DE68916301T2

DE68916301T2 - Immobilisierte FTF Enzyme.

Info

Publication number: DE68916301T2
Application number: DE68916301T
Authority: DE
Inventors: Akira Ryoka-Aobadai-Dai Kamata; Hiroshi Kusano; Takao Uchiyama
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1988-04-06
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2009-04-05
Also published as: CA1315724C; KR890016168A; EP0336376A3; DE68916301D1; EP0336376B1; EP0336376A2; JPH01256388A; US5094948A; JPH0746990B2; DK162289A; DK162289D0

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, welches in vorteilhafter Weise bei der Herstellung von Di-D-Fructofuranose-2',1 : 2,3'-dianhydrid, nachfolgend als "DFA III" bezeichnet, angewandt werden kann.

Beschreibung des Standes der Technik

Inulin-D-Fructotransferase (Inulinase II), nachfolgend als "FTF" bezeichnet, ist ein Enzym zur Herstellung von DFA III aus Inulin.
DFA III ist ein Disaccharid mit der Struktur, in der zwei Moleküle Fructose unter Dehydration über 1,2'- und 2,3'-Bindungen kondensiert sind, und welches 1931 von Jackson et al. isoliert und identifiziert worden ist, Bur. stand. J. Res., 6, 709 (1931). DFA III kann als kalorienarmer Süßstoff angesehen werden, da er in Tieren weder metabolisiert noch vergärt wird, und es wird angenommen, daß er in Zukunft für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich ist, einschließlich für die Verwendung in einer diätetischen Nahrung.
Verschiedene Bakterien, welche FTF herstellen können, sind bekannt und schließen zum Beispiel Arthrobacter ureafaciens 7116 (FERM P-1969), Arthrobacter globiformis C 11-1 (FERM P-8748), Arthrobacter aurescens IFO 12136 (Uchiyama et al., 1975, der 48. Kongress der "Society of Japan Biochemistry") und Pseudomonas fluorescens Nr. 949 (Kuramato et al., der Kongress der "Society of Japan Agricultural Chemistry", Seite 654 (1987) und Seite 112 (1988)) ein.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben ebenfalls herausgefunden, daß Arthrobacter ilicis MCI-2297 (FERM P-9893, ebenfalls als FERM BP-2279 unter dem Budapester Vertrag bezeichnet) ebenfalls FTF erzeugen kann: Japanische Patentanmeldung Nr. 53164/1988; Uchiyama et al., der Kongress der "Society of Japan Agricultural Chemistry", Seite 269 (1988).
Bei herkömmlichen Enzymreaktionen, die solche Enzyme in wäßrigen Lösungen verwenden, wäre eine Modifizierung oder Entfernung der Enzyme erforderlich, um gewünschte Produkte nach der Reaktion industriell zu sammeln. Somit müßten die Enzyme nach jeder Reaktion verworfen werden, sogar obgleich sie noch aktiv sind, was zu wirtschaftlichen Nachteilen führt.
Bei dem Versuch, die Enzyme wiederzugewinnen, wäre eine Behandlung wie Ultrafiltration notwendig, was eine Menge an Gerätschaften und Zeit erfordert, um die Enzyme aus der Reaktionsmischung abzutrennen. Somit ist dieses ebenfalls wirtschaftlich nachteilig.
Die EP-A-132 998 beschreibt eine immobilisierte Enzymzusammensetzung, die ein Styrol-Divinylbenzol-Anionenaustauschharz mit einem daran adsorbierten Enzym umfaßt, wobei die adsorbierten Enzymmoleküle miteinander durch die Reaktion des Enzyms in situ mit einem mehrwertigen Aldehyd vernetzt wurden, um die Freisetzung des Enzyms zu verhindern. Chemical Abstracts, Band 79, Nr. 15, 88677r beschreibt die Reinigung und die enzymatischen Eigenschaften von DFA III herstellende Inulase II, welche von Arthrobacter ureafaciens hergestellt wird Die Immobilisierung des Enzyms ist darin nicht erwähnt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben große Anstrengungen unternommen, um die oben erwähnten Nachteile zu überwinden, und sie untersuchten verschiedene Verfahren, welche industriell von Vorteil sein könnten. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, daß ein immobilisiertes Enzym (FTF), bei dem das Enzym vorausgehend bzw. zunächst in einem besonderen Anionenaustauschharz getragen wird, nicht nur mit wirtschaftlichen Vorteilen (zum Beispiel kann es recycelt werden) angewandt werden kann, sondern auch zu einer höheren Menge an adsorbierten Enzym, Enzymaktivität und/oder Bindungskraft zwischen dem Enzym und dem Trägerharz bereitstellen kann. Darüber hinaus zeigt das in einem solchen Harz getragene Enzym eine sehr hohe und stabile Aktivität.
Es ist demzufolge ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein immobilisiertes FTF mit einer großen Menge an adsorbiertem Enzym und einer hohen Enzymaktivität bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können dieses und andere Ziele, welche aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden, erreicht werden, indem ein immobilisiertes FTF-Enzym, wobei FTF in einem Anionenaustauschharz getragen wird, welches Poren mit einem Modusradius, wie er deutlich nachfolgend definiert wird, von 7,5 bis 200 nm (75 bis 2000 Å) besitzt, bereitgestellt wird, wobei die Enzymmoleküle nicht miteinander vernetzt sind.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
Das Enzym FTF, welches gemäß der vorliegenden Erfindung von einem spezifischen Anionenaustauschharz getragen oder unterstützt wird, kann jedes beliebige FTF-Enzym sein, welches die Reaktion zur Herstellung von DFA III aus Inulin katalysieren kann.
Solch ein Enzym kann durch verschiedene Bakterien hergestellt werden, einschließlich jenen, die zur Gattung Arthrobacter gehören, wie zum Beispiel Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter aurescens und Arthrobacter ilicis; und jene, die zur Gattung Pseudomonas gehören, wie Pseudomonas fluorescens. Erläuternde Beispiele von Bakterien, welche ein solches Enzym, FTF, herstellen können, können zum Beispiel Arthrobacter ureafaciens 7116 (FERM P-1969), Arthrobacter globiformis C 11-1 (FERM P-8748), Arthrobacter aurescens IFO 12136, Arthrobacter ilicis MCI-2297 (FERM BP-2279) und Pseudomonas fluorescens Nr. 949: Kuramato et al., der Kongress der "Society of Japan Agricultural Chemistry", Seite 654 (1987) und Seite 112 (1988) einschließen.
Bei der Herstellung des Enzyms FTF kann ein solches Bakterium, wie es obenstehend erwähnt ist, auf jede entsprechende Weise kultiviert werden. Wenn die hergestellten Enzyme in das Kulturmedium segregiert werden, können sie von den Zellen mittels Zentrifugation, Filterpressung und ähnlichen Verfahren abgetrennt werden. Wenn die produzierten Enzyme innerhalb der Zellen verbleiben, können verschiedene bekannte Verfahren angewendet werden, um FTF zu erhalten; zum Beispiel können mechanische Verfahren, wie die Ultraschallbehandlung und die Druckeinwirkung, verwendet werden, es kann die Autolyse, bei der die Zellen durch ihre eigenen zytolytischen Enzyme sich selbst spontan abbauen, angewandt werden.
Hier verwendbare Anionenaustauschharze sollten Poren mit einem Modusradius im Bereich von 7,5 bis 200 nm (75 bis 2000 Å), vorzugsweise von 7,5 bis 100 nm (75 bis 1000 A) besitzen.
Der hier verwendete "Modusradius" steht für den häufigsten Wert bezüglich der Radien aller Poren, die im verwendeten Anionenaustauschharz vorliegen.
