DE69229911T2

DE69229911T2 - Monoklonale antikörper gegen rezeptor-induzierte bindungsstellen

Info

Publication number: DE69229911T2
Application number: DE69229911T
Authority: DE
Inventors: Mark Ginsberg; Edward Plow; Concepcion Zamarron
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1992-02-12
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2012-02-13
Also published as: EP0573545A1; EP0573545A4; US5372933A; IE920462A1; PT100122B; ATE184019T1; AU1415292A; WO1992014150A1; JP3315405B2; PT100122A; DE69229911D1; AU649800B2; JP2002275196A; DK0573545T3; GR3031720T3; EP0573545B1; CA2103893A1; ES2134799T3; JPH06506203A

Description

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einer Antikörper-Bindungsstelle, die auf einem Liganden induziert wird, wenn dieser Ligand von einem Rezeptor gebunden wird, um mit diesem einen Rezeptor- Liganden-Komplex zu bilden. Sowohl monoklonale Antikörper, die mit einer solchen rezeptorinduzierten Bindungsstelle eine Immunreaktion eingehen wie auch damit zusammenhängende diagnostische und therapeutische Verfahren werden betrachtet.

Hintergrund

Die Wechselwirkungen von Liganden mit Rezeptormolekülen der Zelloberfläche sind Kennzeichen biologischer Verfahren. Beispielhaft für solche Wechselwirkungen sind die Bindung des Liganden, der durch einen Teil des Hüllproteins (gp140) des AIDS-Virus (HIV) gebildet wird mit dem CD4-Rezeptor auf T-Zellen, die Rezeptoren des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex, die mit zahlreichen Liganden während der Vorgänge der Eigen-/Fremd-Erkennung des Immunsystems in Wechselwirkung treten und die Wechselwirkungen des Fibrinogen-Liganden mit dem GPIIb-IIIa-Zellrezeptor auf Thrombozyten. Die Fibrinogen : GPIIb-IIIa Liganden-Rezeptor-Paarung ist im Bereich der Blutgerinnung und Thrombusentstehung von besonderem Interesse und wird im folgenden als beispielhaft für Liganden und Rezeptoren verwendet.
Im Fachgebiet wurde lange nach immunologischen Verfahren zur Unterscheidung der gebundenen und nicht gebundenen Formen von Liganden und Rezeptoren gesucht, da diese Fähigkeit eine Bestimmung des Stadiums der physiologischen Vorgänge, die durch Rezeptor-Liganden- Komplexbildung hervorgerufen werden, erlauben würde. Bis vor kurzem schlugen die Anstrengungen, solche Bestimmungen durch immunologische Verfahren zu erreichen, fehl, weil biologische Proben Liganden und Rezeptoren sowohl in gebundener (komplexer) wie auch in freier Form enthalten können. So enthält z. B. das Gefäßsystem von Individuen während eines thrombotischen Ereignisses sowohl nicht gebundene Formen von Fibrinogen und GPIIb-IIIa wie auch Thrombozyten mit einem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex auf ihrer Oberfläche. Der Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex weist antigene Determinanten auf, die er mit nicht gebundenem Fibrinogen und nicht gebundenem GPIIb-IIIa gemeinsam hat und erschwert damit die Identifikation eines thrombotischen Zustandes oder einer Thrombus-Lokalisation durch bestehende immunologische Verfahren. Kürzlich berichtete Frelinger et al., J. Biol. Chem.. 263 : 12397-12402 (1988) über die Identifikation einer antigenen Determinante, die durch GPIIb-IIIa nur bei Bindung von GPIIb-IIIa an einen Liganden exprimiert wird. D. h.. daß die antigene Determinate, die von Frelinger et al. beschrieben wird, durch den Rezeptor des Rezeptor- Liganden-Komplexes exprimiert wurde.
Andere berichteten über die Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit einer Antigen-Determinante, die bei Bindung eines Liganden an künstliche Nicht-Rezeptoroberflächen exprimiert wurde, eine Immunreaktion eingehen. Soria et al., J. Colloid Interface Sci, 107 : 204-208 (1985) beschreiben einen speziellen, als DSB² bezeichneten monoklonalen Antikörper, der durch Immunisierung mit vernetztem Fibrinfragment induziert wird, und welcher an plastikadsorbiertes Fibrinogen und auch an sogenanntes Fibrinogen-D-Fragment, welches an Plastik adsorbiert ist oder sich frei in Lösung befindet, bindet. Es wird berichtet, daß der Antikörper nicht an das in Lösung befindliche Fibrinogen oder an das sogenannte Fibrinogen-E-Fragment, wenn sich dieses in Lösung befindet, bindet.
Darüberhinaus berichten Nilsson et al., Molec. Immunol., 24 : 487-94 (1987) über die Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit an Zymosan-A-Teilchen partikel-gebundenen Komplement-C3- Fragmenten eine Immunreaktion eingehen, aber nicht mit gelösten C3-Fragmenten. Die Natur der Bindung von Proteinen an Zymosan-A beinhaltet kovalente chemische Bindungen.
In einem anderen Bericht diskutieren Abrams et al., Blood (Suppl. 1), 70 : 355a (Dez. 1987) kurz einen monoklonalen, 9F9 genannten Antikörper, der laut veröffentlichtem Abstract an Thrombozyten gebundenes Fibrinogen bindet. Dieser kurze Bericht beschreibt jedoch nicht die spezifischen Bindungseigenschaften von monoklonalem 9F9.
Es wurde über zahlreiche monoklonale Antikörper, die mit gelöstem Fibrinogen eine Immunreaktion eingehen, berichtet. Ein solcher Bericht stammt von Lindon et al., Blood, 68 : 355-362 (Aug. 1988). Diese Abhandlung berichtet über den Gebrauch von kommerziell erhältlichen, gegen menschliches Fibrinogen gerichteten monoklonalen Antikörpern, wie auch von affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern, die gegen die D- und E-Fragmente gerichtet sind.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht die Entdeckung mit ein, daß spezifisch an einen Rezeptor gebundene Liganden von nicht gebundenen Liganden durch das Vorhandensein einer rezeptorinduzierten Antikörper-Bindungsstelle (RIBS), die vom rezeptorgebundenen Liganden exprimiert wird, unterschieden werden können. Das bedeutet, daß nun eine Klasse antigener Determinanten entdeckt worden ist, bei der eine Determinante dann exprimiert wird, wenn der Ligand spezifisch an einen Rezeptor gebunden wird, aber nicht, wenn der Rezeptor und der Ligand nicht gebunden sind.
Eine RIBS wird auf einem Liganden als Folge der spezifischen Wechselwirkung eines Liganden bei der Bindung an seinen zugehörigen Rezeptor exprimiert. Eine RIBS ist nicht ein Ort einer antigenen Determinante, der freigelegt wird, wenn ein Protein unspezifisch mit einer anderen Oberfläche wie etwa einem plastikabsorbierten Protein interagiert, oder wenn ein Protein durch kovalente chemische Bindungen mit einer Oberfläche in Wechselwirkung tritt. Diese zwei letzteren Beispiele wurden in Soria et al. und Nilsson et al., Verweise siehe oben, veröffentlicht und beziehen nicht eine spezifische Wechselwirkung bei der Rezeptor-Liganden-Bindung mit ein, bei der eine wie hier definierte RIBS entsteht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das bis zu ungefähr 40 Aminosäurereste umfaßt und eine Aminosäurerest-Sequenz mit der Formel
Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys
einschließt.
Vorzugsweise hat das Polypeptid die Formel
H-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys-OH
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Polypeptid bereit, das bis zu etwa 20 Aminosäurereste umfaßt, einschließlich einer Aminosäurerest-Sequenz, die der Formel
Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr- Thr
entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der gegen eines der genannten Peptide gerichtet ist.
Vorzugsweise geht ein Antikörper der Erfindung auch eine Immunreaktion mit einem Thrombozyten- Fibrinogen-Komplex ein.
Die genannten Polypeptide und Antikörper ermöglichen eine Anzahl therapeutischer und diagnostischer Protokolle. Zum Beispiel wird ein Verfahren überdacht, bei dem man einen der genannten Antikörper neutralisiert und/oder daran hindert, mit einem Thrombozyten-Fibrinogen-Komplex bei einem Patienten eine Immunreaktion einzugehen, indem man den Patienten mit einem der genannten Polypeptide, z. B. unter Beimengung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffes behandelt. Auf diese Weise geht ein wie oben beschriebenes Polypeptid kompetitiv eine Immunreaktion mit einem Antikörper ein und reduziert damit die Anwesenheit von freiem Antikörper im Patienten.
Eine andere Verwendungsmethode für die genannten Polypeptide und Antikörper wird überlegt, bei der das Vorhandensein eines Antikörpers in einer Lösung, die den Antikörper enthält, nachgewiesen wird. Dabei kann die Lösung über eine Oberfläche mit dem auf ihr immobilisierten, betreffenden Polypeptid geleitet werden, wobei der Antikörper vorzugsweise mit dem Polypeptid zu einem nachweisbaren Immunkomplex reagiert. Das Vorhandensein des Immunkomplexes zeigt die Gegenwart des Antikörpers in der Lösung an.
Eine weitere in Betracht gezogene Verwendung ist die Isolierung eines der genannten Antikörper aus einer Lösung, die den Antikörper enthält, beispielsweise aus Unreinheiten in der Lösung. Die Antikörper enthaltende Lösung kann über ein betreffendes Polypeptid, das auf einer Oberfläche immobilisiert ist, geleitet werden, von der der Antikörper anschließend entfernt wird. Der Zielantikörper wird gesammelt und dabei gereinigt.

Beschreibung der Zeichnung

Abb. 1 zeigt die Bindung von MAb 2G5 an thrombozytengebundenes Fibrinogen. Die Bindung von ¹²&sup5;I-2G5 (0.1 uM) an Thrombozyten (1 · 10&sup8;/ml) wurde mit nicht stimulierten, ADP (10 uM) stimulierten oder α-Thrombin (0.5 Einheiten/ml) stimulierten Thrombozyten in der Abwesenheit (schraffierter Balken) oder in der Anwesenheit (ausgefüllter Balken) von 1 uM Fibrinogen durchgeführt. In parallel durchgeführten Experimenten wurde die Bindung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen (0.3 uM) allein gemessen (leerer Balken).
Abb. 2 zeigt die Isolierung der proteolytischen Fragmente von D100, die mit MAb 2G5 reagieren. D100 wurde mit Plasmin verdaut und einer Affinitäts-Chromatographie auf immobilisiertem 2G5 unterzogen. Tafel A, ein Chromatogramm, überprüft bei Absorption bei 280 nm, zeigt die durchgelaufenen (F) und gebundenen (B) Anteile. Gebundenes Material wurde gesammelt und einer HPLC (Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie) auf einer Umkehr-Phase-Vydac-C18-Säule unterzogen. Tafel B, HPLC-Chromatogramm bei 280 nm.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäurerest-Sequenz: Eine Reihe von zwei oder mehr Aminosäureresten, die über Peptidbindungen zwischen benachbarten Resten verbunden sind, um ein Peptid oder Polypeptid zu bilden. Eine Aminosäurerest-Sequenz wird praktischerweise durch die Ein- oder Drei- Buchstabenabkürzungen seiner Aminosäure-Bestandteile dargestellt. Die im folgenden für Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind die von 37 C. F. R. §1.822(b)(2) zur Verfügung gestellten und werden in der folgenden Korrespondenzliste aufgeführt: KORRESPONDENZTABELLE
Die einzelnen Reste, die eine Aminosäurerest-Sequenz umfassen, können im folgenden als D- oder L- Isomere vorliegen, solange die gewünschte funktionelle Eigenschaft dem Molekül (den Molekülen) erhalten bleibt, in die die Aminosäurerest-Sequenz eingebaut ist. Außerdem darf die Aminosäurerest- Sequenz nach der Translation modifizierte Aminosäuren beinhalten, z. B. hydroxylierte oder glykosylierte Aminosäurereste oder Reste, die über Disulfidbrücken verbunden sind. Außerdem kann eine Aminosäurerest-Sequenz ein oder mehrere modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Eine Aminosäurerest-Sequenz kann durch die Abkürzungen ihrer zugehörigen Aminosäure- Bestandteile dargestellt werden, wobei ein Bindestrich zwischen zwei benachbarten Abkürzungen eine Peptidbindung zwischen korrespondierenden Resten anzeigt.
Peptid/Polypeptid: Ein Polymer, das mindestens zwei Aminosäurereste umfaßt und in dem benachbarte Reste durch eine Peptidbindung zwischen der Alpha-Aminogruppe des einen Restes und der Alpha- Carbonylgruppe des benachbarten Restes verbunden sind. Die Primär-Struktur eines Polypeptids weist eine primäre Aminogruppe an einem Ende und eine Carbonsäure-Gruppe am anderen Ende des Polymers auf. So kann ein Polypeptid durch die Formel:
dargestellt werden, wobei R eine für einen vorgegebenen Aminosäurerest charakteristische Seitenkette ist und i die Anzahl der Aminosäurereste angibt, die das Polymer umfaßt, wobei die Anzahl zwei oder mehr ist. Ein Polypeptid kann ein oder mehrere Aminosäurerest-Sequenzen beinhalten. Außerdem kommt ein Polypeptid normalerweise in wäßriger Lösung in ein oder mehreren zwitterionischen Formen, abhängig vom pH-Wert der Lösung, vor.
Protein: Ein einzelnes Polypeptid oder mehrere vernetzte Polypeptide, die mehr als ca. 50 Aminosäurereste umfassen. Proteine können innerhalb der selben Polypeptidkette oder zwischen benachbarten Polypeptiden chemische Venetzungen aufweisen, z. B. Disulfidbrücken. Proteine können glykosyliert sein und werden dann Glykoproteine genannt.
Rezeptor: Ein biologisch aktives eiweißhaltiges Molekül, das sich spezifisch an andere Moleküle bindet (oder sich mit anderen Molekülen verbindet), die Liganden genannt werden, um ein Rezeptor- Liganden-Protein oder einen Glykoproteinkomplex zu bilden.
Ligand und zugehöriger Ligand: Ein Molekül, das einen strukturellen Anteil enthält, der durch eine spezifische Wechselwirkung mit einem speziellen Rezeptormolekül gebunden wird.
Antigene Determinante oder Antigen: Antigene Determinante oder Antigen bezieht sich auf den tatsächlichen strukturellen Anteil des Antigens, der immunologisch durch eine Antikörper- Bindungsstelle gebunden wird. Die Ausdrücke sind auch mit dem Ausdruck Epitop austauschbar.
Neo-Antigen: Ein Neo-Antigen, wie hier definiert, ist eine neue antigene Determinante, die nicht von einem Liganden vor der Bindung an einen Rezeptor exprimiert wird, sondern die von dem Liganden- Rezeptor-Komplex exprimiert wird.
Kryptische Antigene Determinante: bezieht sich auf eine neo-antigene Determinante, die durch Änderungen in der Konformation eines Ligandenproteins bei Bindung an seinen zugehörigen (spezifischen) Rezeptor entstehen. Das bedeutet, ein Ligand, wie hier beschrieben, exprimiert die kryptische Determinante nicht, bis der Ligand spezifisch an einen Rezeptor gebunden hat.
Rezeptor-Induzierte-Bindungsstelle (RIBS): Eine RIBS ist eine neo-antigene Determinante, die durch den Ligandenanteil eines Rezeptor-Liganden-Komplexes exprimiert wird, die aber weder durch den nicht gebundenen Liganden noch durch den nicht besetzten Rezeptor exprimiert wird. Eine RIBS kann entweder "konformationsbezogen" oder "sequentiell" sein. Eine RIBS ist das Ergebnis von spezifischen Änderungen des Liganden, die durch die Rezeptorbindung hervorgerufen werden, sprich, eine "verborgene antigene Determinante".
Antikörper: Die Bezeichnung "Antikörper" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier benutzt, um Immunglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Teile der Immunglobulin-Moleküle zu bezeichnen, sprich Moleküle, die eine Antikörperbindungsstelle oder Paratop enthalten. Beispiele für Antikörper-Moleküle sind vollständige Immunglobulin-Moleküle, weitestgehend vollständige Immunglobulin-Moleküle und Teile von Immunglobulin-Molekülen, einschließlich jener Anteile, die auf diesem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')&sub2; und F(v) bekannt sind.
Antikörperbindungsstelle: Eine Antikörperbindungsstelle ist der strukturelle Anteil eines Antikörper- Moleküls, der eine schwere und eine leichte Kette variabler und hypervariabler Regionen, die spezifisch an ein Antigen binden bzw. mit diesem eine Immunreaktion eingehen, umfaßt. Die Bezeichnung "eine Immunreaktion eingehen" in ihren verschiedenen Formen bedeutet die spezifische Bindung zwischen einem eine antigene Determinante enthaltenden Molekül und einem Molekül, das eine Antikörperbindungsstelle wie z. B. ein ganzes Antikörper-Molekül oder ein Teil eines Antikörper- Moleküls enthält.
Monoklonaler Antikörper: Die Bezeichnung "Monoklonaler Antikörper" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörper-Molekülen, die im wesentlichen nur eine Sorte einer Antikörperbindungsstelle enthält, welche fähig ist, mit einem speziellen Antigen eine Immunreaktion einzugehen. Ein monoklonaler Antikörper zeigt somit typischerweise eine alleinige Bindungsaffinität zu dem Antigen, mit dem er eine Immunreaktion eingeht. Ein monoklonaler Antikörper kann somit also ein Antikörper-Molekül enthalten, das eine Vielzahl von Antikörperbindungsstellen enthält, von denen jede für ein unterschiedliches Antigen immunspezifisch ist, wie z. B. ein bispezifischer monoklonaler Antikörper.

