DE2910414A1

DE2910414A1 - Verfahren zur herstellung von polyglutaraldehyd und seine verwendung

Info

Publication number: DE2910414A1
Application number: DE19792910414
Authority: DE
Inventors: Alan Rembaum
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1978-03-17
Filing date: 1979-03-16
Publication date: 1979-09-27
Also published as: JPS54130696A; GB2017125B; GB2017125A

Description

California Institute of Technology,

Eine Gesellschaft nach den Gesetzen des Staates Kalifornien,

"Pasadena, Kalifornien, Y.St.Ä.

"Verfahren zur Herstellung von Polyglutaraldehayd und seine
Verwendung".

beanspruchte Priorität: 17. März 1978, T. St .A., JJr. 887 825.

Pie vorliegende Erfindung ist in Ausübung einer Arbeit unter MASA-Vertrag durchgeführt worden und unterliegt den Verordnungen des Paragraph 305 der National Aeronautics and Space Act von 1958, Public law 83-568 (72 Stat.'435; 42 USC 2457).

Hie Erfindung betrifft die Herstellung von Polyglutaraldehyd, die Überführung des Polymerisats in eine fluorescierende Form, die Bindung von Proteinen an das Polymerisat und die Verwendung der Polymerisat-Protein-Additionsprodukte für die biologische und chemische Forschung und Untersuchung.

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Die Gewinnung und Charakterisierung von Zellmembranen und ihrer Bestandteile ist wesentlich für das Verständnis der Rolle, die Oberfläehenmenbranen hinsichtlich der Steuerung einer großen Anzahl von biologischen und immunologischen Wirkungen spielen. Die zu diesem Zweck angewendeten gegenwärtigen Techniken sind nicht voll befriedigend«

Die Kenntnis der Art, der Anzahl und der Verteilung von spezifisch wirkenden Rezeptoren auf Zelloberflächen ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlage, die derartigen biologischen Erscheinungen, wie eines Zellen-Zellen-Erkennens bei der Entwicklung, einer Zellenübertragung und -regulierung durch Hormone und chemische Überträger und von Unterschieden bei normalen und Tumorzelloberflächen zugrundeliegen. Bei früheren Bemühungen ist die Lokalisierung von Antigenen und Kohlehydratresten auf den Zelloberflächen, insbesondere bei roten Blutkörperchen und Lymphozyten, durch ein Binden von Antikörpern oder Lectinen (aus Pflanzen isolierte hämagglutinatierende Substanzen) an solche Makromoleküle, wie Ferritin (einem kristallisier baren Protein mit einem Gehalt von 20 bis 24 Prozent Eisen und 1,2 bis 2 Prozent Phosphor), Hämocyanin oder Peroxidase, die als Markierungsmittel für die Durchstrahlungselektronenmikroskopie gedient haben, bestimmt worden. Jedoch kann vorteilhaft bei der Elektronenmikroskopie mit hoher Rasterfeinheit die topographische Verteilung der molekularen Rezeptoren auf den Oberflächen von Zellen- und Gewebeproben in einfacher Weise durch gleiche histocheiaische Techniken unter Verwendung von kürzlich entwickelten, mittels der Elektronenmikroskopie mit hoher Rastei-

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■ ■ 4tr

feinheit auflösbaren Markierungsmitteln bestimmt werden.

Seit kurzem sind im Handel erhältliche Polystyrollatex-Teilehen als immunologische Markierungsmittel zur Anwendung in der Elektronenmikroskopie mit hoher Rasterfeinheit verwendet worden. Die Oberfläche derartiger Polystyrol-Teilchen ist hydrophob, und deshalb werden bestimmte Arten von Makromolekülen, wie Antikörper, unter sorgfältig geregelten Bedingungen auf der Oberfläche absorbiert. Jedoch haften derartige Teilchen in unspezifischer Weise an zahlreichen Oberflächen und Molekülen, und dies begrenzt in schwerwiegender Weise ihre breite Anwendbarkeit.

■Die Herstellung von kleinen stabilen kugelförmigen Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat-Teilchen? die biologisch verträglich sind, d.h. nicht in unspezifischer Weise mit Zellen oder anderen biologischen Komponenten reagieren, und die funktioneile Gruppen enthalten, an die besondere Proteine und andere biochemische Moleküle kovalent gebunden werden können, ist in der US-PS 3 957 741 beschrieben.

Kleinere und noch gleichmäßiger geformte Mikrokügelchen aus Acry!polymerisaten sind in der US-PS 4 138 383 beschrieben. Mikrokügelchen, die eine von Zellmembranen unterschiedliche Dichte aufweisen, sind in der US-PS 4 035 316 offenbart, und fluorescierende Mikrokügelchen auf Basis eines Acrylmischpolyraerisats sind in der am 27. August 1976 hinterlegten US-Patentanmeldung Nr. 718 104 vorgeschlagen worden.

Hydroxlgruppen können durch Bromeyan aktiviert werden, um Proteine und andere chemische Verbindungen mit Aminogruppen an Po-

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lymerisatperlehen kovalent zu binden. Methacrylsäurereste, die den Teilchen eine negative ladung verleihen, dürften wahrscheinlich eine unspezifische Bindung an Zelloberflächen verhindern und Carboxylgruppen liefern, an die eine "Vielzahl von biochemischen Molekülen unter Anwendung der Carbodiimid-Methode kovalent gebunden werden können. . " "

Die Derivatisierungsarbeitsweise ist in unnötiger Weise kompliziert und erfordert eine zusätzliche Stufe, um die Perlchenoberfläche für eine kovalente Bindung an Proteine, wie Antikörper, Lectine und dergleichen, oder an andere Moleküle, wie Desoxyribonucleinsäure, Hormone und dergleichen, herzustellen. Aus diesem Grunde ist das Derivatisierungsverfahren von Mikrokügelchen auf Basis von Acrylpolymerisaten langwierig und hinsichtlieh seiner Anwendbarkeit begrenzt. Monomerer Glutaraldehyd ist als biochemisches Reagens zur kovalenten Bindung von Proteinen, wie Immunglobulinen, an !ferrit in~Polymerisatmikrokügelchen und an andere kleine Teilchen verwendet worden, die dann zur topographischen Darstellung von Rezeptoren auf Zellmembranen angewendet wurden» Der Reaktionsmechanismus von Proteinen mit Glutaraldehyd läßt sich nur schwierig feststellen, da seine Struktur noch unk3.ar ist und man berichtet hat, daß sie mit cyclischen und hydratisierten Formen im Gleichgewicht steht. Die Reaktion ist nichtleicht durchzuführen und liefert häufig unbe'friedigende Ergebnisse,

Die Erfindung befaßt sich nun mit der unmittelbaren Bindung von Proteinen an Polyglutaraldehyd. Im Gegensatz zu monomerem GIutaraldehyd enthält das Polymerisat konjugierte Aldehydgruppen*

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. ■■ ' ; . 29104U

Dies gewährleistet die Bildung stabiler Schiff^!scher Basen, die sich nach der Reaktion mit Proteinen bilden, und weiterhin wird, da der hydrophile Polyglutaraldehyd verhältnismäßig lange Ketten aufweist, die sich von der Oberfläche in das umgebende wäßrige Medium erstrecken, die heterogene Reaktion mit Protein erleichtert,

Polyglutaraldehyd kann in einer lösung hergestellt werden, die zum Gießen von Pollen oder Filmen oder zum Überziehen von Oberflächen von Substraten, wie Polymerisat-Mikrokügelchen, insbesondere mit Amino- oder Hydrazidgruppen substituierte Perlchen, geeignet ist. - Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können unmittelbar durch Suspensionspolymerisation in Gegenwart einer grenzflächenaktiven Verbindung oder durch Ausfällen aus einer eine grenzflächenaktive Verbindung enthaltenden lösung hergestellt werden« Polyglutaraldehyd kann in fluorescierendes Polymerisat durch Umsetzung mit nicht-fluorescierenden Verbindungen, wie m-Aminophenol, umgewandelt werden. Des weiteren kann man magnetische, eine hohe Dichte oder eine hohe· Elektronendichte aufweisende Mikrokügelchen durch Überziehen von Iletalltelichen oder durch Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart einer Suspension von feinteiligen Metallen oder Metalloxiden herstellen. Höhere Ausbeuten und höhere Molekulargewichte kann man durch Verwendung eines Gemisches von Wasser mit stark polaren Lösungsmitteln erhalten.

Diese und zahlreiche andere Vorteile der· vorliegenden Erfindung werden nachstehend zum besseren Verständnis näher erläutert, wobei die Zeichnung mit heranzuziehen ist,

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JtT-

Fig. 1 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von 60 mg Polyglutaraldehyd mit 4,5 mg menschlichen Immunglobulin G- (IgG-) in 50 ml phosphatgepufferter llatriumehloridlösung bei 22°G:

β pH 6,

ο pH 7,4-.

Pig. 2 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Perlchen eines Vinylpyridin-Acrylamid-hydrazid-Mischpolymerisats (im folgenden als "Poly-VP-AU-hydrazid" bezeichnet) mit-fluorescierendem menschlichen IgG bei 22⁰C und pH 7,4:

• an Poly-YP-AM-hydrasid gebundener Polyglutaraldehyd, ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Ivlonoglutaraldehyd, χ Perlenen aus Poly-YP-AM-hydx-azid (Vergleich), £ ' IgG in phosphatgepufferter Batriurachloridlösung (Vergleich).

Pig. 3 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Poly-VP-AM-hydrazid-Perlchen mit fluorescierendem menschlichen IgG- bei 4 Ci

• an Poly~VP-AM-hydrazid gebundener Polyglutaraldehyd, ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Monoglutax^aldehyd, χ Perlchen üms Poly-VP-AM-hydx-asid (Vergleich), £ IgG in phosphatgepuffex-ter Ifatriumchloridlösung (Vergleich)„

Pig. 4 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Poly-VP-AM-hydrazid-Perlchen mit fluoresciex^%endem antimenschlichen Ziegen-Immunglobulin M bei 4°C und pH 7,4: -

ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Polyglutaraldehyd, Δ an Poly-yp-AM-hydrasid gebundener Monoglutaraldehyd, χ Perlchen aus Poly-VP-AM-hydrazid (Vergleich).

