JPH03504383A - ラミニンの付着受容体およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラミニンの・　　管　およびその 發朋ヱυＬ肚 本発明は、一般に細胞付着システムに関し、特にラミニンの付着受容体に関する 。

λ豆Δ！盈 細胞表面において起こることの多くは、その周囲にある物質の細胞による認識に 関連する。第１の例は、細胞による可溶性ホルモンの結合およびそのような結合 に対する反応である。細胞表面認識のもう１つの重要な局面は、細胞とそれを取 り巻く不溶性構造物との相互作用７ある。このような構造物は、その他の細胞ま たは細胞外マトリックスの表面であり得る。

細胞間および細胞外マトリックスとの相互作用についてはまだ充分に理解されて いないが、それらは細胞の生命において重要な役割を果たしている。例えば、細 胞マトリックスおよび細胞間の相互作用によって、細胞が体内のどの部分に存在 するべきか、または移動する場合には、どの部分に移動するべきかが決定される ようである。特に興味深い例は、我々のプロセスを適切な部位へ送る神経細胞で あり、それによって体内の離れた部位への連絡が形成される。腫瘍がその起源細 胞に不適切な体内の部分へ侵入および散在するため９部位シグナルは、明らかに 癌中において損なわれている。事実。

我々の細胞マトリックスおよび細胞間の相互作用の理解が高まり、その探求が可 能になるにつれて、この分野は新しく重要な医学の最先端として発展していくで あろう。

細胞表面におけるタンパクおよび糖は両方とも細胞マトリックスおよび細胞間の 相互作用に参与し得る。細胞外マトリックスは細胞によって配置されるタンパク および糖の不溶性網状組織から構成され、細胞内空間の大半を占める。体内にお ける異なる部位のマトリックスは、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン 、ヒアルロン酸およびフィブロネクチンおよびラミニン等の様々な糖タンパクの 異なる組合せからなる。事実、同定された＃１Ｉｒｅａ外マトリックス糖タンパ クおよびコラーゲンはすべて細胞と相互作用する。

細胞と細胞外マトリックス分子との相互作用の中で最も容易に観察可能な結果は 、細胞付着である。細胞外マトリックスタンパクの付着特性は、細胞を細胞外マ トリックス物質または精製されたマトリックスタンパクの１つによってコートさ れた表面にプレートすることによってインビトロで容易に示され得る。細胞は、 そのような表面に容易に付着し、その上に広がる。しかし、付着タンパクは、付 着を促進するだけでなく、細胞移動をも刺激する。細胞は９表面に勾配として付 与された。制限された濃度の付着タンパクに直面すると。

より濃度の高いところへ移動する。

細胞外マトリックスが細胞に影響する更に複雑な方法は。

細胞の分化、生存および増殖を促進することである。細胞外マトリックスタンパ クの１つであるラミニンは、特に細胞に大きな影響を与える。特定の細胞外マト リックスシート、基部膜に存在するこのタンパクは、細胞の付着および移動を促 進し９分化および腫瘍の転移において役割を果たす。ラミニンはまた。神経細胞 プロセスまたは神経突起の成長を促進および誘導する。

細胞およびラミニンの間のこれらの相互作用は、ラミニンの付着受容体として機 能する細胞表面受容体によって媒介されると思われる。ラミニンの細胞に対する 影響を媒介するこの単数または複数の受容体の全特性はまだ知られていない。

従って、ラミニン付着受容体を同定および単離する必要がある。単離された受容 体を得ることによって、この例えば腫瘍細胞の表面におけるラミニン受容体の発 現を分析するために使用され得る。受容体に特異的な抗体の生成が可能となる。

受容体に結合する組換え体タンパク断片のような化合物は。

ラミニンの活性を再生またはラミニンを含有する構造物に対する細胞付着を阻害 するのに使用され得る。更に、リボーソームを、治療またはその他の目的のため の特異的な組織に標的化し得る必要がある。本発明は、これらの必要性を満足す ると共に、付加的な利点をも提供する。

及五旦斐且 本発明は、２つのサブユニット、αおよびβを含み、ラミニン、およびそのポリ ペプチドのＣ０ＯＨ末端部分からなるラミニンの部分由来の、ラミニンの細胞付 着促進断片と相互作用することを特徴とする。実質的に純粋な哺乳類のラミニン 付着受容体を提供する。ラミニンまたはラミニンの細胞付着促進断片との相互作 用は、二価カチオン依存性である。大きい方の（α）サブユニットが、抗α３抗 血清と反応性を有する。

１つの局面において１本発明は、ラミニン付着受容体を単離および精製する方法 を提供する。本発明のもう１つの局面において、モノクローナル抗体およびポリ クローナル抗体が。

単離された受容体に対して調製され、その反応性が精製された受容体に対して分 析される。その他のいかなる受容体も。

α３サブユニツトを含んでいることが知られていないので、大きい方のαサブユ ニットに対する抗体は、ラミニン受容体に対して特異的であるのに対して、小さ い方のβサブユニ、トに対する抗体の中にはフィブロネクチン受容体およびその 他の関連細胞付着受容体と反応し得るものがある。抗αサブユニット抗体は、所 定の細胞タイプによって発現されるラミニン受容体の量を決定するのに有用であ る。更に、細胞付着分析による選択によって、細胞のラミニンへの付着を阻害し 得る抗αサブユニット抗体が提供される。このような抗体は。

インビトロ分析において、腫瘍細胞が羊水膜組織を介して侵入するのを防止する 。

本発明のもう１つの局面において、受容体は、ラミニン受容体の機能を再生また は阻害し得る化合物を提供するのに使用される。本発明の更にもう１つの局面に おいて、細胞表面受容体は、リポソームの膜に取り入れられる。次いで、そのよ うなリポソームは、リポソームの内容物をラミニンを含む組織に標的化するのに 使用され得る。

鳳ｉ旦星星星迫里 第１図。ラミニン親和性マトリックスから溶離された画分のドデシル硫酸ナトリ ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）分析。ＲｕＧＩｉグ リア芽細胞腫細胞の表面を標本して抽出し、その抽出物を共有結合したラミニン の細胞付着促進断片を含むセファロースカラムにより実施例Ｉに説明されるよう に分画した。各画分の一部を、非還元条件の下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析 し、オートラジオグラフィーを使用してタンパクバンドを可視化した。レーン１ −１３は、カラムのＥＤＴＡ溶離物由来の断片を示す。分子量マーカーは、ミオ シン。

２００ｋＤ；β−ガラクトシダーゼ、　　１１６　ｋＤ；ホスホリラーゼＢ、　 　９４　ｋＤ；　ウシ血清アルブミン、６７ｋＤ；オバルブミン、４３ｋＤであ った。

第２図。非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件の下でのＲｕＧ１１ラミニン受容 体（レーン１）およびフィブロネクチン受容体（レーン２）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ 分析。フィブロネクチン受容体を。

Ｐｙｔｅｌａら、　　Ｃｅ１ｌ　４０：５４８．　（１９８５）　（参考として 本願に記載されている）の方法を使用して親和性マトリックスとしてフィブロネ クチン細胞付着断片セファロースを使用することによってラミニン受容体と同様 の細胞抽出物から得た。電気泳動の条件は、第１図と同様であった。矢印は、α サブユニットの軽鎖を示す。

第３図。ラミニン受容体の免疫プロット分析。ＲｕＧ１　ｉ細胞から単離された フィブロネクチン（Ａ）およびラミニン（Ｂ）受容体を非還元条件の下で電気泳 動にかけ、ニトロセルロースフィルターに移し、このフィルターをウサギ抗フィ ブロネクチン受容体抗体と共にインキュベートした（　Ａｒｇｒａｖｅｓ　ラ、 　　Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：１１８３．１９８７．　　本願で参考として記 載されている）次いで、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結 合したヤギ抗ウサギＩｇＧにより検出した。

第４図。ラミニンおよびフィブロネクチン受容体の免疫プロット分析。ＲｕＧ１ １細胞抽出物から単離したフィブロネクチン（レーン１．３）およびラミニン（ レーン２，４）受容体を非還元条件の下で電気泳動にかけ、ニトロセルロースフ ィルターに移した。このフィルターを、セフ１０一ス結合ラミニン受容体に吸収 されたフィブロネクチン受容体に対するウサギ抗血清（レーン１．　２）、　　 またはセファロース結合フィブロネクチン受容体に吸収されたウサギ抗ラミニン 受容体抗血清（レーン３，４）と共にインキュベートした。結合抗体をセイヨウ ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ！ｇＧにより検出した。吸収に 使用される抗フィブロネクチン受容体抗体については説明されており（Ｐｙｔｅ ｌａら、　　Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙ■ｏ１．、１４４＋４７５−４８９　（１９ ８〕）９本願において参考として記載されている）、抗ラミニン受容体抗血清を 、実施例１に記載のＲｕＧ１１細胞から精製された受容体と共に免疫することに よって調製した。