B. Rezeptorinduzierte Bindungsstellen und Polypeptide

Wie zuvor bemerkt, ist die Bildung eines Liganden-Rezeptor-Komplexes maßgeblich für viele biologische Prozesse. Es wurde nun festgestellt, daß neben der biologischen Funktion, die eine Liganden-Rezeptor-Bildung begleitet, eine andere, unauffälligere Änderung auftritt. Die Änderung liegt in der Konformation des Ligandenmoleküls, die aus der Bindungswechselwirkung mit dem Rezeptor während der Komplexbildung resultiert. Die Änderung in der Liganden-Konformation führt zu der Bildung einer neo-antigenen Determinante, die im wesentlichen nur bei der Komplexbildung exprimiert wird. Die neo-antigene Determinante wird hier als Rezeptor-Induzierte Bindungsstelle (RIBS) bezeichnet.
Die RIBS, die durch den Komplex, der durch die Bindung von Fibrinogen als Ligand an GPIIb-IIIa entsteht, als Rezeptor exprimiert wird, wird hier beschrieben. Monoklonale Antikörper, die mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex eine Immunreaktion eingehen, aber weder mit dem Liganden noch mit dem Rezeptor, wenn diese nicht als Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex vorliegen, wesentlich reagieren, werden hier auch als Beispiele für Anti-RIBS (oder einfacher, RIBS) monoklonale Antikörper verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Polypeptid eine Aminosäurerest-Sequenz, die mit einer Aminosäurerest-Sequenz auf einer Gamma-Kette des menschlichen Fibrinogens, welche ein RIBS definiert, korrespondiert. Am besten ist es, wenn die vollständige Sequenz des Polypeptids mit derjenigen der fibrinogenen Region, die sie imitiert, identisch ist, es werden jedoch auch konservative Substitutionen des Polypeptids anstelle derjenigen für das native Fibrinogen überlegt.
Damit hat als bevorzugter Aspekt der Erfindung ein Polypeptid dieser Erfindung eine Aminosäurerest- Sequenz, die durch die folgende Formel dargestellt wird:
H-Xn-Y-Xm-OH,
wobei Y eine Aminosäurerest-Sequenz ist, die aus der Gruppe menschlicher Gamma-Ketten- Fibrinogen-Aminosäurerest-Sequenzen ausgesucht wurde. Xn fehlt, wenn n = 0 und ist eine N-terminale (Führungssegment) Aminosäurerest-Sequenz, die bis zu ungefähr 30 Reste enthält, wenn n = 1 ist; und Xm fehlt, wenn m = 0 und ist eine C-terminale (Endsegment) Aminosäurerest-Sequenz, die bis zu ungefähr 30 Reste umfaßt, wenn m = 1 ist.
Das vollständige Polypeptid umfaßt bis zu ungefähr 40 Aminosäurereste, bevorzugt bis zu ungefähr 30 Reste und besonders bevorzugt bis zu ungefähr 20 Reste.
Vorzugsweise korrespondiert Y mit einer Aminosäurerest-Sequenz auf der Gamma-Kette von menschlichem Fibrinogen von ca. Rest 363 bis ca. Rest 393. Bevorzugt ist Y eine Aminosäurerest- Sequenz, die durch folgende Formel beschrieben wird:
Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr- Thr.
Besonders bevorzugt hat Y die Formel
Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys.
Wenn entweder Xn oder Xm eine Aminosäurerest-Sequenz ist, umfaßt Xn oder Xm vorzugsweise bis zu ungefähr 20 Reste, besonders bevorzugt bis zu ungefähr 10 Reste und noch bevorzugter bis zu ungefähr 5 Aminosäurereste. Typischerweise haben Xn und Xm jeweils eine Aminosäurerest-Sequenz, die identisch zu der korrespondierenden Sequenz ist, die in menschlichem Fibrinogen gefunden wird. In einer noch mehr vorzuziehenden Ausführungsform hat ein Polypeptid der Erfindung die Formel:
H-Y-OH,
wobei Y wie bereits zuvor definiert ist.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung einer Vielzahl nützlicher Antikörper benutzt werden, wobei die Art und Weise im folgenden beschrieben wird. Die Anwendungsmöglichkeiten der Polypeptide wird durch die unten ausgeführte Diskussion verdeutlicht. Typischerweise wird das betreffende Polypeptid nicht glykosyliert, d. h. es wird entweder direkt durch standardisierte Peptid-Synthese-Techniken oder durch prokaryotische Wirtsexpression eines rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung synthetisiert. Ein eukaryotisch produziertes Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist normalerweise glykosyliert.
Das betreffende Polypeptid kann eine Anzahl von Änderungen enthalten, wie z. B. Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäureresten, die sowohl konservativ als auch nicht konservativ sein können, solange das daraus entstehende Polypeptidmolekül die gewünschten Eigenschaften an den Tag legt. Die "gewünschten Eigenschaften", wie hier genannt, beinhalten, daß das Polypeptid in einem geeigneten Wirt immunogen ist und die Fähigkeit hat, Antikörper gegen das Polypeptid und vorzugsweise gegen einen GPIIb-IIIa Fibrinogenkomplex, wie er z. B. auf Thrombozyten exprimiert wird, herstellen zu können. Außerdem ist das Polypeptid antigen, so daß ein Antikörper mit dem Polypeptid eine Immunreaktion eingeht, vorzugsweise mit einem GPIIb-IIIa Fibrinogenkomplex.
Wenn ein betreffendes Polypeptid konservative Substitutionen von Sequenzen, die mit den oben beschriebenen korrespondieren, beinhaltet, werden die substituierten Aminosäurereste gegen einen anderen, biologisch ähnlichen Aminosäurerest ersetzt, so daß das daraus entstehende Polypeptid eine Aminosäurerest-Sequenz hat, die sich von einer Sequenz von Fibrinogen unterscheidet, davon verschieden ist. Einige Beispiele konservativer Substitutionen beinhalten die Substitution eines hydrophoben Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin gegen einen anderen hydrophoben Rest. Außerdem kann ein polarer Rest wie Arginin, Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin, Asparagin und so weiter konservativ gegen ein anderes Mitglied aus dieser Gruppe ausgetauscht werden. Ein noch anderer Aspekt eines Polypeptids, das konservative Substitutionen beinhaltet, tritt auf, wenn ein substituierter Aminosäurerest einen unsubstituierten Eltern-Aminosäurerest ersetzt. Wenn das Polypeptid eine Aminosäurerest-Sequenz besitzt, die mit der Fibrinogen-Sequenz korrespondiert, aber eine oder mehrere konservative Substitutionen aufweist, werden vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 20%, und noch bevorzugter nicht mehr als ungefähr 10% der Aminosäurereste des nativen Proteins substituiert. Besonders bevorzugte konservativ substituierte Polypeptide sind einfach substituierte Analoga einer menschlichen Gamma-Ketten Aminosäurerest-Sequenz, so wie die oben beschriebenen.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch eine beliebige Synthese-Peptid-Technik, die dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden. Eine Zusammenfassung einiger gängiger Techniken kann in J. M. Stuard und J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman, Co., San Francisco (1969), J. Meinhofer, "Hormonal Proteins and Peptides" Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York) 1983, und U. S. Patent Nr. 4,631,211 gefunden werden. Wenn ein Polypeptid, das in der vorliegenden Erfindung benutzt werden soll, relativ kurz ist (weniger als ungefähr 40 Aminosäurereste lang), werden direkte Peptid-Synthesetechniken normalerweise bevorzugt, gewöhnlich durch Verwendung einer Fest-Phase-Technik wie der von Merrifield [Merrifield JACS, 85 : 2149 (1963)]. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Polypeptid-Zusammensetzung, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, vermischt mit einem passenden pharmazeutischen Träger umfaßt, vorzugsweise Einheitsdosierungsform. Die Polypeptid-Zusammensetzung kann zum "Neutralisieren" von Antikörper-Molekülen benutzt werden, die mit einem Polypeptid der Erfindung eine Immunreaktion eingehen. Auf diese Weise können Antikörper-Moleküle, wie sie in Säugetieren vorliegen und mit einem betreffenden Polypeptidmolekül eine Immunreaktion eingehen, effektiv aus der Zirkulation des Säugetieres durch Komplexbildung von Peptid und Antikörper entfernt werden.
Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung liegt vor, wenn der Antikörper ein Polypeptid in der Polypeptidzusammensetzung erkennt, welche ein RIBS-Epitop auf einem menschlichen Fibrinogen, welches mit menschlichem GPIIb-IIIa wie auf Thrombozyten exprimiert wird, einen Immunkomplex bildet, kennzeichnet. Eine besonders vorzuziehende Ausführungsform verwendet ein 2G5-MAb, welcher durch ein Polypeptid neutralisiert wird, welches eine der zuvor aufgelisteten Aminosäurerest- Sequenzen oder eine davon konservativ substituierte Sequenz enthält.
Von einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung aus kann ein betreffendes Polypeptid benutzt werden, um Antikörper, die mit dem Polypeptid auf die hier beschriebenen Arten eine Immunreaktion eingehen, zu erzeugen. Das Polypeptid kann benutzt werden, um ein Tier entweder alleine oder in Verbindung mit einer anderen chemischen Gruppe, z. B. einem Trägerprotein, zu immunisieren. Jede Trägergruppe, die von dem Empfänger toleriert wird, wird berücksichtigt.

C. Monoklonale Antikörper

Ein monoklonaler Antikörper (MAb) der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß er Antikörper-Moleküle, die mit einer rezeptorinduzierten Bindungsstelle eines Liganden eine Immunreaktion eingehen, umfaßt. Ein MAb der vorliegenden Erfindung geht mit einer RIBS eine Immunreaktion ein, aber im wesentlichen weder mit der ungebundenen (freien) Form des Liganden noch der des Rezeptors, d. h. wenn entweder der Ligand oder der Rezeptor frei in Lösung vorliegen und ermöglicht somit die Unterscheidung zwischen rezeptorgebundenen und -ungebundenen Formen eines Liganden. Ein MAb der vorliegenden Erfindung geht keine "wesentliche" Immunreaktion mit einer anderen Art als der hier beschriebenen ein, wenn die monoklonale Antikörper-Immunreaktion mit einem Liganden-Rezeptor-Komplex durch nicht mehr als ungefähr 15% und vorzugsweise weniger verhindert wird, wie durch kompetitive Bindung an freie Liganden oder ungebundene Rezeptoren.

