DE68924517T2

DE68924517T2 - Wässerige Suspension für diagnostischen Test.

Info

Publication number: DE68924517T2
Application number: DE68924517T
Authority: DE
Inventors: Wilfridus Maria Brouwer
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2009-11-04
Also published as: CA2002672A1; DK567389A; DK567389D0; AU4462289A; KR900008277A; EP0369515A1; FI895366A0; ZA898482B; ATE129075T1; ES2080740T3; US5635405A; DE68924517D1; EP0369515B1; AU637333B2; JPH02183165A; IE893553L; FI98863B; FI98863C; IE71197B1; US5583056A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine wässrige Suspension für diagnostische oder immundiagnostische Tests, die nichtpolymere Kerne umfasst, die von einem hydrophilen Copolymer, welches funktionelle Gruppen enthält, umgeben sind, und auch auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Suspension.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz oder einer immunochemisch aktiven Komponente in einer Testflüssigkeit und auf ein Reagenz und eine Testgarnitur, die bei Anwendung besagter Nachweisverfahren benutzt werden.
Die oben erwähnte Suspension und ein Verfahren zur Herstellung der Suspension sind aus U.S. Patent 4,157,323 bekannt. Die Partikel der darin beschriebenen Suspensionen sind Mikrosphären, die aus einem Copolymer bestehen, in dem fein verteiltes Metall oder Metalloxid eingebettet ist, wie in Figur 1 abgebildet.
In immundiagnostischen Tests werden häufig Proteine verwendet, die an einen Marker gekoppelt sind. Kolloidale Partikel, an die das Protein physisch adsorbiert ist, werden dann als Marker verwendet. Damit verbundene Nachteile sind unter anderem die schlechte Reproduzierbarkeit der Herstellung des Testmaterials und das Auslaufen von Protein. Letzteres heisst, dass das aktive Protein nicht stabil an die Partikel gebunden ist, als Folge davon vermindert sich die Empfindlichkeit des Tests während der Lagerung.
Die Verwendung von Markern, an die Proteine kovalent gebunden werden können, wie in U.S. Patent 4,157,323 beschrieben, kann eine Lösung für Probleme dieser Art sein. In diesem Fall besteht der aktuelle Marker aus den nichtpolymeren Partikeln. Unter Marker wird die Komponente verstanden, die aufgrund einer spezifischen Eigenschaft (Farbe, Radioaktivität und ähnliches) nachgewiesen werden kann.
Die Suspension aus dem oben erwähnten Patent weist mehrere Nachteile auf. Erstens umfasst das feste Material in dieser Suspension höchstens 50 Gewichtsprozent nichtpolymere Kerne. Dies bedeutet, dass die Nachweisempfindlichkeit und die Anzahl der Anwendungsmöglichkeiten im Vergleich mit Markern, bei denen Protein direkt an die Kerne gebunden ist, reduziert sind. Zweitens kann eine kolloidale Goldlösung zum Zweck von Agglutinationstests nicht in dieser Suspension verwendet werden. Goldpartikel bilden jedoch einen sehr geeigneten Marker durch die Eigenschaft, dass die Farbe einer stabilen Gold-Kolloidlösung rot ist, während die Farbe beim Ausflocken nach blau umschlägt (Agglomeration der Partikel in Tests unter Einfluss des nachzuweisenden Proteins). Wenn Goldkerne in einer Suspension gemäss U.S. Patent 4,157,323 verwendet werden, ist die Farbe der suspendierten Partikel entweder blau oder rot, aber diese Farbe kann sich beim Ausflocken nicht ändern.
Wenn die Partikel blau sind, sind die Goldkerne so dicht aneinander gepackt, dass bereits eine Agglomeration in jedem Partikel angenommen werden kann; siehe Figur 2.
Wenn die Partikel rot sind, werden die Kerne voneinander durch das Copolymer getrennt und werden das auch bleiben, sogar nach Agglomeration der polymeren Sphären, infolge dieser die Farbe nicht umschlägt (siehe Figur 3).
Ausserdem weist diese Suspension auch einen Nachteil bei der Verwendung von kolloidalen Farbstofflösungen als Kern auf. Aus EP 0 032 270 ist bekannt, dass beim Nachweis von kolloidalen Farbstofflösungen die Farbintensität durch Lösen der Kolloidpartikel in einem organischen Lösungsmittel gesteigert werden kann. Im Fall von Farbstoffpartikeln, die in der dicken Polymerhülle von US 4,157,323 eingebettet sind, ist das nicht mehr möglich. US-A-4 454 234 offenbart Mikropartikel, die einen Kern von magnetisch reaktivem Material und eine aus kreuzvernetztem polymerem Material gebildete Beschichtung mit chemisch reaktiven Gruppen an der Oberfläche umfassen.
Die festen Bestandteile einer der Erfindung gemässen Suspension weisen einen Gehalt an nichtpolymeren Kernen von mindestens 50% Gewichtsprozent auf, und diese Suspension erlaubt einen Farbumschlag durch Agglomeration, wenn Goldkerne verwendet werden. Ausserdem ist das Polymer, welches die Kerne umgibt, dünn genug um - über Anschwellen - die Verteilung von Farbstoffkernen in einem organischen Lösungsmittel zu gestatten.
Die Erfindung besteht darin, dass in einer Suspension der oben erwähnten bekannten Art die nichtpolymeren Kerne jeder einzeln von einer eigenen Hülle aus dem Copolymer umgeben sind. Dies wird in Figur 4 dargestellt.
Partikel dieser Konstruktionsart vereinigen die Vorteile der polymeren Oberfläche mit den Eigenschaften des Kerns in einem Verhältnis, das so vorteilhaft wie möglich ist. Der Gehalt an nichtpolymeren Kernen hängt von der Art des Kerns und der Dicke der polymeren Umhüllung ab. Im Fall von Gold kann dieser mehr als 90% betragen. Die Dicke der Umhüllung kann von etwa 3 bis etwa 70 nm variieren, was unter anderem von den Versuchsbedingungen abhängt.
