DE68924984T2

DE68924984T2 - Adhäsionsrezeptor für laminin und dessen verwendung.

Info

Publication number: DE68924984T2
Application number: DE68924984T
Authority: DE
Inventors: Eva Engvall; Kurt Gehlsen; Erkki Ruoslahti
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-22
Publication date: 1996-05-23
Anticipated expiration: 2009-05-23
Also published as: EP0452314B1; DE68924984D1; ATE130757T1; EP0452314A4; JPH08205885A; AU3766989A; CA1338771C; WO1989011273A1; EP0452314A1; JPH03504383A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Zelladhäsionssysteme und im besonderen einen Adhäsionsrezeptor für Laminin.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Vieles von dem, was auf der Zelloberfläche geschieht, hängt mit der Erkennung von Substanzen durch die Zelle zusammen, die diese umgeben. Ein gutes Beispiel hierfür ist die Bindung von löslichen Hormonen durch die Zelle und ihr Ansprechen auf eine derartige Bindung. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Zelloberflächenerkennung ist die Interaktion der Zelle mit sie umgebenden unlöslichen Strukturen. Eine derartige Struktur kann die Oberfläche einer anderen Zelle oder die extrazelluläre Matrix sein.
Obgleich die Interaktionen von Zellen untereinander und mit extrazellulären Matrizes nicht gut verstanden werden, spielen sie eine wichtige Rolle im Leben der Zelle. Beispielsweise scheinen Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen einer Zelle mitzuteilen, an welcher Stelle des Körpers sie sein sollte oder wo sie sich hinzubegeben hatte, wenn sie migrieren soll. Ein besonders faszinierendes Beispiel hierfür liefern Nervenzellen, die Fortsätze an geeignete Positionen aussenden und dadurch Verbindungen zu entlegenen Teilen des Körpers herstellen. Das positionelle Signalisieren ist bei Krebs offensichtlich beeinträchtigt, da Tumore in Teile des Körpers eindringen und sich dort ausbreiten, die für deren Zellursprung unpassend sind. Da sich unsere Kenntnisse der Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen erweitern und ihre Erforschung möglich wird, ist es tatsächlich sehr wahrscheinlich, daß durch dieses Gebiet neues, wichtiges medizinisches Neuland erobert wird.
Sowohl Proteine als auch Kohlenhydrate an der Zelloberfläche können bei den Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen beteiligt sein. Extrazelluläre Matrizes sind aus einem unlöslichen Maschenwerk aus Protein und Kohlenhydrat zusammengesetzt, das von den Zellen verankert wird und den überwiegenden Bereich der interzellulären Zwischenräume ausfüllt. Die Matrizes an verschiedenen Stellen des Körpers bestehen aus verschiedenen Kombinationen von Kollagenen, Proteoglykanen, Elastin, Hyaluronsäure und verschiedenen Glykoproteinen wie Fibronektin und Laminin. Nahezu sämtliche der identifizierten extrazellulären Matrix-Glykoproteine und Kollagene interagieren mit Zellen.
Das am schnellsten zu beobachtende Ergebnis der Interaktion von Zellen mit den extrazellulären Matrix-Molekülen ist die Zelladhäsion. Die adhäsiven Eigenschaften der extrazellulären Matrixproteine können leicht in vitro nachgewiesen werden, indem Zellen auf eine mit extrazellulärem Matrixmaterial oder mit einem der gereinigten Matrixproteine beschichtete Oberfläche ausplattiert werden. Die Zellen werden sich rasch an eine derartige Oberfläche anheften und sich auf ihr ausbreiten. Die adhäsiven Proteine fördern jedoch nicht nur die Adhäsion, sondern sie stimulieren auch die Zellmigration. Sofern Zellen mit beschränkenden Konzentrationen eines als Gradient auf eine Oberfläche aufgebrachten adhäsiven Proteins konfrontiert werden, bewegen sie sich in Richtung der höheren Konzentration.
Auf komplexeren Wegen vollzieht sich die Einflußnahme der extrazellulären Matrizes auf Zellen bei der Förderung der Differenzierung, des Überlebens und des Wachstums von Zellen. Eines der extrazellulären Matrixproteine, Laminin, weist besonders bemerkenswerte Effekte auf Zellen auf. Dieses Protein, welches in den spezialisierten extrazellulären Matrixschichten und Basalmembranen vorhanden ist, fördert die Anheftung und Migration von Zellen und spielt eine Rolle bei der Differenzierung und der Metastasierung von Tumoren. Ferner fördert und steuert Laminin das Wachstum von Nervenzellfortsätzen oder Neuriten.
Es wird davon ausgegangen, daß diese Interaktionen zwischen Zellen und Laminin durch Zelloberflächenrezeptoren vermittelt werden, die als Adhäsionsrezeptor für Laminin fungieren. Die vollständige Beschaffenheit des Rezeptors, oder der Rezeptoren, die die Effekte von Laminin auf Zellen vermitteln, ist nach wie vor unbekannt.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifizierung und Isolierung von Laminin-Adhäsionsrezeptoren. Die Verfügbarkeit eines isolierten Rezeptors wird die Herstellung von für diesen Rezeptor spezifischen Antikörpern erlauben, die beispielsweise bei der Analyse der Expression von Lamininrezeptoren an der Oberfläche von Tumorzellen verwendet werden könnten. Verbindungen, wie rekombinante Proteinfragmente, die an den Rezeptor binden, können verwendet werden zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Reproduktion der Aktivität von Laminin oder zur Inhibierung der Adhäsion von Zellen an Laminin enthaltende Strukturen. Zudem besteht ein Bedarf an einer Zusammensetzung zum Targeting von Liposomen zu spezifischen Geweben für therapeutische oder andere Zwecke. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und liefert ebenfalls zusätzliche Vorteile.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Durch die vorliegende Erfindung wird ein im wesentlichen reiner, von Säugern stammender Laminin-Adhäsionsrezeptor bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er zwei Untereinheiten, α und β, umfaßt und mit Laminin und den die Zellanheftung fördernden Fragmenten von Laminin ausgehend von dem Bereich von Laminin, der aus den COOH-terminalen Bereichen seiner Polypeptide besteht, interagiert. Die Interaktion mit Laminin oder die Zellanheftung fördernden Fragmenten von Laminin ist von einem divalenten Kation abhängig. Die größere (α)-Untereinheit ist reaktiv gegenüber Anti-α&sub3;-Antiserum.
Nach einem Aspekt wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Laminin-Adhäsionsrezeptors bereitgestellt. Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden monoklonale und polyklonale Antikörper gegen den isolierten Rezeptor hergestellt, und deren Reaktivität gegenüber dem gereinigten Rezeptor wird analysiert. Da keine anderen Rezeptoren bekannt sind, die die α&sub3;-Untereinheit enthalten, sind Antikörper gegen die größere α-Untereinheit spezifisch für den Lamininrezeptor, wohingegen einige Antikörper gegen die kleinere β-Untereinheit mit dem Fibronektinrezeptor und anderen, mit der Zelladhäsion zusammenhängenden Rezeptoren reagieren können. Die Anti-α-Untereinheit-Antikörper sind geeignet zur Bestimmung der Menge an Lamininrezeptor, die von einem gegebenen Zelltyp exprimiert wird. Eine weitere Selektion anhand von Assays zur Zellanheftung liefert Anti-α-Untereinheit-Antikörper, die die Anheftung von Zellen an Laminin inhibieren können. Derartige Antikörper verhindern in einem in vitro-Assay das Eindringen von Tumorzellen durch das Gewebe der Amnionmembran.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird der Rezeptor verwendet zur Bereitstellung von Verbindungen, die verwendet werden können zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Reproduktion oder zum Inhibieren der Funktion des Lamininrezeptors. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Zell-Oberflächenrezeptoren in die Membranen von Liposomen eingeschlossen zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Targeting des Inhalts der Liposomen zu Geweben, die Laminin enthalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1. Analyse von aus der Laminin-Affinitätsmatrix eluierten Fraktionen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE). RuGli Glioblastomzellen wurden oberflächenmarkiert und extrahiert, und der Extrakt wurde wie in Beispiel I beschrieben über eine Sepharose-Säule fraktioniert, die, kovalent gebunden, die Zellanheftung fördernde Fragmente von Laminin enthielt. Aliquots einer jeden Fraktion wurden mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, wobei zur Sichtbarmachung der Proteinbanden eine Autoradiographie erfolgte. Die Spuren 1-13 zeigen Fraktionen aus der EDTAElution der Säule. Die Molekulargewichtsmarker waren: Myosin, 200 kd; β-Galaktosidase, 116 kD; Phosphorylase B, 94 kD; bovines Serumalbumin, 67 kD; Ovalbumin, 43 kD.
