-
-
Hydrophile Latexpartikel, Verfahren zu deren
-
Herstellung und deren Verwendung Die Erfindung betrifft hydrophile
Latexpartikel, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Trägermaterial
für biologisch und/oder immunologisch aktive Substanzen in diagnostischen Mitteln.
-
Für die Agglutination von Antigen-Antikörper-Komplexen, die in der
Immunologie im Rahmen vieler diagnostischer Bestimmungen ausgenutzt wird, weil sie
besonders schnell und einfach durchgeführt und häufig mit bloßem Auge beobachtet
werden kann, verwendet man seit langem hydrophobe Latexpartikel als Träger von immunologisch
aktiven Subst;nzen, beispielsweise von Antikörpern. Diese hydrophoben Latexpartikel
bestehen meist aus Polystyrolhomo- oder Copolymerisaten, beispielsweise Styrol-Butadien-Copolymerisaten
oder
Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymerisaten (ABS) und werden durch Emulsionspolymerisation
hergestellt.
-
Bei der seit langem bekannten Emulsionspolymerisation sind im allgemeinen
vier Komponenten zugegen: ein in Wasser schwerlösliches Monomer oder ein Gemisch
verschiedener in Wasser schwerlöslicher Monomerer, Wasser, ein Emulgator und ein
wasserlöslicher Initiator. Das Monomere wird dabei durch den Emulgator in Form feiner
Tröpfchen emulgiert, wobei sich durch Zusammenlagerung von mehreren Emulgatormolekülen
u.a. größere Micellen bilden, die teilweise leer und teilweise mit Monomermolekülen
gefüllt sind; letzteres wird als "Solubilisierung" des Monomeren bezeichnet. Der
wasserlösliche Initiator bildet Radikale, die die Polymerisation sowohl von einzelnen
Monomermolekülen in der Wasserphase als auch in den monomergefüllten Micellen sowie
in den Monomertröpfchen auslösen bzw. aktivieren können. Tatsächlich findet aber
die Polymerisation überwiegend in den gequollenen Micellen statt, da einerseits
die Monomerkonzentration in den Micellen wesentlich größer ist als in der Umgebung
einzelner gelöster Monomermoleküle und andererseits die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung
von Micellen wegen ihrer im Vergleich zur Zahl der Monomertröpfchen wesentlich größeren
Anzahl beträchtlich höher ist. Der Durchmesser der gefüllten Micellen nimmt während
der Polymerisation zu, bis diese schließlich in kugelförmige Latexteilchen übergehen.
Die Emulgatormoleküle der nichtaktivierten Micellen und diejenigen aus der Oberfläche
der verbrauchten Monomertröpfchen bedecken die Oberfläche der Latexteilchen und
tragen so zur Stabilisierung der entstehenden Polymerdispersion bei.
-
Diese nach dem bekannten Verfahren unter Zusatz eines Emulgators oder
Emulsionsstabilisators, welcher beispielsweise ein Tensid oder Netzmittel sein kann,
hergestellten Latices haben folgende Nachteile, die insbesondere ihre
Verwendung
als Träger von immunologisch aktiven Substanzen stören und ihren Einsatz in kontinuierlichen
Lösung meßsystemen verhindern: 1. An der hydrophoben Oberfläche der Latexpartikel
werden neben den gewünschten immunologisch aktiven Substanzen, beispielsweise Antikörpern,
unspezifisch eine Vielzahl anderer Serumbestandteile gebunden; 2. die nur adsorptiv,
nicht kovalent gebundenen immunologisch aktiven Substanzen können sich während der
Messung im Verlauf eines diagnostischen Tests wieder ablösen; 3. die bei der Emulsionspdlymerisation
als Emulgator oder Stabilisator verwendeten Tenside können die Struktur und damit
die Aktivität der biologisch aktiven Proteine zerstören, weil sie in die wäßrige
Lösung diffundieren; 4. beim Entfernen der sie stabilisierenden Tenside koaguliert
die Latexsuspension und auch beim Zentrifugieren wird die Stabilisierung gebrochen.
Der hierbei entstehende Niederschlag kann nur schwer oder überhaupt nicht mehr zum
vorherigen Zustand resuspendiert werden.
-
Zur Vermeidung dieser Nachteile wurden bereits verschiedene Vorschläge
gemacht, die aber immer nur einen Teil der vorstehend genannten Probleme lösen konnten:
So sind aus der DE-AS 22 03 377 hydrophobe Latexpartikel mit einer Teilchengröße
von 0,01 bis 0,9 pm aus carboxy -lierten ABS-Copolymeren und carboxy~lierten Styrol-Butadien-Copolymeren
bekannt, die als serologisch inerte Träger für biologisch aktive Proteine verwendet
werden können, wobei die Proteine kovalent an den Träger gebunden werden, und zwar
über die in den Latex eingeführten Carboxylgruppen, unter Ausbildung von Amidbindungen.
