DE10027776A1 - Neuartige core-shell Partikel - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft kolloide Metallpartikel mit einer Beschichtung aus nicht quervernetztem SH-aktiviertem Dextran oder Aminodextran sowie die Herstellung und die Verwendung solcher Partikel in immunologischen Testverfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft kolloide Metallpartikel mit einer Beschichtung aus nicht quervernetz­ tem SH-aktiviertem Dextran oder Aminodextran, sowie die Herstellung und die Verwendung solcher Partikel in immunologischen Testverfahren.

Beschreibung

Kolloide Metallpartikel haben in den letzten Jahren eine breite Verwendung in biologischen, biochemi­ schen und immunologischen Untersuchungen erfahren. Speziell im Umfeld der immunologischen Assays wurden kolloide Metallpartikel mit großem Erfolg zur Markierung von Biomolekülen jedweder Art ein­ gesetzt.

Zur Herstellung kolloidaler Metallpartikel, insbesondere kolloidaler Goldpartikel wurden viele verschie­ dene Methoden beschrieben. Meist werden die kolloidalen Goldpartikel durch Reduktion von Lösungen der Tetrachlorgoldsäure gewonnen und die relevanten Biomoleküle in einem oder mehreren weiteren Schritten an diese Partikel adsorptiv gebunden. Die Größe der kolloidalen Metallpartikel kann über die Ausgangskonzentration der unterschiedlichen Reaktionspartner gezielt gesteuert werden (G. Frens, Nature Physical Science, 241, S. 20-22 (1973)). Auch die Streubreite in der Partikelgröße lässt sich, wie in EP-B-426 300 beschrieben, durch gezielte Wahl des Herstellungsverfahrens optimieren.

Die Anbindung von Biomolekülen, wie z. B. von Antikörpern, Lektinen oder auch Nukleinsäuren, erfolgt meist absorptiv, wobei die jeweiligen Beladungsbedingungen stark von den physiko-chemischen Eigen­ schaften (z. B. Isoelektrischer Punkt) des Biomoleküls abhängen. Grundsätzliche Überlegungen zur Be­ schichtung von kolloidalen Metallpartikeln finden sich in der einschlägigen Fachliteratur (z. B. deMey, The Preparation and Use of Gold Probes, in: Immunocytochemistry, Herausgeber. J. M. Polak und S. v. Noorden, Seiten 115-145, Wright, Bristol, 1986 oder G. T. Hermanson, Preparation of Colloidal-Gold- Labelled Proteins, in: Bioconjugate Techniques, Seiten 593-604, Academic Press, 1996).

Es hat sich als notwendig und sinnvoll erwiesen, die mit dem Biomolekül beschichteten kolloidalen Me­ tallpartikel durch Zugabe geeigneter weiterer Substanzen zu stabilisieren. Die Zugabe solcher Stabilisie­ rungs- und Blockierungssubstanzen bewirkt, dass eventuell noch nicht abgesättigte "klebrige" Stellen auf den Partikeln blockiert werden. Zudem wird durch diese Substanzen die Verklumpung der Partikel mi­ nimiert und die Rückdiffusion des relevanten Biomoleküls reduziert.

Im Stand der Technik werden als Stabilisatoren unter anderem inerte Proteine wie beispielsweise Rinder­ serumalbumin oder wasserlösliche technische Polymere wie Polyethylenglykol (Molekulargewicht 20,000 D), Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyvinylsulfat, Dextran, sowie Gelatine verwendet (vgl. z. B. De Mey, supra; Beesley, J. E., Colloidal Gold: A New Perspective for Cytochemical Marking, Microscopy Handbooks 17, Oxford University Press, 1989, insbesondere S. 1-14; Behnke, Eur. J. Cell Biol. 41 (1986), S. 326-338; DE 24 20 531 C3; Meisel et al., J. Phys. Chem. 85 (1981), S. 179-187).

Die direkte Beschichtung von Biomolekülen auf die Oberfläche von kolloidalen Metallpartikeln hat jedoch auch einige gravierende Nachteile. Als solche Nachteile sind vor allem zu erwähnen, dass erfolgreiche Verfahren nicht ohne Weiteres von einem Biomolekül auf ein Zweites übertragen werden können und, dass sich die Stabilität solcher Partikel oft als problematisch herausgestellt hat (vgl. de Mey, supra, S. 116 und S. 122-123).