Figur 2. SDS-PAGE-Analyse des RuGli Lamininrezeptors (Spur 1) und des Fibronektinrezeptors (Spur 2) unter nicht-reduzierenden (NR) und reduzierenden (R) Bedingungen. Der Fibronektinrezeptor wurde erhalten aus demselben Zellextrakt wie der Lamininrezeptor, indem unter Anwendung des Verfahrens von Pytela et al., Cell 40:548, (1985), als Affinitätsmatrix die Zellanheftung fördernde Fibronektinfragment-Sepharose verwendet wurde. Die Bedingungen der Elektrophorese waren dieselben wie in Figur 1. Die Pfeile bezeichnen die leichten Ketten der α-Untereinheiten.
Figur 3. Immunoblot-Analyse des Lamininrezeptors. Die aus RuGli-Zellen isolierten Fibronektin (A)- und Laminin (B)-Rezeptoren wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen, und die Filter wurden mit Anti-Fibronektinrezeptor-Antikörpern des Kaninchens inkubiert (Argraves et al., J. Cell Biol. 105:1183, 1987), wonach die gebundenen Antikörper anhand von mit Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-Kaninchen-IgG der Ziege nachgewiesen wurden.
Figur 4. Immunoblot-Analyse von Laminin- und Fibronektinrezeptoren. Die Fibronektin (Spuren 1, 3)- und Laminin (Spuren 2, 4)-Rezeptoren, die aus RuGli-Zellextrakten isoliert worden waren, wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter wurden entweder mit Kaninchen-Antiserum gegen den Fibronektinrezeptor, absorbiert mit Sepharose-gekoppeltem Lamininrezeptor (Spuren 1, 2) oder mit einem von Sepharose-gekoppeltem Fibronektinrezeptor absorbierten Anti-Lamininrezeptor- Antiserum des Kaninchens (Spuren 3, 4) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit Anti-Kaninchen-IgG der Ziege, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Der zur Absorption verwendete Anti-Fibronektinrezeptor-Antikörper ist beschrieben worden (Pytela et al., Meth. Enzymol., 144:475-489 (1987)), und das Anti-Lamininrezeptor-Antiserum wurde hergestellt durch Immunisieren mit aus RuGli-Zellen gemäß Darlegung in Beispiel I gereinigtem Rezeptor.
Figur 5. Bindung von den Lamininrezeptor enthaltenden Liposomen an Substrate. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden beschichtet mit verschiedenen Proteinen, und nicht besetzte Bindungsstellen des Kunststoffes wurden blockiert, indem die Vertiefungen mit bovinem Serumalbumin inkubiert wurden. Das Binden oder die Inhibierung des Bindens der Rezeptorliposomen an die Vertiefungen wurde anschließend wie in Beispiel II beschrieben untersucht. Die Ergebnisse von sechs Experimenten sind als Prozentgehalt der maximalen Bindung angegeben. Die mittlere Standardabweichung nach Subtraktion des Hintergrundes von der BSA-Anheftung ist dargestellt: LM, humanes Laminin; FN, Fibronektin; IV, Typ IV-Kollagen; LM + LM-Fragmente, LM + 20 ug chymotryptische Lamininfragmente; LM + RGD, LM + 1 mg/ml GRGDSP- Peptid; LM + YIGSR, LM + 1 mg/ml YIGSR-Peptid; Fibronektinrezeptor-Liposomen (weiße Säulen); LMR, Lamininrezeptor-Liposomen (schraffierte Säulen).
Figur 6. Radiorezeptor-Bindungs-Assay. Aus verschiedenen humanen (MG-63, A431) und Ratten (RuGli, NRK-49F)-Zellen isolierte gereinigte und mit Jod markierte Lamininrezeptoren inkubierte man mit verschiedenen Proteinen, mit denen man Vertiefungen einer Mikrotiterplatte beschichtet hatte. Die Vertiefungen wurden gewaschen, und der gebundene Rezeptor wurde in 1 % SDS in TBS löslich gemacht und in einem γ-Zähler quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Prozentgehalt an gebundenem Rezeptor angegeben, wobei die Lamininbindung mit 100 % gleichgesetzt wurde. Die Säulen repräsentieren Rezeptoren aus verschiedenen Zelltypen, wie in der Figur angegeben - LM, humanes Laminin; FN, humanes Fibronektin; CIV, Typ IV-Kollagen; CI, Type I-Kollagen; BSA; bovines Serumalbumin.
Figur 7. Inhibierung der Lamininrezeptorbindung im Radiorezeptor-Bindungs-Assay. Die Daten veranschaulichen den Prozentgehalt von an mit Laminin beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren gebundenem Lamininrezeptor, verglichen mit der uninhibierten Lamininbindung, welche mit 100 % gleichgesetzt wurde. Die Lamininrezeptoren aus A-431-Zellen (gering schraffierte Säulen) und den RuGli-Zellen (dicht schraffierte Säulen) wurden verwendet. Die untersuchten Inhibitoren waren Laminin und Fibronektinfragmente und unmarkierter Rezeptor (beschrieben in Beispiel VIII). Der RuGli-Rezeptor wurde mit zweien der Inhibitoren (NA) nicht untersucht.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen von Säugern stammenden Adhäsionsrezeptor für Laminin. Es ist bekannt, daß Laminin sowohl bei der Differenzierung von normalen Zellen als auch bei der Metastasierung von malignen Zellen eine Rolle spielt. Die Isolierung dieses Rezeptors und gegenüber ihm reaktiven Antikörpern kann angewendet werden, um die Anwesenheit des Lamininrezeptors auf der Oberfläche von Tumorzellen nachzuweisen. Es ist gefunden worden, daß die Fähigkeit von Zellen, an Laminin zu binden, mit ihrer invasiven und metastatischen Kapazität korrelieren.
Um den Laminin-Adhäsionsrezeptor von Säugern zu isolieren und zu reinigen, wurden Extrakte von oberflächenmarkierten Säugerzellen fraktioniert über immobilisierte Lamininfragmente, die in der Lage sind, die Zellanheftung zu fördern. Vorzugsweise sind solche Zellen maligne Zellen neuraler Abstammung, obgleich auch andere Säuger-Zelltypen verwendet werden können. Beispielsweise wurden Glioblastomzellen der Ratte (RuGli) zunächst mit Jod und Lactoperoxidase oberflächenmarkiert und in Octylglykosid gelöst. Die RuGli-Zellen heften sich an einer mit Laminin beschichteten Kunststoffoberfläche an und breiten sich über diese aus. Die Zugabe von Mn²&spplus; zur Zellsuspension während des Anheftungs-Assays steigert die Anheftung der Zellen an die mit Laminin beschichtete Oberfläche. Durch Anwendung desselben Reinigungsverfahrens kann ein Rezeptor aus anderen Zelltypen und Geweben, wie aus humanen Osteosarcom-MG-63-Zellen oder Plazentageweben isoliert werden.