-
Aus der DE-OS 28 12 845 sind hydrophobe Latices mit einer Teilchengröße
von 0,05 bis 1 pin aus ABS-Copolymeren bekannt, bei denen der Latex ebenfalls mit
Carboxylgruppen modifiziert und mit einer reaktiven Seitenkette kondensiert ist,
so daß immunologisch aktive Substanzen ebenfalls kovalent gebunden werden können.
-
Mit diesen bekannten hydrophoben Latices wird zwar das Problem Nr.
2 (s.o.) gelöst, alle übrigen Nachteile bleiben aber unverändert bestehen.
-
Man hat deshalb auch schon versucht, anstelle hydrophober Latices
hydrophile Gele als Träger für immunologisch aktive Substanzen zu verwenden. Da
hydrophile Gele keine oder nur sehr geringe Adsorptionseigenschaften haben, andererseits
aber die kovalente Bindung von Proteinen an solche Gele bekannt ist, hat man "Mikrogele"
vorgeschlagen, die aufgrund ihrer Herstellungsweise und ihres Teilchendurchmessers
ebensogut als "Latices" bezeichnet werden könnten. Solche hydrophilen Latices sind
beispielsweise aus der US-PS 4 138 383 bekannt. Sie bestehen aus kugelförmigen Teilchen
mit einem Durchmesser von weniger als 0,35 pm, die unter den Bedingungen einer durch
freie Radikale initiierten wäßrigen Emulsionspolymerisation hergestellt werden,
wobei als Monomere Acrylamide, Acrylsäure, Methacrylsäure oder Acrylate verwendet
werden.
-
Als Emulgatoren werden beispielsweise Metallseifen verwendet. An die
so erhaltenen hydrophilen Mikrogele werden biologisch und/oder immunologisch aktive
Substanzen in an sich bekannter Weise über Carbodiimid- oder Glutaraldehyd-Brücken
kovalent gebunden. Damit sind zwar die Probleme Nr. 1 und 2 (s.o.) gelöst worden,
nicht aber die Probleme Nr. 3 und 4, da die Emulsionspolymerisation nach wie vor
unter Zusatz eines Emulgators oder Stabilisators durchgeführt werden muß.
-
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, hydrophile Latexpartikel,
ein Verfahren zu deren Herstellung und
ein diese enthaltendes diagnostisches
Mittel zu schaffen, mit denen es gelingt, alle.vier oben.genannten Nachteile zu
vermeiden. Der Erfindung liegt also insbesondere die Aufgabe zugrunde, hydrophile
Latexpartikel zu schaffen, die in der Lage sind, biologisch undXoder immunologisch
aktive Substanzen kovalent zu binden, die die Struktur und damit die Aktivität der
biologisch aktiven Proteine nicht beeinträchtigen, deren Stabilisierung beim Zentrifugieren
nicht gebrochen wird und die sich koagulieren und anschließend wieder leicht resuspendieren
lassen.
-
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch aus einem Homo- oder
Copolymerisat von in Wasser schwerlöslichen Monomeren bestehende hydrophile Latexpartikel
gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie durch Emulsionspolymerisation in
Anwesenheit eines wasserlöslichen1 Radikale bildenden Initiators, jedoch ohne jeden
Zusatz eines Emulgators, Stabilisators oder Netzmittels herstellbar sind.
-
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Qesteht mindestens
ein Teil der Monomeren, aus denen die hydrophilen Latexpartikel aufgebaut sind,
aus einem mindestens eine polymerisierbare c=c -Doppelbindung im Molekül enthaltenden
Epoxid.
-
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß entgegen der in Fachkreisen
seit langem herrschenden Meinung, die auch in dem eingangs zitierten Stand der Technik
zum Ausdruck gebracht wird, der Zusatz eines Emulgators, Stabilisators oder eines
Netzmittels zur Durchführung der Emulsionspolymerisation gar nicht erforderlich
ist. Damit entfällt aber die meist sehr schwierige und umständliche Entfernung von
Emulgatorresten aus den polymeren Latexpartikeln, die bisher zwingend erforderlich
war, weil die als Emulgatoren verwendeten Metallseifen oder Tenside aus den Latexpartikein
diffundierten und die biologische Aktivität der an die Latexpartikel kovalent gebundenen
Proteine beeinträchtigten oder vollkommen zerstörten.
-
Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von mindestens eine
polymerisierbare Doppelbindung enthaltenden Glycidyl-Verbindungen als Monomer erwiesen.
Die Struktur dieser Verbindungen weist in der polymerisierbaren Doppelbindung einen
hydrophoben und in der Epoxid-Gruppe, dem Oxiran-Ring, zugleich einen hydrophilen
Teil auf. Die erfindungsgemäß entstehenden Latexsuspensionen koagulieren nicht trotz
Abwesenheit jeglichen Emulgators, Stabilistors oder Netzmittels. Die Stabilisierung
der Latexsuspension wird auch beim Zentrifugieren nicht gebrochen. Da die endständigen
Epoxidgruppen für verschiedene Umsetzungen (Hydrolyse, Ammonolyse, Aminolyse, Kondensationen)
sehr leicht zugänglich sind, müssen die Epoxidgruppen die Oberfläche der monodispers
verteilten Latexkügelchen so bedecken, daß sie in die Wasserphase hinaus orientiert
sind.
