorf, Hamburg, Alemania y todos los otros reactivos para llevar a cabo el metodo segun la invencion. Por lo tanto, el kit ademas puede contener un material con una afinidad a acidos nucleicos, preferentemente el material con una afinidad a acidos nucleicos comprende un material con una superficie de sflice. Preferentemente, el material con una superficie de sflice es un vidrio. Lo mas preferentemente, el material con una afinidad a acidos nucleicos es una composicion que comprende partfculas de vidrio magneticas. El kit puede comprender mas o ademas un reactivo de proteasa y un tampon de lisis que contiene, por ejemplo, agentes caotropicos, detergentes o alcoholes o mezclas de los mismos que permiten la lisis de las celulas. Estos componentes del kit segun la invencion se pueden proporcionar por separado en tubos o recipientes de almacenamiento. Dependiendo de la naturaleza de los componentes, estos incluso se pueden proporcionar en un tubo sencillo o recipiente de almacenamiento. El kit ademas puede comprender mas o ademas una solucion de lavado que es adecuada para la etapa de lavado de las partfculas de vidrio magneticas cuando un acido nucleico se une a las mismas. Esta solucion de lavado puede contener etanol y/o agentes caotropicos en una solucion o soluciones tamponadas con un pH acido sin etanol y/o agentes caotropicos como se describieron anteriormente. Con frecuencia la solucion de lavado u otras soluciones se proporcionan como soluciones madres que tienen que diluirse antes del uso. El kit puede comprender mas o ademas un eluyente o tampon de elucion, es decir, una solucion o un tampon (por ejemplo, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) o agua pura para eluir el acido nucleico unido a las partfculas de vidrio magneticas. Ademas, los reactivos adicionales o soluciones tamponadas pueden estar presentes, las cuales se pueden usar para el proceso de purificacion de un acido nucleico.
Preferentemente, el kit contiene una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'. Tambien preferido es que el kit contiene una enzima con actividad de transcriptasa inversa.
En otra realizacion preferida, el kit contiene una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3' y actividad de transcriptasa inversa.
En una realizacion preferida de la descripcion, el metodo segun la invencion esta embebido en una secuencia de metodos llevados a cabo dentro de un sistema analftico, formando de ese modo preferentemente un proceso automatizable.
Por lo tanto, un aspecto preferido de la descripcion, es lo siguiente:
un sistema analftico para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano en una muestra biologica por PCR en tiempo real, comprendiendo dicho sistema:
- un modulo de preparacion de muestra que comprende un tampon de lisis y un recipiente para aislar y purificar dicho acido nucleico microbiano,
- un modulo de amplificacion y deteccion que comprende un recipiente de reaccion en el cual se realiza el metodo anteriormente descrito,
- un kit como se describio anteriormente.
El modulo de preparacion de muestra puede comprender ventajosamente componentes para los procedimientos de preparacion de muestra descritos anteriormente, es decir, por ejemplo, partfculas de vidrio magneticas y un magneto para separarlas de la solucion, un reactivo de proteasa, soluciones de sal caotropica y uno o mas recipientes que contienen la muestra cruda y los reactivos requeridos para la preparacion de muestra.
El recipiente de reaccion en el modulo de amplificacion y deteccion puede ser, por ejemplo, una placa de microtftulo, un vial de centrifugacion, un tubo de lisis, o cualquier otro tipo de recipiente adecuado para contener una mezcla de reaccion segun la invencion.
En una realizacion preferida de la descripcion, el sistema analftico contiene un modulo de almacenamiento que
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contiene los reactivos para realizar el metodo de la invencion.
Ademas, dicho modulo de almacenamiento puede contener mas otros componentes utiles para el metodo de la invencion, por ejemplo, desechables tales como puntas de pipetas o incluso recipientes para usar como recipientes de reaccion dentro del modulo de amplificacion y deteccion.
En una realizacion preferida de la descripcion, el sistema analttico incluye un modulo de sistema preanalttico para transferir la muestra biologica desde tubos principales a recipientes utilizables sobre el sistema analttico.
In otra realizacion preferida mas de la descripcion, el sistema analttico contiene un modulo de transferencia para transferir la muestra biologica desde el modulo de preparacion de muestra al modulo de amplificacion y deteccion.
Aunque es posible llevar a cabo dicha transferencia manualmente, es preferible usar un sistema automatizado en el que la transferencia se realiza, por ejemplo, mediante un dispositivo robotico tal como, por ejemplo, como una rejilla movil conducida por motor o brazo articulado robotico.