D. Methoden zur Erzeugung monoklonaler Antikörper-Verbindungen

Die vorliegende Erfindung betrachtet eine Verfahren, um einen monoklonalen Antikörper, der mit einer rezeptor-induzierten Bindungsstelle eine Immunreaktion eingeht, herzustellen. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
(a) Immunisierung eines Tieres mit einem Polypeptid gemäß der Erfindung. Dies wird normalerweise durch Gabe einer immunologisch effektiven Menge eines Immunogens an ein immunologisch kompetentes Säugetier, d. h. einer Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen, erreicht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Säugetier um ein Nagetier wie ein Kaninchen, eine Ratte oder eine Maus, obwohl andere Säugetiere wie Ziegen, Pferde und Affen verwendet werden können. Das Säugetier wird für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Säugetier Zellen produzieren kann, die Antikörper-Moleküle sezernieren, die mit dem Polypeptid eine Immunreaktion eingehen, erhalten.
(b) Es wird dann eine Suspension aus antikörper-sezemierenden Zellen hergestellt, die von dem immunisierten Säugetier gewonnen werden. Normalerweise erreicht man dieses durch Entfernung der Säugetier-Milz und mechanische Trennung der einzelnen Milzzellen in einem physiologischen Medium durch Verfahren, die auf diesem Fachgebiet gut bekannt sind.
(c) Die suspendierten, antikörper-produzierenden Zellen werden mit einem transformierenden Wirkstoff behandelt, der fähig ist, eine transformierte ("unsterbliche") Zell-Linie zu erzeugen. Transformierende Wirkstoffe und ihr Gebrauch, um unsterbliche Zell-Linien herzustellen, sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten DNA-Viren wie etwa Epstein-Barr-Virus (EBV), Simian-Virus 40 (SV40), Polyoma-Virus und so weiter, RNA-Viren wie etwa Moloney Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV), Rous- Sarkom-Virus und andere, Myelom-Zellen, wie etwa P3X63-Ag8.653, Sp2/O-Ag14 usw. In den bevorzugten Ausführungsformen bewirkt die Behandlung mit einem transformierenden Wirkstoff die Herstellung eines Hybridoms durch den Gebrauch eines passenden Fusions-Promotors, wobei suspendierte Milz-Zellen mit Maus-Myelom-Zellen aus einer passenden Zell-Linie fusioniert werden. Das bevorzugte Verhältnis beträgt ungefähr 5 Milz-Zellen pro Myelom-Zelle in einer Suspension, die ungefähr 10&sup8; Milz-Zellen enthält. Ein bevorzugter Fusions-Promoter ist Polyethylen-Glykol mit einem durchschnittlichen Molekülgewicht von ca. 1000 bis ungefähr 4000 (kommerziell erhältlich als PEG 1000); es können jedoch auch andere auf diesem Fachgebiet bekannte Fusions-Promoter verwendet werden.
Die verwendete Zell-Linie sollte vorzugsweise einem sogenannten "Medikamentenresistenten" Typ entsprechen, so daß unfusionierte Myelomzellen in einem Selektiv-Medium nicht überleben, während Hybride überleben. Die am häufigsten vorkommende Klasse sind die 8-Azaguanin-resistenten Zell- Linien, denen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Tranferase fehlt und deren Wachstum daher von einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium nicht unterstützt wird. Es ist außerdem normalerweise erwünscht, daß die Myelom-Zell-Linie, die verwendet wird, dem sogenannten "nicht sezernierenden" Typ entspricht, so daß sie nicht selbstständig Antikörper produziert, obwohl auch sezernierende Typen benutzt werden können. In bestimmten Fällen können sogar sezerniernde Myelom-Linien bevorzugt werden.
(d) Die transformierten Zellen werden dann geklont, vorzugweise bis zur Monoklonalität. Die Klonierung wird vorzugsweise in einem Gewebe-Kultur-Medium durchgeführt, das nicht transformierte Zellen nicht unterstützt. Wenn die transformierten Zellen Hybridome sind, wird dies üblicherweise durch Verdünnung und Zucht in separaten Behältern durchgeführt, wobei die Mischung aus unfusionierten Milz-Zellen, unfusionierten Myelom-Zellen und fusionierten Zellen (Hybridomen) in einem Selektiv- Medium erfolgt, das die unfusionierten Myelom-Zellen nicht unterstützt und es wird ausreichend Zeit für den Tod der unfusionierten Zellen (ca. 1 Woche) gegeben. Die Verdünnung und Anzüchtung wird in getrennten Behältern durchgeführt und die Verdünnung kann eine limitierende Verdünnung sein, wobei das Volumen des Verdünnungsmittels statistisch berechnet wird, um eine bestimmte Anzahl an Zellen (z. B. 1-4) in jedem getrennten Behälter zu isolieren (z. B. in jeder Vertiefung einer Mikrotiter-Platte). Das Medium (z. B. HAT-Medium) ist eines, das medikamentenresitente (8-Azaguanin-resistente) unfusionierte Myelom-Zell-Linien nicht unterstützt.
(e) Das Gewebekultur-Medium der geklonten, transformierten Zellen wird auf das Vorhandensein von sezernierten Antikörper-Molekülen untersucht, die nicht mit einem freien Liganden, aber mit einem Liganden, der als Teil eines Rezeptor-Liganden-Komplexes auftritt, eine Immunreaktion eingehen. Die Untersuchung wird mit gut bekannten immunologischen Techniken durchgeführt, wie sie im folgenden beschrieben werden.
(f) Sobald ein gewünschter Transformand in Stufe (e) identifiziert worden ist, wird er selektiert und in einem geeigneten Gewebe-Kultur-Medium über einen passenden Zeitraum angezüchtet, gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Antikörpers aus dem Überstand der Kultur. Ein passendes Medium und die Dauer der Wachstumszeit sind auf diesem Fachgebiet bekannt oder können leicht bestimmt werden.
Um eine viel größere Konzentration von geringfügig weniger reinem monoklonalem Antikörper zu erhalten, kann das gewünschte Hybridom in Mäuse oder andere Säugetiere, in denen das Hybridom wachsen kann, injiziert werden, wobei vorzugsweise syngene oder semisyngene Mäuse benutzt werden. Das Hybridom bewirkt nach einer angemessenen Inkubationsszeit die Bildung eines Antikörperproduzierenden Tumors, wodurch eine hohe Konzentration des gewünschten Antikörpers (ungefähr 5-20 mg/ml) in dem Blutstrom und im peritoneafen Exudat (Ascites) der Empfänger-Maus entsteht.
Medien und Tiere, die für die Herstellung dieser Zusammensetzungen benutzt werden können, sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt und kommerziell erhältlich und schließen synthetische Kultur-Medien, durch Inzucht erzeugte Mäuse und so weiter mit ein. Ein Beispiel für ein synthetisches Medium ist Dulbecco's essentielles Minimalmedium [DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8 : 396 (1959)], das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälber-Serum supplementiert wird. Ein Beispiel für eine durch Inzucht erzeugte Maus-Linie ist die Balb/c.
Ein durch das oben beschriebene Verfahren erzeugter monoklonaler Antikörper kann z. B. auf diagnostische und therapeutische Art und Weise verwendet werden, wie sie in größerer Ausführlichkeit später diskutiert wird, wobei die Bildung eines Immunreaktions-Produktes, welches eine RIBS enthält, erwünscht ist. Solche Anwendungsarten beinhalten z. B. die diagnostischen Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung, um fibrinogen-gebundene Thrombozyten in einer Körperprobe nachzuweisen, z. B. für die in vivo Detektion eines Thrombus, die Auflösung eines Thrombus oder die bildliche Darstellung eines Thrombus.
Ein RIBS monoklonaler Antikörper wird gewöhnlich in einer wäßrigen Zusammensetzung verwendet. Diese Zusammensetzung kann das Gewebe-Kultur-Medium sein oder Ascites-Flüssigkeit, wie man sie gewinnt, oder in verdünnter Form. Solche Zusammensetzungen verwendet man üblicherweise in vitro. Für den in vivo-Gebrauch wird der RIBS monoklonale Antikörper üblicherweise durch Verfahren wie z. B. Präzipitation mit Ammoniumsulfat, Affinitäts-Reinigungsverfahren und so weiter gereinigt und dann in einer wäßrigen Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel verwendet. Die Konzentration von RIBS monoklonalen Antikörpern in der wäßrigen Zusammensetzung wird so eingestellt, daß sie dem erwünschten Verwendungszweck entspricht.

E. Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen

Der Erfindung zufolge sind monoklonale Antikörper vor allem auf den Gebieten, die mit Blutgerinnung und Thromben zu tun haben, nützlich. Dies ist so, weil diese Arten Anti-RIBS monoklonale Antikörper mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Rezeptor-Komplex, der sich auf aktivierten Thrombozyten, die gebundenes Fibrinogen enthalten, befindet, eine Immunreaktion eingehen und thrombozytengebundenes Fibrinogen an der Thrombusbildung beteiligt ist. Außerdem kann durch den Gebrauch von einem oder mehreren dieser monoklonalen Antikörper eine extreme Spezifizität der Immunreaktion erreicht werden, da nach Definition diese RIBS monoklonalen Antikörper nicht mit löslichem Fibrinogen, wie es in vivo in zirkulierendem Blut enthalten ist, eine Immunreaktion eingehen. Die Beschreibung einiger bevorzugter Anwendungen einer betreffenden Antikörper-Zusammensetzung folgen.

1. Thrombus-Auflösung

Eine Anwendungsmöglichkeit der Antikörper dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Auflösung eines Thrombus. Dabei werden die Antikörper-Moleküle chemisch mit einem Plasminogen-Aktivator-Enzym gekoppelt, um ein Konjugat zu bilden, bei dem die Bindung des Antikörper-Anteils des Konjugats an seine RIBS und die plasminogen-aktivierende Aktivität des Enzyms im wesentlichen unbeeinträchtigt bleiben. Verfahren zur Herstellung eines Antikörper-Protein-Konjugats, bei dem die Aktivitäten beider Anteile des Konjugats im wesentlichen unbeeinträchtigt bleiben, sind dem Fachmann gut bekannt. Ein Plasminogen-aktivierendes Enzym bezieht sich auf die Gruppe fibrinolytischer Medikamente in der Klasse der Prothrombolyse wie z. B. Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren, die die Thrombolyse ohne systemische Fibrinolyse oder Fibrinogenabbau induzieren. Andere fibrinolytische Medikamente, die in die Überlegungen mit einbezogen werden, sind solche, die mit dem Proaktivator Plasminogen interagieren, und schließen Streptokinase, Urokinase (u-PA) und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) mit ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
In Übereinstimmung mit diesem Verfahren wird eine pharmazeutisch akzeptable wäßrige Zusammensetzung, die eine thrombusauflösende Menge eines zuvor beschriebenen Konjugats enthält, beispielsweise durch intravenöse Injektion oder Infusion, einem Säugetier wie auch einem Menschen, der einen Thrombus hat, der aufgelöst werden soll, verabreicht. Das so behandelte Säugetier wird für eine Zeitspanne erhalten, die für den Antikörper-Anteil des Konjugats ausreicht, um mit dem thrombozyten-gebundenen Fibrinogen-Komplex, der in dem Thrombus vorliegt, eine Immunreaktion einzugehen, und die ausreicht, damit der Plasminogen-aktivierende Enzym-Anteil des Konjugats Plasminogen aktivieren kann. Da die Entfernung des Konjugats eine schwierige und zeitraubende Maßnahme wäre, wird das Säugetier für eine Zeitspanne, die ausreicht, damit sein eigener Körper das Konjugat auf übliche Art und Weise entfernen kann, erhalten.

2. Inhibition der Thrombus-Bildung

Eine anderes Behandlungsverfahren wird für Lebewesen überlegt, die ein Risiko einer Thrombus-Bildung aufweisen, wie z. B. für Personen in den ersten Tagen nach einer größeren Operation, z. B. einer koronaren Bypass-Operation. Dabei wird eine Thrombus-inhibierende Menge eines monoklonalen Antikörpers, der in einer pharmazeutisch akzeptablen wäßrigen Zusammensetzung vorliegt, einem Säugetier, wie z. B. einem Menschen, bei dem eine Thrombus-Bildung inhibiert werden soll, verabreicht. Das behandelte Säugetier wird für einen ausreichenden Zeitraum erhalten, so daß die verabreichten RIBS monoklonalen Antikörper aus seinem Körper auf gewöhnlichem Wege gereinigt werden können. Bei dieser Vorgehensweise verhindert die Immunreaktion der RIBS monoklonalen Antikörper mit aktivierten Thrombozyten, die gebundenes Fibrinogen enthalten, die Thrombusbildung. Da ein RIBS monoklonaler Antikörper mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex auf den Thrombozyten und nicht mit dem Fibrinogen im Blut eine Immunreaktion eingeht, wird die normale Funktion des behandelten Tieres natürlich nicht beeinträchtigt.
Bei einer ähnlichen Verwendungsart wird ein Verfahren der Thrombozyten-Aggregations-Inhibition überlegt, das die Verabreichung einer pharmazeutisch akzeptablen wäßrigen Zusammensetzung, die monoklonale Antikörper-Moleküle gemäß der Erfindung enthält, zu einer Thrombozyten enthaltenden Lösung umfaßt. Eine Thrombozyten-Aggregations-hemmende Menge des Antikörpers wird in vivo einem Tier, bei dem die Hemmung der Thrombozyten-Aggregation erwünscht ist, verabreicht, oder wird in vitro mit einer Thrombozyten enthaltenden Lösung wie z. B. Plasma oder Blut vermischt. Die Immunreaktion der RIBS monoklonalen Antikörper mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex auf den Thrombozyten ergibt ein Immunreaktions-Produkt, das die Thrombozyten-Aggregation hemmt.
Ein einzelner, zuvor beschriebener RIBS monoklonaler Antikörper kann in jedem der oben beschriebenen Verfahren benutzt werden, oder es kann eine Mischung, die mehr als einen Antikörper enthält, verwendet werden. Verschiedene monoklonale Antikörper können mit verschiedenen Epitopen einer RIBS eine Immunreaktion eingehen. Dadurch wird ein Vorteil durch den Gebrauch einer Mischung dieser monoklonalen Antikörper (allein oder in Konjugation) erreicht, so daß vielfältige Bindungen der Verbindungsstellen an ein einzelnes, gebundenes Fibrinogen-Molekül auftreten können.
Die Herstellung einer pharmazeutisch akzeptablen wäßrigen Zusammensetzung, die Antikörper- Moleküle als aktive Bestandteile enthält, ist auf diesem Fachgebiet gut bekannt. Üblicherweise werden solche Zusammensetzungen zur i.v.-Gabe entweder als wäßrige Lösungen oder Suspensionen hergestellt, jedoch können auch feste Formen, die für die Auflösung oder Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit vor Injektion geeignet sind, hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden. Das Konjugat oder der monoklonale Antikörper allein wird, wie allgemein gut bekannt ist, oft mit einem Trägerstoff vermischt, der pharmazeutisch akzeptabel und mit dem Konjugat oder dem monoklonalen Antikörper kompatibel ist. Passende Trägerstoffe sind z. B. Wasser, Kochsalz, Dextrose, Glycerin, Ethanol usw., oder Kombinationen aus diesen. Außerdem kann die Zusammensetzung, wenn erwünscht, kleinere Anteile von Hilfs-Substanzen, wie benetzende, emulgierende oder pH-puffernde Wirkstoffe, die die Effektivität des aktiven Inhaltsstoffes erhöhen, enthalten.
Ein Konjugat oder ein monoklonaler Antikörper kann in die oben beschriebene wäßrige Verbindung als neutralisierte pharmazeutisch akzeptable Salzform in die Formel aufgenommen werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze beinhalten die Säure-Additionssalze (gebildet durch die freien Aminogruppen des Enzyms oder des Antikörper-Moleküls), die durch anorganische Säuren wie z. B Salzsäure oder Phosphorsäure oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure usw., gebildet werden, Salze, die durch die freien Carboxyl-Gruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie z. B. Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und so weiter abgeleitet werden.
Die therapeutischen, Antikörper-Moleküle enthaltenden Zusammensetzungen werden üblicherweise intravenös, z. B. durch Injektion einer Einheitsdosierung, verabreicht. Eine Zusammensetzung wird auf eine Art und Weise verabreicht, die sich mit dem Dosierungsschema verträgt und wird in einer therapeutisch effektiven, d. h. in einer Thrombus-auflösenden oder einer Thrombus-inhibierenden Menge verabreicht.

3. Antikörper-Neutralisation

Es werden auch therapeutische Verfahren überlegt, bei denen ein Anti-RIBS-Antikörper, der mit einem Polypeptid dieser Verbindung eine Immunreaktion eingeht, "neutralisiert" oder inhibiert wird. Folglich kann eine inakzeptabel hohe Konzentration eines Antikörpers in einem Patienten, wenn z. B. der Antikörper die Thrombozyten-Aggregation übermäßig hemmt, effektiv durch die Gabe einer therapeutisch effektiven Menge eines der zuvor beschriebenen Polypeptide reduziert werden. Typischerweise wird das Polypeptid als sterile pharmazeutische Zusammensetzung und in einer Einheitsdosierungsform, wie sie im folgenden beschrieben wird, verabreicht.

4. Anwendungs-Regime

"Einheitsdosierung", soweit sie die Inokula der vorliegenden Erfindung betrifft, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosierung für Tiere zu gebrauchen sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge an aktivem Material enthält, die so berechnet ist, daß sie in Verbindung mit dem benötigten Verdünnungsmittel, sprich Träger oder Vehikel, den erwünschten immunogenen Effekt erzielt. Die Spezifikationen für die neue Einheitsdosierung dieser Erfindung werden bestimmt durch und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials und dem speziellen immunologischen Effekt, der erreicht werden soll und (b) den Grenzen, die diesem Fachgebiet bei der Herstellung solch aktivem Materials zum immunologischen Gebrauch bei Tieren auferlegt sind, wie im folgenden offenbart wird, wobei dies Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Einheitsdosierungsformen werden üblicherweise aus gefrorenem oder getrocknetem Antikörper durch Dispersion in einem physiologisch tolerierbaren Verdünnungsmittel oder Träger wie Wasser, Kochsalz oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zur Bildung einer wäßrigen Zusammensetzung gewonnen. Solche Verdünnungmittel sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt und werden z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980), auf den Seiten 1465-1467 diskutiert.
Dosierungsformen können auch ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels enthalten. Adjuvantien wie das komplette Freunds's-Adjuvans (CFA), inkomplette Freunds-Adjuvans (IFA) und Alaun sind Stoffe, die in diesem Fachgebiet gut bekannt sind und die auch kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich sind.
Die Menge der Antikörper-Zusammensetzungen, die verabreicht wird, hängt unter anderem von der Tiergattung, die behandelt werden soll, der Versuchstiergröße, der Größe des Thrombus (wenn bekannt), der Menge der vorhandenen Fibrinogen-gebundenen Thrombozyten und der Fähigkeit des Versuchstieres, das Konjugat oder den monoklonalen Antikörper zu nutzen, ab. Die genaue Menge des Konjugats oder des monoklonalen Antikörpers, die verabreicht werden soll, hängt von der Beurteilung des Anwenders ab und ist für jedes Individuum spezifisch, vor allem, wenn Menschen die zu behandelnden Lebewesen sind. Die Dosierungsspielräume können jedoch durch eine therapeutisch effektive Blutkonzentration gekennzeichnet werden und können bei einer Konzentration des Antikörper- enthaltenden Konjugats oder des Antikörpers der vorliegenden Erfindung alleine zwischen ungefähr 0,1 uM bis ungefähr 100 uM, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,1 uM und 10 uM liegen.
Passende Therapie-Regime für die initiale Gabe und die Booster-Injektionen sind auch variabel, sind aber durch eine initiale Gabe, auf die wiederholte Dosierungen in ein- oder mehrstündigen Intervallen durch eine Nachfolge-Injektion oder eine Gabe auf andere Art folgen, gekennzeichnet. Alternativ wird auch eine konstante intravenöse Infusion überlegt, die ausreicht, um eine therapeutisch effektive Konzentration zu erhalten.