Nichtpolymere Kerne sind beispielsweise Kerne von Metall, Metalloxid, Metallegierungen, wobei das Metall nicht magnetisch reagiert, andere anorganische Verbindungen wie Kieselerde, organische Farbstoffe oder organische Pigmente und Emulsionströpfchen aus synthetischen, tierischen, pflanzlichen oder Mineralölen. Nichtpolymere Kerne, die aufgrund einer einzigartigen Eigenschaft am besten nachweisbar sind, sollten bevorzugt werden. Das sind aufgrund des bereits erwähnten Farbumschlags nach Agglomeration Gold oder Hämatit (Fe&sub2;O&sub3;) aufgrund der rot-braunen Farbe.
Wenn Farbstoffe in kolorimetrischen Tests verwendet werden, ist es bei korrekter Auswahl des Farbstoffs möglich eine höhere molare Absorption - und damit eine höhere Empfindlichkeit - als mit kolloidalen Metallösungen zu erhalten. Ausserdem kann, wie oben erwähnt, nachträglich eine Verstärkung der Farbe erreicht werden.
Unter Copolymeren, die funktionelle Gruppen enthalten, werden Copolymere verstanden, die Gruppen wie OH, NH&sub2;, COOH, CHO, SH, NN&spplus;Cl&supmin; enthalten, an welche Proteine direkt oder nach chemischer Behandlung kovalent gebunden werden können.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Suspension, gemäss der oben beschriebenen Erfindung. Beim bekannten Verfahren gemäss US 4,157,323 werden Suspensionen durch in-situ-Copolymerisation eines in Wasser gelösten Gemisches von Monomeren in Gegenwart von nichtpolymeren Partikeln hergestellt, wobei das Monomergemisch folgende Monomerarten enthält:
- ein ethylenisch ungesättigtes Monomer, das ohne Hydrolyse oder nach Hydrolyse mindestens eine kovalent bindende funktionelle Gruppe enthält;
- ein hydrophobes Monomer;
- ein vernetzendes Monomer.
Bei diesem Verfahren werden die nichtpolymeren Partikel in der Monomerlösung dispergiert. Zusätzlich zu den oben geschilderten Nachteilen, welche die gebildeten Partikel besitzen, weist auch das Verfahren mehrere Nachteile auf. So werden auch reine Polymersphären ohne einen Kern gebildet. Diese sind unerwünschte Nebenprodukte, die entfernt werden müssen. Zusätzlich kann die Agglomeration von Partikeln nicht vermieden werden. Dies kann durch Zugabe eines Stabilisators, zum Beispiel eines nichtionischen Netzmittels, verhindert werden. In Markern für Proteine stört eine Substanz dieser Art normalerweise die Bindung und Konformation der Proteine. Wenn Partikel, die gemäss einem solchen Verfahren hergestellt wurden, für immundiagnostische Tests verwendet werden, müssen separat zugegebene Netzmittel wieder entfernt werden. Dies ist jedoch häufig nur teilweise erfolgreich.
Das Ziel bei dem der Erfindung gemässen Verfahren ist es, nichtpolymere Partikel mit ihrer eigenen, separaten Copolymerhülle zu versehen, was ermöglicht, die Verwendung von Netzmitteln zu vermeiden und wobei keine reinen Copolymersphären gebildet werden.
Das der Erfindung gemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine stabile, kolloidale Dispersion der nichtpolymeren Partikel, die nicht magnetisch reagieren, als Ausgangsmaterial verwendet wird, und dass das Monomergemisch dazu gegeben wird, wobei das Monomergemisch so gewählt wird, dass das resultierende Copolymer eine Ladung mit identischem Vorzeichen wie die ursprüngliche Dispersion trägt.
Das beabsichtigte Vorzeichen der Ladung wird durch die elektrophoretische Mobilität bestimmt. Dieses Konzept ist dem Fachmann bekannt und benötigt keiner weiteren Erläuterung an dieser Stelle.
Wenn die Ladungen der anfänglichen Dispersion oder Emulsion und des Hüllpolymers nicht dasselbe Vorzeichen tragen, findet bei Abwesenheit von Netzmitteln eine Koagulation der Dispersion während der Bildung der Hülle statt. Ladungen mit identischem Vorzeichen werden während der Polymerisation durch Verwenden eines Initiators, der geladene Gruppen mit einer Ladung mit korrektem Vorzeichen zur Verfügung stellt, und/oder Verwendung von geladenen Monomeren mit einer Ladung dieses Vorzeichens erreicht.
Die anfängliche Dispersion kann durch peptisierende Ionen aber auch durch schwach adsorbierende oberflächenaktive Substanzen stabilisiert werden. In dieser Phase verwendete schwach adsorbierende Netzmittel können mittels Mikrofiltration gut entfernt werden und behindern die Verwendung der Suspension in immundiagnostischen Tests nicht.
Die ethylenisch ungesättigten Monomere mit mindestens einer kovalent bindenden funktionellen Gruppe können aus Monomeren, die eine OH-, NH&sub2;-, COOH-, CHO-, SH- oder NN&spplus;Cl&supmin;- Gruppe enthalten, ausgesucht werden. Beispiele dafür sind Ethylenimin, 2,3-Dihydroxypropylmethacrylat, Maleinsäure, Acrylamid, Methylolacrylamid, (Meth)acrylsäure, Aldonsäure, Allylamide wie Arabinonallylamid, Gluconallylamid, α-Glucoheptonallylamid, Lactobionallylamid, Natriumvinylsulfonat, Methallylsulfonat, Dimethylaminoethylmethacrylat, Vinylpyridinsalze, (Meth)acrylsäureester aus Polyethylenglykol und Vinylpyridin bei tiefem pH.
Es ist auch möglich, Monomere zu verwenden, die nach Hydrolyse eine kovalent bindende funktionelle Gruppe enthalten. Beispiele dafür sind:
- Vinylacetat (Hydrolyseprodukt: Vinylalkohol);
- N-vinyl-tertiäres Butylcarbamat (Hydrolyseprodukt: Vinylamin;
- Glycidylmethacrylat (Hydrolyseprodukt: 2,3-dihydroxypropylmethacrylat);
- Diethylmaleat (Hydrolyseprodukt: Maleinsäure).
Die hydrophoben Monomere können aus Monomeren ausgesucht werden, die eine Löslichkeit in Wasser von mindestens 35 g/l bei 20ºC aufweisen. Beispiele dafür sind: Styrol, Butadien, Butylacrylat, Vinylidenchlorid, Vinylchlorid, Ethen, Methylmethacrylat, Ethylacrylat, Vinylester, Diethylmaleat, Glycidylmethacrylat und 2,3-Epithiopropylmethacrylat.
Die vorteilhaftesten hydrophoben Monomere sind jedoch diejenigen, die eine hydrolysierbare Gruppe besitzen, sodass eine hydrophile Einheit im Polymer gebildet wird. Beispiele dafür sind die gleichen hydrolysierbaren Monomere wie oben beschrieben.
Beispiele für vernetzende Monomere sind N,N-Methylenbisacrylamid, Ethylenglykoldimethacrylat, Diallylphthalat, Pentaerythritoltriacrylat und N,N-Diallylweinsäurediamid. Wenn Monomere wie Glycidylmethacrylat und Methylolacrylamid, die schon vernetzbar sind,als hydrophiles und hydrophobes Monomer ausgewählt werden, ist die Zugabe eines separaten vernetzenden Monomers überflüssig. Ein vernetzendes Agens ist ebenfalls unnötig, wenn das Copolymer ausreichend unlöslich im Polymerisationsmedium ist. Dies ist der Fall bei einem Kopolymer aus Styrol oder Acrylamid.
Das Verhältnis, in dem die Monomere ausgewählt werden können, ist abhängig davon, welche Monomere gewählt werden.
Es ist wesentlich, dass das gebildete Hüllpolymer stabilisierende Eigenschaften besitzt. Dies kann dadurch demonstriert werden, dass man das Monomergemisch in Abwesenheit der Kernpartikel polymerisieren lässt, wobei auch Netzmittel nicht anwesend sein dürfen. Ein Copolymer, das eine stabile Emulsion mit einer Partikelgrösse zwischen 50 und 300 nm bildet, bildet sich dann aus geeigneten Monomergemischen.
Ein Reagenz oder ein immunochemisches Reagenz gehört ebenfalls zur Erfindung. Der Begriff Reagenz bedeutet, dass das hydrophile Copolymer, das den nichtpolymeren Kern umgibt, mit einem Reaktionsmittel versehen wird.
Reaktionsmittel, die verwendet werden können, sind Substanzen, mit denen entweder ein Rezeptor oder ein Ligand in einer Rezeptor-Ligand-Kombination reagieren können. In solchen Rezeptor-Ligand-Kombinationen weisen Rezeptor und Ligand eine direkte oder indirekte Bindungsaffinität füreinander auf. Geeignete Rezeptor-Ligand-Kombinationen sind zum Beispiel: Avidin-Biotin oder DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybride. Das besagte Reagenz kann dann in einem Verfahren zum Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in einer Testflüssigkeit verwendet werden, wobei diese Substanz eine Bindungsaffinität für das im Reagenz vorliegende Reaktionsmittel besitzt.
Der Begriff immunochemisches Reagenz bedeutet, dass das hydrophile Copolymer, das den nichtpolymeren Kern umgibt, mit einer immunochemisch aktiven Substanz versehen wird (als Reaktionsmittel). Ein Antikörper, ein Antigen oder Hapten können als immunochemisch aktive Substanz verwendet werden.
Dieses immunochemische Reagenz kann dann in einem Verfahren zum Nachweis von immunochemisch aktiven Komponenten in einer Testflüssigkeit verwendet werden. Die immunochemische Reaktion, die stattfinden sollte, wenn das Nachweisverfahren angewendet wird, ist vorzugsweise eine Sandwichreaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine kompetitive Reaktion oder eine Hemmungsreaktion.
Um beispielsweise ein Antigen in einer Testflüssigkeit nachzuweisen, kann ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper an ein geeignetes Trägermaterial gebunden werden, wonach die Testflüssigkeit in Kontakt mit dem Trägermaterial gebracht wird, und das Vorliegen von Immunkomplexen, die sich zwischen dem Antigen in der Testflüssigkeit und dem Antikörper bilden, durch Zugabe des geeigneten, der Erfindung gemässen, immunochemischen Reagenz zum Trägermaterial nachgewiesen wird, nachdem sich der Immunkomplex gebildet hat.
Trägermaterialien, die verwendet werden können, sind die innere Oberfläche einer Mikrotestvertiefung, ein Röhrchen oder eine Kapillare, eine Membran, ein Filter, Teststreifen oder die Oberfläche eines Partikels wie zum Beispiel ein Emulsionspartikel, ein Erythrozyt, eine kolloidale Farbstofflösung, eine kolloidale Metallösung oder eine Metalllegierung als Partikel einer kolloidalen Lösung.
Eine der Erfindung gemässe Testgarnitur muss als wesentlichen Bestandteil besagtes Reagenz oder immunochemisches Reagenz enthalten.
Die Erfindung wird unten mit Hilfe der folgenden nicht einschränkenden Beispiele und Figuren 1 bis 4 veranschaulicht.
Figur 1 zeigt die Partikel einer Suspension gemäss dem vorherigen Stand der Technik. Hier sind mehrere Kernpartikel pro Partikel eingeschlossen.
Figur 2 zeigt Partikel einer Suspension gemäss dem Stand der Technik, in der die Kerne eng aneinander eingebettet sind.
Figur 3 zeigt Partikel einer Suspension gemäss dem Stand der Technik, in der die Kerne durch das Copolymer voneinander getrennt sind.
Figur 4 zeigt die Partikel einer der Erfindung gemässen Suspension. In diesem Fall besitzt jeder Kern seine eigene Copolymerhülle.