Um diese Probleme des älteren Standes der Technik zu umgehen, wurden in den letzten Jahren einige neue Verfahren entwickelt. Besonders sogenannte Core-Shell-Partikel sind in diesem Zusammenhang zu erwähnen. Core-Shell-Partikel bestehen aus einem (meist) metallischen Kern (Core) und aus einer Hülle (Shell), welche das Partikel vollständig umgibt. Wichtige Beispiele für solche Hüllsubstanzen sind z. B. RSA (= Rinderserum Albumin), beschrieben in EP 258 963 und EP 428 412, denaturierte Proteine wie z. B. Gelatine, wasserlösliche Polymere wie z. B. Aminodextran (US 5,248,772) oder Hüllen aus nieder­ molekularen Thiolverbindungen oder thiolierte Proteine (EP 489 465).

Zur Stabilisierung der Hülle werden die Hüllsubstanzen meist quervernetzt (z. B. US 5,248,772). Solche Hüllen enthalten funktionelle Gruppen, an welche die gewünschten Biomoleküle auf allgemein bekannte Art und Weise kovalent gebunden werden können.

Die kovalente Kopplung der Biomoleküle an die Core-Shell-Partikel hat gegenüber der direkten adsorpti­ ven Bindung an die Kolloidoberfläche einige Vorteile. Durch die kovalente Kopplung wird ein Abbluten der Biomoleküle verhindert. Außerdem werden unspezifische Wechselwirkungen unterbunden, die bei der adsorptiven Beladung auf verbleibende, freie, der Adsorption nicht zugänglichen Oberflächenbereiche zurückzuführen sind. Auf eine Nachbeladung der Oberfläche durch Zugabe von Stabilisatoren kann bei den Core-Shell-Partikeln verzichtet werden. Durch die Verwendung einer gut löslichen hydrophilen Hülle kann die Stabilität der resultierenden Core-Shell-Protein-Konjugate deutlich verbessert werden. Eine In­ stabilität durch Aggregation der Konjugate, wie sie bei adsorptiv beladenen Kolloid-Protein-Konjugaten immer wieder beobachtet wird, kann damit verhindert werden. Darüber hinaus ist die kovalente Kopp­ lung der Proteine an die Core-Shell-Partikel weitestgehend unabhängig von den physiko-chemischen Eigenschaften der Proteine, sodass auch Proteine verwendet werden können, die für eine adsorptive Bin­ dung nicht geeignet sind.

Die im Stand der Technik eingesetzten Hüllsubstanzen adsorbieren durch komplexe und bisher nicht vollständig verstandene Mechanismen an die Metalloberfläche. Dabei spielen sowohl elektrostatische Wechselwirkungen, als auch hydrophobe Wechselwirkungen eine Rolle. Je nach Art der Hüllsubstanz, überwiegt die eine oder andere Bindungsart der Hüllsubstanzen an kolloidale Metall-Partikel.

Wechselwirkungen von Metallen, insbesondere Gold mit schwefelhaltigen Verbindungen, führen zu einer Verstärkung dieser adsorptiven Anbindung. EP 369 515 beschreibt die Beschichtung kolloidaler Goldpar­ tikel mit niedermolekularen Thiol-haltigen Verbindungen. Über zusätzliche funktionelle Gruppen kön­ nen dann an diese "Thiol-Schale" die relevanten Biomoleküle gebunden werden.

Aus dem Stand der Technik ist zudem bekannt, dass chemisch quervernetzte Aminodextrane als Hüllsub­ stanz eingesetzt werden können (US 5,248,772). Eine Quervernetzung des Aminodextrans ist erforderlich, um den solchermaßen hergestellten Partikeln eine hinreichende Stabilität zu verleihen. Ein weiterer Nachteil des in US 5,248,772 beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass kopplungsfähige SH-Gruppen nachträglich in die Hülle aus quervernetztem Aminodextran eingebaut werden müssen. Eine solche Vor­ gehensweise erfordert eine Reihe zusätzlicher Arbeitsschritte. Zudem lässt sich die Einbaurate der SH- Gruppen weniger exakt steuern und eine Analyse der Einbaueffizienz ist kaum möglich.