F. Diagnostische Systeme

Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung beinhaltet als Kit-Form in einer zumindest für eine Untersuchung ausreichenden Menge einen RIBS monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung als ein separat verpacktes Reagenz. Ein Marker, um das Vorhandensein einer Immunreaktion zwischen der RIBS und dem RIBS monoklonalen Antikörper anzuzeigen, wird vorzugsweise auch in das gleiche oder ein getrenntes Paket eingeschlossen. Anweisungen für den Gebrauch des verpackten Reagenz werden normalerweise auch beigelegt.
Die Gebrauchsanweisung enthält normalerweise einen greifbaren Ausdruck, um die Reagenz- Konzentration zu beschreiben oder wenigstens einen Parameter der Untersuchungsmethode wie die Mischung der relativen Mengen von Reagenz und Probe, Erhaltungszeiten für die Reagenz/Proben- Mischungen, Temperatur, Pufferbedingungen usw.
Eine Verwendungsmöglichkeit dieser Erfindung liegt in einem diagnostischen System in Kit-Form, um fibrinogen-gebundene Thrombozyten in einer Thrombozyten enthaltenden Gefäßflüssigkeits-Probe wie z. B. Blut oder Plasma zu bestimmen. Das System umfaßt ein Paket, das einen monoklonalen Antikörper enthält, der mit einer RIBS, die vom Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, eine Immunreaktion eingeht. Vorzugsweise liegen die Antikörper-Moleküle als eine monoklonale Antikörper- Zusammensetzung vor, die mehr als einen speziellen monoklonalen Antikörper enthält. Bevorzugt werden Kits, in denen die Antikörper-Moleküle an einen Radionuklid-Marker, vorzugsweise einen ¹²&sup5;I- Marker, gekoppelt sind. Verwendbare Marker werden im folgenden diskutiert.
In einer anderen Ausführungsform ist ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung eines in vivo vorliegenden Thrombus geeignet. Das System umfaßt ein Paket, das monoklonale Antikörper-Moleküle enthält, die mit einer RIBS, die durch den Rezeptor-Liganden-Komplex exprimiert wird, eine Immunreaktion eingehen. Die Antikörper-Moleküle sind vorzugsweise an einen in vivo-Marker oder -Indikatoren gekoppelt.
Obwohl ein Kit für eine in vivo-Abbildung oft für in vitro-Assays genutzt werden kann, ist es bekannt, daß das Gegenteil nicht stimmen muß. Zum Beispiel sollten die monoklonalen Antikörper, die bei der in vivo- Arbeit benutzt werden, wie auch jegliche Puffersalze der wäßrigen Zusammensetzung und die Reagenzien frei von Pyrogenen sein. Die Freiheit von pyrogenem Inhalt ist für in vitro-Assays nicht notwendig. Außerdem sind die Indikatoren, die bei in vivo-Darstellung üblich sind, normalerweise andere als die bei in vitro benutzten, wie im folgenden diskutiert wird. Somit ist das Assay-System für die in vivo- Darstellung geeignet und geeignete Puffersalze, wäßrige Lösungen und Indikatoren können als Teil des Kits in demselben oder verschiedenen Paketen geliefert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung außerdem einen Marker oder Indikatoren, die in der Lage sind, die Bildung eines Immunreaktions- Komplexes, der ein Antikörper-Molekül der vorliegenden Erfindung enthält, anzuzeigen.
Die Bezeichnungen Marker und Indikatoren, wie sie hier in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen verwendet werden, beziehen sich auf einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Herstellung eines erkennbaren Signals beteiligt sind, welches das Vorhandensein eines Komplexes anzeigt. In vivo-Marker oder Indikatoren sind solche, die im Körper eines Menschen gebraucht werden können und schließen ¹¹In, &sup9;&sup9;Tc, &sup6;&sup7;Ga, ¹&sup8;&sup6;Re und ¹³²I ein.
Jeder Marker oder Indikator kann an ein Antikörper-Molekül gekoppelt oder daran gebunden sein, welches Teil eines Konjugats oder einer monoklonalen Antikörper-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist und diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit weiteren Reagenzien verwendet werden. Solche Marker sind in der klinischen diagnostischen Chemie gut bekannt und stellen nur insofern einen Teil dieser Erfindung dar, wie sie mit ansonsten neuartigen Protein-Verfahren und/oder -Systemen verwendet werden.
Die Kopplung an Marker, sprich die Markierung von Antikörpern ist in diesem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können von einem Hybridom produzierte Antikörper-Moleküle durch metabolische Aufnahme von Radio-Isotopen enthaltenden Aminosäuren, die als Bestandteil des Nährmediums bereitgestellt werden, markiert werden. Siehe auch, z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73 : 3-46 (1981). Die Techniken der Proteinkonjugation oder -paarung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders geeignet. Siehe auch Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Bd. 8 Suppl. 7 : 7-23 (1978), Rodweil et al., Biotech., 3 : 889-894 (1984), und U. S. Pat. Nr. 4,493,795.
Die in vitro-Diagnostik-Systeme können auch ein spezifisches Bindemittel, vorzugsweise getrennt verpackt, enthalten. Ein "spezifisches Bindemittel" ist eine molekulare Einheit, die zu einer selektiven Bindung an einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung fähig ist, jedoch nicht selber ein Antikörper-Molekül der vorliegenden Erfindung ist. Beispiele für spezifische Bindemittel sind Zweit- Antikörper-Moleküle, Komplement-Proteine oder Teile davon, S. aureus-Protein A und so weiter. Das spezifische Bindemittel bindet das RIBS monoklonale Antikörper-Molekül dieser Erfindung, wenn der monoklonale Antikörper als Teil eines Immunkomplexes mit dem Liganden-Rezeptor-Komplex vorliegt. In den bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindemittel markiert. Wenn das diagnostische Verfahren jedoch ein spezifisches Bindemittel enthält, das nicht gekennzeichnet ist, wird das spezifische Bindemittel gebräuchlicherweise als Verstärkungsmittel oder Reagens verwendet und ein zweites Reagens, das gekennzeichnet ist, bindet an das spezifischen Bindemittel (das Verstärkungsmittel). Bei diesen Ausführungsformen ist das markierte 2. Reagens in der Lage, spezifisch das Verstärkungsmittel zu binden, wenn das Verstärkungsmittel an einen, einen RIBS monoklonalen Antikörper enthaltenden Immunkomplex gebunden ist.
Ein diagnostisches Kit der vorliegenden Erfindung kann in einem "ELISA"-Format benutzt werden, um das Vorhandensein oder die Menge an Liganden-Rezeptor-Komplex nachzuweisen, z. B. fibrinogen- gebundene Thrombozyten in einer Körperflüssigkeitsprobe wie Serum, Plasma oder Urin. "ELISA" bezieht sich auf einen enzymgekoppelten Immunosorptions-Assay, der einen Antikörper oder ein Antigen (hier den RIBS enthaltenden Liganden-Rezeptor-Komplex), der an eine Fest-Phasen-Matrix gebunden ist, welche eine feste Grundlage bildet und ein Enzym-Antigen- oder ein Enzym-Antikörper-Konjugat verwendet, um die Menge des in der Probe vorhandenen Antikörpers oder Antigens nachzuweisen und zu quantifizieren. Eine Beschreibung der ELISA-Technik findet sich in Kapitel 22 der 4. Auflage von Basic and Clinical Immunology von D. P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publications in Los Altos, CA 1982 und in den U.S.-Patenten Nr. 3,654,090, Nr. 3,850,752, und Nr. 4,016,043.
In einer bevorzugten ELISA-Kit-Ausführungsform wird ein Antikörper Molekül der vorliegenden Erfindung auf einer festen Matrix fixiert, um eine feste Grundlage zu schaffen, die getrennt in den betreffenden diagnostischen Systemen verpackt wird. Die Antikörper werden gebräuchlicherweise durch Adsorption von einem wäßrigen Medium auf der festen Matrix fixiert, obwohl auch andere Fixationsmethoden, die den auf diesem Fachgebiet Erfahrenen wohl bekannt sind, verwendet werden können.
Ein markiertes spezifisches Bindemittel, das an einen Liganden-Rezeptor-Komplex oder einen Bestandteil davon bindet oder ein nicht markiertes spezifisches Bindemittel plus einem zweiten markierten Wirkstoff, der an das spezifische Bindemittel bindet, wird ebenfalls in ein bzw. zwei getrennten Paketen dem Kit beigegeben. Bei Verwendung eines der monoklonalen Antikörper, die von einem der durch ATCC abgesetzten Hybridome produziert wurden, als Beispiel für einen matrix- gebundenen Antikörper, sind gekennzeichnete Anti-Fibrinogen-Antikörper, wie sie kommerziell erhältlich sind, beispielhaft für einen spezifischen Bindungswirkstoff.
Nützliche feste Matrizen sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt. Zu solchen Stoffen gehören das vernetzte Dextran, welches unter dem Handelsnamen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist, Agarose, Polystyren-Kügelchen von ungefähr 1 Micron bis ungefähr 5 mm Durchmesser, erhältlich von Abbott Laboratories of Chicago, IL; Polyvinylchlorid, Polystyren, vernetztes Polyacrylamid, auf Nitrozellulose oder Nylon basierende Gewebe wie Blätter, Streifen oder Schaufeln; oder Röhren, Platten, oder die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte wie die aus Polystyren oder Polyvinylchlorid hergestellten.
Ein monoklonaler Antikörper (gekennzeichnet oder ungekennzeichnet), ein gekennzeichneter spezifischer Bindungswirkstoff oder ein Verstärkungsmittel jeglichen Verfahrens, das hierbei beschrieben wird, kann in Lösung, als flüssige Dispersion oder als im wesentlichen getrocknetes Pulver, z. B. in lyophylisierter Form zur Verfügung gestellt werden. Wo das Indikationsmittel ein Enzym ist, kann das Enzymsubstrat ebenfalls als getrenntes Paket des Baukastensystems zur Verfügung gestellt werden. Eine feste Unterstützungsmatrix wie die zuvor beschriebene Mikrotiter-Platte und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als separat verpackte Elemente dieses diagnostischen Nachweisverfahrens beigelegt werden.
Die Pakete, die im folgenden in Verbindung mit diagnostischen Verfahren diskutiert werden, sind die, die gewöhnlich bei diagnostischen Verfahren verwendet werden. Solche Pakete enthalten Glas- und Plastikflaschen und -Gefäße (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polykarbonat), plastik- und plastikfolien-verkleidete Umschläge und so weiter.

G. Untersuchungsmethoden

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit mit einem Verfahren, mit dem man Rezeptor-Liganden- Komplexe nachweisen kann, wie sie z. B. in einem Thrombus oder einem fibrinogen gebundenen Thrombozyten gefunden werden, vorzugsweise GPIIb-IIIa-Fibrinogen.
Das Verfahren verwendet die Expression einer rezeptor-induzierten Bindungsstelle (RIBS) und ein monoklonales Antikörper-Molekül, das mit der RIBS in dem Ligandenanteil des Rezeptor-Liganden- Komplexes eine Immunreaktion eingeht, jedoch nicht mit einem ungebundenen Rezeptor oder einem ungebundenen Liganden reagiert. Der Fachmann wird verstehen, daß viele gut bekannte diagnostische Verfahren der klinischen Chemie angewendet können, um solche Immunkomplexe zu bilden. Daraus folgt, daß während hier einige beispielhafte Untersuchungsverfahren beschrieben werden, die Erfindung nicht so eingeschränkt ist.

1. Thrombusnachweis

Genauer, es wird ein Verfahren betrachtet, um das Vorhandensein eines Thrombus in einem Säugetier wie dem Menschen aufzuspüren. Eine wäßrige Zusammensetzung, die eine effektive Abbildungsmenge eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung enthält, wobei die Antikörper-Moleküle an in vivo-Indikatormittel gekoppelt sind, wird einem Säugetier, wie z. B. einem Menschen, der eine solche Behandlung braucht, verabreicht.
Das behandelte Säugetier wird über eine vorbestimmte Zeit versorgt, die ausreicht, damit das markierte Antikörper-Molekül mit dem als Teil des Thrombus vorhandenen thrombozyten-gebundenen Fibrinogenkomplex eine Immunreaktion eingehen kann. Das betroffene Säugetier wird dann auf die Anwesenheit und vorzugsweise Lokalisation von jedem entstandenen und markierten Immunkomplex untersucht, um so den Thrombus nachzuweisen und vorzugsweise seine Lokalisation festzustellen. Da ein markierter RIBS monoklonaler Antikörper normalerveise ein Radionuklid als Kennzeichnung oder Indikatormittel enthält, wird die bildgebende Untersuchung mit gewöhnlichem, gut bekanntem Radio- Abbildungs-Verfahren durchgeführt. Solche Verfahren können zwischen der relativ hohen Konzentration von radioaktiver Markierung am Thrombus und der relativ geringeren systemischen Menge der radioaktiven Markierung unterscheiden. Wenn relativ langlebige Radio-Isotope benutzt werden, kann das behandelte Säugetier für eine Zeitspanne versorgt werden, die für eine ausreichende systemische Reinigung von dem markierten monoklonalen Antikörper ausreicht und somit für eine noch geringere Menge an Hintergrundsignalen der radioaktiven Markierung sorgt.