-
Als Monomere werden erfindungsgemäß vorzugsweise Glycidylmethacrylat,
Glycidylacrylat, Glycidylvinyläther, Glycidylvinylphthalat und 3,4-Epotbut(l)en
verwendet. Es kann dabei ausschließlich eines dieser Monomere verwendet werden,
so daß die entstehenden hydrophilen Latexpartikel ein Homopolymerisat darstellen,
es kann aber auch ein Gemisch dieser Monomere copolymerisiert werden.
-
Zur Steuerung des Gehaltes an Epoxidgruppen können mit einer oder
mehreren der genannten Glycidylverbindungen auch andere Monomere copolymerisiert
werden, beispielsweise Styrol, Diene, Acrylamide, Methacrylamide, Alkyl-, Hydroxyalkyl-
und Aminoalkylacrylate, Alkyl-, HydroxY-alkyl- und Aminoalkylmethacrylate, Vinyläther,
Vinylester, N-Vinylpyrrolidon und dergleichen.
-
Es kann auch in Gegenwart monomerer, polymerisierbarer Derivate von
Farbstoffen oder fluoreszierenden Verbindungen, z.B. Fluorescein, polymerisiert
werden. Auf diese Weise werden farbige bzw. fluoreszierende Latexpartikel erhalten,
die sich zum Nachweis von Antigenen bzw. Antikörpern in menschlichen oder tierischen
Geweben eignen. Diese Nachweis-
methode eignet sich:basonder5.tarte;thaSt
zur Herstellung von Gewebeschnitten in der Histologie. Als monomere, polymerisierbare
Derivate werden vorzugsweise Farbstoffe bzw.
-
fluoreszierende Verbindungen eingesetzt, in die in an sich bekannter
Weise Methacryl- bzw. Acryl-Reste eingebaut worden sind.
-
Um die Schwerlöslichkeit der entstehenden Latexpartikel in Wasser
zu erhöhen, können während der Emulsionspolymerisation übliche Vernetzungsmittel
zugesetzt werden, beispielsweise Alkylen- oder Hydroxy.alkylen diacrylate, Alkylen-
oder Hydroxy.alkylen dimethacrylate, Alkylenbisacrylamide oder Alkylenbisacrylmethacrylamide,
Divinylbenzol und dergleichen.
-
Als Initiator kann jeder Ublicherweisc für die emulsion polymerisation
verwendete wasserlösliche Initiator verwendet werden; erfindungsgemäß werden vorzugsweise
Peroxodisulfate, Peroxoborate, Wasserstoffperoxid oder geeignete Redoxsysteme eingesetzt.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren der emulgatorfreien Emulsionspolymerisation
von einem oder verschiedenen in Wasser schwerlöslichen Monomeren zur Herstellung
der hydrophilen Latexpartikel ist gegenüber Luftsauerstoff bzw. freiem Sauerstoff-überhaupt
empfindlich. Der Sauerstoff muß deshalb sehr sorgfältig aus allen Polymerisationskomponenten
und Gefäßen durch gründliches Auskochen, durch Destillation unter Inertgasatmosphäre
oder durch Hindurchleiten von Stickstoff, Argon oder einem anderen Inertgas entfernt
werden.
-
Die emulgatorfreie Emulsionspolymerisation wird erfindungsgemäß vorzugsweise
mit einem Flottenverhältnis, bezogen auf die Volumina, zwischen Wasser- und Monomerenphase
von 8 : 1 bis 16 : 1 durchgeführt.
-
Die Konzentration des in der wäßrigen Phase gelösten Initiators beträgt
vorzugsweise zwischen 0,5 und 1,5 g/l
und die KonzentratioU- des.EpNxias.
des Expoxids in der 1)t't££'i(jt vor-zll(3swei3e 1 bis 1'Sj;y '-.
-
Die Emulsionspolymerisation wird vorzugsweise bei einer Temperatur
von 0 bis 800C durchgeführt. Die Temperatur ist abhängig vom gewählten Initiator:
bei Verwendung von Kaliumperoxodisulfat arbeitet man vorzugsweise bei 60 bis 700C.
Ebenfalls abhängig von der Wahl des Initiators ist die Reaktionsdauer, die zwischen
5 und 40 Stunden beträgt.
-
Die erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel sind streng kugelförmige,
monodispers verteilte und untereinander annähernd gleich große Teilchen mit einem
Durchmesser von etwa 0,15 bis 1,5 pm.
-
Die hydrophilen Latexpartikel können nach beendeter Emulsionspolymerisation
noch Reste nichtauspolymerisierter Monomerer enthalten, die durch Wasserdampfdestillation
oder Dialyse beseitigt werden können. Auch hierbei kommt die besonders vorteilhafte
Eigenschaft der erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel zum Tragen, die darin
besteht, daß die Latexpartikel durch Zentrifugieren sedimentiert werden können,
ohne daß die Stabilisierung gebrochen wird, so daß sie anschließend wieder redispergiert
werden können. Auf diese Weise kann der erfindungsgemäße Latex durch mehrfaches
Zentrifugieren und Dekantieren auf einfache Weise gereinigt werden.
