JP5797051B2 - 脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法 - Google Patents
脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法 Download PDFInfo
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ラミニンの活性は、ラミニンと細胞表面の受容体との結合及びそれに共役した細胞内シグナル伝達を介したラミニンシグナル系を通じて発揮されると考えられている。ラミニンを受容する主要な受容体としては、インテグリンα6β1、α3β1、α6β4、α7β1、ジストログリカン、シンデカン等が知られている(非特許文献8)。インテグリンは、α−サブユニットとβ−サブユニットからなるヘテロダイマータンパク質である。現在哺乳類においてα−サブユニット18種、β−サブユニット8種の組み合わせにより24種のインテグリンが報告されており、各インテグリンはECMリガンドを特異的に認識する(非特許文献9)。インテグリン下流の主要な情報伝達経路としては以下の3つが挙げられる。第一にRhoを介しアクチンなど細胞骨格系制御に働く経路、第二にPI3K/Aktのリン酸化を介した、アポトーシス抑制など生存維持に関するシグナルを伝達する経路、第三にMAPK(Erk)のリン酸化を介し細胞増殖に関するシグナルを伝達する経路である。
(1)脂肪細胞における試験物質によるラミニンシグナル抑制活性を評価することを特徴とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法。
(2)上記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニンとラミニン受容体との結合を阻害する活性である(1)記載の方法。
(3)上記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニン又はラミニン受容体の発現を抑制する活性である(1)記載の方法。
(4)上記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニンに起因する細胞内シグナル伝達を抑制する活性である(1)記載の方法。
従って、本発明は、脂肪細胞における試験物質によるラミニンシグナル抑制活性を評価することを特徴とする脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法を提供する。
ラミニン受容体としては、インテグリンα6β1、α3β1、α6β4、α7β1等のインテグリン、ジストログリカン、シンデカン等が挙げられる。
(a)細胞培養容器底面をラミニン精製物によりコートする。別途、ラミニンコートしない培養容器を用意する。
(b)ラミニンコート及び非コートの培養容器に、脂肪由来細胞をそれぞれ播種する(それぞれ、試験群及び対照群)。通常、培地は10%calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を使用する。播種した細胞を37℃、5%CO2条件下にて培養する。
(c)細胞を100%コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換する。分化誘導培地は、通常培地に5μg/mlインスリン、1μMデキサメタゾン、0.115mg/mlイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いる。分化誘導培地に交換した日をday1とし、day3に再び通常培地に培地交換する。以後は2日おきに培地交換を行う。
(d)上記(b)〜(c)のいずれか、あるいは全工程において、試験群の培地に試験物質を含有させておく。
(e)day10に細胞のラミニンシグナルを測定し、対照群と試験群との間で測定値を比較し、試験物質のラミニンシグナルに対する影響を評価する。ラミニンシグナル抑制活性が認められた試験物質を、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤として選択する。
実験には、マウス前駆脂肪細胞由来細胞株3T3−L1細胞(ATCC)を用いた。通常の培地は、10%calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を使用し、37℃、5%CO2条件下にて培養した。
ラミニンでコートした6穴ディッシュ(BD社)に3T3−L1細胞を撒き、100%コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換した。分化誘導培地は、通常培地に5μg/mlインスリン、1μMデキサメタゾン、0.115mg/mlイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いた。分化誘導培地に交換した日をday1とし、day3に再び通常培地に培地交換した。以後は2日おきに培地交換を行い、day10に細胞を回収した(ラミニン群)。対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した(コントロール群)。
Fabp4は脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られている。PPARγは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして知られている。またGLUT4及びLPLは糖・脂質取り込みに関連する遺伝子であり、ACC-1、FAS及びDGATは脂質合成関連遺伝子であり、HSL及びATGLは脂質分解関連遺伝子であり、これらはいずれも、エネルギー代謝に関わる主要遺伝子として知られている。