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BAD

■ !ig. 5 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von 1.00 mg Polyglutaraldehyd in 50 ml phosphatgepufferter Jatriumchloridlösung mit 7,5 mg Hämoglobin bei 22⁰C als Funktion des pH-Yiertes; ο pH 6,

h PH 7,4,

χ pH 8,4, . ■ ·

• Perlchen aus einem Methacrylsäure—hydroxyäthylester—

Acrylamid-Mischpolymerisat bei pH 6 (Vergleich). Eig. 6 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Perlchen eines Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat mit Hämoglobin bei pH 6 und 22⁰C:

ο an die Perlchen gebundener Polyglutaraldehyd, & an die Perlchen gebundener Monoglutaraldehyd, Φ -Perlchen (Vergleich),

Pig. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung der Konzentration einer grenzflächenaktiven Verbindung auf den Dur damesser der Mikrokügelchen (10 Gewichtsprozent G-lutaraldehyd, pH 11). Fig. 8 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung des pH-Wertes auf den Durchmesser der Mikrokügelchen.(10 Gewichtsprozent GIutaraldehyd, 1 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung). 3?ig. 9 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung der Konzentration des Glutaraldehyds auf den Durchmesser der Mikrokügelchen (1 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung, pH 11),

Nachstehend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen näher beschrieben.

Polyglutaraldehyd wird aus einer wäßrigen Lösung, die 5 bis 50 Gewichtsprozent monomeren Glutaraldehyd enthält, durch Erhöhung

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des pH-Wertes der lösung auf Werte oberhalb 7> "vorzugsweise auf Werte von 9 Ms 12, hergestellt. In Abwesenheit eines Katalysators verläuft die Reaktion spontan exotherm. Pur die Anfangszeit der Polymerisation von 30 bis 180 Minuten wird die Lösung vorzugsweise auf eine Temperatur von 15 bis 30⁰C gekühlt und dann bis zur Beendigung der Polymerisation auf eine Temperatur oberhalb 40⁰C erwärmt. Man nimmt an, daß das Polymerisat die nachstehende sich wiederholende Einheit aufweisti

- CH₀ - CH₀ - CH = C-

CHO

Eine Analyse aufgrund des UV- oder IR-Spektrums bestätigt das Yorliegen von konjugierten funlctionellen Aldehydgruppen im Polymez'isat, die.mit Aminogruppen-enthaltenden Molekülen, wie Proteinen, stabilere Bindungen bilden,

Wenn das wäßrige Medium mindestens 80 Prozent Wasser enthält, fällt das Polymerisat aus und kann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet werden» Ein weiteres Waschen mit Lösungsmitteln, wie Aceton, scheint die Ausbeute ssu verringern* Das-Polymerisat kann in polaren Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, oder Tetrahydrofuran, und insbesondere in stark polaren Lösungsmitteln, wie Biiaethylsulf oxid oder Dimethylformamid., wieder gelöst werden. "Die Lösungspolymerisation, in Gemischen von Wasser und polaren Lösungsmitteln, die 20 bis 80 Prozent Lösungsmittel enthalten, liefern höhere Ausbeuten an Polymerisat. Die.Lösung kann zum Gießen von Folien oder 3?ilmen oder zum Überziehen von Subotraten dienen. Das Polymerisat kann aus der Lösung ausgefällt v.c:eden, Inder:: nan den Y/assergehalt auf über 80 Prozent

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erhöht und dann die Teilchen gewinnt. * .

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Im Handel erhältliche wäßrige Lösungen von Glutaraldehyd werden mittels Aktivkohle gereinigt. Sie sind dann frei von Polymerisaten, wie die Abwesenheit der Absorptionsbande bei 235 nm zeigt, gemessen mittels eines Spektrophotometers "Cary 14". Eine 25-prozentige Lösung von G-lutaraldehyd wird bei 22⁰G durch Einstellen des pH-Wertes auf 11',5 mittels Natriumhydroxid polymerisiert. Fach 120 Minuten wird das Reaktionsgemisch 8 Stunden "bei 5O⁰C gerührt. Das ausgefallene polymerisat wird abfiltriert, mit Wasser und anschließend mit Aceton gewaschen und dann unter vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ausbeute: 60 Prozent. Der molare Extxnktionskoeffxzient βρ⁷5 ^ⁿ Äthanol) ist 1,53 x 10

— 1 —1
Liter χ Mol χ cm . Der molare Extinktionskoeffizient von GIutaraldehyd bei 280 nm (extrahiert aus wäßrigen Lösungen mit Äther und über Magnesiumperchlorat getrocknet) ist £ pgc ~ ^'^ -^ it er χ

—1 —1

Mol χ cm . Der Polyglutaraldehyd ist löslich in Dimethylsulfoxid und weist ein durchschnittliches Molekulargewicht von annähernd 20 000, das mittels Gel-Permeations-Ohromatographie bestimmt worden ist, auf.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird in einem Gemisch von Wasser und Dirnethylsulfoxid im Verhältnis 1:1 wiederholt. Das Polymerisat bleibt in Lösung,

Polyglutaraldehyd zeigt eine geringe iTuorescenz. Jedoch liefert

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-yf- ^η^ 29104U

die Umsetziing von Polyglutaraldehyd mit bestimmten Verbindungen, die selbst nicht fluorescierend sind, ein fluorescierendes Polymerisat durch Bildung von fluorescierenden Chromophoren, die an das Polymerisat gebunden sind. So reagiert Anthron mit AcröleinEinheiten unter Bildung eines Benzanthron-Fluorogens und m-Amino-phenol mit Acrolein-Einheiten unter Bildung des Fluorogens 7-Hydroxy-chinolin,. Aminofluorescin reagiert ebenfalls mit Polyglutaraldehyd unter Bildung eines fluorescierenden Polymerisats«

Beispiel 3 ■ ,

50 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen Polyglutaraldehyds werden in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Dann fügt man 20 mg · m-Aminophenol und einen (Eropfen 10-n Chlorwasserstoff säure hinzu und erwärmt die lösung 60 Minuten auf 50 C, Die lösung fluoresciert stark, wenn sie mit einer UY-Lichtlampe bestrahlt wird. Durch Zusatz von Wasser fällt das Polymerisat aus, das mit Yvasser gewaschen und dann getrocknet wird. Das isolierte Polymerisat wird wieder in Dimethylsulfoxid gelöst und hinsichtlich der Pluorescenz untersucht. Man beobachtet ein stark fluorescierendes Polymerisat mit einem ITuoreseenz-Eralssionsmaximum-bei 470 bis 480 nm,

Beispiel 4

Etwa 0,1 g des nach Beispiel 1 hergestellten festen Polymerisats werden in 0,5-n rlatriumbicarbonat-Lösung suspendiert und mit einer wäßrigen Lösung von 2 mg. 9—Amino—acridin—hydrochlorid bei Raumtemperatur versetzt. Nach erschöpfendem Y/aschen mit 7/asser zeigen die Polyglutaraldehydteilchen unter einer geeigneten UY-Licht-Strahlenquelle eine intensive Fluorescenz. Nach mehreren

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-V-

anschließenden V/aschungen nimmt die Fluorescenzintensität nicht ab.

Lösungen von Polyglutaraldehyd in stark polaren Lösungsmitteln, die im allgemeinen 0,1 bis 5 Gewichtsprozent Polyglutaraldehyd enthalten, können zu durchsichtigen Filmen oder Überzügen unterschiedlicher Dicken, gewöhnlich 0,0025 bis'0,125 mm, gegossen werden, indem man die Lösung auf die Oberfläche aufbringt und die Lösungsmittel aus dem Film oder dem Überzug verdunsten läßt. Die Oberflächen können eine planare, teilchenförmige, kugelförmige oder stabellenförmige Gestalt haben und aus anorganischen oder organischen Substanzen bestehen. Die anorganische Substanz kann ein Metall oder eine Metallverbindung, insbesondere eine magnetisierbar Substanz, wie Eisen, Nickel oder Kobalt, oder deren Oxide, wie Magnetit, ferner keramische oder Glaskügelchen oder dergleichen sein. Organische Substanzen sind gewöhnlich kleine Polymerisatkügelchen, wie die bereits vorstehend erwähnten Perlchen aus einem Methacrylsäure-hydroxyäthyle'ster-Acrylamid-Mischpolymerisat.

Die Überzüge aus Polyglutaraldehyd können kovalent an Substratoberflächen gekuppelt werden, die Aminogruppen enthalten, wie mit Aiainosilanverbindungen modifizierte Glaskügelchen, beispielsweise Kügelchen aus mit Trimethoxy-isopropylamino-silan vernetzten Acrylamid-Homopolymerisaten oder -Mischpolymerisaten. Die Kügelchen sind vorzugsweise sehr klein, nämlich 20 nm bis 100 um, imkllgemeinen 50 nm bis 10 pm, so daß die spezifischen Rezeptorstellen an einer Zellenoberfläche markiert werden können. Perlchen oder Kügelchen 'aus Vinylpyridin- oder Methacrylsäure-hydmxy-

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äthylester-Acrylamid-Mischpolymerisaten sind in der US-PS 3 957 beschrieben und auch in der am 22. März 1977 hinterlegten US-Patentanmeldung ITr, 780 007 vorgeschlagen worden, auf deren Inhalte Bezug genommen wird. Die Mischpolymerisat-Perlchen oder -Kügelchen enthalten im allgemeinen mindestens 50 Prozent Vinylpyridin (YP), 5 bis 35 Prozent Acrylamid (AM) und 0,1 bis 30 Prozent eines damit mischpolymerisierbaren Vernetzungsmittels, wie Bis-(acrylamid) (BAM).

Die Haftfähigkeit von Polyglutaraldehydüberzügen an die Perlchen oder Kügelclien viird weiterhin durch Umwandlung der Aminogruppen in Hydrazidgruppen gesteigert. Die Modifikation kann durch eine Umsetzung mit einem Überschuß von Hydrazin-hydrat bei einer Temperatur von mindestens 40⁰C mit anschließendem Abtrennen und Waschen bewirkt werden.

Beispiels.

Es wird eine 0,1-prozentige Lösung von Polyglutaraldehyd in tetrahydrofuran auf ein G-Ia s subs trat gesprüht. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man einen durchsichtigen I⁵IIm, der fest an die Glasoberfläche gebunden ist.