第５図。ラミニン受容体を含むリポソームの基質への結合。

マイクロタイターウェルを様々なタンパクでコーティングし。

プラスチック上の非占有結合部位を、このウェルをウシ血清アルブミンでインキ ュベートすることによってプロ、ツクした。

次いで、受容体リポソームのウェルへの結合または結合の阻害を、実施例ＴＩで 説明されるようにテストした。６つの実験結果を最大結合率（％）により示す。

ＢＳＡが付着したものからバックグラウンドを差し引いた後の平均に標準エラー を加えたもの：　ＬＭ、　　ヒトラミニン：　ＦＮ、　　フィブロネクチン、　 ＋Ｖ。

タイプ１ｖフラーゲン；　ＬＭ　＋　ＬＭ断片、Ｌ、Ｍ＋２０μｇのキモトリプ シンのラミニン断片；　ＬＭ　＋　ＲＧＤ、　ＬＭ　＋　１＋ｍｇ／ａｌ　ＧＲ ＧＤＳＰペプチド；　ＬＭ　＋　ＹＩＧＳＲ，ＬＭ　＋　ｌ＋ｍｇ／ｍｌ　ＹＩ ＧＳＲペプチド；フィブロネクチン受容体リポソーム（白抜き棒）；ＬＭＲ，ラ ミニン受容体リポソーム（斜線環）。

第６図。放射受容体結合分析。様々なヒ）　（ＭＯ−６３，Ａ４３１）およびラ ット（ＲｕＧｌｉ、　ＮＨＫ−４９Ｆ）細胞から単離された精製ヨウ素化ラミニ ン受容体を、マイクロタイターウェルにコートした様々なタンパクと共にインキ ュベートした。このウェルを洗浄し、結合受容体をＴＢＳ中の１％ＳＤＳで可溶 化し、ガンマカウンターで定量した。その結果を、ラミニン結合を１００ノ＜− セントとして、受容体結合率で示す。縦棒は１図中、　　ＬＭ、　　ヒトラミニ ン；　ＦＮ、　　ヒトフィブロネクチン；　Ｃ＋Ｖ、　タイプ１ｖフラーゲン； Ｃ１，タイプ■コラーゲン；　ＢＳＡ、　　ウシ血清アルブミン；で示されるよ うに、異なる細胞タイプからの受容体を示す。

第７図。放射受容体結合分析におけるラミニン受容体結合でコートされたマイク ロタイターウェルに対するラミニン受容体の結合率（％）を、阻害されないラミ ニン結合を１００パーセントとし、これと比較して示す。Ａ−４３１細胞（広い 斜線環）およびＲｕＧ１　ｉ細胞（狭い斜線環）由来のラミニン受容体を使用し た。テストした阻害剤は、ラミニン断片およびフィブロネクチン断片ならびに標 識されていない受容体（実施例Ｖｌｒｌに記載）であった。ＲｕＧ　Ｉ　ｉ受容 体は、２つの阻害剤（ＮＡ）と共にはテストしなかった。

及μ目と１狗ツ」え吸 本発明は、ラミニンの哺乳類付着受容体に関する。ラミニンは１通常の細胞の分 化および悪性細胞の転移の両方において役割を果たすことが知られている。この 受容体およびそれと反応する抗体の単離は、腫瘍細胞の表面上におけるラミニン 受容体の存在を検出するのに使用され得る。ラミニンに結合する細胞の能力は、 その侵入および転移能力と関連しているのが発見されている。

哺乳類ラミニン付着受容体を単離および精製するために。

表面を標識された哺乳類細胞の抽出物を、細胞付着を促進することが可能な固定 されたラミニン断片により分画した。その他の哺乳類細胞タイプも使用され得る が、そのような細胞が神経由来の悪性細胞であることが好ましい。例えば、ラッ トグリア芽細胞腫細胞（ＲｕＧｌｉ）の表面を、まず、ラクトペルオキシダーゼ でヨウ素化し、オクチルグルコシド中に溶解させた。ＲｕＧ１　ｉ細胞はラミニ ンでコートされたプラスチ・ンク表面に付着し、その上に広がる。付着分析にお ける細胞懸濁物にＭｎ２＋を加えることによって、ラミニンでコートされた表面 への細胞の付着が高められる。同様の精製方法を適用することによって、受容体 が、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ−６３または胎盤組織のような他の細胞のタイプおよび 組織から単離され得る。

通常、　　Ｅｎｇｖａｌｌら、　　Ｊ、　　Ｃｅ１ｌ　ｂｉｏｌ、　　１０３： ２４５？　（１９８６）　（本願で参考として記載されている）の方法によって 、細胞付着促進活性を保持するラミニン断片を単離した。この方法には。

非損傷ラミニンまたはペプシンおよびキモトリプシン以外のプロテアーゼにより 生成した断片を使用する等の様々な改変が可能である。ラミニン断片を臭化シア ン（ＣＮＢｒ）活性セファ０−ス（Ｓｆｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ ）に結合することによって。

親和性マトリックスを調製した。特定の溶離液を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミノ テトラ酢酸）でカラムを処理することによって得た。溶離緩衝液を除くすべての 緩衝液は、受容体の親和性マトリックスへの結合を容易にするために、１■Ｍ　 Ｍｎ２＋を含んでいた。溶離した断片を、　５ＤＳ−ＰＡＧＥにより１次いでオ ートラジオグラフィーによって分析した。第１および２図に示されるように、非 還元条件下において、　　ＲｕＧ１１細胞由来のタンパクが存在する。不完全な 非折りたたみ状態で、１５０ｋＤおよび１２０　ｋＤの見かけ分子量に対応する 部位に移動した２つのタンパクバンドが見られた。還元条件の下で５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによって決定されるより正確な分子量は、これらのサブユニットの分子量が それぞれ約１６５および１４０　ｋＤであることを示している。なぜなら還元し た場合、サブユニットの大きい方が１３５　ｋＤおよび３５　ｋＤの分子量を有 する２つのポリペプチドを生じるからである。この分析において、小さい方の成 分は、　　３５／３０　ｋＤの複体として現れる。この説明によって限定される ものではないが、３０ｋＤポリペプチドは、３５ｋＤポリペプチドの開裂断片で あると思われる。

ＲｕＧ１１細胞タンパクのサブユニットに類似するサブユニットを有するラミニ ン結合タンパクをまた。ヒトＭＧ−６３骨肉腫細胞および胎盤組織から単離した 。このヒトラミニン受容体はまた。２つのポリペプチドからなる。しかし、大き い方のサブユニットは元来の１７０，０００　Ｄの分子量を有する。

本願で使用される「ラミニン付着受容体」（「ラミニンの付着受容体」とも呼ば れる）という用語は、細胞のラミニンへの付着を媒介するために機能する細胞表 面受容体のことを指す。ラミニン付着受容体は、細胞付着促進活性を保持するラ ミニンまたはラミニン断片に特異的に結合し、ビトロネクチン、フィブリノーゲ ン、コラーゲンタイプＩまたはアルブミンには、実質的に結合しない。天然のラ ミニン付着受容体は１分子量が約１６５から１７０　ｋＤおよび約１４０　ｋＤ である２つのサブユニットから構成される。一方、大きい方のポリペプチドは２ 分子量が約１３５　ｋＤおよび３５　ｋＤである２つのジスルフィド連結鎖から 構成される。

「ラミニン付着受容体」という用語は、ラミニンまたはうミニン断片結合活性を 保持する天然の構造物およびこの構造物の修飾物または類似体（ｉｓｏｆｏｒｍ ）を指す。細胞付着促進活性を保持するラミニンまたはラミニン断片は、ラミニ ン付着受容体のリガンドと言われる。リガンド結合活性を破壊することなくラミ ニン付着受容体の構造物に、限定された改変を加えることは可能であり、−次構 造物全体の一部分のみが活性を有するために必要とされ得ることが理解される。

リガンド結合活性を保持する受容体の断片はこの定義内に含まれる。

本発明のラミニン付着受容体の状態を説明するのに使用される「実質的に純粋な 」という用語は、その自然環境において１通常、受容体と関連または受容体と共 に生じる他のタンパクを実質的に持たず、そして１例えば単離工程により取り入 れられた抗体のように、干渉および希釈するような細胞表面タンパクまたはその 他のタンパクから実質的に分離しているような受容体を指す。しかし、２つ以上 の受容体の類似体が「実質的に純粋な」調製物において存在し得る。