Im Stand der Technik sind keine Core-Shell-Partikel auf Aminodextranbasis bekannt, welche sich einfach, schnell und kostengünstig herstellen lassen, keine zusätzlichen Behandlungsschritte wie beispielsweise die Quervernetzung der Aminodextranhülle und keine nachträgliche Einführung funktioneller Gruppen (z. B. für Kopplungschemien auf SH-Basis) erfordern.

Aufgabe war es daher, verbesserte Core-Shell-Partikel bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik weitgehend vermeiden.

Die Aufgabe wird gelöst durch die in den Ansprüchen näher definierte Erfindung.

Mit der vorliegenden Erfindung werden kolloidale Metallpartikel mit einer Hülle aus SH-Dextran oder SH-Aminodextran zur Verfügung gestellt, welche einfach und reproduzierbar hergestellt und sehr vorteil­ haft, vor allem in Immunoassays, verwendet werden können. Die Erfindung betrifft insbesondere kolloi­ dale Metallpartikel mit einer diese Metallpartikel umgebenden Hülle (Core-Shell-Metallpartikel), dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle aus nicht quervernetztem Dextran oder Aminodextran besteht, welches SH-Gruppen trägt.

Legende zu den Abbildungen

Abb. 1: UV/Vis-Analyse zur Stabilität von Antikörper-Goldkonjugaten, die gemäß dem Stand der Technik hergestellt worden waren.

Unter den gewählten Lagerbedingungen (ca. 7 Monate bei 4°C) zeigt die UV/Vis-Analytik, dass die Kur­ ven für beide Konjugat-Chargen vor und nach Belastung einen deutlich veränderten Kurvenverlauf auf­ weisen. Dies bedeutet, dass die geprüften Konjugate durch Lagerung bei 4°C über ca. sieben Monate star­ ke Veränderungen erfahren. Mit anderen Worten diese Konjugate sind unter den geprüften Bedingungen nicht stabil.

Abb. 2: UV/Vis-Analyse zur Stabilität von Antikörper-Goldkonjugaten die unter Verwen­ dung von erfindungsgemäßen Core-Shell-Partikeln hergestellt worden waren.

Der nahezu identische Kurvenverlauf für beide Präparationen vor und nach Belastung in der UV/Vis- Analyse belegt, dass beide Chargen, welche erfindungsgemäß hergestellt worden waren, unter den ge­ wählten Lagerbedingungen (ca. 7 Monate bei 4°C), sich gleich verhalten und unter den Lagerbedingungen keine Veränderung aufgetreten ist. D. h., diese Konjugate sind unter den geprüften Bedingungen stabil.

Abb. 3: Remissionsanalyse eines erfindungsgemäßen Core-Shell-Partikels, sowie eines Partikels gemäß dem Stand der Technik.

An die erfindungsgemäß hergestellten kolloidalen Goldpartikel wurde ein monoklonaler Antikörper (MAK) gebunden. Ebenso wurde ein MAK-Gold-Konjugat mit den Methoden des Standes der Technik hergestellt. Beide Konjugate wurden über Remissionsanalyse bewertet. Ein niedrigerer Remissionswert ist gleichbedeutend mit einer verbesserten Empfindlichkeit des Konjugates im Test.

Im Folgenden ist die Erfindung im Detail beschrieben:
Die Begriffe kolloidale Core-Shell-Partikel oder kolloidale Metallpartikel mit Hülle werden im Folgenden gebraucht, um Partikel mit einem metallischen Kern und einer Hülle/Schicht bestehend aus einer oder aus mehreren nicht-metallischen Komponenten zu beschreiben.

Als metallische Core-Partikel kommen alle nach Methoden des Standes der Technik herstellbaren kolloi­ dalen Metallpartikel in Betracht. Bevorzugt wird es sich bei den zugrundeliegenden Metallen um Edelme­ talle, insbesondere um Gold oder Silber und ganz bevorzugt um Gold handeln.

Dextrane stellen eine dem Fachmann bekannte Gruppe der Polysaccharide dar. Bevorzugt werden insbe­ sondere Moleküle mit Molekulargewichten von 5000 bis 2 MioD, weiter bevorzugt von 20000 bis 1 MioD, besonders bevorzugt von 30000 bis 100000 D, eingesetzt.