Beispiel 6

100 mg abzentrifugierte 5 feuchte Vinylpyridin-Acrylamid-Mischpolymerisat-Kügelchen, die einen Gehalt von 20 Prozent Acrylamid und von 20 Prozent Bis-(acrylamid) aufweisen und einen Durchmesser von 0,7 um haben, werden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 ml Hydrazin-hydrat verrührt und dann 120 Minuten unter Rühren auf 120⁰G erwärmt. Die Mikrokügelchen werden dann mit Wasser gewaschen. Wenn sie mit 2,4,6-ΪΎχηχΐχ-ο-^εηΕθΐ3^ίοη8Μυτβ geprüft werden,

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liefern sie ein gefärbtes Produkt, das Hydrazidgruppen anzeigt. Dieses Hydrazidgruppen aufweisende Mischpolymerisat wird im folgenden als "Poly-YP-AM-hydrizid" bezeichnet.

Beispiel 7

Die Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen' nach Beispiel 6 werden mit Polyglutaraldehyd eingekapselt, indem man eine 10 ml-Suspension (25 mg/cm ) der Mikrokügelchen 240 Minuten bei Raumtemperatur mit Polyglutaraldehyd verrührt, der wie in Beispiel 1 in Dirnethylsulfoxid (25 mg in 50 ml) hergestellt worden ist. Fach 'dem Abzentrifugieren und nach gründlichem Waschen mit Dimethylsulfoxid und Wasser wird das Vorliegen von Aldehydgruppen an der "Oberfläche durch Prüfen mit Puchsin-Schiff'schem-Testreagens bestätigt.

Die mit Polyglutaraldehyd überzogenen Mikrokügelchen sind für klinische, diagnostische Untersuchungen, die Affinitäts-Chromatographie, die Ixnmoblisierung von Enzymen, die chemische Abtrennung und Entfernung von Harnstoff und allgemein für Anwendungsgebiete anwendbar, wo eine Bindung an Aminogruppen enthaltende Verbindungen nützlich ist. Es sind zahlreiche Anwendungsgebiete in der Biochemie, der Biologie und in der klinischen Chemie aufgefunden worden.

Die Reaktionsfähigkeit von Polyglutaraldehyd mit niedermolekularen Aminen wird an einem einphasigen (homogenen) System und an einem zweiphasigen (heterogenen) System untersucht. Homogene Reaktionen werden ' bei verhältnismäßig niedriger Temperatur durchgeführt, beispielsweise wird Polyglutaraldehyd mit Methylamin in flüssigem wasserfreien Ammoniak 60 Minuten bei etwa -40°C reagie- !•en gelassen, !fach dem Ansteigen der Temperatur und nach dem 7in-

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-X-

dampfen zur Trockne werden die Produkte mit Wasser gewaschen und bei 6O⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man analysiert die Produkte spektrometrisch und bestimmt ihren Stickstoffgehalt. Das Polymerisat ist bei Raumtemperatur auch in höhersiedenden Aminen, wie Allylamin, Butylamin, iithano'lamin, Hydrazin und Äthylendiarain, löslich. Die Umsetzung mit diesen Aminen wird 60 Minuten bei 22°C durchgeführt. Die Analyse erfolgt in gleicher We ise wie Im Falle der Umsetzungen bei niedriger Temperatur«

Die heterogene Reaktion wird in der ?/eise durchgeführt, daß man 120 mg des Polymerisats in 20 ml einer phosphatgepufferten latriumchloridlösung mit einem Gehalt von 1 g des Amins bei einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4 suspendiert und die Suspension mindestens 30 Stunden in einem geschlossenen Behältnis rührt, Fach dem Waschen mit Y/asser und nach dem Trocknen wird der Stickstoffgehalt des Produkts bestimmt. In der nachstehenden Tabelle I sind die Ergebnisse der Elementaranalyse der hergestellten Produkte angegeben.

Tabelle I.
Stickstoffvierte von Polyglutaraldehyd-lmin-Reaktionsprodulrten.

Amin	homogene	Reaktion	heterogene	Reaktion
	foE ber.	^C0 gef.	<f°E ber.	°/οΈ gef.
Methylamin	38,1	5,6
Hydrazin	47,4	14,0
Ammoniak	16,8	2,9
Allylaiiiin	48,6	5,6
Butylamin	63,1	6,5
Ithanolamin '	44,6	5,0	5,3	0,6
Diaminoheptan	31,9	4,6	3,5	0,5
Hydroxylamin '			52,1	7,5
Glycin			8,9	0,9

Durchschnittswert von 2 Bestimmungen;

Hydroxylaiuin-HGl wird bei pH 7,3 und- 7,4 verwendet; der

y
Stickstoffgehalt

Prozent«

QZ

Die theoretische Menge Stickstoff wird aufgrund der Vermutung berechnet ^ daß jede Einheit -CH₂-CH₂-CH=C(GHO)- ein Molekül Amin bindet. Die spektrophotometrische Untersuchung zeigt, daß bei den meisten Produkten das der Aldehydgruppe zugeschriebene Absorptionsmaximum bei 285 um erheblich reduziert worden ist. Aufgrund der Ergebnisse mit Hydroxylamin enthält der Polyglutaraldehyd eine Aldehydgruppe je Molekulargewicht von 160.

Die Prüfung der Ergebnisse führt zu folgenden Schlüssen:

Polyglutaraldehyd zeigt eine hohe Reaktionsfähigkeit gegenüber niedermolekularen Aminen unter milden YerSuchsbedingungen (vgl. Tabelle I). Die bemerkenswerte Reaktionsfähigkeit von Hydroxylamin zeigt an, daß diese Verbindung ein besseres Reagens gegenüber Glycin darstellt, das bei Versuchen zur Inaktivierung von Aldehydgruppen auf mit Glutaraldehyd oder Polyglutaraldehyd aktivierte Reagentien zur Zellenmarkierung verwendet wird. Die höchsten theoretischen Ausbeuten an Reaktionsprodukten, bezogen auf die Vermutung, daß die sich wiederholende Einheit in dem Polymerisat ein substituierter Acroleinanteil ist, betragen etwa 50 bis 60 Prozent. Spektrometrische Untersuchungen zeigen das Vorhandensein von nicht-umgesetzten Aldehydgruppen bei den Reaktionsprodukten. Deshalb ist es wahrscheinlich, daß die Bildung von Schiff sehen Basen einen Gleichgewichtszustand erreicht und daß durch Änderung der Versuchsbedingungen höhere Ausbeuten als die in der Tabelle I angegebenen erwartet werden können.

Reaktionen mit menschlichen Immunglobulinen: Pluorescierendes menschliches Immunglobulin G und nichtmenschliches Ziegenimmunglobulin M werden an mit Diäthylaminäthyl-cellu-

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lose gefüllten Säulen gereinigt. Ihre Fluoreseenzintensität bei unterschiedliehen pH-Werten wird "bei Raumtemperatur mittels eines "Aminco-Fluorimeters", Modell SPl 125, gemessen.

Der Umsetzungsgrad wird nach dem Zentrifugieren der Suspensionen, die das fluorescierende Immunglobulin G und unlöslichen Polyglutaraldehyd enthalten, durch. Messen der iTuorescenz der überstehenden Lösung bestimmt. Man führt zwei Versuchsreihen durch. In der ersten Versuchsreihe viird pulverförmiger Polyglutaraldehyd unmittelbar mit fluorescierendem Immunglobulin G umgesetzt und die Abnahme der Fluorescenz nach der Umsetzung geinessen, so daß man die an das Polymerisat gebundene Menge des Immunglobulins G- erhält. MikroMigelchen aus einem Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat werden unter identischen Bedingungen iimgesetzt und dienen zu Kontroll- bzw. Vergleichszwecken.

Die zweite Versuchsreihe besteht aus Umsetzungen mit Polyglutaraldehyd, der an die Hydrazidgruppen an der Oberfläche der Perlchen von Poly-VP-AM-hydrazid mit einem Durchmesser von 0,7 um kovalent gebunden ist*

Das Ausmaß der chemischen Bindung wird auf folgende leise untersucht: 25 mg Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen werden mindestens 5 Stunden lang mit 50 ml einer 25 mg Polyglutaraldehyd gelöst enthaltenden Lösung von Dimethylsulfoxid gerührt. Nach dem Abzentrifugieren und Waschen mit Dimethylsulfat und Wasser werden zu 5 cm Kügelchen fluorescierende Immunglobuline gegeben (Tabellen II, III und IV). Die jeweiligen Gemische werden bei einer bestimmten Temperatur gerührt, und dann wird der Verlust an Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit unter Verwendung der abzentrifugierten Lö-

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Qk

sung in aliqoten Teilen "bestimmt.

Umsetzung mit Hämoglobin:" Polyglutaraldehyd oder Poly-VP-AM-hydrazid-Kügelchen mit einem Polyglutaraldehydüberzug werden in zweimal umkristallisierten Hämoglobin, das in 0,01-m Phosphat-Pufferlösung gelöst ist, suspendiert. Man stellt den pH-Wert mittels Fatriumphosphat ein und verzeichnet nach einer bestimmten Zeit die optische Dichte bei 412 nm von abfiltrierten aliquoten Anteilen.

Markierung von Lymphozyten mit Immun-Mikrokügelchen: Menschliche Lymphocyten werden von den roten Blutkörperchen mittels eines "Pieoll-Hypaque"-Gradienten ("Picoll"· =· ein polymerer Rohrzucker vom Molgewicht 400 000; "Hypaque" = Natriumsalz der 3,5-Diacetamido-2,4 >'6-trijod-benzoesäure) abgetrennt, von Monocyten mittels Eisenteilchen befreit und in einem Medium bei einem pH von 7,2 bis 7,4 suspendiert, dem 20 Prozent Serum von Kalbsföten zugegeben ist. Das Medium ("EPMl/H") besteht aus*"RPMI 1640" (der Firma G-ibco, Y.St.A.) und 0,025-m F-2-Hydroxyäthyl-piperazin-l^lI-2-athansulfonsäure-Lösung.