単離されたラミニン付着受容体のヘテロダイマー構造物。

その大きい方のサブユニットのジスルフィド結合２本鎖組成物、および還元によ り小さい方のサブユニットの分子量が増加することは、すべて、インテグリン（ ＲｕｏｓｌａｈｔｉおよびＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３８：４９１（１９８７）を参照１本願で参考として記載されている）と呼ばれ る受容体類の特性である。多数の受容体を含むインテグリンは、アミノ酸配列の 類似性を共有する。

ラミニン付着受容体と既知のインテグリンとの関係を探求するために、この受容 体を、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体と共にフィブロネクチンお よびビトロネクチン受容体に免疫プロットした。抗フィブロネクチン受容体抗体 は、ラミニン付着受容体の小さい方の（β）サブユニットと交差反応したが、一 方、抗ビトロネクチン受容体抗体とは反応しなかった。これらの結果は、ラミニ ン付着受容体が特殊なタンパクで、その１つのサブユニットがフィブロネクチン 受容体βサブユニットに関連し得ることを示す。ラミニン受容体のαサブユニッ トは、α３サブユニツトの細胞質領域の既知の配列をモデルにしたペプチドに対 する抗体と反応しく）１ｙｎｅｓら、　　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、印刷中 ）、このことはラミニン受容体のαサブユニットがα３であることを示唆してい る。第３図に示すように、βサブユニットは、フィブロネクチン受容体βサブユ ニットに密接に関連する。しかし、第４図は、少なくともＲｕＧ１１細胞受容体 の場合において、免疫学的にベータサブユニットがフィブロネクチン受容体βサ ブユニットと異なり得ることを示す。

ラミニン受容体のりガント結合の特異性をリポソーム結合分析において研究した 。受容体を、　Ｐｙｔｅｌａら、　　Ｃｅ１ｌ　４０：１９１゜（１９８５）　 （本願で参考として記載されている）の方法によってホスファチジルコリンリポ ソーム膜に取り入れた。簡単に述べれば、受容体およびホスホリドを含む洗浄剤 溶液を、洗浄剤を含まない緩衝液に対して透析する。生成したリポソームは、ラ ミニンでコートされた基質に強力に付着した。これらはまた、ある程度の変動は あるが、フィブロネクチン、タイプＩＶおよびタイプＩコラーゲンに結合した。

しかし、ビトロネクチン、フィブリノーゲンまたはアルブミンでコートされた基 質には結合しなかった。これに対して、同様の細胞からフィブロネクチン受容体 と共に形成されたリポソームは。

フィブロネクチンに強力に結合し、ラミニンとの相互作用を示さなかった。ラミ ニン付着受容体と共に調製されたリポソームの付着は、細胞がフィブロネクチン およびビトロネクチン（Ｇｅｈｌｓｅｎら、　　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　１０６：９２５−９５０　　（１９８ｇ）；本願に参考として記載されている ）と結合するのを阻害するＧＲＧＤＳＰペプチド、またはラミニン由来のその他 の・ペプチド（Ｇｒａｆら、　　Ｃｅ１１４８＋９８９．　（１９８７）　；本 願で参考として記載されて０る）によってではなく、精製された細胞付着促進ラ ミニン断片（こよって阻害された。すべてのペプチドは、従来の１文字の略号に よって示される。これらの結果は、ラミニン付着受容体がリポソーム膜に取り入 れられ得、ラミニンとの所望される結合をリポソームまで持ち込むことを示す。

ラミニン付着受容体リポソームは、リポソームを基部膜に標的化するのに有用で ある。例えば、腎臓糸球体における沈澱物は、タンパク加水分解酵素およびその 他の酵素で負荷されたリポソームで、受、容体媒介標的化によって、処理され得 る。

非脂質表面を受容体でコートするために、そのようなフーティングまたは結合に 用いられる多数の周知の方法の１つを使用して、溶液からの受容体を、プラスチ ックのような表面に吸着または共有結合させる。リガンド結合活性を保持する′ が１分子の膜包埋部分を欠損する受容体断片は、完全な受容体よりも更に溶解性 が高いため、有利に利用される。受容体でコートされたこのような材料は９例え ば人工レンズのように基部膜の付着が所望されるプロチーセス（ｐｒｏｔｈｅｓ ｅｓ）として使用される。

単離されたラミニン受容体の結合特異性はまた。ラミニンまたはその他のタンパ クによってコートされたマイクロタイターウェル中で１２５．、．１で標識され た受容体をインキ一ベートし。

放射能のウェルへの結合を測定することからなる放射受容体分析において調べら れている。各細胞タイプからのラミニン受容体はラミニンによってコートされた ウェルと結合した。

これらもすべてフィブロネクチンに対しである種のアフィニティーを示し、受容 体の中にはタイプＩＶコラーゲンと結合するものもあった（第６図）。後者の結 果から、様々な細胞タイプから単離された受容体が２つのカテゴリー−タイプ１ ｖコラーゲン非結合（例えば、　　ＲｕＧＩｉ）およびタイプＩＶコラーゲン結 合（例えば、　　ＭＧ６３）に分類されることが示唆される。これらのタイプの 受容体の間にはいかなる化学的相違も確立されていなかった。

また、放射受容体分析を使用して、様々なタンパク断片がラミニンおよびその受 容体の間の相互作用を阻害する能力を査定した（第７図）。分子のＣｏ（ＩＨ末 端部を構成する部分由来のラミニンの断片（Ｄｆｌｌｎｅｒら、前出）は、結合 を阻害した。

更に、その分子の細胞付着領域由来のフィブロネクチン断片もまた。阻害的であ った。断片のラミニン受容体の相互作用を阻害する能力は、腫瘍細胞が血管基部 膜へ付着するのを防止するのに有用である。この分析は、ラミ、１ン受容体とラ ミニンとの相互反応を阻害できるその他の物質を同定するのにも有用である。

ラミニン付着受容体に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、 当該技術分野に既知の手法に従って調製した。ポリクローナル抗体を、セファロ ースに結合した精製フィブロネクチン受容体により吸収させる（Ａｒｇｒａｖｅ ｓら。

前出）。ラミニンおよびフィブロネクチン受容体のβサブユニ・ノドは類似して おり、フィブロネクチン受容体βサブユニットは、多数のその他のインテグリン によって共有されるため、この処理により、このインテグリン類における受容体 によって共有される決定基に対する抗体が除去される。また。

この処理により、ラミニンおよびフィブロネクチン親和性マトリックスの両方に 非特異的に結合する混入タンパクに対する抗体が除去される。必要に応じて、こ のような抗体はまた。

「疑似精製（ｍｏｃｋ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）受容体調製」　（実施例Ｖｌを参照 ）により抗血清を吸収することによっても除去され得る。抗体の特異性は、酵素 免疫分析；表面がヨウ素化されそして代謝的に標識された細胞からの洗浄剤抽出 物の免疫沈澱；ならびに当該技術分野で既知の方法により得られた単離されたラ ミニン受容体、その他の単離されたインテグリン、および全細胞抽出物の免疫プ ロッティングを実施することによって調べられる。第４図に示されるように、　 　ＲｕＧｌｊ細胞受容体の場合には、　　ＲｕＧＩｉ！、ＦＢ胞ラミニン受容体 に対して形成された抗血清をＲｕＧＬｉ細胞クイプロネクチン受容体と共に吸収 することによって、主とＬ７てラミニン受容体と反応性を存する抗体の調製物を 産生じた。

モノクローナル抗体を、単離された受容体または受容体を含むその他の物質で免 疫し９次いで当該技術分野で周知の抗体生成ハイブリドーマ細胞を単離すること によって調製する。

（例えば、　　１（ａｒｌｏｖおよびＬａｎｅ、　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：　Ａ 　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　１９８８；本願で参考として記載されている；を参照）。適切なハイブ リドーマ細胞を、精製ラミニン受容体を用いて酵素免疫分析を行うことによって 選択する。ラミニン受容体に対して特異的な抗体は、ラミニン受容体のサブユニ ットの中の１つと反応するが、他のインテグリンサブユニットととは反応しない 抗体を選択する。免疫プロッティングを使用することによって得られる。受容体 のラミニン結合活性を阻害し得るラミニン受容体に対して特異的な抗体を得るた めに、サブユニット特異性モノクローナル抗体を、ラミニンへの細胞付着阻害剤 としてテストする。この分析は、抗体の存在および不在下において細胞をマイク ロタイターウェルに付着させることによって行なわれる。最後に。