-
Die endständigen freien Epoxidgruppen des erfindungsgemäßen Latex
sind gegenüber den unterschiedlichsten chemischen Substanzen hoch reaktionsfähig
und können deshalb leicht hydrolysiert, mit Periodat oder Periodsäure zur Aldehydgruppe
oxidiert, mit Ammoniak, primären Aminen, Diaminen oder Hydrazinen zu prim.od.sek.
Aminogrupp umgesetzt oder mit Hilfe anderer bekannter Reaktionen modifiziert werden.
Die Emulsion des erfindungsgemäßen Latex weist trotz Fehlens eines Emulgators eine
derart hohe Stabi.liLat auf, daß die Modifizierung der Epoxidgruppen
gewünschtenfalls
auch schon während der Emulsionspolymerisation durchgeführt werden kann, so daß
bereits aus der Polymerisationsreaktion ein Latex entsteht, der an der Oberfläche
beispielsweise mit primären Aminogruppen modifiziert ist. Die modifizierten oder
derivatisierten Epoxidgruppen stehen dann für die "Kupplung" mit biologisch und/oder
immunologisch aktiven Proteinen, die somit kovalent an die als Träger fungierenden
hydrophilen Latexpartikel gebunden werden, zur Verfügung.
-
Die eingangs genannte Aufgabe wird somit weiter durch die Verwendung
der erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel als serologisch inerte Träger für
biologisch und/oder immunologisch aktive Substanzen gelöst, beispielsweise als Träger
für Peptide, Proteine, Enzyme, Hormone, Vitamine, Antigene, Antikörper und Mikroorganismen.
-
Gegenstand der Erfindung ist somit weiterhin ein diagnostisches Mittel,
enthaltend erfindungsgemäße hydrophile Latexpartikel als Träger und an diesen Träger
direkt oder über ein Kupplungsmittel als "Brücke" kovalent gebundene biologisch
und/oder immunologisch aktive Substanzen der vorstehend genannten Art.
-
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel eignen sich besonders
zum Einsatz in Radioimmuno-(RIA) , Enzymimmuno-(EIA) und sogenannten ELISA(enzymelinked
immunosorbent assay)-Tests.
-
Beispiel 1 In 80 ml destilliertem Wasser werden 0,08 g Kaliumperoxodisulfat
(K2S208) gelöst und dadurch von Luftsauerstoff befreit, daß 30 Minuten lang Stickstoff
hindurchgeleitet wird. Gleichzeitig werden 10 ml Glycidylmethacrylat auf dieselbe
Weise von Luftsauerstoff befreit. Beide Komponenten werden in einen Glasreaktor
verbracht und weitere 10 Minuten lang mit Stickstoff behandelt. Danach wird der
Reaktor geschlossen und die Reaktion unter ständigem Rühren 6 Stunden lang bei einer
Temperatur von 65°C durchgeführt. Nach dieser Zeit beträgt der Umsatz 98%. Das Reaktionsprodukt
ist ein Latex aus kugelförmigen, monodispers verteilten Polyglycidylmethacrylat-Partikeln
mit einem Durchmesser von 0,44 Beispiel 2 Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden
160 ml destilliertes Wasser, in dem 0,08 g K2S208 gelöst sind, und 10 ml eines Gemischs
aus 15 Gew.% Glycidylmethacrylat und 85 Gew.% Styrol getrennt vom Sauerstoff befreit
und 6 Stunden lang unter ständigem Rühren bei einer Temperatur von 650C miteinander
umgesetzt. Danach beträgt der Umsatz 71,6%. Die nichtauspolymerisierten Restmonomeren
werden durch Wasserdampfdestillation beseitigt. Die entstehenden monodispersen copolymeren
Latexpartikel haben einen Durchmesser von 0,22 ;ihm.
-
Beispiel 3 Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden eine Lösung von 0,1
g K2S208 in 100 ml destilliertem Wasser und 10 ml eines Gemischs aus 15 Gew.% Glycidylmethacrylat
und 85 Gew.% Vinylacetat miteinander umgesetzt. Der Umsatz beträgt 80%. Die Restmonomeren
werden durch Wasserdampfdestillation entfernt. Der entstehende Latex besteht aus
monodispersen, kugelförmigen Teilchen mit einem Durchmesser
von
0,16 ;ihm.
-
100 ml des so hergestellten Latex werden mit 100 ml 0,1 M-NaOH-Lösung
vermischt und bei einer-Temperatur.von etwa 25 0C 24 Stunden stehengelassen. Auch
während und nach der Hydrolyse bleibt die Stabilität des Latex erhalten. Die Emulsion
wird zentrifugiert, der Uberstand abgegossen und die feste Phase wieder in Wasser
redispergiert. Das Zentrifugieren und Redispergieren wird zweimal wiederholt. Die
entstehende neutrale Emulsion wird mit 1 M-H2S04 auf einen pH-Wert von 3 gebracht
und mit Periodsäure in einer den Epoxidgruppen äquivalenten Menge versetzt. Die
Oxidation wird bei 25 0C etwa 24 Stunden lang durchgeführt; anschließend werden
die nichtumgesetzten niedermolekularen Stoffe durch Dialyse entfernt. Die modifizierten
Latexpartikel der stabilen Emulsion enthalten 2,8 Gew.% oder 0,97 mMol/s an Aldehydgruppen.