2. Nachweis von fibrinogen-gebundenen Thrombozyten in einer Körperprobe

Verschiedene heterogene und homogene Untersuchungsprotokolle können verwendet werden, entweder kompetitiv oder nicht kompetitiv, um die Anwesenheit und vorzugsweise auch die Menge fibrinogengebundener Thrombozyten in einer Thrombozyten und/oder freies Fibrinogen enthaltenden Körperprobe nachzuweisen, wobei die Körperflüssigkeitsprobe vorzugsweise Blut oder ein Thrombozyten enthaltender Anteil von Blut ist. Z. B. werden eine mit Heparin versetzte (nicht geronnene) Blutprobe und eine Art der zuvor besprochenen, mit ¹²&sup5;I-markierten und hinterlegten RIBS Antikörper-Moleküle vermischt. Es werden natürlich Mengen und Konzentrationen der Blutprobe und des markierten monoklonalen Antikörpers verwendet, mit denen ein aussagekräftiges Resultat erreicht werden kann. Die dabei entstehende Immunreaktionsmischung wird unter biologischen Untersuchungsbedingungen solange beobachtet, bis genügend fibrinogen-gebundene Thrombozyten in der Probe vorhanden sind, um mit den markierten Antikörpern eine Immunreaktion einzugehen und ein markiertes Immunreaktions- Produkt zu bilden. Wenn das markierte Immunreaktions-Produkt vorhanden ist, wird es von den eventuell ebenfalls anwesenden markierten Antikörpern, die nicht reagiert haben, getrennt. Bei homogenen Assays wird die Trennung normalerweise durch eine Zentrifugation erreicht, durch die alle Thrombozyten, die sich in der Probe befinden, pelletiert werden. In heterogenen Assays wie dem ELISA wird das Immunreaktions-Produkt an einen festen Träger gebunden und die Trennung wird normalerweise durch Waschung erreicht, wobei jeder ungebundene RIBS Antikörper entfernt und das an den festen Träger gebundene Immunreaktions-Produkt zurückgehalten wird.
Es sollte wohl verstanden werden, daß, wenn ein unmarkierter RIBS monoklonaler Antikörper benutzt wird, um mit einem RIBS enthaltenden Liganden-Rezeptor-Komplex eine Immunreaktion einzugehen, eine zweite Mischung zwischen dem zuvor beschrieben, abgetrennten Immunkomplex und einem markierten Bindungsreagens oder einem unmarkierten Bindungsreagens, das als Verstärkungsmittel benutzt wird, gebildet wird. Diese Reaktionsmischung wird unter biologischen Bedingungen solange aufbewahrt, bis ein zweiter Bindungskomplex zwischen dem zuerst gebildeten Immunkomplex und dem spezifischen Bindungswirkstoff gebildet wird.
Wenn der spezifische Bindungswirkstoff Antikörper-Moleküle umfaßt, ist der zweite Bindungskomplex ein zweiter Immunkomplex. Wenn z. B. S. aureus-Protein A benutzt wird, bindet sich der zweite Bindungskomplex nicht verlässlich an die Antikörper-Bindungsstelle, und ein solcher Komplex wird am besten als Bindungskomplex bezeichnet. Da ein Immunkomplex ein spezifischer Bindungskomplex ist, ist der Komplex, der zwischen dem spezifischen Bindungswirkstoff und dem erstgenannten Immunkomplex gebildet wird, ein zweiter Bindungskomplex. Der zweite Bindungskomplex wird anschließend von jedem eventuell vorhandenen spezifischen Bindungswirkstoff, der nicht reagiert hat, durch eine der zuvor genannten Techniken getrennt und die Anwesenheit der Markierung und damit des Immunkomplexes wird bestimmt und vorzugsweise auch quantifiziert.
Wenn der spezifische Bindungswirkstoff nicht markiert ist und als Verstärkungsmittel benutzt wird, wird eine dritte Mischung gebildet, die, wenn vorhanden, aus dem oben erwähnten, abgetrennten zweiten Bindungskomplex und einem eine Markierung enthaltenden zweiten Bindungswirkstoff besteht. Die Anwesenheit der Markierung im zweiten Bindungskomplex wird natürlich nicht nach dem oben beschriebenen Verfahren festgestellt, bei dem keine Mischung mit einem markierten Reagens vorgenommen wurde. Die zuvor beschriebenen Aufbewahrungs- und Trennungsschritte werden für diesen Aspekt des Verfahrens wiederholt, wobei ein eine Markierung enthaltender dritter Bindungskomplex gebildet und zurückbehalten wird. Das Vorhandensein und vorzugsweise auch die Menge des Markers wird danach bestimmt.
Damit sorgt in jedem der oben beschriebenen Aspekte dieser Untersuchung die Anwesenheit und vorzugsweise die Menge der Markierung für die Basis, um die Anwesenheit und vorzugsweise die Menge von fibrinogen gebundenen Thrombozyten zu bestimmen.
Es fällt auf, daß der Arbeiter, der das oben beschriebene Assay durchführt, normalerweise nicht weiß, ob tatsächlich ein oder mehrere der Immunkomplexe oder Bindungskomplexe gebildet wurden, bis die Menge des vorhandenen Markers bestimmt wird. Unabhängig davon werden alle Schritte jeder Untersuchungsdurchführung so ausgeführt, als wäre der RIBS enthaltende Komplex tatsächlich vorhanden.
Es muß betont werden, daß wegen der einzigartigen Spezifität der RIBS monoklonalen Antikörper das oben beschrieben Assay für fibrinogen-gebundene Thrombozyten und das davor beschriebene Abbildungs-Assay für einen Thrombus in Anwesenheit sowohl von freien Thrombozyten und freiem Fibrinogen, sprich nicht komplex-gebundenen Thrombozyten und Fibrinogen durchgeführt werden kann und vorzugsweise auch wird. Daraus resultiert, daß spezielle Behandlungsmaßnahmen, wie Trennungen und Waschungen der Körperprobe nicht durchgeführt werden müssen, um diese Probe in einem Assay zu benutzen. Dieses Kennzeichen haben alle Assays, die RIBS monoklonale Antikörper verwenden, gemeinsam.

3. Antikörper-Nachweis

Es wird auch ein Verfahren betrachtet, um einen genannten Antikörper, z. B. in einer Blutprobe, zu entdecken. Ein solches Verfahren umfaßt folgende Schritte:
(a) eine wäßrige Lösung, von der man annimmt, daß sie den Antikörper zu enthält, wird einem Polypeptid dieser Erfindung, das auf einer Oberfläche immobilisiert wurde, z. B. einer Sepharose-Säule, ausgesetzt;
(b) der Antikörper wird für eine ausreichende Zeitspanne und unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen mit dem immobilisierten Polypeptid in Kontakt gehalten, so daß ein Antikörper- Polypeptid-Immunkomplex gebildet wird; und
(c) die Anwesenheit von gebildetem Immunkomplex, die mit der Anwesenheit von Antikörper in der geprüften Lösung in Beziehung steht, wird bestimmt. Der Nachweis kann durch Radiomarkierung des Antikörpers, ELISA-Analyse des gebundenen Antikörpers, und, wie gut bekannt, durch ähnliche Verfahren geführt werden.
Biologische Untersuchungsbedingungen sind solche, die die biologische Aktivität der Antikörper- Moleküle dieser Erfindung und der fibrinogen gebundenen Thrombozyten oder anderer, RIBS enthaltende Komplexe, die untersucht werden sollen, erhalten. Solche Bedingungen beinhalten eine Temperaturspanne von ungefähr 4ºC bis ungefähr 45ºC, vorzugsweise ungefähr 37ºC, eine pH-Wert- Spanne von ungefähr 5 bis ungefähr 9, vorzugsweise ungefähr 7, und eine Ionen-Stärke, die zwischen der von destilliertem Wasser bis zu der von 1-molarem Natriumchlorid schwanken kann, wobei die von physiologischer Kochsalzlösung vorzuziehen ist. Verfahren, um diese Bedingungen zu optimieren, sind dem Fachgebiet gut bekannt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Ausmaß der vorliegenden Erfindung, ohne es zu limitieren.

1. Herstellung von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper wurden durch den Gebrauch standardisierter Hybridom-Techniken hergestellt. Kurz gefaßt, wurden Balb/c-Mäuse immunisiert und anschließend dreimal mit ungefähr 50 Mikrogramm (ug) Fibrin-D-Dimer-Immunogen pro Maus Antigen-ausgesetzt, welches im wesentlichen so hergestellt wurde wie in Cierniewski et al., Thromb. Haemostas., 48 : 33-37 (1982) beschrieben. Anschließend wurden 1,23 · 10&sup8; Milz-Zellen einer immunisierten Maus, deren Antikörper mit dem Immunogen eine Immunreaktion eingegangen waren, mit 2,46 · 10&sup7; P3Ag8653.1 Maus-Myelom-Zellen in Anwesenheit des Zellfusions-Promotors Polyethylenglykol 4000 vermischt. Die so transformierten, Antikörper produzierenden Zellen wurden dann mit einer Dichte von ungefähr 3 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung auf eine Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen übertragen und gezüchtet.
Gewebe-Kultur-Überstände von 235 Vertiefungen, die nach ca. 14 Zucht-Tagen anscheinend lebensfähige Hybridome enthielten, wurden durch einen Radioimmuno-Assay auf das Vorhandensein von Anti-RIBS Antikörper-Molekülen untersucht. Kurz gefaßt, 100 Mikroliter (ul) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die entweder 1 ug/ml Fibrinogen oder niedrigdichtes Lipoprotein (LDL) (Kontrolle) enthielten, wurden in die Vertiefungen von flachbodigen Polyvinyl-Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen als Fest-Phase-Matrix beigegeben. Die Platten wurden dann für ungefähr 16 bis 20 Stunden bei 4ºC stehengelassen, um dem Fibrinogen oder LDL die Adsorption an die Oberfläche der Vertiefungen zur Bildung eines festen Trägers zu erlauben. Die bedeckende Lösung wurde durch Schütteln entfernt, die Vertiefungen ausgewaschen, und 100 ul einer Blocker-Lösung (PBS, das 5% normales Ziegenserum enthält) in jede Vertiefung gegeben, um überschüssige Protein-Bindungs-Stellen zu blockieren. Die Vertiefungen wurden für ca. 30 Minuten bei 37ºC bebrütet und dann wurde die Blocker-Lösung entfernt. Danach wurde in jede Vertiefung 100 ul von entweder (a) Hybridom-Gewebe-Kultur-Überstand, verdünnt 1 : 10 in PBS oder (b) Hybridom-Überstand, der 1 : 10 mit PBS, das 100 ug/ml Fibrinogen als kompetitivem Inhibitor enthielt, gemischt. Die Immunreaktions-Mischungen, die auf diese Weise gebildet wurden, wurden danach bei Zimmertemperatur für ungefähr 16 bis 20 Stunden bei 4ºC stehengelassen, um die Bildung eines an Fest-Phase-gebundenen Immunreaktions-Produktes und einer Füssig-Phase, die jedes nicht gebundene monoklonale Antikörper-Molekül enthielt, zu erlauben.
Zu jeder Vertiefung wurden dann 100 ul ¹²&sup5;I-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG gegeben. Die markierende Immunreaktions-Mischung, die auf diese Art und Weise gebildet wurde, wurde für ungefähr 6 bis 20 Stunden bei 4ºC beobachtet, um die Bildung eines ¹²&sup5;I-markierten zweiten Fest-Phase Immunreaktions- Produktes zu erlauben. Die festen und flüssigen Phasen wurden getrennt, um jegliches nicht gebundenes ¹²&sup5;I-Ziegen-Anti-Maus-IgG zu entfernen. Die Menge des ¹²&sup5;I, gebundenen in jeder Vertiefung, wurde durch Gamma-Szintillation bestimmt.
Die Anwesenheit von mindesten der 3-fachen Menge von nicht spezifisch gebundenem ¹²&sup5;I, wie bestimmt von den LDL-ausgekleideten Vertiefungen in einer mit Fibrinogen ausgekleideten Vertiefung, zeigte die Anwesenheit von Anti-Fibrinogen Antikörpern in einem Gewebe-Kultur-Überstand an. Eine Verringerung des Fest-Phase-gebundenen ¹²&sup5;I von nicht mehr als ungefähr 15% durch die Anwesenheit von Flüssig-Phase-Fibrinogen-Konkurrenten in der Immunreaktions-Mischung [Teil (b) oben] zeigte das Vorhandensein von Anti-RIBS Antikörpern in dem Gewebe-Kultur-Überstand an.
Die oben beschriebene Screening-Prozedur resultierte in der Identifikation von 4 Hybridomen, sogenanntes 2G5, 2F10, 3G11 und 4G10, die Anti-RIBS Antikörper produzieren, die Fibrinogen : GPIIb- IIIa-Komplex binden. Die Hybridome haben die folgenden ATCC-Hinterlegungsnummern: 2G5(HB9847), 2F10(HB9844), 3G11(HB9845) und 4G10(HB9846).
Jedes der 4 oben beschriebenen Hybridome wurde durch limitierende Verdünnung zweimal geklont und anschließend zur Produktion von Ascites-Flüssigkeit benutzt. Die Antikörper wurden dann von den Ascites-Flüssigkeiten durch den Gebrauch von Protein-A-Sepharose isoliert.
Zusammensetzungen, die Fab-Fragmente des monoklonalen Antikörpers (MAb) 2F10 enthielten, wurden durch Verdau von Protein-A-Sepharose - isoliertes MAb 2F10 mit Papain (200 : 1 Gewicht MAb zu Gewicht Papain) für 6 Stunden bei 37ºC gemäß dem Verfahren von Mage et al., Methods in Enzymology, 70 : 142-50 (1980) hergestellt.
Nicht verdauter Antikörper und Fc-Fragmente wurden von den Fab-Fragmenten durch Chromatographie auf Protein-A-Sepharose entfernt. Die daraus entstehenden Fab-Fragmente wurden von der Sepharose gesammelt, um eine 2F10-Fab-Aufbereitung zu bilden.

2. Nachweis einer Fibrinogen: GPIIb-IIIa-RIBS auf aktivierten Thrombozyten

Monoklonale Antikörper, die durch die Hybridome 2G5, 2F10 und 3G11 produziert werden, sprich MAb 2G5, MAb 2F10 bzw. MAb 3G11, auf ihre Fähigkeit, mit an eine Zelloberfläche gebundener RIBS eine Immunreaktion einzugehen, untersucht. Jeder der vier monoklonalen Antikörper wurde unter Verwendung des Standard-Chloramin-T-Verfahrens mit ¹²&sup5;I markiert [Greenwood et al., Bio. Chem. J., 89 : 114-123 (1963)].
Sechzig Milliliter (ml) menschlichen Vollblutes wurden in 5 ml ACD (0,065 M Zitronensäure, 0,085 M Natriumcitrat, 2% Dextrose) gesammelt, welches Hirudin (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) in einer Formelkonzentration von 0,06 Einheiten pro ml (U/ml) enthielt, und für 15 Minuten bei 120 · g zentrifugiert. Der daraus resultierende Überstand, thrombozytenreiches Plasma genannt, wurde zurückgewonnen, isoliert, und für 15 Minuten bei 1200 · g weiter zentrifugiert, um ein Pellet aus isolierten Thrombozyten zu bilden.
Die isolierten Thrombozyten wurden erneut in 2 ml einer calciumfreien Tyrodes-Puffer-Lösung (0,13 M NaCl, 0,0026 M KCl, 0,002 M MgCl&sub2;-6H&sub2;O, 5 mM Hepes, 0,012 M NaHCO&sub3;, pH7,2), die 1 mg/ml Rinder- Serum-Albumin (BSA) und 1 mg/ml Dextrose enthielt, suspendiert. Die Thrombozyten-Suspension wurde dann auf eine Sepharose-CL2B-Säule (40 ml totales Bettvolumen; Pharmacia Inc. Piscataway, NJ) verbracht, und mit demselbem Tyrodes-Puffer äquifibriert. Gewaschene Thrombozyten wurden von dem unbesetzten Volumen der CL2B-Säule in einem endgültigen Volumen von 4 bis 5 ml zurückgewonnen. Proben der gewaschenen Thrombozyten wurden dann durch Mischung mit entweder Adenosindiphosphat (ADP) zu einer Konzentration von 10 Mikromol (uM), oder mit Thrombin zu einer Konzentration von 0,1 Einheiten/ml stimuliert (aktiviert). Einige Proben der ADP-stimulierten Thrombozyten wurden auch mit Fibrinogen zu einer Fibrinogenkonzentration von 1 mM vermischt. Zu jeder Thrombozyten-Probe, einschließlich einiger nicht stimulierter Kontrollproben, wurde ein ¹²&sup5;I- markierter MAb zu einer Konzentration von 10 Nanomol (nM) beigegeben. Die Immunreaktions- Mischung, die auf diese Weise gebildet wurde, wurde für 30 Minuten bei 22ºC stehengelassen, um die Bildung eines Immunreaktions-Produktes zu erlauben. Die Immunreaktions-Produkte wurden von nicht gebundenem ¹²&sup5;I-MAb durch Zentrifugation durch 0,3 ml 20%-iger Saccharose getrennt. Die Menge des mit dem Thrombozyten-Pellets verbundenen ¹²&sup5;I-MAb wurde durch Szintillations-Spektrometrie bestimmt.
Wie in unten in Tabelle 2 gezeigt wird, weisen die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, daß die Anti- RIBS monoklonalen-Antikörper im wesentlichen nicht mit nicht aktivierten Thrombozyten eine Immunreaktion eingehen. Wenn die Thrombozyten jedoch mit einem Agonisten wie ADP oder Thrombin stimuliert werden, erhält man eine signifikante Immunreaktion der MAb's mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa- Komplex auf den Zellen. Die Stimulation von Thrombozyten mit ADP oder Thrombin führt zur Sezernierung und Oberflächenbindung durch GPIIb-IIIa des thrombozyten-endogenen Fibrinogens. Die Zugabe von exogenem Fibrinogen neutralisierte (inhibierte) die Bindung von ¹²&sup5;I-MAb an stimulierte Thrombozyten nicht und zeigte damit, daß MAb's RIBS-spezifisch sind, sprich sie gehen nicht mit frei in Lösung befindlichem Fibrinogen eine Immunreaktion ein. Ähnliche Resultate erhielt man auch mit MAb 4G10. TABELLE 2
Um den Punkt zu betonen, daß exogen zugefügtes Fibrinogen nicht zellgebunden ist (sprich nicht Teil des Zell-Rezeptor-Liganden-Komplexes ist), aber dennoch nicht die Immunreaktivität der MAb's 2G5, 2F10, 3G11 und 4G10 mit dem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex neutralisiert, wurde die Immunreaktivität der MAb's mit den Thrombozyten untersucht, wobei thrombozytenreiches Plasma, das 2-3 mg/ml Fibrinogen enthielt, verwendet wurde.
Wie unten in Tabelle 3 gezeigt wird, geht trotz des großen Überflusses an freiem Fibrinogen jeder der 4 ¹²&sup5;I-MAb's eine Immunreaktion mit Fibrinogen: GPIIb-IIIa-RIBS auf der Thrombozyten-Oberfläche ein. TABELLE 3
Als weiteres Anzeichen für die Spezifität der 4 hinterlegten MAb's für RIBS wurden ähnliche MAB Bindungsstudien durchgeführt, wobei Zellen, die einen MAC-1-Rezeptor enthielten, den Thrombozyten mit dem GPIIb-IIIa Thrombozyten-Glykoprotein-Rezeptor vorgezogen wurden. Sowohl Mac-1 als auch GPIIb-IIIa binden spezifisch auf Rezeptor-Liganden-Art an Fibrinogen, aber die zwei Wechselwirkungen bewirken unterschiedliche biologische Ergebnisse. In den Bindungsstudien zeigten die 4 hinterlegten RIBS keine Immunreaktion mit Fibrinogen-MAC-1-Komplex, aber gingen eine Immunreaktion mit Fibrinogen in einem Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex ein.
Das bedeutet, die 4 MAb's, die getestet wurden, gehen spezifisch mit RIBS auf Fibrinogen, die in einem Komplex mit GPIIb-IIIa exprimiert werden, eine Immunreaktion ein, jedoch nicht mit RIBS auf Fibrinogen, wenn dieses mit Mac-1 einen Komplex bildet.