Proceso automatizable significa que las etapas del proceso son adecuadas para llevarse a cabo con un aparato o maquina capaz de funcionar con poco o sin control externo o influencia por un ser humano. Metodo automatizado significa que las etapas del metodo automatizable se llevan a cabo con un aparato o maquina capaz de funcionar con poco o sin control externo o influencia por un ser humano. Solamente las etapas de preparacion para el metodo pueden tener que ser hechas a mano, por ejemplo, los recipientes de almacenamiento se tienen que llenar y poner en su lugar, la eleccion de muestras tiene que realizarse por un ser humano y las etapas adicionales conocidas por el experto en el campo, por ejemplo, el funcionamiento de un ordenador controlador. El aparato o maquina puede, por ejemplo, anadir automaticamente lfquidos, mezclar las muestras o llevar a cabo las etapas de incubacion a temperaturas espedficas. Generalmente, tal maquina o aparato es un robot controlado por un ordenador que lleva a cabo un programa en el que se especifican las etapas simples y los comandos.
Por tanto, preferentemente, el sistema analttico segun la descripcion comprende ademas una unidad control para controlar los componentes del sistema.
Tal unidad control puede comprender un programa informatico para asegurar que los diferentes componentes de dicho sistema analttico funcionan e interactuan de manera correcta y con el ritmo correcto, por ejemplo, moviendo componentes tal como la muestra al modulo de reaccion de una manera coordinada. La unidad control tambien puede comprender un procesador que corre un sistema que funciona en tiempo real (RTOS), que es un sistema operador multitarea destinado a las aplicaciones en tiempo real. En otras palabras, el procesador del sistema es capaza de manejar las restricciones en tiempo real, es decir, vencimientos operacionales desde el suceso a la respuesta del sistema sin tener en cuenta la carga del sistema. Controla en tiempo real que las diferentes unidades dentro del sistema funcionen y respondan de manera correcta segun las instrucciones dadas.
Todas otras realizaciones preferidas y descripciones espedficas de las realizaciones de los usos, kits y sistemas analfticos descritos son las mencionadas para el metodo segun la descripcion.
Descripcion de las Figuras
Figura 1a:
En la grafica se muestran las curvas de crecimiento control interno para las reacciones PCR en tiempo real cuantitativas de la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VlH-1 comercial. Las reacciones PCR conteman concentraciones de diana de VIH-1 que abarcaban un intervalo de 5 log10 y una muestra diana negativa. Si estan presentes altas concentraciones de diana en la reaccion (vease “Diana alto positiva”) el nivel de fluorescencia que se alcanza por el acido nucleico patron cuantitativo interno (QS) es significativamente inferior que en el caso de reacciones PCR sin diana de VIH-1 presente (vease “Diana negativo”). Ya que el QS debe ser valido en todas las concentraciones de diana para ser capaces de calcular un tftulo para una produccion de resultado cuantitativo, el ajuste de nivel de intensidad de fluorescencia minima (“RFImin”) para el QS es bajo. Los ajustes de RFImin para una produccion de resultado cuantitativo en las tres pruebas comerciales CoBaS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHB, VHC y VIH-1 se dan en la Tabla 1.
Figura 1b:
En la grafica se muestran las curvas de crecimiento control interno para las reacciones PCR en tiempo real de la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VIH-1 comercial. Todas las reacciones PCR conteman muestras diana negativas de VIH-1. El nivel de fluorescencia de las curvas de crecimiento control interno se encuentra dentro de un intervalo estrecho y el ajuste del nivel de la intensidad de fluorescencia minima (“RFImin”) para el acido nucleico control interno cualitativo (IC) es alto. En reacciones diana positivas el IC puede caer por debajo del RFImin y puede llegar a ser invalido; en presencia de diana el resultado para la reaccion PCR es todavfa valido. Los ajustes de RFImin como los optimizados para una produccion de
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resultado cuantitativo para las tres pruebas comerciales COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHB, VHC y VIH-1 se dan en la Tabla 1.
Figura 2:
Produccion de partmulas de ARN blindado: vector de expresion para la produccion de partmulas de ARN blindado y microscop^a por electrones de partmulas de ARN blindado. Las partmulas de ARN blindado se componen en E. coli. Despues de la induccion del Operon lac se transcribe el ARNm que incluye el gen del bacteriofago MS-2 de la protema de la cubierta de MS-2, la secuencia control, una senal de empaquetamiento y una secuencia del plasmido corriente arriba (upstream) del terminador TrrnB. Despues de que se traduzca la protema de cubierta, la composicion de la partmula se da espontaneamente empaquetando una copia de ARNm.