In die kommerziell erhältlichen Dextrane oder Aminodextrane werden SH-Gruppen eingeführt, wobei Aminodextrane besonders bevorzugt sind. Der Einbau der SH-Gruppen erfolgt auf chemischem Weg über die Reaktion von z. B. aktivierten Carbonsäuren mit den Aminogruppen. Bevorzugt werden hierzu Rea­ genzien vom Typ des S-Acetylthiopropionylsäure-N-Hydroxysuccinimidesters (SATP), N-Succinimidyl- S-Axetylthioacetat (SATA) oder S-Acetyl-Mercapto-Bernsteinsäureanhydrid (SAMBA) eingesetzt. Die Aktivierung von OH-Gruppen der Dextrane erfolgt z. B. mittels 1-Cyano-4-(Dimethylamino)-Pyridinium Tetrafluoroborat (CDAP) und die Einführung der SH-Gruppen durch die anschließende Zugabe von SH­ geschützten Aminothiolen (z. B. S-Acetylcysteamin).

Bei Verwendung von SATP zur Einführung von SH-Gruppen in Aminodextrane wird so vorgegangen, dass der weitaus größte Anteil der Aminogruppen umgesetzt wird. Die SH-Gruppen werden dann freige­ setzt durch Zugabe von Hydroxylamin. Besonders vorteilhaft sind SH-Aminodextrane, in welchen min­ destens 70% der Aminogruppen, besonders bevorzugt mehr als 80% der Aminofunktionen und ganz besonders bevorzugt mehr als 90% der Aminogruppen umgesetzt werden und eine SH-Funktionalität tragen.

Die Aktivierung von Aminodextran mittels SATP kann unter sehr variablen Bedingungen erfolgen, wobei pH-Werte von 7,5 bis 9,0, Temperaturen von 4°C oder Raumtemperatur und Zeiträume von 2 bis 24 Stunden bevorzugt werden. Als besonders geeignet hat es sich erwiesen, bei pH 8,5 und Raumtemperatur zu arbeiten und ca. 3 Stunden Reaktionsdauer anzusetzen. Die Freisetzung der SH-Gruppen z. B. durch Zugabe von Hydroxylamin erfolgt bevorzugt unter leicht sauren pH-Bedingungen, besonders bevorzugt bei pH 6,0 bis 6,5.

Wenn im Folgenden von SH-Aminodextran oder Aminodextran mit aktiven SH-Gruppen oder SH­ aktiviertem Aminodextran die Rede ist, so sind damit generell SH-Aminodextrane oder SH-Dextrane umfaßt, wie sie z. B. nach den oben diskutierten Methoden hergestellt werden können.

Im einschlägigen Stand der Technik (EP 489 465) wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass zur Nach­ beschichtung, Stabilisierung und Bereitstellung reaktiver Gruppen kurzkettige Moleküle, z. B. Alkan­ ethiole mit einer maximalen Kettenlänge von 24 C-Atomen, eingesetzt werden sollen. EP 489 465 definiert aus gutem Grund die Obergrenze mit einer Kettenlänge von 24 L-Atomen. Die Ursache für diese Scheu vor langkettigen Molekülen mit mehr als 2 oder 3 SH-Gruppen ist offensichtlich. Der Fachmann musste annehmen, dass längerkettige Moleküle, wie z. B. SH-Aminodextrane, Metall-Sol-Partikel nicht stabilisie­ ren, sondern eine Verklumpung herbeiführen.

Gerade solche Agglomerate oder Klumpen vieler kolloidaler Metallpartikel sind aber das größte Problem im Umfeld der Technologie, sie führen zu Instabilitäten und zu Problemen auf Grund von unspezifischen Bindungen.