-
Beispiel 4 Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden eine Lösung von 0,1
g K2S208 in 100 ml destilliertem Wasser und 10 ml eines Gemischs aus 15 Gew.% Glycidylmethacrylat
und 85 Gew.% Isopren bei einer Temperatur von 650C 24 Stunden lang umgesetzt. Der
Umsatz beträgt 76%. Die Restmonomeren werden anschließend durch Wasserdampfdestillation
entfernt, wobei stabile, monodispers verteilte kugelförmige Latex partikel mit einem
Durchmesser von 0,25 pm entstehen.
-
100 ml dieser Emulsion werden anschließend mit 100 ml wäßriger Ammoniaklösung
(25%ig) versetzt und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen, wobei
die Epoxidgruppen durch Ammonolyse in Aminogruppen übergehen.
-
Das Reaktionsprodukt wird anschließend mit Periodsäure behandelt,
wobei ein Latex entsteht, der 4,5 Gew.% oder 1,55 mMol/g an Aldehydgruppen enthält.
-
Beispiel 5 Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden eine Lösung Von 1,5
g K2S208 in 1,5 1 Wasser und 15 ml Glycidylmethacrylat getrennt von Sauerstoff befreit
und miteinander umgesetzt. Weitere 120 ml von sauerstoffreiem Glycidylmethacrylat
werden kontinuierlich während 6 Stunden unter Sauer stoffausschluß in das Reaktionsgefäß
zugetropft. Danach wird die Polymerisation noch 30 Minuten lang fortgesetzt.
-
Der Umsatz beträgt dann 85%, und die entstehenden Partikel haben einen
Durchmesser von 1,1 pm.
-
Beispiel 6 Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 10 ml eines Gemischs
von 1 Gew.% Glycidylmethacrylat und 99 Gew.% Styrol und eine Lösung von 0,1 g K2S208
in 100 ml destilliertem Wasser bei 650C während 22 Stunden polymerisiert, wobei
hydrophile Latexpartikel mit einem Durchmesser von 0,5 P entstehen. Der Umsatz beträgt
90%.
-
Beispiel 7
20 ml einer nach Beispiel 1 hergestellten Latex-Suspension werden mit 5 ml 2N Natronlauge
über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann 5 Std. gegen Wasser dialysiert. Die
verbleibende Suspension wird nach Zusatz von 100 mg Natriumperjodat auf pH 3 eingestellt
und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann 4 Std. gegen dest. Wasser dialysiert.
-
Beispiel 8
20 ml einer nach Beispiel 1 hergestellten Latex-Suspension werden mit 10 ml konzentrierter
Ammoniak-Lösung 20 Std.
-
bei Raumtemperatur gerührt und 48 Std. gegen fließendes Wasser dialysiert.
Die erhaltene Suspension wird abzentrifugiert. Der Stickstoff-Gehalt der Trockensubstanz
liegt danach bei etwa 1 %, was einer Aminierung von etwa jeder 10. Epoxid-Einheit
entspricht, bei einer bevorzugten Reaktion an der Oberfläche aber sicher einem höheren
Derivatisierungsgrad entspricht. Die abzentrifugierte Festsubstanz wird mit 20 ml
0,1 N Natronlauge wieder aufgenommen.
-
Dazu werden unter Rühren 1,5gBernsteinsäurehydroxysuccinimidester-amidoacetaldehyd-acetal
(gelöst in 6 ml Dimethylformamid) getropft. Die entstehende Suspension wird noch
3 Std. gerührt, danach mit 1N Salzsäure auf pH 3 gebracht und dann 12 Std.
-
gegen fließendes dest. Wasser dialysiert.
-
Beispiel 9
20 ml einer nach Beispiel 1 hergestellten Latex-Suspension werden mit 0,5 g Na2S9H20
versetzt und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird gegen fließendes
dest. Wasser dialysiert, bis die Suspension geruchsfrei ist, dann wird die Suspension
abzentrifugiert. Die Trockensubstanz enthält etwa 2 % Schwefel, was einer Derivatisierung
etwa jeder 10. Epoxid-Einheit entspricht, bei einer bevorzugten Reaktion an der
Oberfläche aber sicher einem höheren Derivatisierungsgrad entspricht.
-
Das abzentrifugierte Produkt wird mit 1 g 6-Maleinimidohexansäure-hydroxysuccinimidester
(gelöst in 6 ml Dimethylformamid) versetzt, 3 Std. bei Raumtemperatur gerührt und
dann 12 Std. gegen fließendes dest. Wasser dialysiert.