Beispiel 1

Beschichtung von Goldpartikeln mit einer Polymerhülle

Eine kolloidale Goldkeimlösung mit einer Partikelgrösse von etwa 20 nm wird nach dem Verfahren von Frens (Nature, Physical Sci. 241 (1973), 20) hergestellt. Die kolloidale Goldlösung hat einen Feststoffgehalt von 0,006 Gewichtsprozent. 80 ml dieser Kolloidlösung werden in einem doppelwandigen, thermostatkontrollierten Reaktor bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute auf 70ºC erwärmt. 0,1 g Kaliumpersulfat und 0,06 g Natriumhydrogencarbonat, die in 5 ml destilliertem Wasser gelöst sind, werden dann zur Goldkolloidlösung zugegeben, gefolgt von 7 ml der folgenden Monomerlösung:
2 g Methylmethacrylat
1 g Natriumvinylsulfonat
1 g N-Methylenbisacrylamid
50 ml destilliertes Wasser
50 ml Methanol
Die Mischung wird bei 70ºC während 18 Stunden gerührt und danach auf Raumtemperatur gekühlt. Die Zentrifugationstests zeigen, dass sich keine separaten Polymerpartikel gebildet haben. Absorptionsspektren im sichtbaren Licht zeigen, dass keine Partikelhaufen vorliegen und dass sich eine Polymerhülle gebildet hat. Dynamische Lichtstreuungstests und Transmissions-Elektronenmikroskopie zeigen, dass die Dicke der Hülle 77 nm beträgt.

Beispiel 2

Monomergemisch mit hydrolysierbarem hydrophobem Monomer

2.1 Beschichtung von Goldpartikeln mit einer dünnen Polymerhülle

Herstellung der kolloidalen Keimlösung

Eine kolloidale Goldlösung wird durch Reduktion einer Tetrachlorogoldsäurelösung mit Natriumcitrat gemäss dem von Frens beschriebenen Verfahren (Nature, Physical. Sci. 241 (1973), 20) hergestellt. Der Feststoffgehalt ist 0,032 Gewichtsprozent Gold. Die mittlere Partikelgrösse beträgt 55 nm. Die auf diese Weise hergestellte Kolloidlösung ist ohne die Zugabe von Netzmitteln kolloidal stabil.

Beschichtungsverfahren

800 ml der kolloidalen Keimlösung werden in einen thermostatkontrollierten 1-Liter-Reaktor gegeben und unter langsamem Rühren (200 Umdrehungen pro Minute, Anker-Rührer) auf 70ºC erwärmt. 10 ml einer Lösung von 0,32 g Kaliumpersulfat und 0,2 g Natriumhydrogencarbonat in 50 ml destilliertem, entionisiertem Wasser werden dann tropfenweise zur Goldkolloidlösung zugegeben. 25 ml einer Lösung mit der folgenden Zusammensetzung werden dann im Verlauf einer Stunde tropfenweise zur gerührten, warmen Goldkolloidlösung zugegeben:

Zusammensetzung der Monomerbeschickung

0,75 g Glycidylmethacrylat
0,38 g Natriumvinylsulfonat
0,38 g N,N-Methylenbisacrylamid
50 ml destilliertes Wasser
50 ml Methanol
Während demselben Zeitraum wird der verbleibende Teil der Initiator-/Pufferlösung zugegeben. Nach Zugabe der Monomere und des Initiators wird das Gemisch während weiteren 15 Stunden bei 70ºC gerührt. Wenn das gleiche Experiment mit Wasser anstelle des Volumens an Goldkolloidlösung durchgeführt wird, bildet sich eine stabile Emulsion mit einer Partikelgrösse von ungefähr 100 nm.

Eigenschaften der beschichteten Goldkolloidlösung

200 ml der auf diese Weise hergestellten Kolloidlösung werden durch Mikrofiltration mit 6'000 ml destilliertem Wasser gereinigt. Analysen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie und quasielastischer Lichtstreuung zeigen, dass jeder einzelne Goldpartikel mit einer 11 nm dicken Polymerhülle beschichtet ist. Weniger als 5% Polymerpartikel ohne Goldkern werden gebildet. Jeder beschichtete Partikel enthält einen einzelnen Goldkern.
Die gereinigte, mikrofiltrierte Kolloidlösung bleibt in einer Lösung von 0,2 M Natriumchlorid in Wasser kolloidal stabil, sogar nach 60 Stunden. Dagegen flockt die anfängliche Kolloidkeimlösung bei einer Natriumchloridkonzentration von 0,04 M aus.
Die Farbe der beschichteten Kolloidlösung ist praktisch identisch mit derjenigen der Kolloidkeimlösung. Maximale Absorption kommt bei den Wellenlängen 539 und 533 nm vor. Beim Ausflocken, beispielsweise unter dem Einfluss von Natriumchlorid, wird sowohl bei der Kolloidkeimlösung als auch bei der beschichteten Kolloidlösung der charakteristische Farbumschlag von rot-rosa nach blau und schliesslich grau-farblos nachgewiesen.