Die Mikrokügelchen, an die Immunglobuline mittels Polyglutaraldehyd (0,5 cur einer.Mikrokügelchensuspension mit einem Gehalt von 0,5 mg Mikrokügelchen in einer phosphatgepufferten ETatriumchloridlösung von pH 7,4) werden 60 Minuten bei 4°C mit 5x10 Lymphocyten in 1 enr "RPMI/H"-Pufferlösung mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Hatriumazid inkubiert. Nach der Zugabe von 1,5 cur Serum von Kalbsföten und 0,1 Prozent Hatriumazid wird die Suspension in einer Zentrifuge mit 1500 UpM (515 g) zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden wieder in einer Lösung aus 50 Prozent "RPHl/H"

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und 50 Prozent Serum τοπ Kalbsföten mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Natriumazid suspendiert und nochmals zentrifugiert. Es ist für erforderlich angesehen worden, das Reinigungsverfahren dreimal zu wiederholen, um praktisch sämtliche nicht-gebundenen·Mikrokügelehen zu entfernen. Fach der dritten Zentrifugierung
werden die Zellen wiederum in "RPMl/H" - diesmal mit einem Gehalt von 1 Prozent Rindei'serumalbumin und 0,1 Prozent Natriumazid suspendiert. Die markierten Zellen werden dann unter dem Mikroskop gezählt.

Bei einem Vergleichsversuch werden die Lymphocyten 60 Minuten
mit aggregierten Iiamunglobulin G inkubiert. Das aggregierte Immunglobulin G- wird durch Auflösen von menschlichen Immunglobulin G (50 mg/cm ) in phosphatgepufferter ifatriumchloridlösung
bei pH 7,4 und 30-minütiges Erwärmen der Lösung auf 63°C hergestellt. Die klare überstehende Lösung wird zur Inkubierung der
Zellen vor der Markierung verwendet. ... *

Ergebnisse ο

Reaktion von Polyglutaraldehyd mit niedermolekularen Aminen;
Vorinformationen auf die Reaktionsfähigkeit des Polymerisats mit Aminogruppen erhält man aufgrund der Durchführung von Reaktionen mit einer Reihe von Aminen. Die Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Eleifientaranalyse der Produkte. Die theoretische Stickstoffmenge wird aufgrund der Annahme berechnet, daß jede Einheit
-CH₂-CH₂-CH=C(CHO)- ein Molekül Amin bindet. Im lalle von Hydroxylamin-hydrochlorid, Hydrazin und Butalamin liegt der Umsetzungsgrad in eier Größenordnung von 50 bis 60 Prozent der theoretischen Menge (l'abelle I).

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■ Qi

Reaktion von Polyglutaraldehyd und Methacralsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat-Kügelchen mit einem Polyglutaraldehydüberzug mit Immunglobulinen: Die Tabelle II zeigt die Menge des an den Polyglutaraldehyd gebundenen Immunglobulins G nach 135-minütigem Rühren der Suspensionen bei Raumtemperatur. Es wird bei diesen Versuchen eine konstante Menge von fluorescierendem Immunglobulin G- verwendet.

Tabelle II.

Reaktion von pulverförmiger)! Polyglutaraldehyd mit menschlichen Immunglobulin G (1 mg fluorescierendes Immunglobulin G in 10 ml Phosphatpufferlösung, pH 7,4).

PοIyglutar-

'Ζ

aldehyd mg/cm

Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat mit Überzug von Polyglutaraldehyd mg/cm3

an das Polymerisat gebundenes Immunglobulin G (Gew ic ht/Ge w icht)

bei pH 7,4 bei pH 6

0,2

2,0

20,0

0,2 • 2,0 20,0

0,	160	o,	200
o,	030	o,	040
o,	004	o,	006
0		0
0		0
0		0

Aus der Tabelle II ist ersichtlich, daß steigende Mengen des Polymerisats ein niedrigeres Immunglobulin G/Polymerisat-Verhältnis liefern. Die gleichen Ergebnisse werden mit Mikrokügelchen, die sich entweder vom polymeren oder vom monomeren Glutaraldehyd ableiten, erhalten (vgl. Tabelle III).

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Tabelle III. 2910414 Vergleich der Reaktionsfähigkeit von Kügelchen mit Überzügen aus monomeren! oder aus polymerem Glutaraldehyd. Wirkung der Konzentration an monomerem oder polymerem Glutaraldehyd (0,5 mg fluorescierendes Immunglobulin G in 10 ml Phosphatpufferlösung, pH 7,4)· In allen Versuchen werden 25 mg Kügelchen je cm verwendet.

Vergleich ZZ mg/cm	PoIyglutaraldehyd mg/cm	Glutaraldehyd mg/cm	-	Gewicht des gebun denen Immunglobu- linsG/Gewicht des Polymerisats χ 10-5
	2,5		11,0
	7,5		4,0
	20,0		1,4
		2,5	6,0
		7", 5	2,0
		20,0	0,7
2,5 . ■		• 0

Tabelle IV.

Vergleich der Realstionsfähigkeit von Kügelchen mit Überzügen aus monomerem oder aus polymerem Glutaraldehyd., Wirkung der Immunglobulin G-Konzentration. In allen Versuchen werden 25 mg Kügelchen je cm verwendet.

Vergleich mg/cm	Polyglu- taraldehyd mg/cm	Glutar- aldehyd mg/cm	menschliches. Immunglobulin G /■■ 3 mg/cm	Gewicht des gebun denen Iimaunglobu- lins G/Gewicht des Polymerisats χ 10^
	2,5	·	0,025	5,7
	2,5		0,050	■ 9,5
	2,5		0,100	14,0
	___	2,5	0,025	5,3
		2,5	0,050	4,5
		2,5	0,100 .	■9,1
2,5				. 0

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Die Tabelle II veranschaulicht, daß bei pH 6 größere Mengen Immunglobulin G als bei pH 7,4 an das Polymerisat gebunden v/erden. Diese Wirkung des pH-Wertes wird in den nachstehend beschriebenen Untersuchungen bestätigt. Es ist ferner ersichtlich, daß bei einer gegebenen Reaktionszeit Polyglutaraldehyd in größeren Mengen an Immunglobulin G.als an Mikroperlchen von Polyglutaraldehyd gebunden wird. Die geringere Menge an gebundenen Immunglobulin G mit steigender Konzentration des Polyglutaralfehyds beruht wahrscheinlich auf einer unvollständigen Reaktion und/oder einer ungenügenden Menge von Immunglobulinen. Die Tabellen II und III zeigen weiterhin, daß bei einem gegebenen ρH-Wert erheblich größere Mengen menschlichen Immunglobulins G von dem Polymerisat als von dem Monomeren kövalent gebunden v/erden. Die Information für die ei¹- · forderliche Reaktionszeit wird durch kinetische Untersuchungenerhalten. In Fig. 1 ist die Abnahme der Fluoreszenz der überstehenden Lösung gegen die Zeit aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß bei pH 7,4 die Reaktion nach 135 Minuten unvollständig ist (die in den vorstehenden Untersuchungen angegebene Zeit) Weiterhin ist bei einem niedrigeren pH-Wert als 7,4 die Reaktionszeit rascher. Die Fig. 2 und 3 bestätigen die raschere Reaktionszeit des Polymerisats gegenüber dem Monomeren und zeigen weiterhin die Einwirkung der Temperatur. Gleiche Ergebnisse werden mit fluoreszierenden nicht-menschlichen Ziegenimmunglobulin M erhalten (Fig. 4).

Reaktionen mit Hämoglobin: Da Hämoglobin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei'412 mn (£ „ = 125> bezogen auf ein

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BAD ORIGINAL

Molekulargewicht von 17 000) hat, stellt die Proteinimmobilisierung ein geeignetes Modell für Untersuchungen dar. Es kann aus dem Absorptionsmaximum bei ^12 nm berechnet werden, daß bei pH 6, 7j^ und 8,4 Poly glut araldehyd nach 500 minütiger Reaktionszeit 8,8, 6,6 bzw. 2,8 % Hämoglobin immobilisiert. Bei Kontroll versuchen mit Methaerylsäure-hydroxyäthylester-/Hämoglobin-Gehalt in der Größenordnung von 1 %_s bezogen auf die Stickstoffanalyse (berechneter Wert: 15>2 % N). Der Hämoglobingehalt der bei 6, 7»^ und 8,4 erhaltenen Polyglutaraldehyd-Hämoglobin-Produkte wird zu 10,4, 7,8 und 5,3 % berechnet, bezogen auf die Stickstoffanalyse, und stimmt im wesentlichen gut mit spektrophotometrischen Ergebnissen überein. Im Gegensatz zu der heterogenen Reaktion findet man, wenn PoIyglutaraldehyd mit einem Überschuß an Hämoglobin homogen in wäßrigem DimethylsuTfoxid umgesetzt wird, daß das erhaltene Pro-

dukt 76 % Hämoglobin enthält (Stickstoffanalyse).-Die Kinetik von an Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen" gebundenem Hämoglobin ist in B'ig. 6 gezeigt. Der Trend einer ansteigenden Reaktions-' geschwindigkeit bei pH 6 im Vergleich zu pH Ί,k ist" augenscheinlich.

Die Reaktionsfähigkeit des Polymerisats mit menschlichem Immunglobulin G ist etwa zweimal größer als die des Monomeren (TabellenII, III, IV und Fig. 2, 3, *J und 6). Die Anzahl von Immunglobulin G-Molekülen je Perlchen von 0,7 MJn Durchmesser nach 10 Stunden Reaktionszeit bei 22°C (Fig. 2) berechnet sich zu 3,8 χ 10·^ für Polyglutaraldehyd und zu 2,3 χ 10^ für Mono-"glutaraldehyd. Größere Mengen und schnellere Reaktionsge-

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-X-

29104U

schwindigkeiten werden bei Reaktionen von Irnmunglobulinen mit Polyglutaraldehyd als mit Mikroperlchen bzw. -kügelchen von Polyglutaraldehyd beobachtet (vgl.Tabellen II, III und IV und Fig. 1 und 2). Die gleichen Schlüsse gelten für die Reaktionen mit Hämoglobin (Fig. 5 und 6)..