Es hat sich nun aber überraschenderweise gezeigt, dass SH-Aminodextrane sehr vorteilhaft zur Nachbe­ schichtung und Stabilisierung von kolloidalen Metallpartikeln eingesetzt werden können. Diese Nachbe­ schichtung führt zu erstaunlich stabilen Partikeln, sodass auf eine Quervernetzung der Aminodextran- Monomere, wie sie sonst üblich ist (US 5,248,772) gänzlich verzichtet werden kann. Offensichtlich ist die Anbindung an die Metalloberfläche über die SH-Funktionalitäten so stabil, dass weder eine zusätzliche Nachbeschichtung zu Absättigung von freien, "klebrigen" Oberflächenbestandteilen notwendig ist, noch ist eine Vernetzung der SH-Aminodextranmoleküle erforderlich, um eine Rückdiffussion (Ausbluten von nicht stabil gebundenen Molekülen) zu verhindern. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von SH-Aminodextranen zur Beschichtung und Stabilisierung von kolloidalen Metallpartikeln.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung kolloidaler Metallpartikel mit einer Hülle aus SH- Aminodextran, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass kolloidale Metallpartikel und SH-aktiviertes Aminodextran unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden. Überraschenderweise lassen sich die er­ findungsgemäßen Core-Shell-Partikel einfach herstellen. Einfaches Zusammengeben der kolloidalen Goldlösung und der Lösung des SH-modifizierten Aminodextrans unter kontrolliertem pH bei Raum­ temperatur führt zur Ausbildung der erfindungsgemäßen Core-Shell-Partikel. Die so erhaltenen erfindungsgemäßen Partikel werden lediglich gewaschen und können, ohne dass eine Stabilisierung durch Quervernetzung erfolgt, zur Kopplung an Linker- oder Biomoleküle eingesetzt werden.

Die Beschichtung des nach Standardverfahren hergestellten Goldsols mit SH-Aminodextran erfolgt bevor­ zugt im Bereich von pH 5,0 bis 7,0, besonders bevorzugt zwischen pH 5,5 und pH 6,5. Reaktionstempe­ ratur und Reaktionsdauer können breit variiert werden, wobei 4°C oder Raumtemperatur für zwei bis 24 Stunden bevorzugt sind.

Die Erfindung betrifft insbesondere kolloidale Metallpartikel mit einer diese Metallpartikel umgebenden Hülle (Core-Shell-Metallpartikel), die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Hülle aus nicht querver­ netztem Aminodextran besteht, welches SH-Gruppen trägt.

Besonders bevorzugt bestehen die erfindungsgemäßen kolloidalen Metallpartikel aus Edelmetallen, ins­ besondere aus Gold und Silber, ganz besonders bevorzugt aus Gold.

Nicht alle SH-Gruppen sind durch die Beschichtung und die Interaktion mit der metallischen Oberfläche blockiert. Viele SH-Gruppen sind überraschenderweise nicht an der Interaktion mit der metallischen Oberfläche beteiligt. Diese SH-Gruppen, welche nach der Beschichtung weiterhin zugänglich sind, stellen eine optimale Anbindungsstelle für weitere Moleküle, insbesondere Biomoleküle dar.

So hat es sich zum Beispiel als sehr vorteilhaft erwiesen, SH-reaktive homo- oder heterobifunktionelle Linker zu verwenden, welche einerseits eine kovalente Bindung an das SH des SH-Aminodextrans herstellen und andererseits das gewünschte Biomolekül über eine gezielt ausgewählte Funktionalität, ebenfalls kovalent bindet. Bevorzugte Funktionalitäten auf den anzuknüpfenden Biomolekülen sind z. B. NW- oder SH-Gruppen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten bestehend aus Biomole­ külen, insbesondere Antikörpern und kolloidalen SH-Aminodextran-Metallpartikeln.

Die Beladung der Partikel mit den Biomolekülen erfolgt unter geeigneten Pufferbedingungen. Besonders bevorzugt bei pH-Werten zwischen 6,5 und 7,0 können beispielsweise mit Maleimid aktivierte Biomole­ küle kovalent an die mit SH-Aminodextran beladenen Goldpartikel gekoppelt werden. Die Ankopplung der Biomoleküle erfolgt bevorzugt über Nacht, d. h., bevorzugt über einen Zeitraum von ca. 10 bis ca. 30 Stunden, wobei die Reaktionstemperatur wenig kritisch ist und beispielsweise bei 4°C oder Raumtempe­ ratur liegen kann. Zur Blockierung der noch vorhandenen reaktiven Maleimid-Gruppen werden Reagen­ zien wie Thioglucose oder Cystein verwendet. SH-Gruppen werden durch Zugabe von Reagenzien wie Jodacetamid, N-Methyl-Maleiimid (NMM) oder N-Ethyl-Maleimid (NEM) blockiert.