-
Beispiel 10 Bildung von Latex-gamma-Globulin-Konjugaten 1 ml gamma-Globulin-Lösung
(enthaltend 56,6 mg Protein) werden mit jeweils 20 ml einer
a)
nach Beispiel 1 hergestellten, b) nach Beispiel 7, c) nach Beispiel 8 und d) nach
Beispiel 9 derivatisierten Latex-Suspension versetzt und 12 Std. bei Raumtemperatur
dialysiert. Die verbleibenden Suspensionen werden abzentrifugiert. Anschließend
wird im Überstand freies Protein bestimmt. Aus dem gefundenen Wert läßt sich der
an die Latex-Teilchen gebundene Anteil berechnen. Danach enthält: Ansatz a 8 mg
gamma-Globulin, gebunden Ansatz b 43 mg gamma-Globulin, gebunden Ansatz c 15 mg
gamma-Globulin, gebunden Ansatz d 19 mg gamma-Globulin, gebunden Beispiel 11 Bildung
von Latex-IgG-Konjugaten Wie in Beispiel 10 beschrieben werden aus einer IgG-Lösung
und verschiedenen Latex-Suspensionen Latex-IgG-Konjugate hergestellt. Durch Antikörper-Komplexbildung
wird die Beladung der Latex-Partikel mit IgG-Molekülen nachgewiesen.
-
Im folgenden werden zwei diagnostische Mittel als Beispiele für die
Verwendung der erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel beschrieben, und zwar
zur immunologischen Bestimmung von Thyroxin (T4) mit Hilfe von T4 -Antikörpern aus
Anti-T4-Serum vom Schaf und zur Bestimmung von Humanthyr(e)otropin (TSH) im Ser.um
mit Hilfe der Doppelantikörper-Trenntechnik.
-
Beispiel 12 Verwendung von Homopolyglycidylmethacrylat-Latexpartikeln
als Träger für Anti-T4-Serum vom Schaf; diagnostisches Mittel zur Durchführung eines
T4-ELISA Für die Bestimmung von Thyroxin (T4) mittels ELISA wurden zunächst T4-Antikörper
aus einem Anti-T4-Serum vom Schaf an die erfindungsgemäßen hydrophilen Homopolyglycidylmethacrylat-Latexpartikel
kovalent gebunden, indem letztere nach einem der Beispiele 7-9 derivatisiert und
in Analogie zu den Beispielen 10 und 11 mit den T4-Antikörpern umgesetzt werden.
Die so erhaltenen solid-face-Antikörper stellen das erste Reagens für den Test dar.
Als zweites Reagens wird T4 in an sich bekannter Weise mit einem hierfür geeigneten
Enzym, beispielsweise Peroxidase (POD) oder ß-Galaktosidase (ß-Gal), markiert, d.h.
zu einem Enzymkonjugat "gekoppelt". Als Enzym wird im vorliegenden Beispiel ß-Gal
verwendet. Das dritte Reagens ist die einen unbekannten Gehalt an T4 aufweisende
Probe und das vierte Reagens ein übliches Substrat für die ß-Gal des Enzymkonjugats,
und zwar im vorliegenden Falle Nitrophenyl-ßgalactosid in Tris-HCl-Puffer, pH 7.3.
-
Das Testprinzip beruht auf dem Ablauf folgender drei Reaktionen: 1.
Der immunologischen Reaktion zwischen den an die hydrophilen Latexpartikel kovalent
gebundenen T Antikörpern einerseits und dem enzymmarkierten T4 ("Enzymonjugat")
und dem in der Probe enthaltenen freien T4 andererseits. Bei dieser Reaktion findet
also eine kompetitive Bindung zwischen den solidface-Antikörpern, dem Enzymkonjugat
und dem T4 der Probe statt.
-
2. Der B/F-Trennung (B=bound, F=free). Es handelt sich hier also um
eine Trennung von gebundenem (bound) und ungebundenem (free) Enzymkonjugat. Diese
Trennung kann in vorteilhafter Weise durch Zentrifugieren oder durch Dialyse, beispielsweise
gegen Wasser oder eine geeignete Pufferlösung, erreicht werden.
-
3. Der Enzymnachweisreaktion, die zwischen dem Enzymkonjugat und dem
üblicherweise verwendeten, für das eingesetzte Enzym spezifischen, Substrat abläuft
und die kolorimetrisch oder auf andere bekannte Weise verfolgt werden kann. Die
Enzymaktivität kann entweder im Zentrifugat (free-Anteil) oder in dem resuspendierten
Niederschlag (bound-Anteil) erfolgen.
-
Versuchsdurchführung Die in oben angegebener Weise hergestellte Latex-anti-T
-4 Suspension wird im Wasser oder Pufferlösung im Verhältnis 1:1000 verdünnt. 0,5
ml dieser Suspension werden mit 100,ul einer T4-Serum-Standardlösung mit verschiedenem,
jeweils bekanntem T4-Gehalt und 100 ,ul einer T4-ß-Gal-Konjugat-Lösung versetzt.
Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation
wurde ein Ansatz ständig geschüttelt, während ein zweiter Ansatz mit gleichem T4-Standardgehalt
lediglich stehen gelassen wurde. Danach wurde jeweils die Suspension zentrifugiert
und der überstand, in dem sich die F-Phase befindet, abgetrennt. Die B-Phase, also
das an die solidface-Antikörper gebundene T4-ß-Ga l-Konjugat, befindet sich im Niederschlag.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird dieser in überschüssiger Substrat-Lösung,
bestehend aus 450 mg/l p-Nitrophenyl-ß-galactosid (Fa. Sigma) 100 mM Natriumchlorid
10 mM Magnesiumchlorid 10 mM Tris-Puffer/HCl 0,4 % (V/V) Mercaptoäthanol pH-Wert
7.3
versetzt und in bekannter Weise die Extinktion bei einer Wellenlänge
von 405 nm gemessen. Es zeigte sich, daß die ohne äußere mechanische Durchmischung
in der Schwebe gehaltenen Latexpartikel ein um etwa 11 % verringertes Signal ergeben.
-
Nachdem auf diese Weise die T4-Eichkurven ermittelt wurden, wurden
anschließend in derselben Weise Bestimmungen durchgeführt, bei denen anstelle von
100 /ul T4-Standardserum jeweils 100 ,ul von Proben unbekannten T4-Gehalts eingesetzt
und die Extinktion der B-Phasen nach der Resuspendierung in Substratlösung gemessen
werden.
-
Es wurde festgestellt, daß die hydrophilen Latexpartikel als Träger
für Antikörper und auch Antigene hervorragend geeignet sind und deren Immunreaktivität
nicht beeinträchtigen. Sie können daher mit großem Vorteil bei solidface-Enzymimmunotesten
als Träger eingesetzt werden. Weiter wurde festgestellt, daß die hydrophilen Latexpartikel
in Puffermilieu über lange Zeit hinweg in der Schwebe bleiben, daß die Dichte der
Partikel also etwa gleich eins ist.
-
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel
gut zentrifugierbar und resuspendierbar, ohne an Immunreaktivität einzubüßen.
-
Beispiel 13 Enzymimmunoassay (EIA) zur Bestimmung von Human-Thyreotropin
(TSH) Die Bestimmung von TSH in Humanserum ist von erheblicher Bedeutung für die
Diagnose von Schilddrüsenerkrankungen.
-
Eine primäre Hypothyreose erkennt man an einer stark erhöhten Basal-TSH-Konzentration
(10 bis 100 pU TSH/ml).
-
Darüber hinaus kann eine Hyperthyreose mit Sicherheit dann ausgeschlossen
werden, wenn der TSH-Basalwert im
Serum von 0,5 bis 3 pU/ml nach
Stimulation mit TRH (Thyroidea-releasing-hormon) nicht ansteigt. Steigt der TSH-Wert
dagegen um mindestens 2,5 U/ml, jedoch um nicht met als 25 pU/ml, dann ist der Schilddrüsen-Stoffwechsel
mit hoher Wahrscheinlichkeit ungestört. Ein Anstieg um mehr als 25 pU/ml von einem
mehr oder weniger leicht erhöhten Basalwert läßt auf eine latente präklinische Hypothyreose
schließen. Es sind bereits Enzymimmunoassays für TSII bekannt (Clinica Chemica Acta
67, 2fi3 - 268 (1976); enzyme labelled immunoassay of hormones and drugs, herausgegeben
von S.B. Pal, Walter de Gruyter, Berlin und New York, 1978, S. 327 - 337; Analytical
Biochemistry 96, 419 - 425 (1979)). Diese bekannten Bestimmungsmethoden benötigen
jedoch übermäßig lange Inkubationszeiten (bis zu 5 Tage), sind unempfindlich (5
pU TSH/ml) oder setzen aufwendige Meßgeräte voraus (Fluorometer oder Luminometer),
wobei außerdem eine Vorrichtung zum Mischen der Ansätze erforderlich ist.
-
Die Verwendung der erfindungsgemäßen hydrophilen Latex partikel ermöglicht
nun eine photometrische Bestimmung des TSH in einer Gesamtinkubationszeit von nur
2 1/2 Tagen nach der Doppelantikörper-Trenntechnik. Dabei wird der zweite Antikörper
an die erfindungsgemäßen hydrophilen Latexpartikel kovalent gebunden. Die gebundene
Enzymaktivität wird dann nach einer B/F-Trennung gemessen.
-
Da die Latexpartikel eine Dichte aufweisen, die nicht wesentlich höher
als diejenige von Wasser ist, bleiben sie auch während der Enzymreaktion in der
Schwebe, wodurch das übliche Mischen entfällt. Bei Verwendung von sehr verdünnten
Latexsuspensionen, die aufgrund der hohen Beladbarkeit mit Antikörpern ohne weiteres
möglich ist, entfällt auch das Zentrifugieren der Partikel nach Ablauf der Enzymreaktion,
da durch die Suspension hindurch photometrisch gemessen werden kann.