3. Verhinderung von Thrombozyten-Aggregation durch RIBS-Antikörper

Zweihundert ul isolierter Thrombozyten, die wie in Beispiel 2 vorbereitet wurden, wurden vermischt mit 190 ul Tyrode's-Puffer, welcher BSA und Dextrose (jeweils 1 mg/ml), Fibrinogen (1 mM), Calcium (5 mM) und ein Fab-Fragment von MAb 2F10 enthielt, das wie in Beispiel 2 vorbereitet wurde und in unterschiedlichen Mengen, wie unten in Tabelle 4 aufgezeigt wird, vorhanden war. Zehn ul ADP (80 uM in Tyrode's-Puffer) wurden dann beigesetzt, um die Thrombozyten-Aggregation zu stimulieren. Die Mischung wurde bei 37ºC gehalten, während Änderungen in der Lichtdurchlässigkeit der Mischung über die Zeit beobachtet wurden, wobei eine Dual-Proben-Aggregations-Messvorrichtung (Modell DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO) benutzt wurde.
Zur Kalibrierung der Aggregations-Messvorrichtung wurde eine Lösung, die 200 ul PRP und 200 ul von Tyrode's Puffer enthielt, benutzt, um eine niedrige Grundlinie der Lichtdurchlässigkeit bei 5% für Kontroll-Aggregationen und bei 10% für Aggregationen in der Gegenwart von Antikörpern festzulegen. Die obere Grenze von 100% Lichtdurchlässigkeit wurde einheitlich unter Verwendung einer Mischung von 100 ml PRP und 300 ul Tyrode's Puffer festgelegt.
Die Ergebnisse, die bei der Messung der Inhibition der Thrombozyten-Aggregation durch Antikörper erhalten wurden, werden in Tabelle 4 gezeigt und werden als Prozent der Lichtdurchlässigkeit (100%) ausgedrückt, die in Abwesenheit von Antikörper bei Messung etwa 3 bis 4 Minuten nach der Beisetzung von ADP erhalten werden.

TABELLE 4

Inhibition der Thrombozyten-Aggregation durch Mab 2F10

Fab-Konzentration Prozent Durchlässigkeit
0 uM 100
0,25 uM 79
0,5 uM 62,5
1,25 uM 34,5
1,87 uM 17,5
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß das MAb-2F10-Fragment eine dosisabhängige Inhibition der Thrombozyten-Aggregation erzeugt. So zeigen die Resultate die effektiven Dosierungen, die brauchbar sind, um Thrombozyten-Aggregation und Prozesse, die Thrombozyten-Aggregation beinhalten, wie z. B. Thrombusbildung, zu verhindern, wenn Antikörper der vorliegenden Erfindung benutzt werden, die mit einer RIBS, die spezifisch für den Fibrinogen : GPIIb-IIIa-Komplex ist, eine Immunreaktion eingehen.

4. Eigenschaften von 2G5-Mab

Der monoklonale Antikörper, der 2G5 genannt wird, ist ein IgG der τ&sub1;-Unterklasse mit einer leichten Kappa-Kette. Die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung des gereinigten Antikörpers sind anderswo beschrieben worden [Zamarron et al., Thromb. Haemost., 64 : 41 (1990)]. Der gereinigte Antikörper wurde mit Biotin-N-Hydroxysuccinimid-Ester (Calbiochen, La Jolla, CA) in Übereinstimmung mit Standardprozeduren [Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem., 27 : 1131 (1979)] und mit ¹²&sup5;I durch eine modifizierte Chloramin-T-Prozedur [McConahey et al., Int. Arch. Allergy Apl. Immunol., 29 : 181 (1966)] zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 1 uCl/pg markiert. Fab-Fragmente des Antikörpers wurden durch Papain-Verdau (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) mit einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1 : 100 (2/2) für 6 Stunden bei 37ºC hergestellt [Porter, Biochem. J., 73 : 119 (1959)]. Unverdaute Antikörper und Fc-Fragmente wurden durch Chromatographie auf Protein-A-Sepharose beseitigt (Pharmacia, AB, Uppsala, Schweden). Der vollständige Verdau des Antikörpers und die Reinheit der Fab-Aufbereitung wurden durch SDS-PAGE bestätigt. Andere monoklonale Antikörper gegen Fibrinogen, die in dieser Studie benutzt werden, wurden von Mäusen, die mit Fibrin-D-Dimer immunisiert wurden, gewonnen, und wurden aus Ascites-Flüssigkeit durch dasselbe Protokoll wie für 2G5 gereinigt.
Fibrinogen wurde aus frischem, menschlichen Blut durch differentielle Ethanol-Präzipitation gereinigt [Doolittle et al., Arch. Biochem. Biophys., 118 : 456 (1967)] und wurde mit ¹²&sup5;I, wie zuvor beschrieben, radiomarkiert [McConahey et al., Int. Arch. Allergy Apl. Immunol., 29 : 181 (1966)]. Der Plasmin-Verdau von Fibrinogen wurde entsprechend beschriebener Protokolle durchgeführt (Veradi et al., Biochemistry, 25 : 519 (1986)]. Fibrinogen (2 mg/ml) in 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,4, das 5 mM Ca²&spplus; enthält, wurde zuerst mit Plasmin, welches durch Zugabe von Plasminogen hergestellt wurde (20 ug/ml, endgültige Konzentration), und Streptokinase (Sigma) (200 Einheiten/ml, endgültige Konzentration) für eine Stunde bei 37ºC verdaut. Die vorherrschenden Arten innerhalb dieses Verdaus, D100 (Fragmente von annähernd 100,000 Molekulargewicht) wurden durch Affinitäts-Chromatographie auf einer 2G5- Säule isoliert (siehe unten). Zusätzlicher Verdau wurde erhalten, indem die Probe in den Tris-Puffer mit 5 mM EGTA {[Ethylen-Bis(Oxyethylennitrilo)]tetraessigsäure} anstelle von 5 mM Ca²&spplus; dialysiert und mit der Plasminogen/Streptokinase-Mischung für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert wurde. Für ausgesuchte Experimente wurde das isolierte D100 in Abwesenheit von Ca²&spplus; mit Plasmin für 24 Stunden bei 37ºC weiter verdaut, Supplementiert mit einer zweiten Zugabe von Plasmin nach 8 Stunden. Die Proteolyse wurde durch die Beigabe von Trasylol (FBA Pharmaceutical, New York, NY) (200 Kallikrein Inhibitor- Einheiten/ml) beendet.

5. Thrombozyten-Bindungs-Studien

Thrombozyten wurden von frischem menschlichen Blut durch Differential-Zentrifugation, die von Gel- Filtration auf Sepharose-2B in divalentem, Ionenfreien Tyrode's-Puffer, pH 7,3, welcher 0,1% Rinderserum-Albumin enthielt, isoliert [Marguerie et al., J. Biol. Chem., 255 : 154 (1980)]. Die Bindung des Antikörpers an die Thrombozyten wurde wie folgt durchgeführt. Thrombozyten wurden mit einer Konzentration von 1 · 10&sup8;/ml in einem divalenten, Ionenfreien Tyrode's-Puffer suspendiert.
CaCl&sub2;, in einer endgültigen Konzentration von 1 mM, und das Stimulans, 10 uM ADP oder 0,5 Einheiten/ml α-Thrombin, wurden den Thrombozyten zugegeben. Wurde Thrombin als das Stimulans verwendet, wurden 30 nM D-Phenylalanyl-L-Prolyl-Argininketon (Calbiochem) 5 Minuten nach der Zugabe von Thrombin zugegeben, um das Enzym zu inaktivieren. ¹²&sup5;I-markierter Antikörper wurde dann in einer mit 0,1 uM endgültigen Konzentration zugegeben, und die Bindung wurde in der Abwesenheit oder der Anwesenheit von 1 uM Fibrinogen bestimmt. In parallelen Experimenten wurde die ¹²&sup5;I- Fibrinogen-Bindung an die Zellen, mit dem Liganden bei 0,3 uM wie beschrieben gemessen [Marguerie et al., J. Biol. Chem., 255 : 154 (1980)]. Die thrombozyten-gebundenen Liganden wurden von den freien Liganden durch Zentrifugation von 50 ul Aliquots der Reaktionsmischung durch 20% Saccharose getrennt und die Moleküle des gebundenen Liganden wurden aufgrund ihrer spezifischen Aktivität berechnet.

6. Thrombozvten-Bindungs-Studien

Thrombozyten (1 · 10&sup8;/ml) wurden bei 37ºC in der Anwesenheit von menschlichem Fibrinogen (0,3 uM) und CaCl&sub2; (1 mM) gerührt. Unterschiedliche Konzentrationen (von 0 bis 2 uM) von 2G5, seinen Fab- Fragmenten oder einem einer Unterklasse zugehörigen Kontroll-Antikörper wurden dann zugegeben und die Aggregation durch die Zugabe von 10 uM ADP angeregt. Die Aggregation wurde als Änderung der Lichtdurchlässigkeit durch die Thrombozyten-Suspension beobachtet, wobei eine Dual-Proben- Aggregations-Messvorrichtung (Sienco Inc., Morrison, CO) verwendet wurde.

7. Enzym-gebundenes Immunoabsorbens Assay (ELISA)

Polyvinyl-Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit 100 ul Protein mit einer Konzentration von 2 ug/ml über nacht bei 4ºC überzogen. Die Platten wurden anschließend mit PBS (0,25 M NaCl, 0,01 M Phosphat- Puffer, pH 7,3) welches 1% Rinderserum-Albumin enthielt, erneut überzogen, dann mit PBS-0,05%- Tween-20 gewaschen und dann 2 Stunden lang mit dem Antikörper in entweder unmarkierter oder biotinylierter Form inkubiert. Die Platten wurden dann mit dem PBS-Tween-20 ausführlich gewaschen und mit einem zweiten Antikörper oder Avidin, welches mit alkalischer Phosphatase (Calbiochem) konjugiert war, für eine Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Bindung unter Verwendung des Substrates P-Nitrophenylphosphat und Messung der Absorption bei 405 nm quantifiziert. Wenn Kompetitionsexperimente durchgeführt wurden, wurde der Kompetitor für 15 Minuten bei 22ºC mit dem Antikörper inkubiert, bevor er den Vertiefungen der Mikrotiter-Platten zugegeben wurde.

8. Peptid-Synthese und Protein-Sequenzierung

Peptide, die sequentiell mit Segmenten der Fibrinogen-Gamma-Kette übereinstimmten, wurden durch Fest-Phase-Synthese auf einem Applied-Biosystems Peptid-Synthesizer, Modell 430 (Foster City, CA) hergestellt, indem Phenylacetamidomethyl-Harze und t-Butoxycarbonyl-Aminosäuren, die von Applied Biosystems erworben wurden, benutzt wurden. Die Peptide wurden auf ihre Homogenität hin durch HPLC analysiert, wobei eine C18-u-Bondapak-Säule mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure benutzt wurde, und es wurde festgestellt, daß sie zu über 85% homogen waren. Die Aminosäure-Zusammensetzungen der Peptide wurden auf 24-Stunden Hydrolysaten in 6 N HCl bestimmt, und die Ergebnisse stimmten mit den theoretischen Vorgaben überein.
Proteinsequenzen wurden für ausgewählte Banden bestimmt, die durch Coomassie-Blau-Färbung an SDS-PAGE identifiziert wurden. Die interessanten Banden wurden aus den Gels ausgeschnitten und einer NH&sub2;-terminalen Sequenzierung direkt in einem Gas-Phasen-Sequenator (Applied Biosystems Modell 475A) wie beschrieben unterzogen [Matsudaira, J. Biol Chem, 262 : 10035 (1987)]. Die Anordnungen der Aminosäure-Sequenzen der individuellen Ketten von menschlichen, Rinder- und Ratten-Fibrinogen wurden von Rixon et al., Biochemistry, 22 : 3237 (1983), Chung et al., Biochemistry, 22 : 3244 (1983), Chung et al., Biochemistry, 22 : 3250 (1983), Crabtree et al., Cell, 31 : 159 (1982) und aus der Genbank-Datensammlung erhalten.

9. Analytische Vorgehensweisen

Affinitäts-Chromatographie auf 2G5 wurde den Anweisungen des Herstellers folgend durch Paarung des gereinigten Antikörpers mit CNBr-aktivierter Sepharose-4B (Pharmacia) durchgeführt. Der Grad der Substitution war 1 mg gebundener Antikörper auf 1 ml von abgesetztem Gel. Affinitäts-Chromatographie wurde auf einer 1,1 · 4,5 cm Säule durchgeführt, die in PBS-0,04%-Azid bei 22ºC äquilibriert war. Die Probe wurde auf die Säule verbracht und gebundenes Material wurde mit 1 M Ammoniumhydroxid (pH 11,5) ausgewaschen. SDS-PAGE wurde auf vertikalen Slab-Gels im Puffersystem von Laemmli durchgeführt [Laemmli, Nature, 227 : 280 (1970)]. Für Western-Immunoblot-Analysen wurden Proteinproben durch SDS-PAGE erneut gelöst und elektrophoretisch auf Immobilon-PVDF-Membranen (Millipore, Bedford, MA) übertragen. Die Übertragungen wurden mit dem Antikörper in einer biotinylierten Form (5 ug/ml) versehen und die Reaktionen wurden mit alkalischer Phosphatase, die mit Avidin (Calbiochem) konjugiert war, und den Enzymsubstraten Bromchlorindolylphosphat und Nitroblautetrazol (Sigma) sichtbar gemacht. Dot-Blot-Analysen wurden durch Gabe eines Tropfens der Proteinlösung direkt auf die Immobilon-Membran durchgeführt. Die Antikörper-Reaktivität mit dem absorbierten Protein wurde wie beschrieben sichtbar gemacht [Zamarron et al., Thromb. Haemost., 64 : 41 (1990)].