付着を促進する抗体の選択を９種々の異なる濃度において精製抗体でマイクロタ イターウェルをコートし２次いで、ラミニン受容体を有する細胞をウェルに加え ることによって行う。

血清アルブミンのような不活性のタンパクでコートされＩ；ウェルに対して細胞 の付着を増加させることによって、所望の特性を有する抗体の存在が示される。

ラミニン付着受容体はまた。様々な化合物のラミニンへの結合のための競合能力 を調べるため、この化合物をスクリーニングするのに使用され得る。好ましくは 、このようなスクリーニングは、実施例ｖ１目に記載されるように阻害分析を使 用して行われる。その他の方法も当該技術者により明白である。この阻害分析は 、未知の物質または物質の混合物の阻害活性を調べるために、これらをスクリー ニングするのに有利に使用され得る。このような混合物が阻害活性を有している ことが発見されると２次いで、特定の活性化合物を単離または同定するために分 画され得る。このような活性化合物は。

基質をそのような化合物でコートすることによってラミニン付着受容体を表現す る細胞の基質への付着を促進するのに。

または可溶形態で化合物を提供することによってそのような細胞のラミニンへの 付着を阻害するのに使用され得る。

以下の実施例は２例示することを目的としており本発明を限定するものではない 。これらの実施例は２通常使用され得るものであるが、当該技術分野に既知のそ の他の手法も代わりに使用され得る。

実施例Ｉ ラミニン　会　の 見−」１虹」ｌ格 Ｍａｘ　Ｐｌａｎｃｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｔｕｂｉｇｅｎ、　Ｗｅｓｔ　 Ｇｅｒｍａｎｙから得られるダリア芽細胞腫細胞系ＲｕＧ　ｌ　ｉをラットラミ ニン付着受容体の源として使用Ｉまた。細胞を増殖させて集密化し、そして、細 胞表面をラクトペルオキシダーゼ法（Ｌｅｂｉｅｎら、　　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 。

１２９：２２８７　（１９Ｂ２）；本願で参考として記載されている）によって １２ＦＩ＋でヨウ素化し、２Ｓ＋ｅＭのオクチル−β−Ｄ−チオグルコシド（Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　ｉ、ａ　ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）、　　１　＋ｏＭのＭｎ Ｃｌ２．　　およびｌ　ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド（、ＰＭ ＳＰ）　　（抽出緩衝液）を含有する。　　ｐＨ７，２のトリス緩衝液で緩衝化 した生理食塩水で抽出した。Ｍｎ”を、フィブロネクチンアフィニティークロマ トグラフィーによってフィブロネクチン受容体の単離を容易にするため、緩衝液 に含有させた。

細胞付着促進および神経突起促進活性を有するラミニン断片を、　Ｖｌｅｖｅｒ ら、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５８：１２６５４　（１９８３）　（ 本願で参考どして記載されている）の免疫アフィニティークロマトグラフィー法 によってヒト胎盤から単離した。単離に使用した４Ｅ１０抗ヒトラミニン抗体は 、　　Ｔｅ１ｉｏｓ　Ｐｈａｒ＋１ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａ ｎ　ｄｉｅｇｏ、　ＣＡから入手可能である。

上記のようにして得られた９０　＋ｏｇのヒトラミニン断片を１　製造者の指示 に従って、ｌｏｍｌの臭化シアン活性化セファロースゲル（Ｐｂａｒｍａｅｉａ 、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ＞に結合させることによって調製した。

５ｍｌの充填された表面ヨウ素化細胞からの可溶性抽出物を。

１０　ｍｌ　（べ、ドボリューム）のラミニン−セファロースカラムにかけた。

細胞抽出物をカラムに２回通過させて、カラムを３０　ｍｌの抽出緩衝液で洗浄 した。初期の希釈を、　　２　＋ｎｇ／ｍｌの合成ペプチドＧＲＧＤＳＰを含有 する２０　ｍｌの緩衝液で１次いで２０　ｍＭＥＤＴＡを含有する２０１１のカ チオンを含まない緩衝液で行った。

各収集された２ｍ１画分のアリコツトを非還元条件の下で７．５％のＳＤＳポリ アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーに一夜かけ ることによって、タンパクバンドが観察された。ＧＲＧＤＳＰ溶離物は、親和性 マトリックスから特異的に溶離されたバンドを放出しなかったのに対して、　　 ＥＤＴＡ溶離物は、第１図に示されるように、ラミニン付着受容体を放出した。

箪１図および第２図に示されるように、　　ＲｕＧ１１細胞由来のタンパクが非 還元条件の下で存在する。不完全な非折り畳み構造を有する状態で、　　１５０ 　ｋＤおよび１２０　ｋＤの見かけ分子量に対応する部位に移動した２つのタン パクバンドが見られた。還元条件の下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるよ り正確な分子量は、これらのサブユニットの分子量がそれぞれ約１６５および１ ４０　ｋＤであることを示している。なぜなら、還元した場合に。

サブユニットの大きい方が１３５　ｋＤ帯および３５／３０　ｋＤの複体である ２つのポリペプチドを生じるからである。この説明によって限定することを意図 したくはないが、３０ｋＤのポリペプチドは、３５ｋＤのポリペプチドの開裂断 片であると思われる。

ｂ、　　ＭＧ−６３Ａ−４３１およびＵ−２５１ヒト骨肉腫細胞（ＭＧ−６３： ＡＴＣＣ受託番号第ＣＲＬ１４２７号）、ヒト表皮悪性腫瘍細胞（Ａ−４３１： ＡＴＣＣ受託番号第ＣＲ［、−１５５５号）およびヒトグリア芽細胞腫細胞（Ｕ −２５１）を、ヒトインテグリンタイプのラミニン受容体の源として使用した。

受容体をＲｕＧ１１受容体用として、上記の方法によって単離した。得られた受 容体は、大きい方の（α）サブユニットが、約１７０．　ＧＯＯＤの見かけ分子 量を有するＲｕＧＩｉ受容体αサブユニットよりも更にゆっくりと移動したこと を除いて、第１図に示すＲｕＧ１１受容体と同様の電気泳動的外観を有していた 。

実施例ＩＩ ラミニン　０　のリポソームへの　　およびリポソームの基！二ノ」Ｌａ 細胞表面受容体を含むホスファチジルコリンリポソームを。

フィブロネクチン受容体（Ｐｙｔｅｌａら、　　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　１４４：４７５−４８９．１９８７）について説明したように、実質的にＭｉ ｓｓｓら。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：８８３．　（１９１１１）の方法によって調 製した。これらの引例は両方とも本願において参考として記載されている。

卵黄ホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）およ び３Ｈ−ホスファチジルコリン（Ｎｅｗ　ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　 ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ）を１００μｇ／ｍｌで受容体画分中に溶解させ９次いでこの溶液を５００ 　＋ｎＭのＮａＣ１，ｌ　ｒａＭのＣａ２Ｃ１およびｌ　ｍＭのＭｇｚＣｌを含 有する５０　＋ｏＭのトリス）ＩＣＩに対して４６Ｃで２４時間透析した。生成 したリポソームを超遠心分離においてショ糖勾配の表面に浮揚させることによっ て単離し、様々な基質を結合するためにテストした。

ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅ ｋ、　　Ｉｎｇｌｅｖｏｏｄ、　　ＣＡ）　　を、　　Ｅｎｇｖａｌｌら、　　 Ｊ、Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　　１０３：２４５７　（１９８５）　（本願で 参考として記載されている）の方法に従って、ラミニン、フィブロネクチン、コ ラーゲンおよびビトロネクチン（Ｔｅｌｉｏｓ　Ｐｈａｒ＋ｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を含む細胞外マトリックスタ ンパクで、　　（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ使用）４’Ｃで一夜コートすることに よって調製した。バックグラウンドの非特異的結合を決定するために、ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ　；　５＋ｏｇ／ｕＬ）によるコーティングを使用した（Ｓ ｉｇ＋＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）。ラ ミニン受容体−リポソームの調製物は、ラミニンでコートされたマイクロタイタ ーウェルへの強力な供与量依存性の結合を示し、フィブロネクチンにわずかに結 合し、そして第５図に示すように、コラーゲンタイプ■または＋Ｖあるいはビト ロネクチンへのバックグラウンドを越えた結合を示さなかった。