2.2 Chemische, kovalente Bindung von Immunoglobulin G (antihumanes Choriongonadotropin, a-hCG) an eine polymerbeschichtete Goldkolloidlösung

Einführen von Aldehydgruppen

100 ml der eingekapselten, mikrofiltrierten Goldkolloidlösung aus Beispiel 2.1 werden mit 8,7 ml einer 0,5 M Natriumperiodatlösung bei pH = 4,6 gemischt.
Die beschichtete, mikrofiltrierte Goldkolloidlösung, gemischt mit 8,7 ml destilliertem Wasser, wird als Kontrollansatz verwendet.
Diese Ansätze werden während 75 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Oxidation wird dann durch Zugabe von 304 ml Ethylenglykol gestoppt, wonach die Ansätze während weiteren 60 Minuten gerührt werden. Die Kolloidlösungen werden danach mit dem 20-fachen Volumen destilliertem Wasser mikrofiltriert.

Chemische Bindung von a-hCG 293A an die mit Aldehyd-Gruppen versehene, beschichtete Goldkolloidlösung

100 ml der mit funktionellen Aldehydgruppen versehenen Goldkolloidlösung werden mit 5 ml der gepufferten a-hCG- Lösung (Boratpuffer, pH = 9 a)) gemischt. Zum Vergleich wird der Kontrollansatz in gleicher Weise behandelt.
Die Ansätze werden bei Raumtemperatur während 18 Stunden inkubiert und danach durch ein grobes Nylonsieb filtriert.
Diese Kolloidlösungen werden dann zweimal mit Trispuffer, ph = 8 b), durch Zentrifugation der Kolloidlösungen während 60 Minuten bei 700 x g gewaschen. Die Sedimente werden in Trispuffer resuspendiert.
Die beschichteten Goldkolloidlösungen, die dieser Behandlung unterzogen wurden, werden unter Verwendung von Predictor-Stäbchen (Chefaro International) auf ihre immunologische Aktivität untersucht. Zu diesem Zweck werden 0,3 ml des Konjugats (optische Dichte = 8,33) mit 0,2 ml Urin, der 0, 50, beziehungsweise 1000 Internationale Einheiten (I.E.) hCG/l enthält, gemischt. Ein Stäbchen, das mit monoklonalem a-hCG (147B) beschichtet ist, wird in der Goldkolloidlösung/Urin- Mischung plaziert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Stäbchen wird anschliessend mit Wasser gewaschen und die Farbe abgelesen. Die Resultate sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I hCG-Konzentration I.E./l Kontroll-Kolloidlösung Aldehyd-Kolloidlösung - bedeutet, dass keine Färbung auf dem Stäbchen sichtbar ist + rot-rosa Färbung auf dem Stäbchen ist sichtbar

a) Zusammensetzung des Boratpuffers:

Lösung A: 0,2 M Borsäure + 0,2 M Kaliumchlorid
Lösung B: 0,2 M Natriumcarbonat
Lösung A wird durch Zugabe von Lösung B auf pH = 9,0 eingestellt.
Gepufferte a-hCG-Lösung: 1 Volumenteil a-hCG (9,9 mg ml&supmin;¹) zusammen mit 8,4 Volumenteilen des 0,2 M Boratpuffers.

b) Zusammensetzung des Trispuffers:

0,25 M Tris (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol)
0,25 M Natriumchlorid
1,29 g Rinderserumalbumin/l
0,025 g Thiomersal/l
durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf pH = 8 eingestellt.

2.3 Herstellung einer dicken Polymerhülle um individuelle Goldpartikel

Beschichtung

Zur Beschichtung der Goldpartikel wird ausser der Zusammensetzung der Monomerbeschickung das gleiche Verfahren gewählt wie in Beispiel 2.1 beschrieben.
1,70 g Glycidylmethacrylat
0,85 g Natriumvinylsulfonat
0,85 g N-Methylenbisacrylamid
50 ml destilliertes Wasser
50 ml Methanol
200 ml der so erhaltenen Kolloidlösung werden mit 6'000 ml destilliertem Wasser mikrofiltriert und charakterisiert. Unter Verwendung von Transmissions-Elektronenmikroskopie wird die Dicke der Polymerhülle auf gut 25 nm geschätzt; aus der quasielastischen Lichtstreuung wird eine Hüllstärke von 40 nm abgeleitet, was ein Anzeichen dafür ist, dass die Polymerhülle in Wasser aufguillt. Die Mehrheit der Partikel (> 95%) bestehen aus einem einzelnen Goldkern, der von einer Polymerhülle umgeben ist.
Die beschichtete, mikrofiltrierte Goldkolloidlösung flockt in einer 0,4 M Natriumchloridlösung nicht aus, auch nicht nach 60 Stunden. Ausflockung findet bei deutlich höheren Natriumchloridkonzentrationen statt, aber der Farbumschlag, der für das Ausflocken von unbeschichteten Goldkolloidlösungen kennzeichnend ist, findet dann nicht mehr statt. Hingegen werden rot-rosafarbene Flocken nachgewiesen. Wenn die kolloidale Goldkeimlösung durch ein entsprechendes Wasservolumen ersetzt wird, resultiert aus der Polymerisation der Monomere eine stabile Emulsion mit einer Partikelgrösse von gut 120 nm.