Lamininfragmente, die ihre die Zellanheftung fördernde Aktivität beibehalten, wurden im allgemeinen nach dem Verfahren von Engvall et al., J. Cell Biol. 103:2457 (1986) isoliert. Dieses Verfahren kann auf vielfältige Weise modifiziert werden, einschließlich der Verwendung von intaktem Laminin oder von Fragmenten, die mit anderen Proteasen als Pepsin und Chymotryp sin generiert wurden. Eine Affinitätsmatrix wurde hergestellt durch Kopplung der Lamininfragmente an Bromcyan (CNBr)-aktivierte Sepharose (Sigma, St. Louis, MO). Eine spezifische Elution wurde herbeigeführt durch Behandlung der Säule mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure). Sämtliche Puffer mit Ausnahme des Elutionspuffers enthielten 1 mM Mn²&spplus;, um die Bindung des Rezeptors an die Affinitätsmatrix zu erleichtern. Die eluierten Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und nachfolgender Autoradiographie analysiert. Wie in den Figuren 1 und 2 dargestellt, wurden in dem unvollständig ungefalteten Zustand, in dem das von RuGli- Zellen abgeleitete Protein unter nicht-reduzierenden Bedingungen vorliegt, zwei Proteinbanden beobachtet, die an Positionen migrieren, welche mit den geschätzten Molekulargewichten von 150 kD und 120 kD korrespondieren. Ein mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen bestimmtes genaueres Molekulargewicht zeigt, daß die Molekulargewichte dieser Untereinheiten etwa 165 bzw. 140 kD betragen, da aus der größeren der Untereinheiten bei Reduzierung zwei Polypeptide entstehen mit Molekulargewichten von 135 kD und 35 kD. Die kleinere Komponente taucht in dieser Analyse als eine 35/30 kD Dublette auf. Obgleich man nicht an diese Erklärung gebunden sein möchte, wird davon ausgegangen, daß das Polypeptid von 30 kD ein Spaltfragment des Polypeptids von 35 kD ist.
Aus humanen MG-63 Osteosarcomzellen und Plazentageweben wurde ebenfalls ein Laminin bindendes Protein mit Untereinheiten isoliert, die denjenigen des RuGli-Zellproteins ähnlich sind. Dieser humane Lamininrezeptor ist ebenfalls aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt. Die größere Untereinheit weist jedoch ein natives Molekulargewicht von 170 000 D auf.
Der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Laminin-Adhäsionsrezeptor" (auch bezeichnet mit "Adhäsionsrezeptor für Laminin") bezieht sich auf einen Zell-Oberflächenrezeptor, der die Adhäsion von Zellen an Laminin vermittelt. Er bindet selektiv an Laminin oder Lamininfragmente, die ihre die Zellanheftung fördernde Aktivität beibehalten, und bindet im wesentlichen nicht an Vitronektin, Fibronektin, Typ I- Kollagen oder Albumin. Der native Laminin-Adhäsionsrezeptor ist zusammengesetzt aus zwei Untereinheiten mit Molekulargewichten von etwa 165 bis 170 kD und etwa 140 kD. Das größere Polypeptid ist wiederum zusammengesetzt aus zwei Disulfid-verknüpften Ketten mit Molekulargewichten von etwa 135 kD und 35 kD.
Der Begriff "Laminin-Adhäsionsrezeptor" bezieht sich sowohl auf die nativen Strukturen als auch auf Modifikationen oder Isoformen solcher Strukturen, welche die Aktivität der Bindung von Laminin oder Lamininfragmenten beibehalten. Laminin oder Lamininfragmente, die die Zellanheftung fördernde Aktivität beibehalten, werden als Ligand des Laminin-Adhäsionsrezeptors bezeichnet. Es ist davon auszugehen, daß begrenzte Modifikationen der Struktur des Laminin-Adhäsionsrezeptors durchgeführt werden können, ohne die Liganden-bindende Aktivität zu zerstören, und daß lediglich ein Teil der gesamten Primärstruktur erforderlich sein kann, um die Aktivität zu bewirken. Fragmente des Rezeptors, die die Liganden-bindende Aktivität beibehalten, sind von der Definition eingeschlossen.
"Im wesentlichen rein" bezieht sich bei Verwendung zur Beschreibung des Zustandes des erfindungsgemäßen Laminin-Adhäsionsrezeptors auf den Rezeptor, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, die normalerweise mit dem Rezeptor assoziiert sind oder sich in dessen nativer Umgebung befinden, und der im wesentlichen von interferierenden und verdünnenden Zell- Oberflächenproteinen oder anderen Proteinen wie Antikörpern getrennt ist, die z.B. durch die Isolierung eingeführt wurden. In der "im wesentlichen reinen" Präparation kann jedoch mehr als eine Isoform des Rezeptors vorhanden sein.
Die heterodimere Struktur des isolierten Laminin-Adhäsionsrezeptors, die Disulfid-verknüpfte zweikettige Zusammensetzung seiner größeren Untereinheit und der Anstieg des Molekularge wichts der kleineren Untereinheit bei Reduktion sind charakteristische Eigenschaften der mit Integrinen bezeichneten Klasse von Rezeptoren (s. Ruoslahti und Pierschbacher, Science 238:491 (1987)). Die Integrine, welche eine Reihe von Rezeptoren einschließen, teilen Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenz.
Um die Beziehung zwischen dem Laminin-Adhäsionsrezeptor und bekannten Integrinen zu erforschen, wurde der Rezeptor einem Immunblotting mit affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern gegen bei Fibronektin- und Vitronektinrezeptoren zugeführt. Der Anti-Fibronektinrezeptor-Antikörper kreuzreagierte mit der kleineren (ß)-Untereinheit des Laminin-Adhäsionsrezeptors, wohingegen bei dem Anti-Vitronektinrezeptor-Antikörper keine Reaktivität beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Laminin- Adhäsionsrezeptor ein verschiedenes Protein ist, wobei eine Untereinheit desselben mit der β-Untereinheit des Fibronektinrezeptors verwandt sein kann. Die α-Untereinheit der Lamininrezeptoren war reaktiv gegenüber einem Antikörper gegen ein Peptid, das in Kenntnis der Sequenz der zytoplasmatischen Domäne der α&sub3;- Untereinheit (Hynes et al., J. Cell Biol., im Druck) modelliert wurde, was darauf hindeutet, daß die α-Untereinheit des Lamininrezeptors α&sub3; ist. Wie in Figur 3 dargestellt, ist die β-Untereinheit mit der β-Untereinheit des Fibronektinrezeptors nahe verwandt. Die Figur 4 zeigt jedoch, daß sie in immunologischer Hinsicht von ihr abweichen kann, zumindest im Fall der RuGli- Zellrezeptoren.
Die Spezifität der Ligandenbindung des Lamininrezeptors wurde anhand von Liposomen-Bindungs-Assays untersucht. Der Rezeptor wurde in Phosphatidylcholin-Liposomenmembranen nach dem Verfahren von Pytela et al., Cell 40:191 (1985), eingeschlossen. Kurz ausgedrückt, wird eine den Rezeptor und ein Phospholipid enthaltende Detergenslösung gegen einen Detergens-freien Puffer dialysiert. Die resultierenden Liposomen hefteten sich stark an mit Laminin beschichtete Substrate an. Sie banden ebenfalls, in variablem Ausmaß, an Fibronektin und an Typ IV- und Typ I-Kollagen, nicht aber an Substrate, die mit Vitronektin, Fibrinogen oder Albumin beschichtet waren. Im Gegensatz dazu banden mit Fibronektinrezeptor von denselben Zellen hergestellte Liposomen stark an Fibronektin und zeigten keine Wechselwirkung gegenüber Laminin. Die Anheftung der mit dem Laminin-Adhäsionsrezeptor hergestellten Liposomen wurde inhibiert durch gereinigte, die Zellanheftung fördernde Lamininfragmente, nicht aber durch das GRGDSP-Peptid, welches die Bindung von Zellen an Fibronektin und Vitronektin inhibiert (Gehlsen et al., J. Cell Biol. 106:925-950 (1988)), und auch nicht an ein anderes Peptid, welches von Laminin abgeleitet ist, nämlich YIGSR (Graf et al., Cell 48:989 (1987)). Sämtliche Peptide sind durch ihre übliche Abkürzung unter Verwendung eines Buchstabens identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Laminin-Adhäsionsrezeptor in die Liposomenmembranen inkorporiert werden kann, und daß er den Liposomen die erwartete Bindung an Laminin ermöglicht.
Die Laminin-Adhäsionsrezeptor-Liposomen sind geeignet zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Targeting von Liposomen in Basalmembranen. Beispielsweise können Ablagerungen in den Nierenglomeruli mit Zusammensetzungen behandelt werden, die Liposomen umfassen, welche mit proteolytischen und anderen Enzymen mittels Rezeptor-vermittelten Targetings beladen sind.
Um eine nicht-lipide Oberfläche mit Rezeptoren zu beschichten, wird ein Rezeptor aus einer Lösung an eine Oberfläche wie einen Kunststoff adsorbiert oder kovalent verknüpft, wobei eines der gut bekannten Verfahren für eine derartige Beschichtung oder Verknüpfung angewendet werden kann. Die Rezeptorfragmente, die die Liganden-bindende Aktivität beibehalten, denen aber der meinbranständige Teil des Moleküls fehlt, werden vorteilhafterweise verwendet, da sie stabiler als der vollständige Rezeptor sind. Derartige, mit Rezeptoren beschichtete Materialien sind geeignet als Prothesen, wenn eine Anheftung einer Basalmembran erwünscht ist, wie z.B. im Falle einer künstlichen Linse.