同様のＩ？ｕＧＩ　ｆ細胞抽出物から単離されたフィブロネクチン受容体を、リ ポソーム分析において比較のために使用した。この受容体で調製されたリポソー ムは、ラミニン受容体リポソームよりも大きな割合、でフィブロネクチンに結合 し、ラミニンへの結合は示さなかった。更に、特性制御には、キモトリプシンに より切断された細胞付着促進ヒトラミニン断片をリポソーム分析へ加えることに よる。ラミニン受容体結合の阻害が含まれた。これらの断片は、ラミニン受容体 リポソームのラミニンへの結合を阻害したが、　　ＧＲＧＤＳＰペプチドまたは ＹＩＧＳＲラミニンペプチドは阻害しなかった。これらの分析の代表的な結果を 第５図に示す。

実施例ＩＩ＋ 治療剤を“的　　るための　管　−リポソーム−の受容体リポソームを上記によ うに調製し、所望の治療剤を文献に記載された方法（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓお よび５ｅｎｉｏｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、　１２：３３ ７．　（１９８４）　；本願に参考として記載されている）に従って、この調製 物に取り入れる。これらの複合リボン・−ムに体重ｋｇ当りｌ−３００μｍｏｌ の脂質を使用して静脈投与または局部投与する。このようなラミニン受容体リポ ソームを９例えば大量のラミニンを含有する薬剤を組織に標的化するために使用 する。

実施例ＩＶ ・　０　　　による　０　、　　の ラミニン受容体のラミニンへの結合およびこの結合に対スる抗体およびタンパク 断片の影響を、フィブロネクチン受容体について上記に説明した放射受容体分析 （Ｈａｕｔａｎｅｎら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６４：１４３７−１４４２　（１９８９））によ り調べた。マイクロタイターウェルを、１−２μｇ／諺ｌのヒトラミニン、ウシ タイプＩコラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｌｅ ｘｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）　。

マウスタイプｌｖコラーゲン（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）　、　　 ヒトブラズマフィブロネクチンまたはウシ血清アルブミンでコートした。表面ヨ ウ素化細胞から単離された１２５■標識受容体を、５０　＋ａＭのオクチル−β −グルコピラノシド、　　１　　ａ＋ＭのＰＭＳＦおよび１　　ｍＭのＭｎＣｌ ２を含有するトリス緩衝化生理食塩水（１５０＋ａＭのＮａＣ１，Ｓｏ　ｍＭの トリスＨＣＩ、　ｐＨ７，５，ＴＢＳ）の存在下において室温で２時間コートさ れたウェルに結合させた。ウェル当りに加えられた受容体の量は、　　１０’　 ｃｐＩｌｌに相当した。インキュベージクンに次いで、ウェルを洗浄し、結合受 容体を、　　ＴＢＳ中の１２のドデシル硫酸ナトリウムで可溶化し、結合放射能 を計数することによって定量した。非特異性結合を、アルブミンでコートされた ウェルにおいて測定した。結合の合計は、加えた放射能の５から１０％の間であ り、この内の７０−８０％は上記の基準から特異的であった。テストした各細胞 タイプからのラミニン受容体は、第６図に示される分析においてラミニンに結合 した。受容体はまた。ある程度の変動はあるが、フィブロネクチンおよびタイプ ＩＶフラーゲンに結合した。この変動の理由は不明である。下記の説明に限定さ れないが、この相違は受容体のβサブユニットに存在し、タイプＩＶコラーゲン に対して親和性をもつ受容体が組成α３β１を有し、　　（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ およびＰ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、前出）、そして、およびタイプＩＹコラ ーゲンに対して親和性をもたない受容体が異なるβサブユニットを有すると思わ れる。この見解は、第４図において立証されるＲｕＧ１１細胞ラミニンおよびフ ィブロネクチン受容体の間の免疫上の相違によって支持される。

符表平３−５０４３８３　（８） 実施例Ｖ １まニュＭ良稗金Ｊｌｉ曹四１直化 ａ３″　、微 ラミニン受容体−ラミニン複合体の電子顕微鏡による分析を、受容体−フィブロ ネクチン複合体（、Ｇａ１ｌｉｔおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｔ　２６３：１２９２７　（１９８８）；本願で参考として記載され ている）について説明したように、かついくつかの改変を加えて行った。アフィ ニティークロマトグラフィー溶難物からの受容体調製物を、各１　　＋ｃＭのＣ ａ２”、　ＭＥ２＋およびＭｎ２“の存在下で、マウスラミニン（ＢＲＬ、　Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍｄ）またはヒトラミニンのペプシン消化断片（Ｄｉｌｉｎ ｅｒら、　　ＥＸ＋）、　Ｃｅ１ｌ。

Ｒｅｓ、　１７７：１８６　（１９８８）　；本願で参考として記載されている ）と混合した。様々な割合の受容体およびラミニンを使用し、高温において二価 カチオンの存在下で発生することが知られるラミニンの凝集を避けるために、受 容体−ラミニン複合体のすべてのインキュベーションを４°Ｃで行った。

ラミニン受容体をマウスラミニンと混合する場合には、ラミニン分子のうちいく らかは受容体と複合化したようであった。受容体は、これらの複合体においてラ ミニンのロングアームの球形端と結合した。ラミニン受容体複合体に類似する構 造物は、ラミニンを単独からなるあるいはＭＧ−５３またはＩ？ｕＧ１ｉ細胞フ ィブσネクチン受容体と混合したラミニンからなるコントロール調製物において 観察されなかった。単独に調製されたいくつかのサンプルからの多数のフィール ドを調べると、１００を越える数の可能な受容体−ラミニン複合体の内、約８０ ％がロングアームの末端における球形領域と関連する受容体を有していた。可能 な複合体の残りの内、受容体分子はショートアームの１つまたはクロスの中心と 多様に関連しているようであった。マウスラミニンとともに得られた複合体に類 似するラミニン−受容体複合体はヒトラミニンのペプシン消化断片をラミニン受 容体と混合する際に見られた。

ｂ、モノクローナル　　による。

ラミニン分子のロングアームの末端における球形領域への受容体の好ましい結合 は、ラミニンの神経突起促進活性を阻害することが可能な１群のモノクローナル 抗体について以前に示されたものと同様であった。ペプシン抽出ヒトラミニンに 対するモノクローナル抗体を、　　Ｅｎｇｖａｌｌら、　　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ。

１０３：２４５７−２４６５　（１９８６）　（本願で参考として記載された方 法）によって調製した。これらの抗体の内の２つ、３Ｅ５および４Ｅ１０の放射 受容体分析における受容体のラミニンへの結合を干渉する能力を調べた。３Ｅ５ および４Ｅ１０抗体は、濃度に依存するような方式でＲｕＧｌｊ受容体のラミニ ンへの結合を阻害した。神経突起生成に影響を与えず、ラミニンクロスの中心付 近の領域に結合する抗体２Ｅ８は、比較しうる抗体濃度においてほとんど阻害を 示さなかった。関連しない特性を有するモノクローナル抗体もまた影響力がなか った。ＭＧ−６３細胞受容体の結合を。

この分析において３Ｅ５および４Ｅ１０抗体によって阻害すると、ラミニン受容 体は両方とも同一の部位に結合し得ることが示された。

Ｃ，ｃＤＮＡクローニングによるモノクローナル　　　人。　の敬夜止 受容体結合部位を規定するモノクローナル抗体の結合のためのこれらのクローン によって形成されたタンパクをテストするために、ラミニンｃＤＮＡクローンを 単離した。ラミニンに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を有 する。胎盤細胞および内皮細胞のλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングすることによって、多数の反応性を有するクローンが産生された。ＤＮＡ 配列、およびすでに文献に記載されたラミニンの配列（Ｐｔｋｋａｒａｉｎｅｎ ら、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　２６２：１０４５４−１０４６２　 （１９ｇ？）およびＰｉｋｋａｒａｉｎｅｎら、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２６３：６７５１−６７５８　（１９８８））との比較によって、これら のクローンのうちのい（つかは、　　ＢｌおよびＢ２鎖のＣ０ＯＨ末端部位をコ ードすることが示された。Ａ鎖りローンは同定されなかった。

ＢｌおよびＢ２鎖クローンから発現された融合タンパクを、マクロプラークフィ ルター分析（５ｕｚｕｋｉら、　　ＥＭＢＯＪ、　４：２５１９−２５２４　（ １９８５））において、モノクローナル抗体との反応性についてテストした。Ｂ １鎖のＣ０ＯＨ末端をコードするすべてのクローン由来の融合タンパクは３Ｅ５ 抗体と反応したが、この抗体はＢ２鎖融合タンパクとは反応しなかった。３Ｅ５ 抗体と反応性を有する最短のクローンがＢ１鎖のＣｏｏ　Ｈ末端の２５２個のア ミノ酸をコードする。Ｂ１およびＢ２鎖のＣ００ＩＩ末端からの融合タンパクは 。