Figura 3:
Curvas de crecimiento normalizadas obtenidas para una reaccion PCR en tiempo real que contiene diana de VHC, un primer acido nucleico control y un segundo acido nucleico control.
Figura 4a:
Amplificacion simultanea de ARN de VHC y QS. La intensidad de fluorescencia de tanto QS como ARN de VHC es menor que en una reaccion que conduce a senales estandar (vease la Fig. 4b).
Figura 4b:
Amplificacion simultanea de ARN de VHC y QS. Ambas reacciones dan como resultado intensidades de fluorescencia estandar. Para comparar vease la Fig. 4a con curvas de fluorescencia suprimidas, tambien indican la diferente magnitud en las dos figuras.
Ejemplos
Ejemplo 1: Un primer acido nucleico control se evalua segun diferentes criterios para obtener una produccion de resultado cualitativo y cuantitativo.
Las pruebas COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHB, VHC y VIH-1 son ensayos de PCR en tiempo real comercialmente disponibles que se han optimizado para la cuantificacion exacta de las dianas vmcas VHB, VHC y VIH-1. Los ensayos se usan o bien sobre el sistema COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan completamente automatizado que incluye una estacion de acoplamiento para la transferencia automatizada de la mezcla de reaccion PCR desde la unidad de preparacion de muestra a la unidad de amplificacion/deteccion o sobre el sistema COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan con transferencia manual o sobre el sistema COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48.
Se uso la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHC como ejemplo para investigar el enfoque de proporcionar resultados del ensayo cuantitativo y cualitativo simultaneos con un conjunto de reactivos identicos. La prueba tiene un Lfmite de Deteccion de 15 Ul/ml y muestra el estado de la sensibilidad de la tecnica, comparable o mejor a los ensayos de VHC cuantitativos pero tambien cualitativos en el mercado. Debido a esta alta sensibilidad ha habido intentos de usar tambien el ensayo como ensayo de VHC cualitativo. El foco de atencion principal de un ensayo cuantitativo es proporcionar tftulos de VHC exactos mientras que el foco de atencion principal de un ensayo cualitativo es asegurar la alta sensibilidad del ensayo. Ya que originalmente la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHC se desarrollo para hacer un seguimiento cuantitativo del exito del tratamiento se condujo un analisis de si el ensayo tambien se puede usar sin ningun cambio para proporcionar resultados cualitativos fiables. Una revision de los datos revelo que en el suceso poco comun de una PCR menos eficaz la sensibilidad de 15 Ul/ml no se garantiza por el ensayo cuantitativo con sus ajustes de analisis de datos actuales. Mas adelante se da un ejemplo de una reaccion PCR que esta inhibida pero muestra un resultado de QS valido y una deteccion fallida de diana (2.183 Ul/ml):
En la Fig. 4a se muestra una reaccion PCR inhibida que produce un resultado valido debido a un QS valido y un resultado de “Diana no detectada”. El QS era valido debido a que superaba los ajustes de umbral de fluorescencia que correspondfan a 0,8 unidades de fluorescencia relativas.
El ensayo de repeticion de la misma muestra mostro una reaccion PCR estandar y un resultado de tftulo de VHC de 2.183 Ul/ml (Fig. 4b).
Por tanto, la prueba de COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHC sin ningun cambio no se puede usar como ensayo cualitativo.
Al usar el ensayo anteriormente mencionado los ajustes de los parametros de analisis de datos del acido nucleico
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control IC/QS se optimizaron de modo que se alcanzaba una produccion de resultado cualitativo fiable. Para demostrar la aplicabilidad general, ademas se emprendio la optimizacion para todos los tres ensayos de VHB, VHC y VIH-1 comerciales sobre el sistema COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan. Al subir significativamente el umbral de la intensidad de fluorescencia relativa minima (RFImin) en los ajustes de parametro se asegura la sensibilidad de todos los tres ensayos cuantitativos de modo que se pueden usar para proporcionar una produccion de resultado cualitativo fiable. Los ajustes de parametro relevantes se muestran en la Tabla 1 de a continuacion:
Tabla 1. Ajustes de RFImin para el control interno de tres pruebas COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan en la aplicacion cuantitativa comercialmente disponible y en una aplicacion cualitativa.