Beispiel 3

Beschichtung einer kolloidalen Farbstofflösung

3.1 Herstellung einer kolloidalen Keimlösung

50 Gramm Palanil light red (eine dispergierte Farbstoffaufschlämmng BASF No. 7764060) werden in 1'000 ml destilliertem Wasser während 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diese kolloidale Farbstofflösung wird durch sechsmaliges Waschen mit destilliertem Wasser gereinigt. Die ersten fünf Waschschritte werden mittels Zentrifugation bei einer Beschleunigung von 2000 x g während 30 Minuten, gefolgt von Redispersion in Wasser, durchgeführt. Der letzte Zentrifugationsschritt wird bei einer Beschleunigung von 125 x g während 60 Minuten durchgeführt. Dieses Reinigungsverfahren ist wirksam zur Entfernung von überschüssigem Netzmittel. Die rohe Kolloidlösung hat eine Oberflächenspannung von 435 uN/cm (43,5 dyne/cm); die gereinigte Kolloidlösung hat eine Oberflächenspannung von 711 uN/cm (71,1 dyne/cm), beides bei einem Feststoffgehalt von 4,8 g Farbstoff/l gemessen.

3.2 Beschichten

125 ml verdünnte, gewaschene kolloidale Farbstofflösung (0,145%) werden auf 70ºC erwärmt und in einem Reaktor gerührt (200 Umdrehungen pro Minute). 12,5 ml einer Lösung von 0,10 g Natriumhydrogencarbonat und 0,10 g Kaliumpersulfat in Wasser werden dann zugegeben. 12,5 ml einer Monomerlösung folgender Zusammensetzung werden dann mit einer peristaltischen Pumpe im Verlauf einer Stunde eingemessen:

Monomerbeschickung

2 g Glycidylmethacrylat
1 g Natriumvinylsulfonat
0,5 g N-Methylenbisacrylamid
50 ml destilliertes Wasser
50 ml Methanol
Die zusammengesetzte Kolloidlösung wird nach 16 Stunden abgekühlt und 100 ml wurden mittels Mikrofiltration mit 2'500 ml destilliertem Wasser gereinigt. Der Durchmesser der beschichteten Kolloidlösung ist 86 nm grösser als derjenige der ursprünglichen Kolloidlösung, der 316 nm beträgt. Zentrifugation der zusammengesetzten Kolloidlösung in einer 52- prozentigen (Gewicht/Gewicht) Glukose/Wasser-Lösung mit einer Dichte von 1,23 g/ml führt zu roten, am Boden des Röhrchens sedimentierten Partikeln. Oben auf der überstehenden Flüssigkeit können keine separaten Polymerpartikel nachgewiesen werden. Mit "Sedimentation field flow fractionation"-Experimenten werden auch keine separaten Polymerpartikel nachgewiesen.
Die Wirkung der Oberflächenmodifikation auf die Adsorption von Proteinen ist beträchtlich: Zwei 4-ml-Röhrchen werden mit 1 ml unbeschichteter, gereinigter, beziehungsweise 1 ml beschichteter, gereinigter, kolloidaler Farbstofflösung befüllt. Jedes Röhrchen enthält 0,054 g Farbstoff. 1,75 ml Phosphatpuffer*) mit pH = 7,4 und danach 0,75 ml einer Lösung, die 2,67 mg/ml Rinderserumalbumin (R-Typ, Organon Teknika) enthält, werden zu diesen Röhrchen zugegeben.
Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur während 2 Stunden geschüttelt und dann zentrifugiert. Der Gehalt an Rinderserumalbumin im Überstand wird mittels HPSEC (Hochleistungsgrössenausschlusschromatographie bestimmt). 0,28 mg/m² Protein wurde an der unbeschichteten, gereinigten Kolloidlösung adsorbiert; an der beschichteten Kolloidlösung wurde keine Proteinadsorption nachgewiesen.

*) Zusammensetzung von Phosphatpuffer:

Lösung A: 9,0772 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 Liter Wasser;
Lösung B: 11,8586 g Dinatriumhydrogenphosphat in 1 Liter Wasser;
mische 5 Teile von Lösung A mit 24 Teilen von Lösung B.

3.3 Chemische, kovalente Bindung von Immunoglobulin G (antihumanes Choriongonadotropin, a-hCG) an eine Polymerbeschichtete, kolloidale Farbstofflösung

3.3.1 Einführung von Aldehydgruppen

Die eingekapselte, mikrofiltrierte, kolloidale Farbstofflösung aus Beispiel 3.2 und andere Proben mit in bezug auf die Polymerbeschichtung unterschiedlicher Hüllstärke werden, wie in 2.2 beschrieben, mit Aldehydgruppen versehen.

3.3.2 Chemische Bindung von a-hCG 293A an die beschichtete, mit Aldehydgruppen versehene, kolloidale Farbstofflösung

Die Kopplung von a-hCG an die mit funktionellen Aldehydgruppen versehenen kolloidalen Farbstofflösungen (siehe 3.3.1) wird wie in 2.2 beschrieben durchgeführt.