他の抗体４Ｅ１０とは反応性を持たなかった。

実施ｆｌｆＶＩ ラミニン　０　に・する　　の−１および　轡　を　　するためのそれらの ａ、ポリクローナル ウサギを、フロイントの完全アジュバント中の精製ラミニン受容体で免疫した。

フロイントの不完全アジュバント中に５０μｇの受容体を含有するブースタを３ 週間間隔で注射し。

最終の注射の１週間後に、血清を採収する。抗血清を、セファロースとそれぞれ 結合しているヒトプラズマタンパク、フィブロネクチンおよびラミニンに吸収さ せた。更に、ウシ血清アルブミンが結合したセファロースカラムで、ラミニン受 容体の源として作用する同様の細胞または組織抽出物を分画することによって得 られる「疑似精製受容体」を吸収させた。

受容体単離におけるのと同様の工程を次いで行い、受容体単離において受容体を 含む画分を疑似精製受容体として採収した。次いで、更に、これもまたセファロ ースと結合したフィブロネクチン受容体に抗血清を吸収させた。フィブロネクチ ン受容体をＰｙｔｅｌａら、前出、の方法で単離した。２　ｍｌの血清を連続し て１００μｇの疑似精製受容体タンパクまたは１００μｇのフィブロネクチン受 容体を含有する１　　ｍｌのセファロースカラムを通過させることによって、疑 似精製受容体−セファロースおよびフィブロネクチン受容体−セファロースによ る吸収を行った。非結合物質の反応性を、固相酸素免疫測定法および５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ免疫プロッティングにより行った。固相酸素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：　 　Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７（１：４１９−４３９ ゜１９８０；本願で参考として記載している）は、抗体として精製ラミニン受容 体およびフィブロネクチン受容体を用いて行い。

そして、　　５ＤＳ−ＰＡＧＥ免疫プロッティングは、受容体に対して。

および受容体の源として働く細胞または組織からの全細胞抽出物または全組織抽 出物に対して行った。この吸収を、これらの分析により、抗血清が特異的である ことが示されるまで繰り返した。抗血清は、それがＥＬＩＳＡ中のラミニン受容 体とのみ反応し、　　Ｔｏｖｂｉｎら、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７６：４３５０（１９７９）およびＡｒｇｒａｖｅｓら 、前出、　（第４図参照）の方法（本願で参考として記載されている）に従って 行われた免疫プロッティングにおいて、ラミニン受容体サブユニットとのみ結合 し、フィブロネクチン受容体サブユニットととは反応しない場合に、ラミニン受 容体に対して特異的であると見なされた。同様の手法を使用し、疑似精製受容体 タンパクおよびラミニン受容体により吸収することによって、フィブロネクチン 受容体抗血清からフィブロネクチン受容体特異性抗体を得た。受容体−セファロ ースカラムを、５０ｍＭ）リスＨＣＩ、　ｐＨ７゜０中の８Ｍの尿素で洗浄する ことによって再生した。

ｂ、モノクローナル マウスに、フロイントの完全アジュバント中の１０μｇの精製ラミニン受容体を 皮下注射し９次いで同量の精製ラミニン受容体をアジュバントを使用せずに腹膜 内注射（ブースタ）することにより免疫した。ブースタ注射の３日後、免疫した マウスからの膵臓細胞を採収し１文献において説明されるようにハイブリドーマ を生成するために使用した。ラミニン受容体と反応するハイブリドーマ分泌抗体 を、抗体としてラミニン受容体を使用して固相酵素免疫分析によって選択した（ Ｅｎｇｖａｌｌ、　　ら、　　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０：４１９− ４３９．１９８０）。分析のために、オクチルグルコシド含有ストック溶液をリ ン酸塩緩衝化生理食塩水で少なくとも１：１０に希釈したｌ　μｇ／ａｌの受容 体溶液で、マイクロタイターウェルをコートした。ラミニン受容体と特異的に反 応するこれらの抗体を、フィブロネクチン受容体に対して陽性な抗体をテストす ることによって更に選択した。この反応性は、ラミニン受容体以外の受容体を含 有する細胞抽出物に対して５ＯＳ−ＰＡＧＥ免疫プロッティングを行うことによ って、　　ＳＤＳ変性の受容体と反応し得る抗体について証明された。

受容体のラミニン結合機能を阻害する抗体を、細胞付着分析において更に選択し た。モノクローナル抗体を、プロティン−Ａセファロースによるアフィニティー クロトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｊａ、　υｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ） によってハイブリドーマ培地から単離しく当該技術分野に熟知のその他の方法も 使用し得る）、単離した抗体の、免疫受容体の源として作用する細胞のラミニン への付着を阻害する能力をテストした。マイクロタイターウェルをｌ　μｇ／＋ １の細胞付着促進ヒトラミニン断片でコートし、　　Ｒｕ（ｉｌｉ細胞を、様々 な濃度のモノクローナル抗体のウェルにそれぞれ加えた。ポリクローナル抗ラミ ニン受容体抗体を陽性コントロールとして使用し、抗フィブロネクチン受容体α サブユニットモノクローナル抗体を陰性コントロールとして使用した。抗体が所 望の阻害活性を有している場合には、はとんどの細胞が分析の末期においてウェ ルに付着しなかった。

実施例ＶＵ における　ラミニン　０　　　のテスト腫瘍細胞が組織に侵入するのを抗ラミニ ンαサブユニット抗体が干渉する能力をテストするために、羊水膜侵入分析を使 用する。ＲｕＧｌｔグリア芽細胞腫細胞を、様々な濃度の抗ラミニン受容体抗体 および上記と同様のコントロール抗体の存在下で１文献（Ｇｅｈ　ｌ５ｅｎら、 　　Ｊ、　　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０１９２５−９３０．　１９８８；本願に 参考として記載している）において記述されているように、羊水膜を通して移動 させる。阻害抗体の存在下において羊水膜を通して移動する細胞は、フントロー ル抗体の場合よりも少ない。

実施例ＶＩｌｌ 放・　０ｔｉ４−Ａ　　　におけるラミニン　０　のマイクロタイターウェルを 、実施例ＩＶにおいて記述したようにＰＢＳ中の１から２μしでラミニンにより コートした。次いで、実施例■において記述したように、　　Ａ−４３１または ＲｕＧ１１細胞から単離したラミニン受容体を単独で（ＬＭ）　、　　またはラ ミニンの牛モトリプシン消化断片（ｃｈｙｍｏ、　ｆｒａｇ、　、　２５　）ｔ 、　ｇ／ｍＬ。

Ｄｉｌｌｎｅｒら、前出）、１ｌｏｋＤのフィブロネクチンの断片（Ｐｉｅｒ５ ｅｈｂａｃｈｅｒら、　　Ｃｅ１ｌ　２６：２Ｓ９−２６７　（１９８１）にお ける１１０　　ｋＤ　ｆｒａｇ−＋　２５μｇ／＋ｍＬ、　１２０　ｋＤの断片 ）、または標識されなイラミニン受容体（Ｃｏｌｄ　ＬＭＲ）の存在下において マイクロタイターウェルに加えた。

その結果を第７図に示す。データは、ラミニン結合が阻害されていないときを１ ００パーセントとして比較した場合の結合したラミニン受容体の割合（百分率） を示す。観察されるように２分子のＣＱＯＨ末端部末端酸する部分由来のラミニ ンの細胞付着促進断片は、ラミニン受容体がラミニンでコートされたウェルへ結 合するのを阻害した。更に２　分子の細胞付着領域由来のフィブロネクチン断片 もまた。阻害的であった。予想されたように、コントロールとしてテストされた 標識されないラミニン受容体はまた。放射性受容体の結合を阻害した。

１１よ立皿■ 本発明によれば、細胞および組織でのラミニン受容体の分析における直接的で迅 速な利用が達成される。上記の単離方法は、培養細胞または組織サンプルをラミ ニン受容体の含量について分析するのに使用され得る。このような分析は、腫瘍 等の細胞の付着能力を決定するのに重要である。あるいは。

単離された受容体は、受容体の定量のための抗体を調製するために使用され得る 。このような抗体と共に、受容体は、放射性免疫分析またはＥＬＩＳＡのような 受容体についての分析を確立させるであろう。受容体へ結合する化合物は、受容 体のラミニンへの結合と競合するように、受容体と共に選択され得。