測定した各遺伝子の発現量は、内部標準(36B4遺伝子発現量)により補正した。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した(n=3)。有意差検定はStudent’s t−testを用いて行った。
実施例1と同様の手法にて回収された脂肪細胞を10%ホルマリンで固定後、細胞内の脂肪滴をOil−red O染色液により染色し、実体顕微鏡により観察、撮影を行った。Oil−red O染色液は、Oil red−Oストック溶液(0.5%Oil red−O/イソプロパノール)とDDWを3:2で混合し、0.5mmフィルターにてろ過したものを用いた。細胞の染色度(脂肪含有量)を定量するため、イソプロパノールにより細胞から色素を抽出し、吸光度OD450を測定し、コントロール群の吸光度を1とした相対吸光度を求めた。得られた吸光度は平均値±標準誤差にてグラフ化した(n=3)。有意差検定はStudent’s t−testを用いて行った。
本実施例では、Akt、Erk及びIRS-1と、それらの活性化(リン酸化)形態p-Akt、p-Erk及びp-IRS-1をウエスタンブロッティングにて検出し、分子の活性化に対するラミニンの影響を調べ、ラミニンが細胞内シグナル伝達系に及ぼす作用を評価した。Akt、Erk、insulin receptor substrate(IRS)-1は、インスリン受容体の下流に存在し、そのリン酸化を介してインスリン刺激によるシグナルを伝達する、インスリンシグナル伝達分子である。
回収した細胞にLysis buffer(50mM Tris−HCl pH7.5、150mM Sodium Chloride、1% Triton X−100)を加え、25Gニードルにてよくホモジナイズした。氷上に15分間静置後、12000rpm、4℃で10分間遠心した。上清をタンパク質溶液として得た。
得られたタンパク質溶液をサンプルとして、以下の抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、上記各分子の検出を行った。
anti-Akt (cell signaling;#9272)
anti-phospho-Akt Ser473(cell signaling;#9271)
anti-Erk1/2 (cell signaling;#4695)
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anti-IRS-1 (upstate biotechnology;#06-248)
anti-phospho-IRS-1 Tyr895 (cell signaling;#3070)
一方、ラミニンによる上記分子の活性化促進作用は、インスリンが存在しない場合には観察されなかった(図3B)。従って、ラミニンはこれらの分子のリン酸化を直接的に誘導しているのではなく、インスリン刺激による分子のリン酸化を補助していると考えられることから、ラミニンに起因して活性化される他の細胞内シグナル伝達分子の存在が示唆された。上記のインスリンシグナル伝達分子だけでなく、ラミニンに起因して活性化されるその他の細胞内シグナル伝達分子の活性もまた、脂肪細胞の分化成熟や脂肪蓄積を評価するための指標とすることができる。
ラミニンが対応する受容体へ結合することを競合的に阻害するラミニン部分ペプチドYIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg:配列番号1、Graf et al, Biochemistry, 1987, 26(22):6896-6900、及び野水基義,蛋白質・核酸・酵素, 2000, 45(14):2475-2482を参照)のC末アミド化体を用いて、ラミニンシグナル抑制による脂肪細胞の分化成熟抑制効果を調べた。
ラット皮下脂肪由来の初代培養細胞を、配列番号1で示されるペプチドのC末アミド化体(終濃度100μg/ml)を添加した通常培地に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした後、ラミニンでコートした6穴ディッシュ(BD社)に播種した。以後、全ての培地に上記ペプチドのC末アミド化体(終濃度100μg/ml)を添加した以外は、実施例1と同様の手法にて細胞を培養し、脂肪細胞を回収した(ラミニン+阻害ペプチド群)。比較対照として上記ペプチドを添加せずに同様の条件下で培養した細胞を回収した(ラミニン群)。陰性対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した(コントロール群)。
Claims (5)
- 脂肪細胞における試験物質によるラミニンシグナル抑制活性を評価することを特徴とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び/又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法であって、
該ラミニンシグナルが、Fabp4、PPARγ、GLUT4、LPL、ACC-1、FAS及びDGATからなる群より選択される1以上の遺伝子の発現である、方法。 - 前記遺伝子の発現量の上昇がラミニンシグナルの活性化を表す、請求項1記載の方法。
- 前記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニンとラミニン受容体との結合を阻害する活性である請求項1又は2記載の方法。
- 前記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニン又はラミニン受容体の発現を抑制する活性である請求項1又は2記載の方法。
- 前記ラミニンシグナル抑制活性が、ラミニンに起因する細胞内シグナル伝達を抑制する活性である請求項1又は2記載の方法。
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