Eine Herabsetzung des pH-Wertes von 7,4 auf 6 erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Erscheinung gilt sowohl, für menschliches Immunglobulin G (Fig. 1) wie auch für Hämoglobin (Fig. 5)· Um diese Wirkung zu interpretieren, nimmt man an, daß die Umsetzung von Polyglutaraldehyd zwischen freien Aminogruppen des Proteins, beispielsweise der Lysinreste, und Aldehydgruppen des Polymerisats unter Bildung von S chi ff'schäl Basen stattfindet. Es kann erwartet werden, daß Carbonyl-Additionsreaktionen durch Säuren ,stärker katalysiert V/erden, denn nach dem Angriff auf das Sauerstoffatom durch ein Proton wird das Kohlenstoffatom erheblich positiver und dadurch leichter reaktionsfähig mit einer nukleophilen Verbindung:

F +
>C=0 φ >C -OH

Wenn die nukleophile Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel R-NHp ist, wandelt die Säure 'das Amin in den nicht-reaktionsfähigen Typ R-NH, um. Deshalb erwartet man zu finden, daß die Additionsgeschwindigkeit ein Maximum bei schwach saurem pH-Wert mit scharfem Abfall nach beiden Seiten zeigt. Dies wird in der Praxis tatsächlich beobachtet/

Das geringe Ausmaß, einer unspezifischen Bindung von Immun-

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• ·' Γ '

- C. "*'* ^! ■ /;W'·· BAD ORIGINAL

-X-

globulinen und Hämoglobin (Fig. 2 und 5) an Substrate, die frei von Glutaraldehyd und Polyglutaraldehyd sind, wird einer physikalischen Adsorption zugeschrieben und kann durch Erniedrigen der Reaktionstemperatur (Fig. 3) vermindert werden.

Die hohe Reaktionsfähigkeit von Polyglutaraldehyd, seine Stabilität, seine leichte Handhabung und die Retention der physiologischen Wirksamkeit von an das Polymerisat gebundenen, menschlichen Iinmun-globulinen macht das neue Reagens für die Bindung von Proteinen wünschenswert«

Obwohl mit Polyglutaraldehyd überzogene Mikrokügelohen reaktionsfähiger als Glutaraldehyd sind, trägt das Erfordernis der Bildung von überzogenen Kügelchen zu einer unnötigen Schwierigkeit des Überführungsverfahrens bei. Es ist weiter gefunden worden, laß eine Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart eines Emulgiermittels wasserunlösliche Polyglutaraldebyd-Mikrokügelchen mit einem Durchmeser von 20 nm bis 10,um, gewöhnlich von 50 nm bis 1,5,um, liefert. Die Polymerisation in Gegenwart einer Suspension von magnetischen Teilchen liefert magnetische Mikrokügelchen. Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können sich auch durch Ausfällen von Polyglutaraldehyd aus einer eine grenzflächenaktive Verbindung enthaltenden Lösung bilden. Fluoreszierende Mikrokügelchen können durch eine Nachpolymerisation mit einem Fluorοchrom oder durch Polymerisieren in Gegenwart eines Fluor ocliroms gebildet werden.

-Bie GröBe der Polyglutaraldehyd-Imniunmikrokügelchen wird durch den pH - Wert, die Konzentration der grenzflächenaktiven Ver-

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'29104U

bindung und durch die Konzentration von monomeren! Glutaraldehyd beeinflußt. Die ImmunmikrokügeIchen werden dadurch hergestellt, daß man eine Suspension mit 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Glutaraldehyd und 0,1 bis 3 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung in einem wäßrigen Medium herstellt, den pH-Wert auf 7 bis 13, vorzugsweise 9 bis 12, einstellt und das Reaktionsgemisch mehrere Stunden rührt. Die Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden dann abgetrennt und gewaschen. Das wäßrige Medium kann 5 bis 50 Gewichtsprozent mit Wasser nicht mischbarer organischer Flüssigkeiten, wie aromatische oder aliphatische organische Lösungsmittel, beispielsweise Benzol, Toluol, Hexanj Heptan oder Octan, oder Triglyceride, wie Bauniwollsamenöl, Maisöl oder Sojabohnenöl, enthalten.

Mikrokügelchen mit einem Gehalt an elektroriendichten Metallen e'rgeben eine räumlich höhere Auflösung der Zelloberfläche. Polyglutaraldehyd-Immunraikrokugelchen mit einem Gehalt art elektronendichten Metallen erzeugen eine stabilere Markierung als Goldteilchen mit physikalisch absorbierten Antikörpern, die gegenwärtig zur Zellmarkierung verwendet werden. Die ein Metall enthaltenden Mikrokügelchen können in situ durch Polymerisieren von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen in Gegenwart einer Suspension von fein verteilten Metallteilchen oder Verbindungen von Metallen, vorzugsweise mittels einer kolloidalen Dispersion des Metalls, hergestellt werden. Das Metall wird in die Mikrokügelchen in einer wirksamen Menge von 0,5 bis 20 Gewichtsprozent, gewöhnlich von 1 bis 10 Gewichtsprozent, eingearbeitet. -

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29104U

Die Metall- oder Metallverbindungsteilchen sind vorzugsweise feinteilige, weitgehend gleich große Substanzen mit einem gleichmäßigen Durchmesser, der kleiner als derjenige der erhaltenen Mikrokügelchen ist und typischerweise unter 100 nm, gewöhnlich bei 2,5 nm bis 50 nm, liegt, Die Metalle sind vorzugsweise elektronendichte Schwermetalle mit einer Ordnungszahl oberhalb 50, vorzugsweise oberhalb 75> wie Blei, Nickel, Kobalt, Platin, Gold oder Eisen. Das Metall kann magnetisch sein, wie Eisen, Nickel, Kobalt oder deren Legierungen, oder eine anorganische magnetische Verbindung, wie ein Metalloxid. Die magnetische Substanz ist vorzugsweise magnetisches Eisenoxid der Formel Pe^O₂,. Bestimmte harte, keramische Verbindungen vom Typ des Ferrits, wie Lithiumferrite, können ebenfalls verwendet werden. Das Metall oder die Metallverbindung kann durch Suspendieren in Wasser mit einem Gehalt an einer grenzfläehenaktiven Verbindung, wie Polyäthylenimin, in eine leicht dispergierbare Form gebracht werden.

Die Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können durch Umsetzen mit einer Verbindung fluoreszierend gemacht wer'den, die mit Acrolein-Gruppen Fluorogene bildet, wie Anfchron oder metar jlminophenol, oder mit Aldehyd-Gruppen reaktionsfähige Fluor ochrome liefert, wie Aminofluorescein, 9-Amino-acridin, Propidiuin-broniid oder Fluorescein-isothiocyanat. Stark fluoreszierende Mikroperlchen können auch durch Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart eines Fluor οohroms mit Aminogruppen hergestellt werden.

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Die grenzflächenaktiven Verbindungen sind wasserlösliche, nichtionische, kationische oder anionische Substanzen im allgemeinen organischer Art, wobei Fluorkohlenv/asserstoffe und Hydrofluorkohlenwasserstoffe sowie Silicium enthaltende Verbindungen mit eingeschlossen sind. Kationische grenzflächenaktive Verbindungenlcinnm Amine, Aminsalze, Sulfonium-, Phosphonium- oder quartäre Ammoniumverbindungen sein. Die grenzflächenaktiven Verbindungen können allein oder in Gegenwart von 1 bis 5 Gewichtsprozent eines Suspendiermittels, wie Polyäthylenoxid, Glycerin, Polyacrylamid oder Polyäthylenimin, verwendet v/erden. Ein Beispiel einer kationischen grenzflächenaktiven Verbindung ist ein kationischer Guar Sum ("Guar C13"). Wasserlösliche anionische grenzflächenaktive Verbindungen können .im Handel erhältliche Carbonsäuren, Schwefelsäureester und Alkansulfonsäuren, beispielsweise Natrium-dodecylsulfat oder ein anionischer Fluorkohlenwasserstoff ("Zonyl PSP"), sein. Nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindungen sind gewöhnlich Polyäthylenoxid- und/oder Polypropylenoxid-Derivate von Phenolen, Alkoholen oder Fettsäuren. Bevorzugte nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindungen sind wasserlösliche Mischpolymerisate »

mit Molekulargewichten von 800 bis 10 000 von Acrylamid mit 30 bis 60 Gewichtsprozent eines Acrylsäureester oder eines Alkyl- oder Alkoxy-methyl-alkylamids, wie Isobutoxymethacrylamid gemäß der US-PS H O98 987. . . '.

Beispiel8

Zu 100 cnr einer 5-gewichtsprozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung mit einem Gehalt von 1 Gewichtsprozent eines Mischpoly-

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. BADORiGiNAL

29104U

inerisats aus 60 % Acrylamid und 4.0 % Isobutoxymethacrylamid

lösung/
wird 10-n Natriumhydroxid/zügetropft, bis ein pH-Wert von erreicht ist. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Stickstoff entlüftet, der Behälter dicht verschlossen und auf einem mechanischen Schüttler 2k Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von jeweils 1, 2 und h Stunden wird der pH-Wert durch Zugabe von 10-n Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch ausgiebig gegen Wasser dialysiert und dann dreimal je 30 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Man erhält 200 mg Polyglutaraldehyd-Kügelehen mit einem mittleren Durchmesser von 200 - 20 nm aufgrund der Rasterelektronenmikroskopie. Die Kügelchen werden in 0,01-m auf pH 7^1 phosphatgepufferter Natriumchloridlösung oder in destilliertem Wasser redispergiert. Durch ein Verändern der Konzentration der grenzflächenaktiven Verbindung, des Monomerengehaltes oder des pH-Wertes kann die Größe der Mikrokügelchen in einer- voraussagbaren Weise geändert werden. .

Das Verfahren d&s Beispiels 8 wird durch Verändern der Konzentration der grenzflächenaktiven Verbindung, des Monomeren-" gehalts und des pH-Wertes zur Bestimmung der Wirkung auf den Mikrokügelchendurchmesser wiederholt, wie aus den Fig. 7_S 8 und 9 ersichtlich ist. Bei Abwesenheit einer grenzflächenaktiven Verbindung ist der Monoglutaraldehyd sehr langsam bei pH 7 einer Aldolkondensation ausgesetzt. Die Polymerisationsgeschv.'indigkeit erhöht sica bei pH-Vier ten oberhalb 7 und lie-Tert pulverföi'rnige Produkte, die Aldehydgruppen aufweisen.