例えば腫瘍侵入中の腫瘍細胞の基部膜への付着を防ぐ場合に有用である。あるい は、不溶形態である場合に、この様な基質は１組織再構築におけるラミニンの細 胞付着促進効果を再生するために使用され得る。上記実施例において記述される ラミニン受容体で主としてなる試薬は、基質を選択された組織に運搬するのに使 用され得る。

本発明は、現在における好ましい実施態様を参照して説明したが１本発明の精神 を逸脱しないようになされた様々な改変が可能であることは理解されなければな らない。従って。

本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。

（以下余白） ？　　２　３　４　５　６　７　８　９１０ｊ＋１２Ｍ３α１ ＦＩＧ、　６ Ｃｈｙｍｏ、　ｍｇ、　ｌ　ｌ　ＯｋＤ　Ｃｒａｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＬＭＲ譲　１ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年１１月２０日 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２２４０ ２、発明の名称 ラミニンの付着受容体およびその使用 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０３７ラ　ホヤ、ノース　トレイ 　パインズ　ロード　１０９０１名称　ラ　ホヤ　キャンサー　リサーチ住所　 〒５４０大阪府大阪市中央区域見−下目２番２７号５、補正書の提出年月日 １９９０年８月３１日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　１通力式■ 、ζて；］〉、審査 明細書 ラミニンの・　　０　およびその 良豆旦公団 本発明は、一般に細胞付着システムに関し、特にラミニンの付着受容体に関する 。

及肌立！見 細胞表面において起こることの多くは、その周囲にある物質の細胞による認識に 関連する。第１の例は、細胞による可溶性ホルモンの結合およびそのような結合 に対する反応である。細胞表面認識のもう１つの重要な局面は、細胞とそれを取 り巻く不溶性構造物との相互作用である。このような構造物は、その他の細胞ま たは細胞外マトリックスの表面であり得る。

細胞間および細胞外マトリックスとの相互作用についてはまだ充分に理解されて いないが、それらは細胞の生命において重要な役割を果たしている。例えば、細 胞マトリックスおよび細胞間の相互作用によって、細胞が体内のどの部分に存在 するべきか、または移動する場合には、どの部分に移動するべきかが決定される ようである。特に興味深い例は、プロセスを適切な部位へ送る神経細胞であり、 それによって体内の離れた部位への連絡が形成される。腫瘍がその起源細胞に不 適切な体内の部分へ侵入および散在するため２部位シグナルは、明らかに癌中に おいて損なわれている。事実、我々の細胞マトリックスおよび細胞間の相互作用 の理解が高まり。

その探求が可能になるにつれて、この分野は新しく重要な医学の最先端として発 展していくであろう。

細胞表面におけるタンパクおよび糖は両方とも細胞マトリックスおよび細胞間の 相互作用に参与し得る。細胞外マトリックスは細胞によって配置されるタンパク および糖の不溶性網状組織から構成され、細胞内空間の大半を占める。体内にお ける異なる部位のマトリックスは、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン 、ヒアルロン酸およびフィブロネクチンおよびラミニン等の様々な糖タンパクの 異なる組合せからなる。事実、同定された細胞外マトリックス糖タンパクおよび コラーゲンはすべて細胞と相互作用する。

（以下余白） 実施例ＩＩ ラミニン　内　のリポソームへの　　およびリポソームの基に二症金 細胞表面受容体を含むホスファチジルコリンリポソームを。

フィブロネクチン受容体（Ｐｙｔｅｌａら、　　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　１４４：４７５−４８９．１９８７）について説明したように、実質的にＭｉ ｍｍｓら。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：８８３、（１９８１）の方法によって調製し た。これらの引例は両方とも本願において参考として記載されている。

卵黄ホスファチジルコリン（Ｓｊｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ｌ＋ｌＯ） および３Ｈ−ホスファチジルコリン（Ｎｅｗ　ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 、　ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ）を１００μｇ／ｌで受容体画分中に溶解させ１次いでこの溶液を５００　 ｒｒｒＭのＮａＣ１，ｉ　ｄのＣａ２Ｃ１および１　ｎＭのＭｇ２Ｃ１を含有す る５０　ｍＭのトリスＨＣＩに対して４°Ｃで２４時間透析した。生成したリポ ソームを超遠心分離においてシミ糖勾配の表面に浮揚させることＩこよって単離 し、様々な基質を結合するためにテストした。

ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｆｔｅｒｔｅ ｋ、　　Ｉｎｇｌｅｗｏｏｄ、ＣＡ）　　を、　　Ｅｒ＋ｇｖａｌｌら、　　Ｊ 、Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　　３０３：２４５？　（１９８６）　（本願で参 考として記載されている）の方法に従って、ラミニン、フィブロネクチン、コラ ーゲンおよびビトロネクチン（Ｔｅｌｉｏｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｆｃａｌｓ 、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を含む細胞外マトリックスタンパ クで、　　（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ使用）４０Ｃで一夜コートすることによっ て調製した。バックグラウンドの非特異的結合を決定するために、ウシ血清アル ブミン（ＢＳ＾；　５＋ｍｇ／ｍＬ）によるコーティングを使用した（Ｓｉｇ＋ ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）。ラミニン 受容体−リポソームの調製物は、ラミニンでコートされたマイクロタイターウェ ルへの強力な供与型依存性の結合を示し、フィブロネクチンにわずかに結合し、 そして第５図に示すように、コラーゲンタイプＩまたはＩＶあるいはビトロネク チンへのノイ・ツクグラウンドを越えた結合を示さなかった。

同様のＲｕＧ１１細胞抽出物から単離されたフィブロネクチン受容体を、リポソ ーム分析において比較のために使用した。この受容体で調製されたリポソームは 、ラミニン受容体リポソーＡよりも大きな割合でフィブロネクチンに結合し、ラ ミニンへの結合は示さなかった。更に、特性制御には、キモトリプシンにより切 断された細胞付着促進ヒトラミニン断片をリポソーム分析へ加えることによる。

ラミニン受容体結合の阻害が含まれた。これらの断片は、ラミニン受容体リポソ ームのラミニンへの結合を阻害したが、　　ＧＲＧＤＳＰペプチドまたはＹＩＧ ＳＲラミニンペプチドは阻害しなかった。これらの分析の代表的な結果を第５図 に示す。

（以下余白） 請求の範囲： １．２つのサブユニットを含むことを特徴とし、そのうちの１つがインテグリン α３で９　該α３サブユニツトが更に２つのジスルフィド結合ポリペプチドを含 み、該受容体が選択的にラミニンまたはラミニンの細胞付着促進断片と結合する 。

実質的に純粋な活性哺乳類インテグリンラミニン付着受容体。

２、前記哺乳類がラットである。請求項１に記載の受容体。

３、前記哺乳類がヒトである。請求項１に記載の受容体。

４、前記受容体が、ラミニンまたはラミニン細胞付着促進断片トの選択的結合物 から、エチレンジアミノテトラ酢酸によって溶離され得る。請求項１に記載の受 容体。

５６　　脂質小胞に取り入れられた請求項１に記載の受容体を含む組成物。

６、基質にコートされた請求項１に記載の受容体を含む組成物。

７、リガンド結合活性を保持する請求項１に記載の受容体の断片を含む組成物。

８、以下の工程を包含する。インテグリンラミニン付着受容体を哺乳類細胞抽出 調製物から単離する方法：ａ、ラミニンの細胞付着促進部位をマトリックスに結 合させてアフィニティーカラムを構成する工程；ｂ、単離されるべき細胞表面受 容体とラミニン細胞付着部位との間の結合を形成するために、二価カチオンの存 在下でカラムに該哺乳類細胞抽出調製物を流す工程；Ｃ１該結合に干渉し該細胞 表面受容体を選択的に溶離し得る物質を含む溶液で該カラムを溶離する工程；お よびｄ、このように溶離された該細胞表面受容体を採収する工程。