Die Bindungsspezifitäten der isolierten Lamininrezeptoren sind ebenfalls in einem Radiorezeptor-Assay untersucht worden, welcher darin besteht, daß mit ¹²&sup5;I markierter Rezeptor in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte inkubiert wird, die mit Laminin oder anderen Proteinen beschichtet sind, und daß die Bindung der Radioaktivität an die Vertiefungen gemessen wird. Die Lamininrezeptoren von jedem der Zelltypen banden an mit Laminin beschichtete Vertiefungen. Sie alle zeigten ebenfalls eine gewisse Affinität für Fibronektin, und einige der Rezeptoren banden an Typ IV-Kollagen (Figur 6). Das letztgenannte Ergebnis deutet darauf hin, daß die aus den verschiedenen Zelltypen isolierten Rezeptoren in zwei Kategorien fallen - Typ IV-Kollagen nichtbindend (z.B. RuGli) und Typ IV-Kollagen bindend (Z.B. MG63). Zwischen diesen Typen von Rezeptoren ist bislang kein chemischer Unterschied etabliert worden.
Der Radiorezeptor-Assay wurde ebenfalls angewendet, um die Fähigkeit verschiedener Proteinfragmente zur Inhibierung der Interaktion zwischen Laminin und seinem Rezeptor zu ermitteln (Figur 7). Fragmente von Laminin, die aus dem Bereich abgeleitet wurden, welcher aus den COOH-terminalen Teilen des Moleküls aufgebaut ist (Dillner et al., oben), inhibierten die Bindung. Zudem erwiesen sich die aus der Zellanheftungsregion des Moleküls abgeleitete Fibronektinfragmente ebenfalls als inhibitorisch. Die Fähigkeit der Fragmente, die Interaktion des Lamininrezeptors zu inhibieren, ist geeignet bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung der Anheftung von Tumorzellen an Basalmembranen von Blutgefäßen. Der Assay ist geeignet zum Identifizieren von anderen Substanzen, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen Lamininrezeptor und Laminin zu inhibieren.
Der vorliegend isolierte und charakterisierte Lamininrezeptor ist ein neuer Rezeptor und leicht von anderen bekannten Molekülen mit der Fähigkeit zur Bindung von Laminin zu unterscheiden. Beispielsweise beschreibt das am 21. Januar 1986 erteilte US-Patent Nr. 4 565 789 einen für Laminin spezifischen Zellmatrixrezeptor, der auf der Oberfläche von Karzinom- und Epithelzellen exprimiert wird. Dieser Rezeptor besitzt ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis etwa 75 000, sofern er auf einem SDS-Gel gereinigt wird. Smalheiser und Schwartz, "Cranin: A laminin-binding protein of cell membranes" P.N.A.S., USA, Bd. 84:6457-6461 (1987) offenbaren ein Glykoprotein von 120 kD, welches ebenfalls die Fähigkeit aufweist, Laminin zu binden. Keine dieser Veröffentlichungen beschreibt den erfindungsgemäßen Lamininrezeptor.
Monoklonale und polyklonale Antikörper gegen den Laminin- Adhäsionsrezeptor wurden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt. Die polyklonalen Antikörper werden absorbiert von dem an Sepharose gekoppelten gereinigten Fibronektinrezeptor (Argraves et al., oben). Da die β-Untereinheiten der Laminin- und Fibronektinrezeptoren ähnlich sind, und da die β- Untereinheit des Fibronektinrezeptors auch bei einer Reihe anderer Integrine vorhanden ist, werden durch diese Behandlung Antikörper eliminiert, die gegen Determinanten gerichtet sind, welche den Rezeptoren dieser Integrinfamilie gemeinsam sind. Ferner werden hierdurch Antikörper eliminiert, die gegen kontaminierende Proteine gerichtet sind, welche unspezifisch sowohl an die Laminin- als auch an die Fibronektin-Affinitätsinatrizes binden würden. Erforderlichenfalls können derartige Antikörper ebenfalls entfernt werden, indem das Antiserum absorbiert wird mit "einer mock-gereinigten Rezeptor-Präparation" (s. Beispiel VI). Die Spezifität der Antikörper wird untersucht, indem Enzym-Immunoassays, eine Immunpräzipitation von Detergensextrakten aus mit Jod oberflächen- und metabolisch markierten Zellen und ein Immunblotting des isolierten Lamininrezeptors, anderer isolierter Integrine und vollständiger Zellextrakte nach allgemein bekannten Techniken durchgeführt werden. Wie in Figur 4 dargestellt, ergab die Absorption eines Antiserums gegen den RuGli-Zell-Lamininrezeptor mit dem RuGli-Zell-Fibronektinrezeptor im Falle der Rugli-Zellrezeptoren eine Antikörperpräparation, die in erster Linie reaktiv gegenüber dem Lamininrezeptor ist.
Monoklonale Antikörper werden hergestellt durch Immunisierung mit dem isolierten Rezeptor oder anderem Material, welches den Rezeptor enthält, und durch nachfolgende Isolierung Antikörper-bildender Hybridoma-Zellen, wie im Stand der Technik bekannt ist. (S. z.B. Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, 1988). Die geeigneten Hybridoma-Zellen werden ausgewählt, indem mit dem gereinigten Lamininrezeptor Enzym- Immunoassays durchgeführt werden. Für den Lamininrezeptor spezifische Antikörper werden erhalten durch Immunblotting, um diejenigen Antikörper zu selektionieren, die gegenüber einer der Untereinheiten des Lamininrezeptors reaktiv sind, nicht aber mit anderen Integrin-Untereinheiten reagieren. Um für den Lamininrezeptor spezifische Antikörper zu erhalten, die die Laminin-bindende Aktivität des Rezeptors inhibieren können, werden die für die Untereinheit spezifischen monoklonalen Antikörper als Inhibitoren der Zellanheftung an Laminin untersucht. Dieser Assay wird durchgeführt, indem man Zellen das Anheften an Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in Anwesenheit und Abwesenheit des Antikörpers gestattet. Schließlich erfolgt eine Selektion der Antikörper, die die Anheftung fördern, indem die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit gereinigtem Antikörper in verschiedenen Konzentrationen beschichtet werden, und man die Zellen, die über den Lamininrezeptor verfügen, den Vertiefungen zugibt. Eine gegenüber Vertiefungen, die mit einem inerten Protein wie Serumalbumin beschichtet sind, gesteigerte Anheftung der Zellen weist auf die Anwesenheit eines Antikörpers mit den gewünschten Eigenschaften hin.
Der Laminin-Adhäsionsrezeptors kann ferner verwendet werden, um verschiedene Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Kompetition der Bindung an Laminin zu screenen. Vorzugsweise erfolgt ein derartiges Screening unter Anwendung eines Inhibierungs-Assays wie dem in Beispiel VIII beschriebenen, obwohl sich einem Fachmann auf dem Gebiet auch andere Verfahren anbieten. Der Inhibierungs-Assay kann vorteilhafterweise angewendet werden, um unbekannte Substanzen oder Mischungen von Substanzen auf inhibitorische Aktivität zu untersuchen. Wenn bei einer solchen Mischung eine inhibierende Aktivität gefunden wird, kann sie fraktioniert werden, um die bestimmte aktive Verbindung zu isolieren oder zu identifizieren. Derartige aktive Verbindungen können anschließend verwendet werden zur Herstellung einer Zusammensetzung entweder zur Förderung der Anheftung an ein Substrat von Zellen, die Laminin-Adhäsionsrezeptoren aufweisen, durch Beschichtung des Substrats mit einer derartigen Verbindung, oder zur Inhibierung der Adhäsion derartiger Zellen an Laminin durch Bereitstellung der Verbindung in löslicher Form.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, nicht aber der Beschränkung der Erfindung. Da die vorgestellten Vorgehensweisen typisch sind für diejenigen, die angewendet werden könnten, können andere Vorgehensweisen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, alternativ angewendet werden.