-
Im Gegensatz zu den üblicherweise in immunologischen Testverfahren
verwendeten Latices lassen-sich die antikörperbeladenen, erfindungsgemäßen hydrophilen
Polyglycidylmethacrylatpartikel nach dem Zentrifugieren leicht resuspendieren. Aus
demselben Grund zeigt sich eine sehr geringe nichtspezifische Adsorption des enzymmarkierten
Antigens (gebundene Aktivität in Abwesenheit vom primären Antikörper).
-
Versuchsdurchführung 0,2 ml TSH-Standard (internationales Referenzpräparat
MRC 68/38 in TSH-freiem Serum) werden mit 0,1 ml einer 1:150000 Verdünnung in Wasser
oder geeigneter Pufferlösung eines an sich bekannten Anti-TSH-Antiserums, beispielsweise
von Meerschweinchen, inkubiert. Nach 12 Stunden werden 0,1 ml einer Lösung eines
Enzymkonjugats, bestehend aus an Glukoseoxidase (GOD) kovalent gekoppeltem TSH (ent-~g
sprechend ca. 1,5 x 10 g TSH), zu dem Gemisch der ersten Stufe pipettiert. Zu diesem
Gemisch werden nach weiteren 12 Stunden 0,1 ml einer Latexsuspension pipettiert.
Die Suspension enthält 0,1 bis 1 mg/ml Methacrylatlatex, wobei - wie in Beispiel
11 beschrieben - pro 1000 mg der trockenen Latexpartikel 5 bis 150 mg Protein einer
Immunglobulinfraktion, die aus einem Ziegenantiserum gegen Meerschweinchen-IgG gewonnen
wurde, hinzugefügt und so an die hydrophilen Latexpartikel kovalent gebunden worden
sind. Nach ner Stunde wird zentrifugiert und der Niederschlag der Latexpartikel
mit 1 ml einer geeigneten Pufferlösung gewaschen, wodurch die Latexpartikel resuspendiert
werden. Anschließend wird erneut mehrfach zentrifugiert und gewaschen. Die Überstände
werden verworfen.
-
Zu jedem Ansatz wird 1 ml einer Substratlösung für die GOD pipettiert
und kurz geschüttelt. Die Latexpartikel bleiben danach mindestens 2 Stunden lang
gleichmäßig suspendiert. Danach wird die Suspension in eine Meßküvette überführt
und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
-
Von jeder Extinktion wird ein Substratleerwert L1 abgezogen. L1 ist
die Extinktion von 1 ml Substratlösung, die die gleiche Masse beladener Latexpartikel
enthält wie die oben erwähnte Latex-Suspension, die zu dem Gemisch aus Anti-TSH-Antiserum
und TSz-GOD zugegeben wurde.
-
Die so ermittelten Extinktionen werden für verschiedene Standardkonzentrationen
an TSH aufgezeichnet. Mit Hilfe dieser Eichkurven werden die Konzentrationen von
TSH in klinischen Proben unbekannten Gehaltes anhand der ermittelten Extinktionen
abgelesen.
-
Als geeignete Pufferlösung wird vorzugsweise eine 0,04 Al Phosphat-Lösung,
pH 7,4, verwendet, die 0,005 M EDTA, 0,1 % Rinderserumalbumin sowie 0,15 M NaCl
enthält.
-
Als GOD-Substratlösung wird bevorzugt eine wäßrige Lösung eingesetzt,
die 5 g/100 ml Glukose, 100 mg/100 ml 2,2'-Azino-di-Z3-ethyl-benzthiazolon-sulfonsäure(6)
7 (ABTS), 5 mg/100 ml Peroxidase (POD), 0,05 M Phosphatpuffer, pH 5,6, enthält.
-
Zum Vergleich wurde der TSH-Gehalt dreier Serumproben sowohl mit dem
vorstehend beschriebenen EIA (A) als auch mit Hilfe eines bekannten Doppelantikörper-RIA
(B) bestimmt. Wie die folgende Tabelle zeigt, stimmen die jeweils ermittelten Werte
gut überein:
(A) (B) Serum 1 11,2 pU/ml 12,5 pU/ml Serum 2 7,3
pu/ml 7,1 pU/ml Serum 3 3,8 pU/ml 4,5 pU/ml Auch aus er vorstehend beschriebenen
TSH-Bestimmung ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen hydrophilen Latex partikel
als Träger für biologisch und/oder immunologisch aktive Substanzen, insbesondere
für Antikörper hervorragend geeignet sind.
-
Ermittlung der unspezifischen Bindung Eine TSH-Standard-Probe wird
in der oben unter "Versuchsdurchführung" beschriebenen Weise behandelt (Probe C)
und mit einer weiteren gleichartigen Probe (Probe D) verglichen, die nahezu den
identischen Umsetzungen wie Probe C unterworfen worden ist. Es wurde lediglich das
Anti-TSH-Antiserum weggelassen. Der Vergleich der für die beiden Proben C und D
in der Suspension gemessenen Extinktionen
| Probe C Probe D |
| Extinktion gemessen in |
| der Suspension abzüglich L1 1,028 0,015 |
zeigt, daß die unspezifische Bindung weniger als 1,5 Oo l)et rigst