１０、該親和性マトリックスがセファロース３である。請求項８に記載の方法。

１１、前記物質が、　　ＲｕＧ１１ダリア芽細胞腫細胞およびＭＧ−６３骨肉腫 細胞の付着によって規定されるラミニンの細胞付着部位を含む、請求項８に記載 の方法。

１２、　　前記細胞抽出調製物が培養哺乳類細胞由来である。請求項８に記載の 方法。

１３、前記細胞抽出調製物が哺乳類組織由来である。請求項８に記載の方法。

１４、　　前記細胞抽出調製物がヒト細胞由来である。請求項８に記載の方法。

１５、前記ヒト細胞が骨肉腫細胞である。請求項１４に記載の方法。

１６、前記細胞抽出調製物が胎盤組織由来である。ｉｆｌ求項８に記載の方法。

１７、前記細胞抽出調製物がラット細胞由来である。請求項８に記載の方法。

１８、請求項１に記載のインテグリンラミニン付着受容体に対するポリクローナ ル抗体。

１９、前記抗体が前記インテグリンラミニン付着受容体のαサブユニットと反応 性を有する。請求項１８に記載の抗体。

２０、　５求項ｌに記載の精製インテグリンラミニン付着受容体で免疫すること によって形成されるモノクローナル抗体。

２１、　　前記抗体が前記インテグリンラミニン付着受容体のαサブユニットと 反応性を有する。請求項２ｏに記載の抗体。

２２、請求項１に記載のインテグリンラミニン付着受容体のβサブユニ、トと反 応性を有するか、β１と反応性を持たない抗体。

２３、以下の工程を包含する。サンプル中のインテグリンラミニン付着受容体の 存在を決定する方法：ａ、ラミニン付着受容体と反応性を有する抗体を提供する 工程； ｂ、該サンプルを該抗体と接触させる工程：およびＣ０該抗体と該サンプルの成 分との結合、ここで該結合は該サンプル中に該ラミニン受容体が存在することを 示す、を検出する工程。

２４、前記抗体がポリクローナル抗体である。請求項２３に記載の方法。

２５、前記抗体がモノクローナル抗体である。請求項２３に記載の方法。

２６、以下を包含する。特異的組織成分に薬剤を標的化する方法： ａ、インテグリンラミニン付着受容体を、そこに含まれる薬剤を有するリポソー ムに取り入れること；およびす、該取り入れたリポソームを該特異的組織成分に 供与し。

該取り入れたリポソームの結合を達成させること。

２７、以下の工程を包含する。インテグリンラミニン付着受容体と結合する化合 物をスクリーニングする方法：ａ、該化合物を該受容体と接触させる工程；およ びす、該化合物の該受容体との結合を決定する工程。

２８、インテグリンラミニン付着受容体と結合し、該受容体の該ラミニンへの結 合を阻害する化合物を提供することによって、ラミニン付着受容体のラミニンへ の結合を阻害する方法。

２９、インテグリンラミニン付着受容体と結合し、該受容体の基質への結合を阻 害する可溶化化合物を提供することを包含する。インテグリンラミニン付着受容 体を表現する細胞の該基質への付着を阻害する方法。

３０、インテグリンラミニン付着受容体と結合し、基質への付着を促進する不溶 性化合物を提供することを包含する。インテグリンラミニン付着受容体を表現す る細胞を付着させる方法。

国際調査報告　　ＰＣＴ／ＩＪＳＢ９／Ｊ２２４゜１−１９＋１φ−０＾−□Ａ ６Ｐζ−畷訃””ＰＣＴ／１ｌｓ８９１０２２４０−一’１４６４４ＡＣＥ（１ １６＋〜’ｔＭ””／ｌＩｃ０ＯｌｎっｊＡｎＰＣＴ／’ｔＪｓ８９１０２２ム つ ＡＴＴＡＣＨＴｏ　ＰＯＲＭ　２１０．　ＳＵＰ！’ＬＥＭＥＮ’ｒＡＬＳＦＥ ＥＴ　（２）、　ＰＡＲＴ　Ｖ工Ｇｒｏｕｐ　Ｈ工、　ｅｌａｌｍ　２ｇ、　ｄ ｒａｗｎ　ｔｏ　ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ　＊ｅｔｈ＋ｘｌｓ　ｕｓ１ｎ６１！ｐ ｏｓｗａｓ　ｂｅａｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｃｓｐｔｏｒ。

リカ合衆国　カリフォルニア　９２１２２　　サンディエゴ、ノ（ルミドライブ 　７６４６−１６

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．２つのサブユニットを含むことを特徴とし，そのうちの１つがα３で，該α ３サブユニットが更に２つのジスルフィド結合ポリペプチドを含み，該受容体が 選択的にラミエンまたはうミエンの細胞付着促進断片と結合する，実質的に純粋 な活性ラミエン付着受容体。
2. ２．前記哺乳類がラットである，請求項１に記載の受容体。
3. ３．前記哺乳類がヒトである，請求項１に記載の受容体。
4. ４．前記受容体が，ラミエンまたはうミエン細胞付着促進断片との選択的結合物 から，エチレンジアミノテトラ酢酸によって溶離され得る，請求項１に記載の受 容体。
5. ５．脂質小胞に取り入れられた請求項１に記載の受容体を含む組成物。
6. ６．基質にコートされた請求項１に記載の受容体を含む組成物。
7. ７．リガンド結合活性を保持する請求項１に記載の受容体の断片を含む組成物。
8. ８．以下の工程を包含する，ラミエン細胞表面受容体を哺乳類細胞抽出調製物か ら単離する方法：ａ．ラミエンの細胞付着促進部位を提供する工程；ｂ．アフィ ニティーカラムを構成するために該物質をマトリックスに結合させる工程； ｃ．単離されるべき細胞表面受容体とラミエン細胞付着部位との間の結合を形成 するために，二価カチオンの存在下でカラムに該細胞抽出調製物を流す工程；ｄ ．該細胞表面受容体を選択的に溶離し得る物質を含む溶液で該カラムを溶離する 工程；および ｅ．このように溶離された該細胞表面受容体を採収する工程。
9. ９．請求項６に記載の方法によって単離された受容体。
10. １０．該親和性マトリックスがセファロースＲである，請求項８に記載の方法。
11. １１．前記物質が，ＲｕＧｌｉグリア芽細胞腫細胞およびＭＧ−６３骨肉腫細胞 の付着によって規定されるラミエンの細胞付着部位を含む，請求項８に記載の方 法。
12. １２．前記細胞抽出調製物が培養哺乳類細胞由来である，請求項８に記載の方法 。
13. １３．前記細胞抽出調製物が動物組織由来である，請求項８に記載の方法。
14. １４．前記細胞抽出調製物がヒト細胞由来である，請求項８に記載の方法。
15. １５．前記ヒト細胞が骨肉腫細胞である，請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記細胞抽出調製物が胎盤組織由来である，請求項８に記載の方法。
17. １７．前記細胞抽出調製物がラット細胞由来である，請求項８に記載の方法。
18. １８．請求項１に記載のラミエン付着受容体に対するポリクローナル抗体。
19. １９．前記抗体が前記ラミエン付着受容体のαサブユニットと反応性を有する， 請求項１８に記載の抗体。
20. ２０．請求項１に記載の精製ラミエン受容体で免疫することによって形成される モノクローナル抗体。
21. ２１．前記抗体が前記ラミエン付着受容体のαサブユニットと反応性を有する， 請求項２０に記載の抗体。
22. ２２．ラミエン付着受容体のβ鎖と反応性を有するか，β１と反応性を持たない 抗体。
23. ２３．以下の工程を包含する，サンプル中のラミエン付着受容体の存在を決定す る方法； ａ．ラミエン付着受容体と反応性を有する抗体を提供する工程； ｂ．該サンプルを該抗体と接触させる工程；およびｃ．該抗体と該サンプルの成 分との結合，ここで該結合は該サンプル中に該ラミエン受容体が存在することを 示す，を検出する工程。
24. ２４．前記抗体がポリクローナル抗体である，請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記抗体がモノクローナル抗体である，請求項２３に記載の方法。
26. ２６．以下を包含する，特異的組織成分に薬剤を標的化する方法： ａ．ラミエン付着受容体を，そこに含まれる薬剤を有するりボソームに取り入れ ること； ｂ．該取り入れたりボソームを該特異的組織成分に供与すること。
27. ２７．以下の工程を包含する，ラミエン付着受容体と反応性を有する化合物をス クリーニングする方法：ａ．リガンドを該受容体と接触させる工程；およびｂ． 該化合物の該受容体との反応性を決定する工程。
28. ２８．ラミエン付着受容体と反応する化合物を提供することによってラミエン付 着受容体のラミエンヘの結合を阻害する方法。
29. ２９．ラミエン付着受容体と反応性を有する可溶化化合物を提供することを包含 する，ラミエン付着受容体を表現する細胞の基質への付着を阻害する方法。
30. ３０．ラミエン付着受容体と反応性を有する不溶性化合物を提供することを包含 する，ラミエン付着受容体を提示する細胞の基質への付着を促進させる方法。