BEISPIEL I

ISOLIERUNG DES LAMININREZEPTORS

a. RuGli-Zellen

Die Glioblastom-Zellinie RuGli, erhalten vom Max-Planck-Institut, Tübingen, Deutschland, wurde als Quelle für den Laminin- Adhäsionsrezeptor der Ratte verwendet. Die Zellen wurde bis zur Konfluenz kultiviert, und die Zelloberflächen wurden mit ¹²&sup5;I nach dem Lactoperoxidase-Verfahren jodiniert (Lebien et al., J. Immunol. 129:2287 (1982)) und mit Tris-gepufferter Saline, pH- Wert 7,2, enthaltend 25 mM Octyl-β-D-thioglucosid (Calbiochem, LA Jolla, CA), 1 mM MnCl&sub2; und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Extraktionspuffer), extrahiert. In dem Puffer war Mn²&spplus; enthalten, da hierdurch die Isolierung des Fibronektinrezeptors durch Fibronektin-Affinitätschromatographie erleichtert wird.
Die Lamininfragmente mit die Zellanheftung fördernder und Neuriten fördernder Aktivität wurden aus menschlicher Plazenta nach dem Immunoaffinitäts-Chromatographieverfahren von Wewer et al., J. Biol. Chem. 258:12654 (1983) isoliert. Der zur Isolierung verwendete anti-humane Laminin-Antikörper 4E10 ist erhältlich bei Telios Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA.
Eine Laminin-Sepharose-Säule wurde hergestellt durch Kopplung von 90 mg humaner Lamininfragmente, erhalten wie oben beschrieben, an 10 ml mit Bromcyan aktiviertes Sepharose-Gel (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers.
Der lösliche Extrakt von 5 ml gepackter, mit Jod oberflächenmarkierter Zellen wurde auf eine 10 ml (Bettvolumen) Laminin-Sepharose-Säule aufgetragen. Der Zellextrakt wurde durch die Säule zweimal passagiert, und die Säule wurde mit 30 ml Extraktionspuffer gewaschen. Eine anfängliche Verdünnung erfolgte mit 20 ml Puffer enthaltend 2 mg/ml des synthetischen Peptids GRGDSP, gefolgt von 20 ml Kationen-freien Puffers enthaltend 20 mM EDTA. Aliquots einer jeden gesammelten Fraktion von 2 ml wurden auf einem 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgel unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteinbanden wurden durch Autoradiographie über Nacht sichtbar gemacht. Die GRGDSP-Elution führte zu keiner Freisetzung von in spezifischer Weise eluierten Banden aus der Affinitätsmatrix, wohingegen die EDTA-Elution zur Freisetzung eines in Figur 1 dargestellten Laminin-Adhäsionsrezeptors führte.
Wie in den Figuren 1 und 2 dargestellt, wurden in dem unvollständig ungefalteten Zustand, in dem das von RuGli-Zellen abgeleitete Protein unter nicht-reduzierenden Bedingungen vorliegt, zwei Proteinbanden beobachtet, die an Positionen migrierten, welche mit den geschätzten Molekulargewichten von 150 kD und 120 kD korrespondierten. Ein mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen genauer bestimmtes Molekulargewicht ergibt Molekulargewichte dieser Untereinheiten von etwa 165 bzw. 140 kD, da aus der größeren der Untereinheiten im Falle der Reduktion zwei Polypeptide entstehen, eine Bande von 135 kD und eine Dublette von 35/30 kD. Obgleich man nicht an diese Erklärung gebunden sein möchte, wird davon ausgegangen, daß das Polypeptid von 30 kD ein Spaltfragment des Polypeptids von 35 kD ist.

b. MG-63- A-431- und U-251-Zellen

Humane Osteosarcomzellen (MG-63; ATCC-Zugriffsnummer CRL 1427), humane epidermale Karzinomzellen (A-431; ATCC-Zugriffsnummer CRL-1555) und humane Glioblastomzellen (U-251) wurden als Quellen für humane Lamininrezeptoren des Integrin-Typs verwendet. Die Rezeptoren wurden nach den oben für den RuGli-Rezeptor beschriebenen Verfahren isoliert. Der erhaltene Rezeptor wies dasselbe elektrophoretische Erscheinungsbild auf wie der in Figur 1 dargestellte RuGli-Rezeptor, mit der Ausnahme, daß die größere (α)-Untereinheit in gewisser Weise langsamer migrierte als die α-Untereinheit des RuGli-Rezeptors, was auf ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 170 000 D hinweist.

BEISPIEL II

INKORPORIEREN DES LAMININREZEPTORS IN LIPOSOMEN UND BINDUNG DER LIPOSOMEN AN SUBSTRATE

Phosphatidylcholin-Liposomen, die die Zell-Oberflächenrezeptoren einschließen, wurden im wesentlichen hergestellt nach dem Verfahren von Mimms et al., Biochemistry 20:883, (1981), wie es für den Fibronektinrezeptor beschrieben wurde (Pytela et al., Meth. Enzymol. 144:475-489, 1987). Eidotter-Phosphatidylcholin (Sigma, St. Louis, MO) und ³H-Phosphatidylcholin (New England Nuclear, Boston, MA) wurden in den Rezeptorfraktionen bei 100 ug/ml gelöst, und diese Lösung wurde anschließend für eine Zeitdauer von 24 Stunden bei 4 ºC gegen 50 mM Tris-HCl enthaltend 500 mm NaCl, 1 mM Ca&sub2;Cl und 1 mM Mg&sub2;Cl dialysiert. Die resultierenden Liposomen wurden isoliert durch Aufschwimmen auf die Oberfläche eines Sucrosegradienten im Wege der Ultrazentrifugation und durch Untersuchung auf Bindung von verschiedenen Substraten.
Die Substrate wurden hergestellt durch Beschichtung von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol (Linbro/Titertek, Inglewood, CA) mit extrazellulären Matrixproteinen einschließlich Laminin, Fibronektin, Kollagenen und Vitronektin (Telios Pharmaceuticals, Inc., La Jolla, CA) nach dem Verfahren von Engvall et al., J. Cell Biol. 103:2457 (1986) unter Verwendung von 20 ug/ml PBS über Nacht bei 4 ºC. Eine Beschichtung mit bovinem Serumalbumin (BSA; 5 mg/ml) wurde angewendet, um die unspezifische Hintergrundbindung zu bestimmen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Lamininrezeptor-Liposomen-Präparationen zeigten eine starke dosisabhängige Bindung an mit Laminin beschichtete Vertiefungen der Mikrotiterplatte, eine leichte Bindung an Fibronektin, sie zeigten aber keine Bindung oberhalb des Hintergrundes an Typ I- oder Typ IV-Kollagene oder an Vitronektin, wie in Figur 5 dargestellt ist.
Der aus demselben RuGli-Zellextrakt isolierte Fibronektinrezeptor wurde in dem Liposomen-Assay für Vergleichszwecke eingesetzt. Mit diesem Rezeptor hergestellte Liposomen banden in einem größeren Ausmaß an Fibronektin als die Lamininrezeptor- Liposomen und zeigten keine Bindung an Laminin. Weitere Spezifitätskontrollen schlossen die Inhibierung der Lamininrezeptor- Bindung durch Zugabe von chymotryptischen humanen, die Zellanheftung fördernden Lamininfragmenten zum Liposomen-Assay ein. Diese Fragmente inhibierten die Bindung der Lamininrezeptor- Liposomen an Laminin, wohingegen dies beim GRGDSP-Peptid oder dem YIGSR-Laminin-Peptid nicht der Fall war. Repräsentative Ergebnisse aus diesen Assays sind in der Figur 5 dargestellt.