RFImin IQS Cuantitativo RFImin IQS Cualitativo
Prueba de VHB sobre COBAS AmpliPrep/COBAS Taqman
1,5 10,4
Prueba de VHC sobre COBAS AmpliPrep/COBAS Taqman
1,8 9,0
Prueba de VIH-1 sobre COBAS AmpliPrep/COBAS Taqman
1,2 20,4
Los ajustes de RFImin cualitativos de 9,0 invalidanan la reaccion PCR inhibida en el ejemplo anteriormente dado para VHC.
Los anteriores ajustes de RFImin para la produccion de resultado cualitativo no se pueden usar simultaneamente para la produccion de resultado cuantitativo debido a que la presencia de diana puede afectar a la intensidad de fluorescencia de las curvas de crecimiento IC/QS como se muestra en la Figura 1a. Como resultado los ajustes de RFImin cualitativos conducen a un alto porcentaje de reacciones invalidas de IC/QS en presencia de altas concentraciones de diana. Por el contrario, esto no afecta a la validez de la produccion de resultado cualitativo ya que el IC no debe ser valido en presencia de diana. Aunque la validez de la reaccion cuantitativa esta afectada significativamente.
Por tanto, si se usan los mismos reactivos de ensayo con un IC/QS para proporcionar tanto una produccion de resultado cualitativo fiable con sensibilidad garantizada del ensayo como un resultado de ensayo cuantitativo fiable con niveles aceptablemente bajos de resultados invalidos de QS esto solamente se puede alcanzar analizando los datos en bruto con dos conjuntos diferentes de ajustes de parametro como se sugiere en la presente.
Ejemplo 2: Se usaron un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones para obtener una produccion de resultado cualitativo y cuantitativo con los mismos reactivos de ensayo.
El objetivo es proporcionar tanto una produccion de resultado cualitativo fiable como un resultado de ensayo cuantitativo fiable con el mismo conjunto de reactivos de ensayo. En este enfoque de dirigirse a este objetivo el acido nucleico control interno que contiene reactivo comprende una formulacion con dos partfculas de ARN blindado diferentes. Los siguientes reactivos se pueden usar para este experimento:
a) reactivos de preparacion de muestra de la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHC (suspension de partfcula magnetica; solucion de proteasa, tampon de lisis; tampon de elucion),
b) partfcula blindada de QS a un nivel de concentracion de aproximadamente 1.000 copias/reaccion y una partfcula blindada de IC a un nivel de concentracion de aproximadamente 100 copias/reaccion. La produccion de partfculas de ARN blindadas se muestra en la Figura 2 de mas adelante. Los transcriptos encerrados por las partfculas blindadas tienen diferentes sitios de union a cebador y diferentes sitios de union a sonda. Las sondas estan marcadas con los marcadores fluorescentes HEX y CY5 junto con el Black Hole Quencher BHQ,
c) reactivo de magnesio,
d) reactivo Mastermix que comprende:
- ADN polimerasa Z05 y UNG,
- tres pares de cebadores diferentes para el VHC diana, para el primer y el segundo acido nucleico control,
- tres sondas diferentes para la diana marcada con FAM y BHQ, para el primer acido nucleico control marcado con HEX y BHQ y para el segundo acido nucleico control marcado con CY5 y BHQ,
- aptamero
- dNTPs (dUTP, dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
5
10
15
20
25
30
- ingredientes tampon mastermix (acetato de potasio, glicerol, Tricina, DMSO, Betaina, IGEPAL, agua).
La preparacion de la muestra y las etapas de amplificacion/deteccion se realizan usando los parametros de extraccion de especimen y el archivo de PCR establecido por la prueba COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan VHC. Se obtienen las curvas de crecimiento para los tres diferentes tintes fluorescentes y se presentan en la Figura 3.
Para las muestras de VHC los tftulos se determinan como sigue para obtener la produccion de resultado cuantitativo: despues de que se complete una corrida de PCR, las lecturas de fluorescencia se procesan para producir un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico QS (marcador fluorescente HEX), un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico patron cualitativo (marcador fluorescente CY5), y un conjunto de datos de concentracion de tinte para el acido nucleico diana (marcador fluorescente FAM). Todos los tres conjuntos de datos de concentracion de tinte se procesan de la misma manera. Los valores de codo (CT) se calculan para el acido nucleico patron cuantitativo y el cualitativo, asf como el acido nucleico diana. El valor de codo se define como el punto donde la fluorescencia del acido nucleico diana o los dos acidos nucleicos control internos cruza un umbral predefinido (concentracion de fluorescencia).