Als Biomoleküle kommen alle in gängigen diagnostischen Testverfahren eingesetzten Moleküle in Be­ tracht. Insbesondere werden erfindungsgemäß darunter bevorzugt Nukleinsäuren, Peptide und Proteine in verstanden. Es können jedoch auch andere Biomoleküle, wie z. B. Haptene, Lipide oder Polysacchari­ de vorteilhaft eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt sind Biomoleküle aus der Gruppe der Proteine, insbesondere solche Proteine, welche gute Bindepartner für weitere Biomoleküle darstellen, ganz besonders bevorzugt sind hier Lektine, Avidin, Streptavidin und Antikörper.

Unter dem Begriff "Antikörper" sind im Sinne der Erfindung neben den intakten Immunoglobinen auch sämtliche Antikörperfragmente zu verstehen. Hierzu gehören beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab')₂- Fragmente. Der Begriff Antikörper ohne den Zusatz "monokional" oder "polyklonal" umfasst immer beide Arten von Antikörpern, sowie chimäre Konstrukte und alle oben angeführten Fragmente.

Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb in einer weiteren Ausgestaltung Core-Shell-Partikel mit einer Beschichtung aus nicht quervernetztem SH-Aminodextran, an welche über die SH-Gruppen des SH- Aminodextrans weitere Moleküle angebunden wurden.

Für diese kovalente Anbindung oder Anknüpfung von Biomolekülen werden vorteilhafterweise SH- reaktive Linkermoleküle, d. h. Moleküle mit mindestens zwei kopplungsfähigen Gruppen, von denen mindestens eine bevorzugt mit SH-Gruppen reagiert, eingesetzt. Die Erfindung umfasst deshalb auch kolloidale Metallpartikel mit einer Beschichtung aus nicht quervernetztem SH-Aminodextran, welche SH-reaktive Linkermoleküle tragen. Insbesondere sind durch die vorliegende Erfindung Core-Shell- Partikel umfasst, an welche Biomoleküle angeknüpft wurden. Dabei ist es unerheblich, ob die Ankopp­ lung der Biomoleküle direkt an SH-Funktionen des SH-Aminodextrans erfolgt, oder ob homo- oder hete­ robifunktionelle Linker zur Kopplung eingesetzt werden. Die mit Biomolekülen verknüpften Core-Shell- Partikel werden auch als Konjugate bezeichnet.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung sind an die erfindungsgemäßen kolloidalen Metall­ partikel Bindepartner für weitere Biomoleküle, insbesondere Antikörper gekoppelt.

Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Antikörper-Konjugate, d. h., Konjugate aus den erfin­ dungsgemäßen Gold-Core-Shell-Partikeln und Antikörpern, Vorteile gegenüber analogen Partikeln aus dem Stand der Technik aufweisen. Aus dem Vergleich der Lagerstabilität von Antikörper-Goldpartikel- Konjugaten welche mit Goldpartikeln gemäß Stand der Technik (Abb. 1) bzw. unter Verwendung der erfindungsgemäßen Core-Shell-Partikel hergestellt worden waren (Abb. 2), geht klar hervor, dass letztere wesentlich stabiler sind. Neben der überraschend vorteilhaften Stabilität zeigen die erfin­ dungsgemäßen Konjugate eine bessere Eignung in immunologischen Testsystemen. Die in Abb. 3 dargestellten Ergebnisse zur immunologischen Sensitivität von zwei verschiedenen Antikörper- Goldpartikel-Konjugaten stammen aus einem sogenannten Schnelltest im Teststreifenformat. Aus Abb. 3 entnimmt der Fachmann, dass der Test unter Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate sensitiver ist.

Unter "Schnelltests" werden meist solche Testsysteme verstanden, in welchen einzelne oder alle reaktiven Testkomponenten auf eine Trägerstruktur, z. B. in Form eines Teststreifens, vorbeschichtet (imprägniert) wurden, sodass es für die eigentliche Testführung meist ausreicht, Probenflüssigkeit aufzutragen. Analyt­ moleküle in der Probe reagieren mit den imprägnierten Nachweisreagenzien während die Probenflüssig­ keit den Teststreifen durchwandert. In aller Regel enthält der Teststreifen als Nachweiszone eine Vor­ richtung, z. B. in Form einer Linie eines fest gebundenen spezifischen Bindepartners zum Abfangen der Analyt-Nachweisreagenz-Komplexe. Die Signalintensität in dieser Nachweiszone wird dann mit dem blosen Auge oder über geeignete Analysengeräte bestimmt. Die vielfältigen Ausgestaltungsmöglichkeiten für solche Schnelltests sind dem Fachmann (z. B. aus EP-B-186 799 oder EP-A-299 428) bekannt.