3.4 Immunoassay

Die auf diese Weise hergestellten kolloidalen (a-hCG)- Farbstoffkonjugate werden in einem Sandwich-Immunoassay für hCG, ähnlich wie in 2.2 beschrieben, durch Inkubation eines mit a-hCG (1478) beschichteten Tauchstäbchens (Predictor stick; Chefaro International) bei Raumtemperatur in einem Ansatz von hCG enthaltenden Urin und Konjugat (A&sub1; cm/580 = 8,3) auf ihre immunologische Aktivität getestet. Das Stäbchen wird dann mit Wasser gespült und die Farbe wird abgelesen. Die Resultate sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II: Kolloidale Farbstoff-(a-hCG)-Konjugate, die in einem Tauchstäbchen-Sandwich-Immunoassay für hCG (Predictor Stick, Chefaro International) gestestet wurden hCG-Konzentration (I.E./l) Inkubationszeit ACI *) Konjugate, das auf den polymerbeschichteten kolloidalen Farbstofflösungen basiert, mit der folgenden veränderlichen Schichtstärke (gemessen mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung/QELS): ACI-113: 86nm; ACI-124: 88nm; ACI-125: 58 nm; ACI-126: 30 nm; ACI-127: 35nm + rot-rosafarbene Färbung sichtbar auf weissem Stäbchens - keine sichtbare Färbung des weissen Stäbchens

Beispiel 4

Die Beschichtung von Goldpartikeln oberhalb der Löslichkeitsgrenze des Hüllpolymers

800 ml der kolloidalen Goldkeimlösung (0,032 Gewichtsprozent; siehe Beispiel 1 zur Herstellung dieser kolloidalen Keimlösung) werden in einem thermostatkontrollierten Reaktor mit Rückflusskondensator und Rührer auf 70ºC erwärmt. 10 ml einer Lösung von 0,32 g Kaliumpersulfat und 0,32 g Natriumcarbonat in 50 ml destilliertem Wasser werden tropfenweise zugegeben, und 10 ml einer Monomerlösung mit folgender Zusammensetzung wird tropfenweise im Verlauf einer Stunde zugegeben:

Monomerbeschickung

12 g Vinylacetat
4 g Diethylmaleat
3 g Diethylweinsäurediamid
50 ml Wasser
50 ml Methanol
Der Rest der Initiator-/Pufferlösung wird während der Zugabe der Monomere zugefügt. 24 Stunden nach Zugabe der Monomere wird der Reaktor auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Kolloidlösung wird mittels Mikrofiltration mit dem relativ zum ursprünglichen Volumen der Kolloidlösung 25-fachen Volumen Wasser gereinigt. Um die Partikel kann keine Polymerhülle nachgewiesen werden, und die kolloidale Stabilität ist genau gleich niedrig wie diejenige der "nicht beschichteten" kolloidalen Keimlösung. Die Wiederholung des Polymerisationsverfahrens unter Verwendung von Wasser anstelle der Keimlösung produziert kein unlösliches Polymer: Die Lösung bleibt klar. Wenn das Polymerisationsverfahren jedoch unter Zugabe von nicht 10 ml sondern 80 ml der oben erwähnten Monomerlösung im Verlauf einer Stunde durchgeführt wird, wird in Abwesenheit von Keimlösung eine Emulsion mit einer Partikelgrösse von 152 nm erhalten. In Gegenwart von Goldpartikeln wird eine Polymerhülle um die Goldpartikel mit einer Dicke von 27 nm gebildet. Die kolloidale Stabilität ist ebenfalls deutlich grösser als diejenige der Keimlösung.

Beispiel 5

Beschichtung von Goldpartikeln unterhalb der Löslichkeitsgrenze des umhüllenden Monomers

100 ml einer 0,032-gewichtsprozentigen kolloidalen Goldkeimlösung (siehe Beispiel 1 zur Herstellung) werden unter einer Stickstoffdecke auf 70ºC erwärmt. 5 ml einer Lösung von 0,1 g Kaliumpersulfat und 0,1 g Natriumhydrogencarbonat werden tropfenweise zu dieser kolloidalen Lösung zugegeben. 2,2 ml einer Monomerlösung mit der folgenden Zusammensetzung:

Zusammensetzung der Monomerbeschickung

5 g Styrol
1 g Acrylamid
80 ml Methanol
werden dann mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe zugegeben.
Nach Rühren und Wärmen auf 70ºC während 24 Stunden wird der Reaktor auf Raumtemperatur abgekühlt. Die kolloidale Goldlösung wird mit einem 25-fachen Volumen Wasser mikrofiltriert. Die gereinigte kolloidale Lösung widersteht nachgewiesenermassen 0,10 M Natriumchlorid nach 24 Stunden Aufbewahrung. Keine zweite Generation von Polymerpartikeln wurde gebildet. Unter diesen Bedingungen löst sich monomeres Styrol vollständig im Reaktionsansatz.
Wenn diese Polymerisation ohne Goldkolloidlösung sondern mit Wasser an ihrer Stelle durchgeführt wird, wird eine kolloidal stabile Emulsion mit einer Partikelgrösse von 120 nm gebildet.
Wenn jedoch eine höhere Konzentration von zugegebenem Monomer durch Zugabe von 3,4 ml des folgenden Gemischs verwendet wird:

Monomerbeschickung

10 g Styrol
2 g Acrylamid
80 ml Methanol entsteht dadurch eine neue Generation von Polymerpartikeln. Bei dieser höheren Monomerkonzentration löst sich Styrolmonomer nicht mehr länger im Ansatz. Ausserdem sind derart behandelte Goldpartikel nachgewiesenermassen wenig widerstandsfähig gegen Salz, und nach der Reinigung flockt die Kolloidlösung bereits bei 0,04 M NaCl aus, bei der selben Konzentration wie die ursprüngliche Kolloidlösung (Keimlösung). Es kann daraus geschlossen werden, dass in diesem Fall keine Umhüllung der Partikel durch Polymer stattgefunden hat. Im Gegensatz zu den Goldpartikeln sind die neu gebildeten Polymerpartikelm fähig, höheren als 0,1 M Natriumchlorid-Konzentrationen zu widerstehen.