10. Diskussion der Beispiele 1-9

Expression von RIBS durch thrombozyten-gebundenes Fibrinogen, das durch 2G5 erkannt wurde

In einer vorherigen Studie [Zamarron et al., Thromb. Haemost., 64 : 41 (1990)] wurde demonstriert, daß der 2G5 monoklonale Antikörper mit Fibrinogen, das auf einer Plastik-Mikrotiter-Platte oder Filterpapier immobilisiert war, reagierte, aber daß 2G5 nicht mit gelöstem Fibrinogen reagierte. Die ursprüngliche Frage, die in der vorliegenden Studie gestellt wurde, war, ob die Bindung von Fibrinogen an GPIIb-IIIa, seinem Rezeptor auf der Oberfläche von Thrombozyten, auch das erkannte Epitop freilegte; sprich, ob die Rezeptorbesetzung die Konformationsänderung innerhalb des Fibrinogenliganden hervorruft, um ein RIBS-Epitop freizulegen.
Abb. 1 zeigt die Bindung von radio-markiertem Antikörper an gewaschenen menschlichen Thrombozyten unter Bedingungen, die in einer variablen Besetzung des GPIIb-IIIa mit Fibrinogen resultiert. Fibrinogen bindet minimal an nicht stimulierte Thrombozyten und dem Antikörper gelang es ebenfalls nicht, an die Zellen in der Anwesenheit oder der Abwesenheit von exogen beigegebenem Fibrinogen zu binden. ADP-Stimulation der Thrombozyten transformiert GPIIb-IIIa von einem latenten Zustand in einen Zustand, in dem es fähig ist, Fibrinogen zu binden. Stimulation von Thrombozyten in der Abwesenheit von Fibrinogen rief nur eine leichte Zunahme von Antikörperbindung hervor.
Wenn Fibrinogen jedoch anwesend war, konnte reichlich Antikörperbindung an die ADP-stimulierten Zellen beobachtet werden. Die Zunahme von Antikörperbindung zu ADP-stimulierten Thrombozyten in der Anwesenheit von Fibrinogen war annähernd 17-fach. Unter denselben experimentellen Bedingungen war diese Zunahme bei Gebrauch von Thrombozyten von drei verschiedenen Spendern (17,2 ± 2,4)- fach. Wenn man bedenkt, daß nur 0,1% des beigegebenen Fibrinogens in der Mischung thrombozyten- gebunden ist, ist die Bindung von Antikörper an zellgebundenes Fibrinogen hochselektiv. Die Wiedererkennung von thrombozyten-gebundenem Fibrinogen trat ebenfalls auf, wenn die Zellen mit einem anderen Agonisten (Thrombin) stimuliert wurden. Thrombin-stimulierte Thrombozyten banden ebenfalls an den Antikörper in Anwesenheit von exogen beigegebenem Fibrinogen. Eine geringe Bindung von Antikörper an thrombin-stimulierte Thrombozyten war sogar in Abwesenheit von beigegebenem Fibrinogen zu beobachten und beleuchtet möglicherweise die Bindung des Antikörpers an endogenes Fibrinogen, welches sezerniert und an GPIIb-IIIa auf der Zelloberfläche gebunden wird [Courtois et al., Eur. J. Biochem., 159 : 61 (1986)]. Zusammengefaßt zeigen diese Beobachtungen, daß die Bindung von Fibrinogen an GPIIb-IIIa an Thrombozyten das von 2G5 erkannte Epitop freilegt.

Wirkung von 2G5 auf die Thrombozyten-Aggregation

Die Bindung von Fibrinogen an seinen Thrombozyten-Rezeptor ist ein notwendiger Schritt für die Thrombozyten-Aggregation. In ersten Studien wurde die Wirkung von intaktem 2G5 auf diese Zell-Zell- Interaktion analysiert, wobei gewaschene Thrombozyten, die in der Anwesenheit von beigegebenem Fibrinogen mit ADP stimuliert worden waren, benutzt wurden. Wie unten in Tabelle 5 gezeigt wird, verhinderte 2G5 bei einer endgültigen Konzentration von 1 uM vollständig die Thrombozyten- Aggregation. Drei andere Antikörper gegen Fibrinogen wurden als Kontrollen getestet. Zwei dieser Antikörper, Anti-Fg-88 und Anti-Fg-85, hatten keine Wirkung auf die Thrombozyten-Aggregation. Der dritte Kontroll-Antikörper, Anti-Fg-128, verhinderte die Thrombozyten-Aggregation ebenfalls. Die Grundlage für die inhibitorische Aktivität von Anti-Fg-128 kann seiner Inhibition der Fibrinogenbindung an die Thrombozyten zugesprochen werden, sprich, bei einer Konzentration von 0,6 uM, blockierte Anti-Fg- 128 die ¹²&sup5;I-Fibrinogen-Bindung. TABELLE 5 Wirkung von Fibrinogen-Antikörpern auf die Thrombozyten-Aggregation und die Fibrinogen-Bindung an Thrombozyten
ND = nicht nachweisbar
Die Wirkung von 2G5 auf die Thrombozyten-Aggregation wurde weitergehend untersucht. Fab- Fragmente des Antikörpers behielten die Fähigkeit, die Thrombozyten-Aggregation zu verhindern. Die inhibitorische Aktivität der Fab-Fragmente war dosisabhängig und die vollständige Inhibition dieser funktionellen Antwort wurde bei einer Konzentration von 2 uM der Fragmente erhalten. Die Fab- Fragmente interferierten nicht mit der Thrombozyten-Stimulation, wie durch das Auftreten einer Thrombozyten-Formänderung angezeigt, trotz der Verminderung der folgenden Aggregationsantwort.

Lokalisation des 2G5-Epitops

Das 2G5-Epitop wird, wie vorher gezeigt, durch die Fibrinogen-Gamma-Kette und durch das Plasmin- Abbauprodukt D100 von Fibrinogen mit hohem Molekulargewicht (Mr = 100,000) exprimiert [Zamarron et al., Thromb. Haemost., 64 : 41 (1990)]. Das bedeutet, das Epitop befindet sich innerhalb des Gammaketten-Segments der D-Domäne von Fibrinogen. Es wurde nachgewiesen, daß D100 in 2 Formen vorkommt, DIA und D1, die sich nur in den aminoterminalen Resten ihrer Gammaketten- Segmente unterscheiden. Beide diese D100-Fragmente enthalten das Carboxy-Ende der Gammakette (Rest 411), wobei DIA jedoch bei Gamma-65 beginnt, während D1 bei Gamma-85 beginnt [Veradi et al., Biochemistry, 25 : 519 (1986)].
Als erster Schritt war es erwünscht, festzustellen, ob das erkannte Epitop von dem Gamma-Segment 65- 85 abhängt. Fibrinogen wurde mit Plasmin in der Anwesenheit (Verdau 1) oder Abwesenheit von Ca²&spplus; (Verdau 2) verdaut. Diese Verdauungen wurden einer Affinitäts-Chromatographie auf immobilisiertem 2G5 unterzogen, um Durchfluß (F1 und F2 aus Verdau 1 bzw. 2) und gebundene Anteile (B1 und B2), die bei basischem pH-Wert eluiert wurden, zu liefern. Diese Fraktionen wurden SDS-PAGE analysiert und nach dem elektrophoretischen Transfer mit Coomassie-Blau gefärbt oder einem Western- Immunoblot unterworfen. Nur die Klasse der D-Fragmente mit dem höchsten Molekulargewicht reagierte mit 2G5 auf der Affinitäts-Säule und durch Immunoblot. Obwohl D-Fragmente mit einem niedrigeren Molekulargewicht von Mr = 85,000-91,000 in dem Verdau 2 festgestellt wurden, reagierten diese nicht mit dem Antikörper und verifizierten damit die Beschränkung des Epitops auf D100. Wenn B1 und B2 unter reduzierenden Bedingungen SDS-PAGE unterworfen wurden, zeigten sie ein ähnliches Muster: ein Duplikat von Mr = 40,000 (die Beta- und Gamma-Ketten-Reste) und ein einzelnes Band von Mrt4,000 (der Alpha-Ketten-Rest), was mit den beschriebenen Berichten übereinstimmt [(Veradi et al., Biochemistry, 25 : 519 (1986); Southan et al., J. Biol. Chem., 260 : 13095 (1985)].
Die Mr = 40,000 Banden wurden aus den Gels ausgeschnitten und einer NH&sub2;-terminalen Aminosäure- Sequenzanalyse unterzogen. Die erhaltenen Sequenzen dabei waren: AIQLTY und SRKML für die Mr = 40,000 Banden aus den B1- bzw. B2-Fraktionen. Beide Sequenzen werden in der Fibrinogen- Gamma-Kette gefunden, die erste Sequenz korrespondiert mit den Gamma-Ketten-Resten 65 bis 70 und die zweite mit den Resten 85-89. Die Sequenz DNENV war ebenfalls vorhanden, welche mit den Resten 134-138 der Fibrinogen-Beta-Kette korrespondiert. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß das Epitop, das durch 2G5 erkannt wird, nicht innerhalb von Gamma 65-85 liegt. Außerdem zeigt die Unfähigkeit der D-Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht, mit dem Antikörper zu reagieren, an, daß die Carboxyterminalen Aspekte der Gamma-Kette für die Epitop-Expression intakt sein müssen [Veradi et al., Biochemistry, 25 : 519 (1986)].
In nachfolgenden Experimenten wurden die gebundenen Fraktionen der Affinitäts-Säule einem weiteren Verdau mit Plasmin unterworfen, um sicherzustellen, daß das gesamte D100 zu Formen mit niedrigerem Molekulargewicht abgebaut wurde. Dieser Verdau wurde dann wieder auf die Affinitäts-Säule gegeben und das gebundene Material bei basischem pH-Wert eluiert. Das Chromatogramm, beobachtet bei 280 nm, wird in Abb. 2A gezeigt. Der Großteil des auf die Säure applizierten Materials wurde als gebundene Fraktion zurückgewonnen. Dennoch wurden bei der Analyse mit SDS-PAGE (7,5-20% Gradient Acrylamid-Gels) keine Coomassie-Blau gefärbten Banden entdeckt. Das gebundene Material wurde dann gesammelt, mit Phosphorsäure neutralisiert, und durch HPLC auf einer Umkehr-Phase- Vydac-C18-Säule fraktioniert. Das HPLC-Profil, beobachtet bei 280 nm, wird in Abb. 2B gezeigt. Es wurde nur ein größerer Peak mit einer Retentionszeit von ungefähr 4 Minuten entdeckt.
Fraktionen von verschiedenen Elutionszeiten wurden gesammelt, lyophilisiert, erneut in PBS aufgelöst und dann auf ihre Fähigkeit, die Bindung von 2G5 an immobilisiertes Fibrinogen zu verhindern, in einem ELISA-Assay getestet. Die einzige Fraktion (Nr. 1) mit inhibitorischer Aktivität korrespondierte mit derjenigen, die von der HPLC-Säule bei 4 Minuten eluiert wurde, und welche den 280 nm Absorptions- Peak enthielt. Als Kontrolle wurde der Elutions-Puffer der Affinitäts-Säule mit Phosphorsäure neutralisiert und auf die HPLC-Säule gegeben. Als die Fraktion, die mit Nr. 1 äquivalent war, gesammelt und in dem ELISA-Assay getestet wurde, wurde keine inhibitorische Aktivität festgestellt. In diesem Assay behielt der Plasmin-Verdau von D100 Aktivität bei und verifizierte dadurch die Stabilität des Epitops RIBS-I während des weiteren Plasmin-Verdaus.
Die ausgewählte HPLC-Fraktion wurde dann einer NH&sub2;-terminalen Aminosäure-Sequenzanalyse unterzogen. Obwohl die Ausbeute gering war (im 1-2 pMol-Bereich), was andeutet, daß eine gewisse Blockade während der Verarbeitung aufgetreten war, wurde die folgende Sequenz erhalten: GGTY. Diese vier Reste korrespondieren mit 351-354 auf der Fibrinogen-Gamma-Kette. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß 2G5 in einem Segment in Richtung des Carboxy-Endes der Gamma-Kette von Rest 351 lokalisiert ist.

Synthese des 2G5-Epitops

Um die Lokalisation des 2G5-Epitops zum Carboxyterminalen Bereich der Fibrinogen-Gamma-Kette zu verifizieren und seine Struktur weiter zu definieren, wurde eine Anzahl überlappender Peptide synthetisiert, die mit den Resten 340411 der Gamma-Kette korrespondierten. Zunächst wurde die direkte Bindung des Antikörpers an diese Peptide bewertet. Mikrotiter-Platten wurden mit den Peptiden (10 ug/ml in PBS) ausgekleidet und die Bindung von 2G5 (50 ug/ml) wurde durch Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten zweiten Antikörpers festgestellt. Wie unten in Tabelle 6 gezeigt wird, reagierte der Antikörper stark mit zweien der Peptide, P3 und P4. Diese Peptide überlappen sich und korrespondieren mit den Resten 365-383 (P3) und 373-385 (P4) der Gamma-Kette. Ein monoklonaler Kontroll-Antikörper gegen GPIIb-IIIa war nicht in der Lage, mit diesen oder irgendeinem der anderen Peptide zu reagieren. Außerdem wurde die Spezifität der 2G5-Bindung an P3 und P4 demonstriert, als die Reaktion mit löslichem D100 oder seines weiteren Plasmin-Verdaus inhibiert wurde; für P4 waren die IC50-Werte für D100 und seinem Plasmin-Verdau 150 ug/ml bzw. 30 ug/ml. TABELLE 6 Reaktivität von 2G5-Mab mit synthetischen Peptiden*
* Die Reaktivität des 2G5-Antikörpers mit den auf Mikrotiter-Platten immobilisierten Peptiden wurde in einem ELISA-Format beurteilt. Ergebnisse werden als die Absorption bei 405 nm ausgedrückt.
In einer Folge von Experimenten wurden Mikrotiter-Platten mit affinitätsgereinigtem D100 ausgekleidet und die Fähigkeit der synthetischen Peptide, die Bindung von 2G5 an dieses Fragment zu verhindern, wurde beurteilt. P4 verhinderte die Antikörper-Bindung an immobilisiertes D100, wohingegen P2 keine Wirkung zeigte. (P3 verhielt sich ungewöhnlich, es verstärkte die Reaktion eher, als sie zu verhindern, oder es hatte keinen Einfluß auf die Reaktion, vermutlich wegen der Bindung des P3-Peptids an das immobilisierte Fragment.) Die inhibitorische Aktivität von P4 war der bei löslichem D100 oder bei seinem weiteren Plasmin-Verdau beobachteten sehr ähnlich.
Es wurde auch gezeigt, daß das P4-Peptid mit 2G5 bei Affinitäts-Chromatographie reagiert. P4 (1 mg in 1 ml PBS) wurde auf die Antikörpersäule gegeben und nach reichlichem Waschen der Säule wurde das gebundene Peptid bei basischem pH-Wert eluiert und seine Rückgewinnung quantifiziert. Basierend auf seiner Absorption bei 280 nm wurde geschätzt, daß 44 uMol Peptid an die Säule gebunden waren. Unter der Annahme, daß alle 26 uMol des Antikörpers in der Säule vollständig funktionstüchtig waren, näherte sich die Rückgewinnung von Peptid der theoretischen Grenze von 2 Mol gebundenem Peptid pro Mol Antikörper. Als das P2-Peptid unter den gleichen Bedingungen zu der Säule gegeben wurde, wurde kein nachweisbares Material von der Säule eluiert. Als P4 ebenfalls zu einer Albumin-Sepharose-Säule gegeben wurde, wurde außerdem auch kein Peptid an die Säule gebunden.