Para la produccion de resultado cuantitativo la determinacion de tftulo se hace analizando solamente los datos de concentracion de tinte para HEX y FAM. La determinacion de tftulo se basa en la suposicion de que el acido nucleico diana y el acido nucleico QS se amplifican con la misma eficacia y que en el valor de codo calculado se amplifican y detectan cantidades iguales de copias de amplicon de acido nucleico diana y acido nucleico QS. Por lo tanto, el (CTQS - CTdiana) es lineal a log (conc. diana/conc. QS). Entonces, el tftulo T se puede calcular, por ejemplo, usando una formula de calibracion polinomial como en la siguiente ecuacion en la que la unica variable en la ecuacion es la diferencia (CTQS - CTdiana):
T' = 10(a(CTQS - CTdiana)2 + b(CTQS - CTdiana) + c)
Para la produccion de resultado cualitativo se analizaron solamente los datos de concentracion de tinte para CY5 y FAM. Al comparar los datos de concentracion de tinte para CY5 y FAM el programa informatico determina si la reaccion PCR es diana negativa o positiva. Si la reaccion PCR es diana positiva se omite el resultado de IC y, por tanto, puede ser valido o invalido. Si la reaccion PCR es diana negativa, el resultado es solamente valido si el IC muestra un resultado valido. En el ejemplo anteriormente mostrado, todas las reacciones contienen niveles bajos de diana de VHC y - aunque no relevante para la validez de los respectivos resultados de ensayo - todas las reacciones muestran un iC valido.

Claims (4)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar y cuantificar simultaneamente un acido nucleico microbiano en una muestra biologica, comprendiendo dicho metodo:
    a) aislar y purificar dicho acido nucleico microbiano,
    b) proporcionar una mezcla de reaccion que comprende un primer y un segundo acido nucleico control en diferentes concentraciones en la que el primer acido nucleico control es un acido nucleico patron cuantitativo presente en una concentracion de 20 a 5.000 veces el lfmite de deteccion de dicho acido nucleico microbiano, y el segundo acido nucleico control es un acido nucleico control interno cualitativo presente en una concentracion de 1 a 10 veces el lfmite de deteccion de dicho acido nucleico microbiano, uno o mas pares de cebadores que hibridan espedficamente con distintas porciones de secuencia de dicho acido nucleico microbiano y con distintas porciones de secuencia de dichos acidos nucleicos control, y sondas que hibridan espedficamente con cada una de las secuencias amplificadas por dichos uno o mas pares de cebadores, en los que dicho acido nucleico microbiano y dicho primer acido nucleico control y dicho segundo acido nucleico control hibridan con diferentes sondas que llevan diferentes marcadores,
    c) anadir el acido nucleico microbiano aislado y purificado a dicha mezcla de reaccion,
    d) realizar una o mas etapas de ciclado, en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de amplificacion, comprendiendo dicha etapa de amplificacion la produccion de uno o mas productos de amplificacion derivados de dicho acido nucleico microbiano si esta presente en dicha muestra y la produccion de un producto de amplificacion derivado de dicho primer acido nucleico control y dicho segundo acido nucleico control, y en donde una etapa de ciclado comprende una etapa de hibridacion, comprendiendo dicha etapa de hibridacion la hibridacion de las secuencias amplificadas por dicho par cebador con dichas sondas, en donde las sondas estan marcadas con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptor y cada una de las sondas lleva un diferente tinte fluorescente,
    e) detectar y medir senales fluorescentes generadas por los productos de amplificacion de dicho primer acido nucleico control y dicho acido nucleico microbiano y que son proporcionales a su concentracion, y detectar simultaneamente senales fluorescentes generadas por dicho producto de amplificacion de dicho segundo acido nucleico control, en donde la presencia de un producto de amplificacion de dicho segundo acido nucleico control es indicativo de una amplificacion que se da en la mezcla de reaccion incluso en ausencia de un producto de amplificacion para dicho acido nucleico microbiano, y determinar la cantidad de dicho acido nucleico microbiano en dicha muestra biologica en comparacion con las senales generadas por dicho acido nucleico microbiano y dicho primer acido nucleico control.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la amplificacion emplea una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho primer y dicho segundo acido nucleico control se proporciona dentro de un reactivo control.
  4. 4. El metodo de cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en el que el primer acido nucleico control y el segundo acido nucleico control tienen los mismos sitios de union a cebador, pero diferentes sitios de union a sonda.
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