BEISPIEL III

VERWENDUNG DER REZEPTOR-LIPOSOMEN-PRÄPARATION ZUR HERSTELLUNG EINER ZUSAMMENSETZUNG ZUM TARGETING THERAPEUTISCHER AGENZIEN

Rezeptor-Liposomen wurden nach obiger Darlegung hergestellt, und ein gewünschtes therapeutisches Agens wird in diese eingeschlossen nach veröffentlichten Verfahren (Gregoriadis und Senior, Biochem. Soc. Trans. 12:337, (1984)). Diese konjugierten Liposomen werden unter Verwendung von 1-300 uMol Lipid pro kg Körpergewicht intravenös injiziert oder lokal appliziert. Derartige Lamininrezeptor-Liposomen werden beispielsweise zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Targeting von Arzneimitteln zu Geweben verwendet, die große Mengen an Laminin enthalten.

BEISPIEL IV

ANALYSE DER REZEPTORSPEZIFITÄT DURCH RADIOREZEPTOR-ASSAY

Die Bindung des Lamininrezeptors an Laminin und der Effekt von Antikörpern und Proteinfragmenten auf diese Bindung wurden in einem Radiorezeptor-Assay untersucht, der zuvor für den Fibronektinrezeptor beschrieben wurden (Hautanen et al., J. Biol. Chem. 264:1437-1442 (1989)). Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden beschichtet mit 1-2 ug/ml humanem Laminin, bovinem Typ I-Kollagen (Collaborative Research, Lexington, MA), murinem Typ IV-Kollagen (BRL, Bethesda, MD), humanem Plasmafibronektin oder bovinem Serumalbumin. Man ließ den aus mit Jod oberflächenmarkierten Zellen isolierten ¹²&sup5;I-markierten Rezeptor 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in Anwesenheit von Tris-gepufferter Saline (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, TBS) enthaltend 50 mM Ocyl-β-glucopyranosid, 1 mM PMSF und 1 mM MnCl&sub2; an die beschichteten Vertiefungen binden. Die Menge an pro Vertiefung zugegebenem Rezeptor entsprach 10&sup4; cpm. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen gewaschen, und der gebundene Rezeptor wurde mit 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in TBS löslich gemacht und durch Messung der gebundenen Radioaktivität quantifiziert. Die unspezifische Bindung wurde in Vertiefungen gemessen, die mit Albumin beschichtet waren. Die insgesamt gebundene Menge variierte zwischen 5 und 10 % der zugegebenen Radioaktivität, und 70-80 % hiervon waren anhand der obigen Kriterien spezifisch. Die Lamininrezeptoren von jedem der untersuchten Zelltypen banden an Laminin in dem Assay wie in Figur 6 dargestellt. Die Rezeptoren banden in variierendem Ausmaß auch an Fibronektin und an Typ IV-Kollagen. Die Gründe für diese Variation sind nicht bekannt. Obgleich man nicht an diese Erklärung gebunden sein möchte, wird davon ausgegangen, daß der Unterschied auf die β-Untereinheit des Rezeptors zurückgeführt werden kann, da der Rezeptor mit Affinität für Typ IV-Kollagen die Zusammensetzung α&sub3;β&sub1; aufweist (s. Ruoslahti und Pierschbacher, oben), und derjenige mit keiner Affinität für Typ IV-Kollagen eine abweichende β-Untereinheit besitzt. Diese Einschätzung wird gestützt durch die immunologischen Unterschiede zwischen den in Figur 4 dokumentierten RuGli-Zell-Laminin- und Fibronektinrezeptoren.

BEISPIEL V

LOKALISIERUNG DER LAMININREZEPTOR-BINDUNGSSTELLE

a. Elektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopische Analysen von Lainininrezeptor/Laminin-Komplexen erfolgten wie für Rezeptor/Fibronektin-Komplexe beschrieben (Gailit und Ruoslahti, J. Biol. Chem. 263:12927 (1988)) mit gewissen Veränderungen. Die Rezeptorpräparationen aus den affinitätschromatographischen Eluaten wurden entweder mit Laminin der Maus (BRL, Bethesda, MD) oder mit Pepsinfragmenten von humanem Laminin (Dillner et al., Exp. Cell Res. 177:186 (1988)) in Anwesenheit von jeweils 1 mM Ca²&spplus;, Mg²&spplus; und Mn²&spplus; vermischt. Verschiedene Verhältnisse zwischen Rezeptor und Laminin wurden eingesetzt, und sämtliche Inkubationen der Rezeptor/Laminin-Komplexe erfolgten bei 4 ºC, um die Aggregation von Laminin zu vermeiden, von der bekannt ist, daß sie in Gegenwart von divalenten Kationen bei höheren Temperaturen stattfindet.
Bei Mischung der Lamininrezeptoren mit Laminin der Maus schienen einige der Lainininmoleküle mit dein Rezeptor Komplexe gebildet zu haben. Der Rezeptor war bei diesen Komplexen an das globuläre Ende des langen Lamininarins gebunden. In Kontrollprä parationen, die aus Laminin allein oder Laminin vermischt mit dem Mg-63- oder RuGli-Zell-Fibronektinrezeptor bestanden, wurden keine Strukturen beobachtet, die den Lamininrezeptor-Koinplexen ähneln. Eine Untersuchung einer großen Anzahl von verschiedenen unabhängig voneinander hergestellten Proben zeigte, daß von mehr als 100 möglichen Rezeptor/Laminin-Komplexen ungefähr 80 % den Rezeptor in Assoziation mit der globulären Domäne am Ende des langen Arms aufweisen. Bei dem Rest der möglichen Komplexe schien das Rezeptormolekül mal mit einem der kurzen Arme und mal mit dem Zentrum der Kreuzung assoziiert zu sein. Laminin/Rezeptor-Komplexe, die denjenigen, die mit Laminin der Maus erhalten wurden, ähnlich sind, wurden beobachtet, wenn Pepsinfragmente von humanem Laminin mit dem Lamininrezeptor vermischt wurden.

b. Lokalisierung mit monoklonalen Antikörpern

Die bevorzugte Bindung des Rezeptors an die globuläre Domäne am Ende des langen Arms des Lamininmoleküls ähnelte derjenigen, die zuvor für eine Gruppe von monoklonalen Antikörpern gezeigt worden war, die in der Lage waren, die die Neuriten fördernde Aktivität von Laminin zu inhibieren. Monoklonale Antikörper gegen mit Pepsin extrahiertes humanes Laminin wurden hergestellt nach dem Verfahren von Engvall et al., J. Cell Biol. 103:2457-2465 (1986). Die Fähigkeit von zwei dieser Antikörper, 3E5 und 4E10, mit der Bindung des Rezeptors an Laminin in einem Radiorezeptor-Assay zu interferieren, wurde untersucht. Die 3E5- und 4E10-Antikörper inhibierten die Bindung des Rugli-Rezeptors an Laminin in einer konzentrationsabhängigen Weise. Der Antikörper 2E8, welcher keinen Effekt auf das Neuritenwachstum aufweist und welcher an eine Region nahe dem Zentrum der Lamininkreuzung bindet, zeigte bei vergleichbaren Antikörperkonzentrationen eine geringe Inhibierung. Ein monoklonaler Antikörper unverwandter Spezifität war ebenfalls nicht wirksam. Die Bindung des MG-63-Zellrezeptors wurde in diesem Assay in ähnlicher Weise durch die 3E5- und 4E10-Antikörper inhibiert, was darauf hinweist, daß beide Lamininrezeptoren an dieselbe Stelle binden können.

c. Lokalisierung der Bindungsstelle für monoklonale Antiköruer durch cDNA-Klonierung

Es wurden Laminin-cDNA-Klone isoliert, um von diesen Klonen gebildete Proteine hinsichtlich der Bindung der monoklonalen Antikörper zu untersuchen, die die Rezeptor-Bindungsstelle definieren. Das Screening von λgt11-cDNA-Bibliotheken plazentaler und endothelialer Zellen mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen Laminin ergab zahlreiche reaktive Klone. Das DNA- Sequenzieren und der Vergleich mit den zuvor veröffentlichten Laminin-Sequenzen (Pikkarainen et al., J. Biol. Chem. 262:10454- 10462 (1987) und Pikkarainen et al., J. Biol. Chem. 263:6751- 6758 (1988)) zeigten, daß mehrere dieser Klone für COOH-terminale Bereiche der B1- und B2-Ketten kodierten. Es wurden keine A- Ketten-Klone identifiziert.
Von den B1- und B2-Ketten-Klonen exprimierte Fusionsproteine wurden auf Reaktivität gegenüber den monoklonalen Antikörpern mittels Makroplaque-Filterassay untersucht (Suzuki et al., EMBO J. 4:2519-2524 (1985)). Die Fusionsproteine sämtlicher Klone kodierten für den COOH-Terminus der mit dem 3E5-Antikörper reagierenden B1-Kette, wohingegen dieser Antikörper nicht mit den B2-Ketten-Fusionsproteinen reagierte. Der kürzeste Klon, der sich gegenüber dem 3E5-Antikörper reaktiv zeigte, kodiert für die 252 COOH-terminalen Aminosäuren der B1-Kette. Keines der Fusionsproteine von den COOH-Termini der B1- und B2-Ketten zeigte eine Reaktivität gegenüber dem anderen Antikörper 4E10.