291OfU

In Gegenwart von grenzflächenaktiven Verbindungen und bei einer basisch eingestellten wäßrigen Lösung fällt Polyglutaraldehyd in Form von kugelförmigen kolloidalen Teilchen aus. Eine Größenabnahme bei ansteigenden pH-Werten ist höchstwahrscheinlich infolge des Auftretens einer Cannizzaro'sehen Reaktion, die Carboxylgruppen entstehen läßt. Dies zeigt sich durch eine erhöhte Löslichkeit bei erhöhten pH-Werten und einem erhöhten Neutralisationsäquivalent der isolierten, Pölyglutaraldehyd-Mikrokügelchen, die bei verschiedenen pH-Werten hergestellt worden sind (Tabelle V). Die Durchmesser der Mikrokügelchen nehmen auch bei Herabsetzen der Konzentration an monomeren oder an grenzflächenaktiven Verbindungen ab.

Tabelle V

Herstellung von Polyglutaraldehyd-'Pulver und -Mikrokügelchen (0,2,um Durchmesser) als Funktion des pH-Wertes (potentiometrische Titration mit 0,1-n Natriumhydroxidlösung in wäßrigem Dimethylformamid (1:1))

Polyglutaraldehyd	Mikrokügelchen PH -	mSqüiviCarboxy IgT,	Anzaj^l der Carboxyl	je Mikro kügelchen χ 10-7
Pulver PH		g Polyglutaraldehyd	gruppen
10,0		<0,03	je gxlÖ"¹⁹
11,0		0,05	<2,0
11,5		0,10	. 3,0
12,3		0,13	6,0
13,5*	10,5	0,95	7,8	< 1,5
	11,5	<0,03	50,0	2*1,0
	12,3	0,10		75,0 j
		0,30
	$00839/0863-

^X^lösliches, bei pH 6 ausgefälltes Polymerisat 2910414

Das Vorhandensein von Aldehydgruppen wird mittels einer Fouriertransformierten Infrarot-Absorptionsspektrenreaktion mit Hydroxylamin-hydrochlorid und mit 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin

— festgestellt. Die Absorptionsbanden bei 1720, 1680 und 1635 cm sind früher schon den Schwingungen von nicht-konjugierten Aldehydgruppen, konjugierten Aldehydgruppen und Kohlenstoff-Kohlenstoff -Doppelbindungen in ct-Stellung" zur Aldehydgruppe zugeschrieben worden.

Aus den Fourier-transformierten Infrarot-Absorptionsspektren ist ersichtlich, daß alle Absorptionsbanden, die für PoIyglutaraldehyd-Pulver charakteristisch sind, bei nicht-magnetischen' und bei magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen vorhanden sind. Eine zusätzliche Absorptionsbande bei 15^0 cm beruht wahrscheinlich auf einem-Restgehalt,an der verwendeten grenzflächenaktiven Verbindung. Die Anwesenheit von Eisenoxid-Kernen in den magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ruft eine Verschiebung von einigen Absorptionsbanden hervor, beispielsweise der Banden von 1680, I36O und 1125 cm . Die Zu-

— 1 Ordnung der Absorptionsbande bei I68O cm zur Aldehydgruppe wird durch die Umsetzung von Polyglutaraldehyd mit Natriumbisulf it bestätigt. Das Reaktionsprodukt von Polyglutaraldehyd mit Natriumbisulfit zeigt eine Absorptionsbande bei I68O cm Ein weiterer Gesichtspunkt für Aldehydfunktionen ist die Stickstoffanalyse von Polyglutaraldehyd-Pulver, nicht-magnetischen und magnetischen Mikrokügelchen, die mit Hydroxylamin-hydrochlorid umgesetzt worden sind. Die Ergebnisse der in Tabelle VI

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angegebenen Stickstoffanalysen zeigen, daß die Anzahl der Aldehydgruppen abnimmt, wenn.der pH-Wert, bei dem die Polymerisate

hergestellt worden sind, erhöht wird. Er stimmt mit dem all- ^; mählichen Anstieg des Neutralisationsäquivalents (Tabelle V) überein, d.h. mit zunehmender Konzentration der Carboxylgruppen. Letztere werden bei Verbrauch der Aldehydgruppen (Tabelle V) gebildet, wie dies im Falle der Cannizzarö* sehen Reaktion zu erwarten ist. · ,

T a b e 1 1 e VI '

Reaktion von Pqiyglutaraldehyd-PuIver und -Mikrokügelchen (0,2 ,um Durchmesser), die mit Hydroxylamin bei verschiedenen pH-Werten hergestellt worden sind (Stickstoffanalyse der Reaktionsprodukte)

Polyglutaraldehyd	Mikrokügelchen pH	% N im Reaktions produkte	-Anzahl der Aldehyd-	je Mikrokügel chen xl0~7
³ul.vei PH	■·."	7,8 7,3 2,2	je gxlO'"²-¹
10,0 11,5 12,3 13,5	10,5 11,2 11,2^XX	6,7 6,1 . 6,7	3,1 1,8 0,9	1,2 1,0

^x berichtigt (der prozentuale Stickstoffwert beträgt vor der Umsetzung beim Pulver 0,05 % und bei den Mikrokügelchen 1,8 %)

nagnetisehe Mikrokügelchen (Eisengehalt lh %, mittels atomarer Absorption)

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Qualitativ kann das Vorliegen von Aldehydgruppen mittels 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin gezeigt werden, wobei man gelb-orange gefärbte Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen erhält, wenn man die Umsetzung hetei'Ogen in wäßriger Suspension bei pH 2 durchführt. Die zum Vergleich verwendeten Poly-VP-AM-hydrazid-MikrOkügelchen ergeben einen negativen Färbtest. Es wurde beobachtet, daß bei saurem pH-Wert und bei einer hohen Salzkonzentration, Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen aggregieren. Da während einer Zellenmarkierung eine Mikrokugelchenaggregation vermieden werden muß, ist es im Falle von magnetischen >Polyglutaräldehyd-Mikrokügelchen erforderlich, den 0,15-m Natriumchloridgehält in der Phosphatpufferlösung durch einaa2,5--m Saccharosegehalt zu ersetzen. Jedoch die nicht-magnetischen Polyglütaraldehyd-Mikrokügelchen können sicher als Suspension in phosphatgepufferter Natriumchloridlösung verwendet werden. ' '

Beispiel 9.

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß die grenzflächenaktive Verbindung "durch 1 Gewichts prozent einer anionischen grenzflächenaktiven Verbindung auf Basis eines Fluorkohlenwasserstoffs ersetzt wird.'Der mittlere Teilehendurchmesser der PolyglutaraXdehyd-Mikrokügelchen liegt bei 0,1,um. ■ ·

Beispiel 10

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß die grenzflächenaktive Verbindung durch ein Gemisch aus 1 Gewichtsprozent einer kationischen grenzflächen-

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aktiven Verbindung auf Basis von Guar Gum und 5 Gewichtsprozent eines Suspendiermittels auf Basis eines Polyäthylenoxids mit

ersetzt wird,/

einem Molekulargewicht von 100 000/ Der mittlere Teilchendurchmesser der Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen beträgt 0,2,um.

Beispiel. 11

Stark fluoreszierende Polyglutaraldehy'd-Mikrokügelchen erhält man durch Zugabe von 10-n Natriumhydroxidlösung zu-einer, wäßrigen Suspension mit 1 Gewichtsprozent eines Mischpolymerisats von 60 % Acrylamid und ^O % Isobutoxymethacrylamid als grenzflächenaktive Verbindung mit einem Gehalt von 0,05 % 9~Aminoacridin als Fluorοchrom bis zum Erreichen von pH 11. Anschließend fügt man eine wäßrige Glutar dehydlösung bis- zur Endkonzentratiön von 5 Gewichtsprozent hinzu und stellt den pH-Wert wiederum auf 11 ein. Die Mikrokügelchen werden wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt. Es werden stark grün fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,15.um erhalten.

Das Verfahren des Beispiels 11 wird mit 0,05 Gewichtsprozent verschiedener Fluoroch.romq,tfiederholt. Man erhält die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse.

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29104H

Tabelle VII

Pluorochrom

Propidium-bromid

Amino-fluorescein (Isomer 1)

o-Phthalaldehyd

5-Dimethy!amino-1-naphthalinsu]fonyl-hydrazid

Fluorescein-isothioeyanat (gelöst in überschüssigem Äthylendiamin)

Fluoreszenz

rot

grün grün

, B e i s ρ 1 e 1 12

Stark fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen erhält man durch 24-stündiges Schütteln bei 25°C von 20 mg der nach Beispiel 8 hergestellten Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit 1 mg einer 0,01-prosentigen Fluorescein-isqthiocyanat-Lösung

in Äthylendiamin. Die fluoreszierenden Mikrokugelehen werden wie in Beispiel 8 gereinigt und in Wasse'r oder phosphatgepufferter Natriumchloridlösung redispergiert.

Beispiel 13

Der Zusatz von 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin zu Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen des Beispiels 8 bei pH 2 eigi"bt eine bleibende gelbe Farbe.

Beispiel Ik

Das Verfahren des Beispiels 8 wird in Gegenwart einer 1-gewichtsprosentigen wäßrigen Dispersion von Fe-,O^ mit einem . Gehalt von 5 Gev/ichtsprozent Eisen wiederholt. Man erhält

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magnetische Kügelchen mit einem mittleren-Durchmeser von'0,1,um. Die Reinigung der Eisen enthaltenden Mikrokügelchen besteht·in einer Dialyse gegen V/asser und Abtrennen von diamagnet.ischen Verunreinigungen mittels eines permanenten Magneten. Die Substanz wird schließlich in 0,5-m phosphatgepufferter Saccharoselösung dispergiert. Die Konzentration der Teilchen in der Lösung beruht auf der Trockengewichtsanalyse. Ein bekanntes Volumen· der Lösung wird bei HO⁰C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. . "

.Beispiel 15

Dispergierbares Eisenoxid wird durch Auflösen von 10 Gramm Eisen(II)-chlorid und 13,5 Gramm Eisen(III)-chlorid in 210 ml einer .l-'gewichtsprozentigen wäßrigen Lösung von Polyäthylenimin (Molgewicht' 1800) erhalten. Dann gibt man 50-prozentige Natriumhydroxidlösung bis- zum pH* 7 hinzu. Qas Reaktionsgemisch wird 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt, gründlich gegen Wasser dialysiert und dreimal magnetisch von nicht-magnetischen Teilchen' getrennt. Die magnetischen Polyäthylenimin-Eisenoxid-Teilchen werden in Wasser redispergiert und dann 10 Minuten mit einem'klinischen Sonikator beschallt. Es bilden sich magnetische Teilchen mit einem Durchmesser von 30 nm mit Aminogruppen an der Oberfläche.