Die Rolle spezifischer Aminosäuren und Protein-Konformationen bei der Etablierung des 2G5-Epitops

Eine Analyse der Reaktivität von 2G5 mit Rinder- und Ratten-Fibrinogen gab Aufschluß über die Feinstruktur-Anforderungen für das RIBS-I-Epitop. Bei der Dot-Blot-Analyse reagierten Rinder- und Ratten-Fibrinogen nicht mit dem Antikörper, wenn er mit 1 mg/ml dem Filterpapier zugegeben wurde, während eine Reaktion mit menschlichen Fibrinogen in derselben Analyse bei 10 ug/ml nachgewiesen werden konnte.
Wie in Tabelle 7 gezeigt wird, weist der Vergleich der P4-Sequenz der Gamma-Kette, Lys373-Lys385, mit den korrespondierenden Sequenzen in den Ratten- und Rinder-Fibrinogen-Gamma-Ketten nur einzelne Unterschiede in den Aminosäuren auf: Lysin381 im menschlichen Fibrinogen wird durch Glutamin im Ratten-Fibrinogen ersetzt und Threonin374 im menschlichen Fibrinogen wird durch ein Serin im Rinder-Fibrinogen ersetzt.
Peptide, die mit den Ratten- und Rinder-Gamma-Ketten-Sequenzen korrespondierten, wurden synthetisiert, auf Mikroliter-Platten immobilisiert und ihre Reaktivität mit dem Antikörper in einem ELISA- Assay bestimmt. Weder das Ratten- noch das Rinder-Peptid reagierten mit dem Antikörper, während seine Reaktion mit dem menschlichen Peptid im selben Assay beobachtet wurde (Tabelle 7). Ein nicht verwandter Kontroll-Antikörper ergab weder ein nachweisbares Signal mit dem menschlichen Peptid, noch mit den zwei anderen Peptiden im selben Assay. TABELLE 7 Reaktivität von 2G5-MAb mit homologen Peptiden aus Menschen-, Ratten- und Rinder-Fibrinogen- Gamma-Ketten
* Die Bedingungen sind dieselben, unter denen die Studien, über die in Tabelle 6 berichtet wird, durchgeführt wurden.
Die Wirkung von Reduktion, Alkylierung und/oder Denaturierung bei der Expression des 2G5-Epitops in menschlichem Fibrinogen wurde ebenfalls analysiert. Wie beim Western-Immunoblot festgestellt wurde, blieb das Epitop erhalten, wenn das Molekül mit 6 M Guanidin-HCl denaturiert, mit Dithiothreitol reduziert, oder mit Iodacetat-Säure alkyliert wurde. Im Gegensatz dazu konnte das Epitop, wenn Fibrinogen in Gegenwart oder Abwesenheit von einem Denaturierungsmittel reduziert oder alkyliert wurde, nicht länger nachgewiesen werden. In einem Kontroll-Experiment wurde das synthetische P4- Peptid einer Reduktion und Alkylierung unter denselben Bedingungen unterzogen, die das Epitop in Fibrinogen verschwinden ließen. Die Reaktivität von behandeltem und unbehandeltem P4 mit 2G5 war bei Immobilisierung auf Mikroliter-Platten die gleiche. Das bedeutet, daß der Verlust des RIBS-I-Epitops in reduziertem und alkyliertem Fibrinogen von den Veränderungen herzurühren scheint, die außerhalb der linearen Lys373-Lys385-Sequenz auftreten.

Diskussion

GPIIb-IIIa kann in vielfachen, konformationsbezogenen Zuständen vorliegen [Plow et al., Progress in Hemostasis and Thrombosis, Bd. 9 (Coller, B. S., Hrsg.), Seiten 117-156 (1989)]. Bestimmte dieser konformationsbezogenen Übergänge werden durch Thrombozyten-Agonisten hervorgerufen, die GPIIb- IIIa von einem latenten Zustand in einen, in dem es fähig ist, Liganden zu binden, zu verändern. Andere konformationsbezogene Änderungen werden weiterhin durch Liganden-Bindung an den Rezeptor induziert, wie durch Änderungen in den biophysikalischen und spektralen Eigenschaften des besetzten Rezeptors [Parise et al., J. Biol. Chem., 262 : 12597 (1987)] und durch die Aufdeckung von RIBS- Epitopen nachgewiesen wird [Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263 : 12397 (1988); Frelinger et al., J.. Biol. Chem., 265 : 6346 (1990)]. Die Expression von RIBS-Epitopen weist daraufhin, daß der Ligand auch einer konformationsbezogenen Änderungen während der Bindung an den Rezeptor unterliegt und zeugt von der dynamischen Natur der Post-Rezeptor-Besetzungsvorgänge. So wie nun gezeigt wurde, daß Liganden-Bindung eine Vielzahl von RIBS-Epitopen aus dem gesamten GPIIb-IIIa hervorrufen kann [Frelinger et al., J. Biol. Chem., 265 : 6346 (1990)], ist es auch sinnvoll, die Hypothese aufzustellen, daß mehrere unterschiedliche RIBS-Epitope auftreten können, wenn Fibrinogen an diesen Rezeptor gebunden wird. 2G5 und 9F9 [Abrams et al., Blood, 75 : 128 (1990)] können zwei unterschiedliche Beispiele für RIBS-Epitope darstellen. Die logische Fortführung der RIBS-Hypothese beinhaltet die Möglichkeit, daß diese Epitope auf folgende Weise induziert werden könnten: 1) wenn andere Liganden, wie etwa Von-Willebrand-Faktor oder Fibronectin an GPIIb-IIIa binden; 2) wenn Fibrinogen an andere Integrine (wie etwa ανβ&sub3;[Cheresh et al., Cell, 58 : 945 (1989)]) oder MAC-1 [Altieri et al., J. Cell. Biol., 107 : 1893 (1988)] oder nicht-Integrin-Rezeptoren (Levesque et al., J. Biol. Chem., 265 : 328 (1990)] bindet; und 3) wenn Liganden an andere Integrine oder nicht-Integrin-Rezeptoren binden. Anfängliche Unterstützung für solche Vorhersagen kann durch den Nachweis erlangt werden, daß RIBS-Epitope durch eine Vielzahl von Liganden, die an GPIIb-IIIa binden und durch Ligandenbindung an Integrine, die sich von GPIIb-IIIa unterscheiden, hervorgerufen werden [Frelinger et al., J. Biol. Chem., 265 : 6346 (1990); O'Toole et al., Cell Regul., 1 : 883 (1990)].
Die durch 2G5 erkannte RIBS ist das erste RIBS-Epitop, das lokalisiert wurde. Das zu den Gamma- Ketten-Resten 365-383 korrespondierende Peptid P3 und das zu den Gamma-Ketten-Resten 373-385 korrespondierende Peptid P4 banden beide an 2G5. Das bedeutet, daß zumindest ein Teil des Epitops innerhalb der Reste 373-383 der Gammakette lokalisiert sein muß. Da das PS-Peptid, das zu den Resten 377-395 korrespondiert, nicht mit dem Antikörper reagierte, müssen die 4 Reste (373)KTRW(376) ein Schlüsselelement in der Definition des 2G5-Epitops sein.
Eine einzelne konservative Substitution eines Threonin zu einem Serin an einer Position, die zu Rest 374 korrespondiert, reicht aus, um Antikörper-Reaktivität zu verhindern. Die proteolytischen Fragmentations- Analysen beschränkten dieses Epitop auf die Region zwischen Rest 351 und dem Carboxy-Ende der Gammakette und bieten unabhängig Bestätigung für die Lokalisation. Trotz der Wichtigkeit der KTRW- Reste von Gamma 373-376 für die Antikörper-Reaktivität weißt das 2G5-Epitop beträchtlich mehr Komplexität auf. Eine Aminosäurerest-Substitution an der Position 381 verhinderte ebenfalls das Epitop. Außerdem trägt die sekundäre und tertiäre Struktur von Fibrinogen signifikant zu dem Epitop bei. So zerstörte die Reduktion und Alkylierung von Fibrinogen das 2G5-Epitop ebenfalls, obwohl das den reduzierenden und alkylierenden Wirkstoffen Aussetzen des P4 Peptids keinen Effekt auf die Reaktion des Antikörpers mit dem Peptid ergab. Diese Ergebnisse zeigen, daß zumindest eine der sekundären, tertiären und quaternären Struktur des Fibrinogens die Gamma 373-385 lineare Sequenz stabilisieren muß, und zwar in einer Konformation, die mit dem Antikörper eine Reaktion eingeht, oder daß eine zweite Region des Fibrinogens, die durch konformationsbezogene Faltung des Moleküls in die Nähe gebracht wird, auch ein Teil des Epitops sein kann.
Vorhersagen für die sekundäre Struktur [Chou et al., Biochemistry, 13 : 222 (1974)] weisen auf eine Transition von einer α-Helix zu einem β-Blatt hin, die bei Rest Lys373 beginnt und daß die Gammakette eine helikale Konformation bei Gly395 anzunehmen beginnt. Solche Transitionen der sekundären Struktur bilden oft Epitope in Proteinmolekülen [Todd et al., Trends Biochem. Sci., 7 : 212 (1982)]. Außerdem wird vorhergesagt, daß die Region in einem hydropathischen Auftrag [Hopp et al., Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 3824 (1981)] einen hydrophilen Charakter habe und damit dieses Kriterium für Antigenität erfüllt [Berzofsky, Science, 229 : 932 (1985)]. Das Vorhandensein von aromatischen Aminosäuren innerhalb einer hydrophilen Kette von Aminosäuren ist ein zusätzlicher Nachweis von Antigenität bei Peptiden [Appel et al., J. Immunol., 144 : 976 (1990)] und Gamma 373-383 enthält sowohl einen Tryptophan- als auch einen Tyrosin-Rest. Danach bildet Gamma 373-385 mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Epitop innerhalb des Fibrinogen-Moleküls. Dennoch ist diese Region für den 2G5 Antikörper im nativen Molekül nicht erreichbar. In Fibrinogen-Modellen, die auf Elektronenmikroskopie basieren [Weisel et al., Science, 230 : 1388 (1985)], scheint es, daß diese Region der Gammakette innerhalb einer globulären Domäne lokalisiert ist und daß diese Organisation den Zugang des Antikörpers zum Epitop erschweren könnte. Diese Interpretation beinhaltet bestimmte Implikationen in Bezug auf eine generelle Strategie für die Produktion von RIBS-Antikörpern. Sie weißt darauf hin, daß eine geänderte Form des Liganden, wie er z. B. durch milde Denaturierung bei begrenzter Proteolyse induziert wird, ein Format des Immunogens zur Hervorbringung von Anti-RIBS bereitstellen könnte. Im Falle der 2G5-RIBS brachte ein proteolytisches Fragment von Fibrinogen den Antikörper hervor.
Die Carboxy-terminale Region der Gammakette von Fibrinogen spielt eine wichtige Rolle in der Fibrin- Polymerisation, wie durch die Lokalisierung einzelner Aminosäure-Substitutionen innerhalb der Gamma- Region 275-330 von Fibrinogen mit Polymerisationsdefekten bewiesen wird [Terukina et al., Blood, 74 : 2681 (1989); Reber et al., Thromb. Haemost., 56 : 401 (1986); Reber et al., Blood, 67 : 1751 (1986); Bantia et al., Blood, 75 : 1659 (1990); Bantia et al., Blood, 76 : 2279 (1990)]. Zusätzlich weisen die Studien von Veradi und Scheraga [Veradi et al., Biochemistry, 25 : 519 (1986)] darauf hin, daß die Region Gamma 356-405 an der Fibrinpolymerisation beteiligt ist, obwohl die Proteinkonformation eine bedeutende Rolle beim Zustandekommen dieser Funktion spielt [Ciernewski et al., J. Biol. Chem., 261 : 9116 (1986)]. Die Fähigkeit des 2G5-Antikörpers, sowohl die Thrombozyten-Aggregation als auch die Fibrinpolymerisation zu inhibieren [Zamarron et al., Thromb. Haemost., 64 : 41 (1990)], weist auf eine zuvor nicht beobachtete Verbindung zwischen den zwei Funktionen des Fibrinogenmoleküls hin. In dem einfachsten Modell für Thrombozyten-Aggregation geht ein einziges Fibrinogenmolekül aufgrund seiner dimeren Struktur und seiner vielfältigen GPIIb-IIIa-interaktiven Stellen direkt zwischen Rezeptoren auf benachbarten Thrombozyten eine Brückenbindung ein und induziert dadurch deren Aggregation. Solch ein Modell der direkten Brückenbindung ist nicht in der Lage, zu erklären, warum bestimmte Thrombozyten-Aufbereitungen (formaldehyd-fixiert [Peerschke et al., Blood, 57 : 663 (1981) oder refraktorische Thrombozyten [Peerschke, J. Lab Clin. Med., 106 : 111 (1985)]) nicht in der Lage sind, zu aggregieren, trotz ihrer normalen Bindung von Fibrinogen an GPIIb-IIIa. Diese Ungereimtheiten mit dem Modell der direkten Brückenbildung weisen darauf hin, daß Ereignisse nach der Rezeptorbesetzung für die Thrombozyten-Aggregation notwendig sein könnten.
Obwohl die vorliegende Erfindung, um für Klarheit zu sorgen, ausführlich durch Illustration und Beispiel beschrieben wurde, ist es klar, daß bestimmte Änderungen innerhalb der dem Umfang beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Polypeptid, das bis zu etwa 40 Aminosäurereste umfasst einschließlich einer Aminosäurerestsequenz mit der Formel:

Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys.

2. Polypeptid, das bis zu etwa 20 Aminosäurereste umfasst einschließlich einer Aminosäurerestsequenz, die der Formel

Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys entspricht.

3. Polypeptid gemäß Anspruch 2 mit der Formel:

H-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys-OH.

4. Polypeptid, das bis zu etwa 40 Aminosäurereste umfasst einschließlich einer Aminosäurerestsequenz mit der Formel:

Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr- Thr.

5. Polypeptid, das bis zu etwa 20 Aminosäurereste umfasst einschließlich einer Aminosäurerestsequenz, die der Formel

Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr- Thr entspricht.

6. Polypeptid gemäß Anspruch 5 mit der Formel:

H-Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys- Thr-Thr-OH.

7. Polypeptid-Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen Arzneimittelträger umfasst.

8. Methode zur Herstellung eines Antikörpers, die die Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 als Immungen umfasst.

9. Methode gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper keine wesentliche Immunreaktion mit nicht aktivierten menschlichen Thrombozyten zeigt.

10. Methode gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper in Gegenwart eines Thrombozyten-Fibrinogen-Komplexes keine wesentliche Immunreaktion mit menschlichem Fibrinogen zeigt.

11. Methode gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper eine Immunreaktion mit einem Thrombozyten-Fibrinogen-Komplex eingeht.

12. Polypeptid gemäß Anspruch 1 zur Hemmung der Immunreaktion eines Antikörpers mit einem Thrombozyten-Fibrinogen-Komplex in einem Patienten.

13. Methode zum Nachweis eines Antikörpers in einer Lösung, die diesen Antikörper umfasst, wobei der Antikörper eine Immunreaktion mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 eingeht, wobei die Methode umfasst, daß:

die Lösung mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 in Verbindung gebracht wird, wobei dieses Polypeptid auf einer Oberfläche immobilisiert ist,

der Antikörper so lange mit dem Polypeptid in Kontakt gehalten wird, daß sich ein Antikörper-Polypeptid-Immunkomplex bilden kann und

das Vorhandensein des entstandenen Immunkomplexes und somit das Vorhandensein des Antikörpers in der Lösung nachgewiesen wird.

14. Methode zur Isolierung eines Antikörpers, der mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 eine Immunreaktion eingeht, wobei diese Methode umfasst, daß

eine Lösung, die den Antikörper umfasst, mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 in Verbindung gebracht wird, wobei dieses Polypeptid auf einer Oberfläche immobilisiert ist,

der Antikörper von dem immobilisierten Polypeptid verdrängt und der Antikörper dadurch isoliert wird.