So können die erfindungsgemäßen Konjugate beispielsweise in einen Schnelltest zum Nachweis von Anti- HIV-Antikörpern eingesetzt werden.

Bei der quantitativen Auswertung der Teststreifenergebnisse mittels Remissionsmessung über ein Chro­ mometer, zeigten die erfindungsgemäß gefertigten Konjugate deutlich sensitivere Signale, als vergleichba­ re Teststreifen mit adsorptiv beladenen Konjugaten. Abb. 3 zeigt eine Verdünnungsreihe einer HIV- positiven Probe für beide Konjugate im Vergleich. Eine geringere Remission ist gleichbedeutend mit höherer Sensitivität für die gemessene Konzentrationsreihe. Dies bedeutet für die Performance des Test­ streifens einen eindeutigen Vorteil.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate bestehend aus Biomolekülen, insbesondere Antikör­ pern und kolloidalen SH-Aminodextran-Metallpartikeln in Testsystemen als Markierung oder Nachweis­ reagenz, insbesondere in immunologischen Testverfahren und dabei ganz besonders bevorzugt in soge­ nannten Schnelltests, ist deshalb eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate kann in allen dem Fachmann geläufigen immunolo­ gischen Testverfahren erfolgen. In allen bekannten Immunoassays wird der Analyt in einer Probe durch Bindung an einen oder mehrere immunologische Bindepartner direkt oder indirekt spezifisch nachge­ wiesen. Die üblichen Testformate, beispielsweise heterogene oder homogene Testführung, sind dem Fachmann bekannt und bedürfen daher hier keiner ausführlichen Erläuterung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren, insbesondere ein immunologisches Ver­ fahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, in dem die Konjugate der erfindungsgemäßen Core- Shell-Partikel mit Biomolekülen als Markierung oder Nachweisreagenz verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 Einführung von SH-Gruppen in Aminodextran

5 g Aminodextran mit einer Molmasse von ca. 40 000 und einem Gehalt von etwa 30 Aminogruppen pro Molekül, wird in 200 ml Phosphatpuffer pH 8,5 gelöst. 1,225 g SATP wird in 62 ml DMSO gelöst und zur Aminodextranlösung gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschlie­ ßend dialysiert. Die Freisetzung der SH-Gruppen erfolgt durch Zugabe von 694 mg Hydroxylamin gelöst in 2 ml Wasser. Der pH wird auf 6,0 gestellt und nach einer Stunde gegen Phosphatpuffer pH 6,0 dialy­ siert.

Beispiel 2 Beschichten von kolloidalem Gold mit SH-modifiziertem Aminodextran

400 ml eines nach dem Stand der Technik hergestellten 40 nm Goldsols mit einem Gehalt von 400 OD wird auf pH 5,6 eingestellt. Anschließend wird 400 µg des SH-Aminodextrans, das gemäß Beispiel 1 her­ gestellt wurde in 10 mM K-Acetat pH 5,6 zugegeben und 2 Stunden gerührt.

Beispiel 3 Einführen von Maleimid-Gruppen (MH) in den Antikörper

18 mg Immunglobulin eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen Digoxigenin (MAK<Dig<M-IgG) werden in 1 ml Phosphatpuffer pH 7 gelöst. 6,9 mg MHS wird in 690 µl DMSO gelöst. 330 µl der Anti­ körperlösung wird anschließend mit 10 gl der MHS-Lösung versetzt und 2 Stunden bei 4°C gerührt. An­ schließend wird über Nacht dialysiert.