Beispiel 6

6.1 Vergleichsbeispiel analog zu US 4 157 323 Beispiel 3

1,8 g Hydroxyethylmethacrylat
0,3 g N-Methylenbisacrylamid
0,6 g Acrylamid
0,3 g Methacrylsäure
werden in einem doppelwandigen Reaktor in 90 ml entionisiertem (Milli-Q) Wasser gelöst.
Die Lösung wird auf 70ºC erwärmt und bei 200 Umdrehungen pro Minute gerührt. 0,1 g Kaliumpersulfat und 0,1 g Natriumhydrogencarbonat, gelöst in 10 ml Wasser, werden dann zugegeben.
Nach etwa 3-5 Minuten bilden sich grosse, weisse Flocken. Dies zeigt die Bildung von nicht-kolloidalem Polymer an.

6.2 Vergleichsbeispiel analog zu US 4 157 323 Beispiel 11

0,64 g Hydroxyethylmethacrylat
0,70 g Methylmethacrylat
0,64 g Methacrylsäure
0,224 g Ethylenglykoldimethacrylat
werden in einem doppelwandigen Reaktor in 90 ml entionisiertem (Milli-Q) Wasser gelöst.
Als Reaktionstemperatur wird Raumtemperatur gewählt. 0,08 g Kaliumpersulfat und 0,04 g Natriumbisulfit, in 10 ml Wasser gelöst, werden zum Ansatz gegeben.
Nach 15 Minuten wird eine instabile Emulsion (ausgeflocktes Polymer) nachgewiesen.

Claims

1. Wässrige Suspension für diagnostische Tests, die nicht-polymere Kerne umfasst, die von einem hydrophilen Copolymer umgeben sind, welches funktionelle Gruppen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-polymeren Kerne nicht magnetisch reagieren und dass jeder einzeln von einer eigenen Hülle des Copolymers umgeben ist.

2. Wässrige Suspension gemäss Anspruch 1 für immundiagnostische Tests.

3. Wässrige Suspension gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern aus einem Metall, Metalloxid, oder einer Metallegierung, wobei das Metall nicht magnetisch reaktiv ist, einer anorganischen Verbindung, organischem Farbstoff, organischen Pigmet oder Emulsionströpfchen aus synthetischen, tierischen, pflanzlichen oder Mineralölen besteht.

4. Wässrige Suspension gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern aus einer kolloidalen Goldlösung oder kolloidalen Farbstofflösung besteht.

5. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Suspension für diagnostische oder immundiagnostische Tests durch in situ Copolymerisation einer Mischung von Monomeren, die in Wasser gelöst sind, in Gegenwart von nicht-polymeren Partikeln, wobei die Monomermischung die folgenden Arten von Monomeren umfasst:

ein ethylenisch ungesättigtes Monomer, das ohne oder nach Hydrolyse mindestens eine kovalent bindende funktionelle Gruppe enthält;

ein hydrophobes Monomer;

ein quervernetzendes Monomer,

dadurch gekennzeichnet, dass besagte Suspension hergestellt wird unter Verwendung einer stabilen, kolloidalen Dispersion der nicht-polymeren Partikel, die nicht magnetisch reagieren, als Startmaterial und Zugabe der Monomermischung dazu, wobei die Monomermischung so gewählt wird, dass das resultierende Copolymer eine Ladung mit identischem Vorzeichen wie diejenige der ursprünglichen Dispersion aufweist.

6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete hydrophobe Monomer ein Monomer ist, welches Gruppen umfasst, die zu hydrophilen Gruppen hydrolysierbar sind und dass diese hydrolysierbaren Gruppen nach der Polymerisation hydrolysiert werden.

Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomergemisch umfasst:

2 bis 98 Gewichtsprozent Glycidylmethacrylat,

0 bis 96 Gewichtsprozent Natriumvinylsulfonat und

2 bis 40 Gewichtsprozent N,N-Methylenbisacrylamid.

8. Reagenz für diagnostische Tests, welches magnetisch unreaktive, nicht-polymere Kerne umfasst, die jeder separat von einer eigenen Hülle aus einem hydrophilen Copolymer umgeben ist, wobei dieses Copolymer mit einem Reaktionsmittel versehen ist.

9. Immunochemisches Reaktionsmittel, welches magnetisch unreaktive, nicht-polymere Kerne umfasst, die jeder separat von einer eigenen Hülle aus einem hydrophilen Copolymer umgeben ist, wobei dieses Copolymer mit einer immunochemisch aktiven Substanz versehen ist.

10. Verfahren zum Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Reagenz gemäss Anspruch 8 verwendet wird, wobei besagte spezifisch bindende Substanz eine Bindungsaffinität für das im Reagenz vorliegende Reaktionsmittel aufweist.

11. Verfahren zum Nachweis einer immunochemisch aktiven Komponente in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein immunochemisches Reagenz gemäss Anspruch 9 verwendet wird, wobei besagte immunochemisch aktive Komponente eine Bindungsaffinität für die im immunochemischen Reagenz vorliegende immunochemisch aktive Substanz aufweist.

12. Testgarnitur zur Verwendung in einem diagnostischen Test, die mindestens ein Reagenz gemäss Anspruch enthält.

13. Testgarnitur zur Verwendung in einem Immunoassay, die wenigstens ein immunochemisches Reagenz gemäss Anspruch 9 enthält.