Beispiel 16 "

Es wird eine 1-prozentige Polyäthylenimin-Eisenoxid-Lösung wie in Beispiel 15 zu einer Suspension gemäß Beispiel 8 zugegeben. Man erhält magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen.

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Beispiel 17

Bei der Zugabe einer 0,01-prozentigen Fluorescein-isothiocyanat-Lösung in Äthylendiamin zu einer Suspension gemäß Beispiel Ik erhält man fluoreszierende magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelohen mit einem mittleren Teilchendürchmesser von 0,1.um.

Beispiel 18'

20 mg der magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen von Beispiel Ik -werden 2k Stunden bei 25°C mit 1 mg Fluoresceinisothiocyanat, das in 0,02 ml destilliertem Äthylendiamin gelöst ist, geschüttelt. Die stark fluoreszierenden magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden gründlich gegen Wasser dialysiert und dann dreimal magnetisch getrennt. Die gereinigt.en Fikrokügelchen werden in Wässer oder in 0,5-m phosphatgepufferter Saccharoselösung redispergiert.

Beispiel- 19

Es werden in einer wäßrigen Suspension mit einem Gehalt an einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel -Pölyglutaraldehyd-Mikrokügelchen gebildet. Zu einer gerührten wäßrigen Lösung von 5 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, 10 % Toluol und/ 2 % eines im Handel erhältlichen Alkyl-polyäthoxyäthanols ("Triton X-100") wird bei 25°C lö-n Natriumhydroxidlösung zugegeben, bis pH 11 erreicht ist. Die Lösung wird 3 Stunden gerührt und dann dreimal bei 2000 g zentrifugiert. Es bilden, sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,5_/um, die nach dem in Beispiel 8 ge- '

909839/0883

-jf- ~:

reinigten Verfahren abgetrennt und gewaschen werden.

. B e i s ρ i e 1 20 ■ '

Magnetische Folyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden durch Zugabe einer 1-gewichtsprozentigen wäßrigen Dispersion von Fe-zOjj mit einem Gehalt von 5 Gewichtsprozent Eisen zu einer Suspension gemäß Beispiel 18 gebildet ,'■ dann dreimal magnetisch abgetrennt, gewaschen und dialysiert.

Beispiel 21 ,

Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden durch Auflösen von 125 mg Polyglutaraldehyd-Pulver gemäß Beispiel 1 in 2,5 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gebildet. Die Lösung wird lebhaft gerührt. Dann fügt man 50 ml einer 2-prozentigen wäßrigen Lösung eines Polyäthylenoxids vom Molgewicht 100 000 hinzu und rührt die Lösung eine weitere Stunde. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von. 0,1,um, die durch dreimaliges Zentrifugieren bei 2000 g gereinigt und dann in Wasser redispergiert werden.

•Beispiel 22.

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine 4-gewichtsprozentige wäßrige Lösung eines anionisch substituierten

Pluorkohlenwasserstoffs verwendet. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen. ; ■ \

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-Jtf-

Beispiel 23

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine 4-prozentige wäßrige Lösung eines kationisch substituierten Fluorkohlenwasserstoffs verwendet. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen.

Beispiel 2k'

Fluoreszierende Mikrokügelchen werden durch Auflösen von 125 Polyglutaraldehyd-Pulver und 12 mg Aminofluorescein unter leb haftem Rühren in 205 ml wasserfreiem Dimethylsiifoxid hergestellt. Bei der Zugabe einer 2-prozentigen wäßrigen Poly- . äthylenoxidlösung erhält man fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Perlchen mit einem mittleren Durchmeser von 0,1,um.

Beispiel 25

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß zu der Dimethylsulfoxid-Lösüng eine 6-prozentige Polyäthylenimin-Eisenoxid-Lösung gemäß Beispiel 15 zugegeben wird. Man erhält fluoreszierende, magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen. _ .

Beispiel 26

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, indem man 50 mg des wasserlöslichen Polyacrylamide, anstelle des in Beispiel 8 genannten Mischpolymerisats als grensflächenaktive Verbindung verwendet. Man erhält P.olyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit '

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einem mittleren Durchmesser von 0,2,Um.

Beispiel 27

Wenn man das Verfahren des Beispiels 26 in Gegenwart einer 1-gewichtsprozentigen wäßrigen Dispersion von Ρβ,Ο. mit einem Gehalt von 5 Gewichtsprozent Eisen wiederholt, erhält man magnetische Perlchen. * .

Reaktionen der Polyglutaraldehyd-Mikroperlehen mit menschlichem Immunglobulin G:

Um die erforderliche Reaktionszeit zur Konjugation von Antikörpern an Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen zu bestimmen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit unter Verwendung von fluoreszierendem menschlichem Immunglobulin G als Modellfall untersucht. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität mit der Zeit ist ein Maß für die Bildungsgeschwindigkeit der kovalenten Bindung. Die anfänglich rasche Reaktion wird bei nicht-magnetischen und bei magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen sowie bei pulverförmigem Polyglutaraldehyd zusammen mit einem Vergleichsversuch untersucht, bei.dem Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen verwendet werden, die frei von Aldehydgruppen sind. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität bei dem Vergleichsversuch zeigt eine physikalische Adsorption an menschlichem Immunglobulin G.an. Der pulverförmige Polyglutaraldehyd besteht aus Teilchen von 20 bis 80 ,um im Durchmesser und hat demzufolge einen viel kleineren Bereich als Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen von 200 nm Durchmesser» dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund für die

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niedrigere Reaktionsgeschwindigkeit.. " " - ~"

Markierte Zellen und magnetische Abtrennung:

Es wurde gefunden, daß die Markierung von Zelloberflächenrezeptoren mittels fluoreszierender oder nicht-fluoreszierender oder fluoreszierender magnetischer Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen einfach und· wirksam ist, wie durch zählreiche Untersuchungen unter Verwendung von fixierten roten Blutkörperchen vom Mensch oder Truthahn als Modellsubstanzen ersichtlich ist. Vorversuche mit lebenden menschlichen Lymphocyten zur Kennzeichnung von Immunglobulin G-Molekülen an B-Zellenverliefen ebenfalls erfolgreich.

Beispiel 28

Markierung von menschlichen roten Blutkörperchen: Eine wäßrige Suspension von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen (0,2 cm^j 2 mg Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 200 nm) wird mit 0,6 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung von gereinigten Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin M (0,2 mg in 0,2 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung) verdünnt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 4°C schwach gerührt. Dann fügt man 20 mg Rinderserumalbumin hinzu und setzt das Rühren eine

> ■ ■ ■

weitere Stunde fort. Nicht-gebundene Antikörper werden dadurch abgetrennt, daß man die Suspension durch eine Säule mit einer Füllung von dreidimensional vernetzter Agarose durchlaufen läßt. Die Trennung wird spektrometrisch bei λ = 280 nm überwacht.

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Menschliche rote Blutkörperchen von einem normalen Spender und mit Glutaraldehyd fixiert werden mit Kaninchen-Antihumanroten Blutkörperchen sensibilisiert. Die roten Blutkörperchen (10'), die in 0,5 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung mit einem Gehalt von 0,2 mg Antiserum suspendiert sind, werden 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden die Zellen abgetrennt und dreimal durch Rotierenlassen der phosphatgepufferten Natriumchloridsuspension in einer internationalen Zentrifuge bei 500 g gewaschen. Die Ziegen-Antikaninchen-Mikrokügelchen werden dann zu den Pellets der sensibilisierten menschlichen roten Blutkörperchen gegeben« Das Gemisch wird 1 Stunde bei.^⁰C langsam gerührt. Die roten Blutkörperchen werden dann von nicht-reagierten konjugierten Mikrokügelchen durch dreimaliges Zentrifugieren bei 500 g abgetrennt. Die markierten Zellen werden in 0,4 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung resuspendiert und im Licht eines Rasterelektronenmikroskops untersucht.

Bei jedem Versuch werden zwei Kontrollversuche durchgeführt:

1. Mikrokügelchen werden mit menschlichem Immunglobulin G konjugiert und auf sensibilisierte rote Blutkörperchen einwirken gelassen; und

2. Mikrokügelchen, die mit Ziegen-Antikaninchen-Imniunglobulin G konjugiert sind, werden auf nicht-sensibilisierte rote Blutkörperchen einwirken gelassen.

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Markierung von menschlichen Lymphozyten:

Es wird die Markierung von lebenden menschlichen Lymphocyten mittels Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen untersucht.

Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 200 nm werden mit menschlichem Immunglobulin G, das mit Pluoresceinisothiocyanat markiert ist, wie in Beispiel 28 beschrieben, konjugiert. Die Anzahl der markierten Rezeptoren werden unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Sie stimmen mit den zuvor erhaltenen Vierten innerhalb einer Fehlergrenze von ί 10 % überein.

Die Abtrennung der magnetisch markierten menschlichen roten Blutkörperchen wird auf folgendem Weg erreicht:

Es werden Gemische von menschlichen roten Blutkörperchen mit den nachstehenden Verhältnissen von unmarkierten zu markierten Zellen hergestellt: 1:1, 7:1 und 9:1. Jeweils 10 ml der Gemische werden in einem Glasgefäß, das mit einem Hufeisenmagneten (0,03 T) ausgerüstet ist, langsam gerührt. Mach 2 Stunden werden die Zellen, die nicht an die Gefäßwandungen angezogen sind, isoliert. Die durch den Magneten angezogenen Zellen werden mit 10 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung verdünnt, und die magnetische Abtrennung wird wiederholt. Die Untersuchung unter einem Rasterelektronenmikroskop zeigt, daß 95 % der unmarkierten Zellen aus allen drei synthetischen Gemischen dadurch abgetrennt werden konnten.

Der Grad der unspezifischen Reaktion mit lebenden menschlichen Lymphocyten sowie die Wirksamkeit der magnetischen Abtrennung

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der Zellensubpopulationen mittels eines magnetischen Trenners werden gegenwärtig untersucht.