Beispiel 4 Herstellen der Konjugate aus MH-IgG und SH-Aminodextran-Gold

360 OD des SH-Aminodextran-Goldes werden auf pH 6,6 eingestellt. Anschließend werden 720 µg des MH-modifizierten Antikörpers, gelöst in 40 ml Acetat/Tris-Puffer pH 6,6 zugegeben, der pH auf 7,0 ge­ stellt und über Nacht bei 4°C gerührt. Die überschüssigen, noch nicht abreagierten SH- und Malei­ midgruppen werden anschließend durch Zugabe von Thioglucose und von Jodacetamid abgestoppt. An­ schließend wird 400 mg Rinderserumalbumin zugegeben und der pH auf 7, 8 gestellt.

Beispiel 5 Herstellung eines adsorptiv beladenen Konjugates

Die Lösung des zu beladenden Antikörpers wird gegen den geeigneten Beladepuffer (z. B. Tris, pH 8,0) dialysiert. Eventuell vorhandene Aggregate werden durch Filtrieren entfernt. Der pH-Wert der Goldsol­ lösung wird auf den pH der Proteinlösung eingestellt. Die Antikörperlösung (10 µg Protein/OD Gold) wird zur Goldsollösung gegeben und 2 h inkubiert. Anschließend wird durch Zugabe einer 10-%igen BSA-Lösung nachgesättigt (Endkonzentration ca. 1% BSA). Die Reinigung des Konjugates erfolgt durch Dialyse.

Beispiel 6 Funktionsbewertung zu den erfindungsgemäßen Konjugaten a) Flüssigstabilität

MAK<Dig<M-IgG-Aminodextran-SH-Konjugate sowie Konjugate aus MAK<Dig<M-IgG und Goldsol- Partikeln aus dem Stand der Technik wurden ca. 7 Monate bei 4°C gelagert. über den beobachteten Zeit­ raum sind die erfindungsgemäßen Konjugate hinsichtlich ihres UV/Vis Spektrums unverändert geblieben. Adsorptiv beladene Konjugate zeigen dagegen entsprechend einer breiter gewordenen Partikelgrößenver­ teilung ein verändertes Spektrum (vgl. hierzu Abb. 1 + 2).

b) Funktionstest

Die beschriebenen MAK<Dig<M-IgG-Aminodextran-SH-Konjugate wurden in einem Anti-HIV- Antikörpertest vergleichend mit einem adsorptiv beladenem Konjugat bewertet.

Das Testformat ist als trockenchemischer Teststreifen ausgelegt, bei dem die HIV-spezifischen Reaktions­ partner (dioxigenyliert) auf ein Trägervlies aufgetrocknet sind. Das MAK<Dig<M-IgG-Goldkonjugat ist auf einem separaten Trägervlies aufgetrocknet.

Durch Applikation der flüssigen Probe (z. B. Serum, Plasma) werden die aufgetrockneten Reagenzien und Reaktionspartner resolubilisiert, reagieren mit den nachzuweisenden HIV-spezifischen Antikörpern aus der Probe und werden in einem separaten Detektionsfeld durch die rote Farbe des Goldkonjugates ange­ zeigt.

Claims (12)

1. Kolloidale Metallpartikel mit einer diese Metallpartikel umgebenden Hülle (Core-Shell- Metallpartikel) dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle aus nicht quervernetztem Dextran oder Aminodextran besteht, welches SH- Gruppen trägt.

2. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Edelmetallpartikel sind.

3. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass über die SH-Gruppen weitere Moleküle an die Metallpartikel gebunden sind.

4. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den weiteren Molekülen um SH-reaktive Linkermoleküle handelt.

5. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass an die Linkermoleküle Biomoleküle gekoppelt sind.

6. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle direkt an die SH-Funktionen gekoppelt sind.

7. Core-Shell-Metallpartikel gemäss Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Antikörper sind.

8. Verwendung kolloidaler Metallpartikel gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche als Markierung oder Nachweisreagenz in immunologischen Testverfahren.

9. Verwendung kolloidaler Partikel gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche als Nachweis­ reagenz in Schnelltests.

10. Verfahren zur Herstellung von kolloidalen Metallpartikeln mit einer Hülle, welche aktive SH- Funktionen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beschichtung dieser kolloidalen Metallpartikel ein Aminodextran verwendet wird, in wel­ ches SH-Gruppen eingeführt wurden.

11. Verwendung von SH-Aminodextranen zur Nachbeschichtung oder Stabilisierung von kolloi­ dalen Metallpartikeln.

12. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis des Analyten ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 eingesetzt wird.