BEISPIEL VI

HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN DEN LAMININREZEPTOR UND DEREN VERWENDUNG ZUM NACHWEIS DES REZEPTORS

a. Polyklonale Antikörper

Kaninchen wurden immunisiert mit gereinigtem Lamininrezeptor in Freund's vollständigem Adjuvans. Booster-Injektionen, die 50 ug Rezeptor in Freund's unvollständigem Adjuvans enthielten, wurden in 3-wöchigen Abständen verabreicht, und das Serum wurde eine Woche nach der letzten Injektion gesammelt. Das Antiserum wurde absorbiert von humanen Plasmaproteinen, Fibronektin und Laminin, jeweils gekoppelt an Sepharose. Zusätzlich erfolgte eine Absorption mit einem "mock-gereinigten Rezeptor", der erhalten wurde durch Fraktionierung desselben Zell- oder Gewebeextrakts, der als Quelle für den Lamininrezeptor diente, über eine Sepharose-Säule, an die bovines Serumalbumin gekoppelt war. Dieselbe Vorgehensweise wie bei der Isolierung des Rezeptors wurde angewendet, und diejenigen Fraktionen, die bei der Isolierung des Rezeptors den Rezeptor enthielten, wurden als mockgereinigter Rezeptor gesammelt. Das Antiserum wurde ferner von Fibronektinrezeptor absorbiert, welcher ebenfalls an Sepharose gekoppelt war. Der Fibronektinrezeptor wurde isoliert nach dem Verfahren von Pytela et al., oben. Die Absorption mit der mockgereinigten Rezeptor-Sepharose und mit Fibronektinrezeptor-Sepharose erfolgte durch sequentielle Passage von 2 ml Serum durch Säulen von 1 ml Sepharose, die 100 ug der mock-gereinigten Rezeptorproteine oder 100 ug des Fibronektinrezeptors enthielten. Das ungebundene Material wurde auf seine Reaktivität untersucht mittels Festphasen-Enzym-Immunoassay (ELISA; Engvall, Meth. Enzymol. 70:419-439, (1980), wobei der gereinigte Lamininrezeptor und der Fibronektinrezeptor als Antigene dienten, und durch SDS-PAGE-Immunblotting gegen die Rezeptoren und gegen einen vollständigen Zellextrakt oder Gewebeextrakt aus den Zellen oder dem Gewebe, die als Quelle für den Rezeptor dienten. Die Absorptionen wurden wiederholt, bis diese Assays zeigten, daß das Antiserum spezifisch war. Das Antiserum wurde als für den Lamininrezeptor spezifisch betrachtet, wenn es im ELISA lediglich mit dem Lamininrezeptor reagierte, und beim Immunblotting nach dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979) und Argraves et al., oben, (s. Figur 4) lediglich an die Untereinheiten des Lamininrezeptors, nicht aber an die Untereinheiten des Fibronektinrezeptors band. Dieselbe Vorgehensweise wurde angewendet, um für den Fibronektinrezeptor spezifische Antikörper aus dem Fibronektinrezeptor-Antiserum zu erhalten durch Absorption mit den mock-gereinigten Rezeptorproteinen und dem Lamininrezeptor. Die Rezeptor-Sepharose-Säulen wurden regeneriert durch Waschen mit 8 M Harnstoff in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0.

b. Monoklonale Antikörper

Mäuse wurden mit 10 ug gereinigtem Lamininrezeptor pro Injektion immunisiert, wobei die erste Injektion subkutan in Freund's vollständigem Adjuvans und die Booster-Injektion intraperitoneal ohne Adjuvans erfolgten. 3 Tage nach der Booster- Injektion wurden Milzzellen aus den immunisierten Mäusen gewonnen und zur Herstellung von Hybridoma-Zellen wie in der Literatur beschrieben verwendet. Die Hybridoma-Zellen, die Antikörper sezernierten, welche mit dem Lamininrezeptor reagierten, wurden unter Verwendung des Lamininrezeptors als Antigen mittels Festphasen-Enzym-Immunoassay ausgewählt (Engvall et al., Meth. Enzymol. 70:419-439, 1980). Für den Assay wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 1 ug/ml der Rezeptorlösung beschichtet, die ausgehend von der Octylglucosid enthaltenden Stammlösung mindestens 1 : 10 mit Phosphat-gepufferter Saline verdünnt wurde. Diejenigen Antikörper, die in spezifischer Weise gegenüber dem Lamininrezeptor reaktiv waren, wurden weiter selektioniert durch Untersuchung der positiven Antikörper gegen den Fibronektinrezeptor. Diese Reaktivität wurde bestätigt für diejenigen Antikörper, die gegenüber dem mit SDS denaturierten Rezeptor mittels SDS-PAGE-Immunblotting gegen Zellextrakte reaktiv waren, die andere Rezeptoren als den Lamininrezeptor enthielten.
Eine weitere Selektion von Antikörpern, die die Lamininbindende Funktion des Rezeptors inhibieren, erfolgte in Assays zur Zellanheftung. Die monoklonalen Antikörper wurden aus dem Hybridoma-Kulturmedium durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) isoliert, obgleich andere im Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt werden können, und der isolierte Antikörper wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit untersucht, die Anheftung von Zellen zu inhibieren, die als Quelle für den immunisierenden Rezeptor für Laminin dienten. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 1 ug/ml der die Zellanheftung fördernden humanen Lamininfragmente beschichtet, und die RuGli-Zellen wurden den Vertiefungen in verschiedenen Konzentrationen eines jeden monoklonalen Antikörpers zugegeben. Polyklonale Anti-Lamininrezeptor-Antikörper wurden als positive Kontrolle eingesetzt, während monoklonalen Anti-Fibronektinrezeptor-α-Untereinheit- Antikörper als negative Kontrolle dienten. Zum Ende des Assays, wenn der Antikörper die gewünschte inhibitorische Aktivität aufwies, hefteten sich weniger Zellen an die Vertiefungen an.

BEISPIEL VII

UNTERSUCHUNG DER ANTI-LAMININREZEPTOR-ANTIKÖRPER IN TUMOR-INVASIONS-ASSAYS

Um die Fähigkeit der Antikörper gegen die Laminin-α-Untereinheit hinsichtlich ihres Einflusses auf die Invasion von Tumorzellen durch Gewebe zu untersuchen, wird ein Invasionsassay unter Verwendung einer Amnionmembran angewendet. Wie in der Literatur beschrieben (Gehlsen et al., J. Cell Biol. 106:925- 930, 1988) ließ man RuGli-Glioblastomzellen in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Anti-Lamininrezeptor-Antikörper und derselben oben beschriebenen Kontroll-Antikörper durch eine Amnionmembran migrieren. In Anwesenheit der inhibitorischen Antikörper migrierten gegenüber den Kontrollen weniger Zellen durch die Amnionmembran.