Das neue, einfach zu handhabende Immunreagens in Form von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ist in einer Vielzahl von Größen und mit einer verhältnismäßig engen Größenverteilung hergestellt worden. Den Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen kann während ihrer Herstellung eine hohe Fluoreszenzintensität zugeteilt werden, die dennoch eine hohe Konzentration von Aldehydgruppen auf der Oberfläche belassen. Die funktioneilen Aldehydgruppen gestatten eine kovalente Bindung mit Antikörpern, Enzymen und anderen Proteinen in einer einzigen Stufe. Aus diesem Grunde vermeidet dieses Imrnunreagens die früher angewendeten Zwischenstufen, bei denen eine Cyanbromid- und Carbodiimid-Reaktion angewendet worden ist. Der weite Bereich einer Ionenbeständigkeit und des pH-Werts ohne Auftreten von Aggregationen und die hohe Spezifität der Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen - zumindest soweit es menschliche rote Blutkörperchen betrifft - sind ebenfalls erwünschte Eigenschaften.

Eine geringe Modifikation bei der Herstellung liefert fluoreszierende magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen für eine große Anzahl von Anwendungsgebieten.

Die Verwendung von magnetischen Teilen hat ein sehr großes Interesse in der biochemischen Forschung und der klinischen Medizin hervorgerufen, wenn sie als Trägermaterialien für immobilisierte Enzyme verwendet werden. Ihre leichte Wiedergewinnung

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aus Flüssigkeiten, die kolloide und gelöste Peststoffe enthalten, sollte von praktischem Wert sein. Die Abtrennung von Proteinen und chemischen Verbindungen mittels Affinitätschromatographie kann durch Ausschalten langv/ieriger Zentrifugierverfahren und Säulenchromatographiestufen vereinfacht werden. Die magnetischen Teilchen sind auch kürzlich bei Radioimmunoassay-Techniken,bei'der Hyperthermiebehandlung von Krebs und bei der Leitung von magnetischen leuchen zu einer, vasculären Mißbildung, wie zerebralem Aneurysma, mit der Absicht untersucht worden, den Schaden durch Induzieren einer Thrombose zu verschließen.

Andere vorgeschlagene Anwendungsgebiete sind Spurensucher im Blutstrom oder in Vehikeln zur Drogenentwöhnung. Die erste erfolgreiche Anwendung von magnetischen Immun-Mikrokügelehen ist bei der Abtrennung von B- und T-Zellen gezeigt worden. Die Ergebnisse sind später durch Verwendung von C-1300-Neuroblastom-Zellen bestätigt worden. Es besteht ein geringer Zweifel, daß eine physikalische Sonderung von Zeilsubpopulationen notwendig wird. Zahlreiche Trennmethoden, obwohl sie brauchbar sind, sind durch beschränkte .Parametersätze begrenzt, auf die die Trennung basieren kann, und außerdem durch die Tatsache, daß sie absatzweise betrieben werden.

Neue Geräte zur Blutkörperchenzählung im Blut und neue Sortierer gestatten ein quantitatives Messen zahlreicher* Parameter und ein Sortieren aufgrund dieser Messungen, doch sind sie inso-

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weit auf die Anzahl der Zellen beschränkt, die in einer gegebenen Zeit abgetrennt werden können. Magnetische Zellensortierer besitzen das Potential einer Zelltrennung in einem kontinuierlichen Verfahren. Die bei den gegenwärtigen Untersuchungen unter Verwendung des Modellzellsysteras erhaltene Klarheit zeigt an, daß magnetische Polyglutaraldehyd-Immun-Mikrokügelchen von gewünschten Größen mit Proteinen in einfacher und leicht zu handhabender Weise konjugiert werden können und deshalb ein Potential für eine breite Staffelung immunologischer Zellsortierung sowie anderer Anwendungsgebiete darstellen.

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Claims

•29104U Patentans prü'che

1) Verfahren zur Herstellung von Polyglutaraldehyd, dadurch gekennzeichnet, daß man.monomeren Glutaraldehyd in einem wäßrigen organischen Lösungsmittelmedium mit einem Gehalt von 5 "bis 80 Gewichtsprozent an organischen Lösungsmittel löst, den pH-Wert der Lösung auf über 7 erhöht und · den Glutaraldehyd polymerisiert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Polymerisation den Wassergehalt des Mediums auf über 80 Prozent erhöht und den Polyglutaraldehyd ausfällt,

3) Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel ein stark polares Losungsreittel in einer Menge von 20 bis 80 Gewichtsprozent verwendet,

4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid verwendet,

5) Verfahren nach .mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Lösung auf 9 bis 12 einstellt. *

6) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man,eine 0,1- bis 50-gewichtsprozentige Lösung von Glutaraldehyd verwendet,

7} Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, da-

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durch gekennzeichnet, daß man bei der Polymerisation die Temperatur der Lösung zuerst 30 bis 180 Minuten auf 15 bis 30⁰C hält und dann die Temperatur der Lösung auf über 40 C erhöht.

8) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1, 2 und 5 bis 7j dadurch gekennzeichnet, daß man in dem wäßrigen organischen Lösungsmittelmedium ein mit Wasser nicht-mischbares organisches Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 50 Gewichtsprozent als organisches Lösungsmittel und zusätzlich eine grenzflächenaktive Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 3 Gewichtsprozent verwendet und daß man die Lösung rührt und_t den Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen· gewinnt und ausfällt.

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindung verwendet.

10) Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Lösung des Polyglutaraldehyds 0,1 bis 3 Gewichts-'prozent einer grenzflächenaktiven Verbindung zugibt, die erhaltene Lösung rührt und den Polyglutaraldehyd in Form von Miki-okügelchen ausfällt.

11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man der gerührten Lösung zusätzlich eine Suspension eines feinteiligen Metalls zugibt und metallhaltige Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ausfällt.

12). Verfahren zur Herstellung von fluorescierendem Polyglutaraldehyd nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge-

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kennzeichnet, daß man den erhaltenen Polyglutaraldehyd mit> einer nicht-fluorescierenden Verbindung umsetzt und dabei fluorogene-Gruppen bildet.

13) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die nicht-fluorescierende Verbindung mit den Acroleingruppen dea Polyglutaraldehyds umsetzt.

14) Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-fluorescierende Verbindungen Anthron, m-Amino-phenol oder Aminofluorescein verwendet..

15) Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichenPolyglutaraldehyd-ilikrokügelchen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14j dadurch gekennzeichnet, daß man zu einem wäßrigen Medium 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Glutaraldehyd und 0,1 bis 3 Gewichtsprozent einer organischen wasserlöslichen grenzflächenaktiven Verbindung zusetzt, den pE-\7ert des Mediums auf 7 bis 13 einstellt,

und/
das Gemisch rührt aus/cTem Reaktionsgemische Polyglutaraldehyd-Mikrokügolchen geviinnt.

16) Verfahren nach Anspruch 15, dadurch-gekennzeichnet, daß man ein Lied ium nit einem" Gehalt von 5 bis 50 Prozent eines organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel verwendet.

17) Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder .16, dadurch gekennzeichnet, daß man dera Keaktionsgemisch eine Suspension eines feinteiligen i.Ictalls mit Teilchendurchmessern unter 100 nm zusetzt,

18) Verfahren nach "Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als iietall ein solches mit einer Ordnungszahl über 50 verwendete

BAD ORiGiNAL

19) Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ifetall Blei, Nickel, Kobalt, Platin, Gold oder Eisen verwendet. "-· ■

20) Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Metall in Form eines Oxids verwendet.

21) Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metalloxid Fe^O, verwendet.

22) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 "bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein Suspendiermittel in einer Menge von 1 bis 5 Gewichtsprozent mitverwendet.

23) Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß.man •als Suspendiermittel ein Polyäthy^enoxid verwendet.

24) Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaral— dehyd in Form von Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 20 nm bis 10 um gewinnt.

■25) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Hikrokügelchen mit einem Durchmesser von unter 10 nm und mit einem Gehalt von 0,5 bis 40 Prozent Metall gewinnt.

26) Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von magnetisch anziehbaren Mikrokügelchen gewinnt.

27) Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 26, dadurch gekenn-

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BAD ORIGINAL

zeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form τοη Mikrokügelchen mit fluorogenen Gruppen gewinnt,

28) Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen mit fluorogenen Gruppen als Fluorοchrom gewinnt.

29) Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß man den Polyglutaraldehyd mit einer mit Aldehydgruppen reaktionsfähigen fluorochromen Verbindung umsetzt.

JO) Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluorochrome Verbindung Aminofluorescein, 9-Amino-phenol,
Propidium-broinid oder Fluorescein-isothioeyanat verwendet.

31) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von. Mikrokügelchen an ein Protein gebunden gewinnt.

32) Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen an Antikörper, Antigene, Immunglobuline, Lymphocyteη und/oder Hämoglobin gebunden.gewinnt.

33) Verwendung des nach den Ansprüchen 1 bis 32 hergestellten
Polyglutaraldehyds als Überzug auf einer Substratoberfläche.

34) Ver?iendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke des Überzugs 0,0025 bis 0,125 mm beträgt.

35) Verwendung nach den Ansprüchen 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat teilchenförmig ist.

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36) Verwendung nach den Ansprüchen 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mit Aldehydgruppen^ reaktionsfähige funkfionelle Gruppen auf v/eist.

37) Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Hydroxyl-, Amino- oder Hydrazidgruppen als funkticnelle Gruppen aufweist.

38) Verwendung nach den Ansprüchen 33 ^i*³ 37» dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Mikrokügelchen' oder -perlchen eines synthetischen organischen Polymerisats mit einem-Durchmesser von 20 nm bis 100 um sind.

39) Verwendung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein Acrylamid-Mischpolymerisat ist.

40) Verwendung nach Anspruph 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein Mischpolymerisat -aus-mindestens 50 Prozent Vinylpyridin oder Methacrylsäure-hydroxyäthylester, 5 bis 35 Prozent Acrylamid und 0,1 bis 30 Prozent eines damit mischpolymerisierbaren. Vernetzungsmittels ist.

41) Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischpolymerisate Hydrazidgruppen aufweisen.

42) Verwendung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyglutaraldehydübersug außen an ein Amin gebunden ist.

43) Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Amin ein Protein ist.

44) Verwendung nach Anspruch 43> dadurch gekennzeichnet, daß

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das Protein Antikörper, Antigene, Iffinrunglobuline, Lymphocyten und/oder Hämoglobin sind.

45) Verwendung nach den Ansprüchen 33 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die überzüge fluorescierend sind.

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