BEISPIEL VIII

INHIBIERUNG DES LAMININREZEPTORS IM RADIOREZEPTOR-BINDUNGSASSAY

Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden beschichtet mit Laminin bei 1 bis 2 ul in PBS gemäß Darlegung in Beispiel IV. Der aus A-431- oder RuGli-Zellen gemäß Beschreibung in Beispiel I isolierte Lamininrezeptor wurde anschließend den Vertiefungen der Mikrotiterplatte entweder allein (LM) oder in Anwesenheit von Chymotrypsin-Fragmenten von Laminin (Chymo. Frag., 25 ug/ml Dillner et al., oben), des 110 kD Fragments von Fibronektin (110 kD Frag., 25 ug/ml, 120 kD Fragment in Pierschbacher et al., Cell 26:259-267 (1981)) oder des unmarkierten Lamininrezeptors (kalter LMR) zugegeben.
Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt. Die Daten zeigen den Prozentgehalt an gebundenem Lamininrezeptor im Vergleich zu nicht-inhibierter Lamininbindung, welche mit 100 % gleichgesetzt wurde. Wie festgestellt werden kann, inhibierten die die Zellanheftung fördernden Fragmente von Laminin, die aus dem Bereich abgeleitet wurden, der aus den COOH-terminalen Teilen des Moleküls aufgebaut ist, die Bindung des Lamininrezeptors an mit Laminin beschichtete Vertiefungen. Zudem war das Fibronektinfragment, welches von der Zellanheftungsregion des Moleküls stammt, ebenfalls inhibitorisch. Wie erwartet, inhibierte der als Kontrolle untersuchte unmarkierte Lamininrezeptor ebenfalls die Bindung des radioaktiven Rezeptors.

Industrielle Anwendung

Die vorliegende Erfindung kann direkt und unmittelbar bei der Analyse des Lamininrezeptors in Zellen und Geweben angewendet werden. Das oben beschriebene Isolierungsverfahren kann angewendet werden, um kultivierte Zellen oder Gewebeproben auf ihren Gehalt an dem Lamininrezeptor zu untersuchen. Eine der artige Analyse ist wichtig bei der Bestimmung der Adhäsionskapazität von Zellen wie solchen in Tumoren. Alternativ kann der isolierte Rezeptor verwendet werden, um Antikörper zur Quantifizierung des Rezeptors herzustellen. Zusammen mit derartigen Antikörpern wird der Rezeptor die Erstellung von Assays für den Rezeptor wie einen Radioimmunoassay oder ELISA ermöglichen. Verbindungen, die in der Weise an den Rezeptor binden, daß sie mit der Bindung des Rezeptors an Laminin kompetieren, können mit Hilfe des Rezeptors ausgewählt werden und sind z.B. geeignet zur Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, die Anheftung der Tumorzellen an Basalmembranen während einer Tumorinva sion zu verhindern. Alternativ können derartige Substanzen, wenn sie in unlöslicher Form vorliegen, verwendet werden zur Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, um den die Zellanheftung fördernden Effekt von Laminin bei der Gewebewiederherstellung zu reproduzieren. Eine Stoffzusammensetzung, die ein Reagens umfaßt, welches im wesentlichen aus dem in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Lamininrezeptor besteht, kann verwendet werden, um Substanzen zu ausgewählten Geweben zu befördern.

Claims

1. Ein im wesentlichen reiner, aktiver, von Säugern stammender Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor, der aus zwei Untereinheiten besteht, von denen die erste Untereinheit ein α&sub3;- Integrin ist, das ein Molekulargewicht von etwa 165 bis 170 kD besitzt und aus zwei Disulfid-verknüpften Ketten mit Molekulargewichten von etwa 135 kD und 35 kD zusammengesetzt ist, und von denen die zweite Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 140 kD besitzt, und wobei der Integrin-Adhäsionsrezeptor selektiv Laminin oder die Zellanheftung fördernde Fragmente von Laminin bindet.

2. Rezeptor nach Anspruch 1, wobei der Säuger eine Ratte ist.

3. Rezeptor nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.

4. Rezeptor nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor mit Ethylendiamintetraessigsäure aus der selektiven Bindung an Laminin oder an die Zellanheftung fördernde Fragmente von Laminin eluiert werden kann.

5. Stoffzusammensetzung, die den in Lipid-Vesikel eingeschlossenen Rezeptor nach Anspruch 1 umfaßt.

6. Stoffzusammensetzung, die den auf ein Substrat aufgebrachten Rezeptor nach Anspruch 1 umfaßt.

7. Stoffzusammensetzung, die Fragmente des Rezeptors nach Anspruch 1 umfaßt, die ihre Aktivität hinsichtlich der Liganden-Bindung beibehalten.

8. Verfahren zur Isolierung des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors nach Anspruch 1 aus einem von einem Säuger stammenden Zellextrakt-Präparat, welches die Schritte umfaßt:

a. Verknüpfen des die Zell-Anheftung fördernden Abschnitts von Laminin an eine Matrix zur Bildung einer Affinitätssäule,

b. Durchleiten des von einem Säuger stammenden Zellextrakt-Präparats durch die Säule in Gegenwart eines divalenten Kations, um eine Bindung zwischen den zu isolierenden Zell-Oberflächenrezeptoren und der Zell- Anknüpfungsstelle von Laminin zu erreichen,

c. Eluieren der Säule mit einer Lösung, die eine Substanz enthält, die in der Lage ist, die Bindung zu beeinträchtigen und den Zell-Oberflächenrezeptor selektiv zu eluieren, und

d. Sammeln des dadurch eluierten Zell-Oberflächenrezeptors.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Affinitätsmatrix Sepharose ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Substanz den Zell-Anheftungsort von Laminin umfaßt, der durch Anknüpfung von RuGli Glioblastomzellen und MG-63 Osteosarcomzellen bestimmt ist

11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zellextrakt-Präparat von kultivierten Säugerzellen abgeleitet ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zellextrakt-Präparat von Säuger-Gewebe abgeleitet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zellextrakt-Präparat von humanen Zellen abgeleitet ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die humanen Zellen Osteosarcomzellen sind.

15. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zellextrakt-Präparat von Plazentagewebe abgeleitet ist.

16. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zellextrakt-Präparat von Rattenzellen abgeleitet ist.

17. Polyklonale Antikörper gegen den Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1.

18. Antikörper nach Anspruch 17, wobei die Antikörper mit der α&sub3;-Untereinheit des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors reagieren.

19. Monoklonaler Antikörper hergestellt durch Immunisieren mit dem gereinigten Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1.

20. Antikörper nach Anspruch 19, wobei die Antikörper mit der α&sub3;-Untereinheit des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors reagieren.

21. Antikörper, die mit der zweiten Untereinheit des Integrin- Laminin-Adhäsionsrezeptors nach Anspruch 1 aber nicht mit β&sub1; reagieren.

22. Verfahren zum Nachweisen eines Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors in einer Probe, wobei das Integrin aus zwei Untereinheiten besteht, von denen die erste Untereinheit ein α&sub3;-Integrin ist, das ein Molekulargewicht von etwa 165 bis 170 kD besitzt und aus zwei Disulfid-verknüpften Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 135 kD und 35 kD zusammengesetzt ist, und von denen die zweite Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 140 kD besitzt, welches die Schritte umfaßt:

a. Bereitstellen von Antikörpern, die mit dem Laminin- Adhäsions rezeptor reagieren,

b. In-Kontakt-Bringen der Probe mit den Antikörpern und

c. Ermitteln der Bindung zwischen den Antikörpern und den Komponenten der Probe, wobei eine Bindung das Vorhandensein des Laminin-Rezeptors in der Probe anzeigt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Antikörper polyklonale Antikörper sind.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

25. Verwendung des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Targeting von Agenzien, die gegen spezifische Gewebekomponenten gerichtet sind, welche das Einschließen des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors in Liposomen umfaßt, in denen Agenzien enthalten sind.

26. Verfahren zum Screenen nach Verbindungen, die an den Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1 binden, welches die Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen der Verbindungen mit dem Rezeptor und

b. Ermitteln der Bindung der Verbindungen mit dem Rezeptor.

27. Verwendung des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren der Bindung des Rezeptors an Laminin, indem man Verbindungen zur Verfügung stellt, die an den Integrin-Laminin- Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1 binden und die Bindung des Rezeptors an das Laminin inhibieren.

28. Verwendung des Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptors nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren der Anheftung an ein Zellsubstrat, das den Integrin- Laminin-Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1 aufweist, indem man gelöste Verbindungen bereitstellt, die an den Rezeptor nach Anspruch 1 binden und die Bindung des Rezeptors an das Substrat inhibieren.

29. Verfahren zum Anheften von Zellen an ein Substrat in vitro, wobei die Zellen den Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor nach Anspruch 1 aufweisen, indem man unlösliche Verbindungen bereitstellt, die an den Integrin-Laminin-Adhäsionsrezeptor binden und die Anheftung an das Substrat fördern.