Bei den bevorzugten Anionenaustauschharzen der vorliegenden Erfindung beträgt das Gesamtvolumen der Poren mit einem Radius im Bereich von 7,5 bis 300 nm (75 bis 3000 Å) (nachfolgend manchmal als "Porenvolumen" bezeichnet) mindestens 0,1 ml/g insbesondere 0,3 bis 2,5 ml/g, und der spezifische Oberflächenbereich der Harzteilchen beträgt mindestens 0,1 m²/g, insbesondere 10 bis 100 m²/g. Solche porösen Harze können gut FTF adsorbieren und tragen und können somit in vorteilhafter Weise bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Die physikalischen Eigenschaften, das heißt der spezifische Oberflächenbereich und das Porenvolumen, des bei der Herstellung des vorliegenden immobilisierten FTF verwendeten Anionenaustauschharzes werden für eine Probe des porösen Austauschharzes, welches unter einem reduzierten Druck von wenigen mmHg bei 50ºC während 10 Stunden getrocknet worden ist, gemäß dem B.E.T.-Verfahren bzw. der Quecksilberporosimetrie (Autopore 200 von MICROMETRIC Company) bestimmt.
Die hierin verwendeten porösen Anionenaustauschharze können mittels verschiedener bekannter Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen können Basismaterialien für die Ionenaustauschharze hergestellt werden, indem mindestens ein Monovinylmonomer und mindestens ein Polyvinylmonomer copolymerisiert werden. Monovinylmonomere, welche vorzugsweise hier verwendet werden können, können aromatische Monovinylverbindungen wie Styrol und aliphatische Monomere wie Acryl- und Methacrylsäuren oder deren Ester einschließen. Bevorzugte Polyvinylmonomere können aromatische Divinylverbindungen wie Divinylbenzol und aliphatische Verbindungen wie Ethylenglykoldimethacrylat ein schließen.
Um solche harzartigen Basismaterialien porös zu machen, können die vorstehend genannten Monomere in Gegenwart einer Substanz polymerisiert werden, welche später durch Lösungsmittelextraktion entfernt werden kann und nicht die Polymerisationsreaktion stört, zum Beispiel Polystyrol, unter anschließender Behandlung des resultierenden Harzes mit einem geeigneten Lösungsmittel, um die Substanz wie Polystyrol nach der Extraktion zu extrahieren.
Die physikalischen Eigenschaften der porösen Harze, wie der spezifische Oberflächenbereich, die Porengröße und das Gesamtvolumen der Poren mit einem Radius von 7,5 nm (75 Å) oder mehr, können durch geeignete Auswahl der Bedingungen zur Herstellung der Harze verändert werden. Es ist schwierig, eindeutig irgendeine Beziehung zwischen den physikalischen Eigenschaften und den Bedingungen zur Herstellung der Harze zu bestimmen. Wenn zum Beispiel Styrol und Divinylbenzol zur Herstellung des Basismaterials bei dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden, wird eine große Menge an verwendetem Divinylbenzol im allgemeinen zu höheren Porositäten führen, das heißt größeren spezifischen Oberflächenbereichen, größeren Porenvolumina und/oder Porenradien; und größere Mengen an Polystyrol werden ebenfalls in der Regel zu größeren Porenvolumina oder -größen führen.
Anionische Austauschgruppen können in das Harz eingeführt werden, indem Chlormethylgruppen in das harzartige Basismaterial unter anschließender Behandlung mit verschiedenen Aminen, einschließlich aliphatischen Aminen wie Trimethylamin, Dimethylethanolamin, Ethylendiamin, Diethylentriamin oder Triethylentetramin und cyclischen Aminen wie Pyrrolidin, Morpholin und Piperidin, vorzugsweise mit aliphatischen Aminen, eingeführt werden. In alternativer Weise kann ein Vinylmonomer mit einer hochreaktiven funktionellen Gruppe, zum Beispiel Glycidyl(meth)acrylat oder Vinylbenzylglycidylether, in vorteilhafter Weise bei der Synthese des harzartigen Basismaterials copolymerisiert werden, unter anschließender Zugabe verschiedener Amine zu der Glycidylgruppe, wobei ein Fortschreiten der Ringöffnungsreaktion davon unter basischen Bedingungen verursacht wird. Durch geeignete Auswahl der Eigenschaften des vorstehend genannten Basismaterials und der Natur der verwendeten Amine können bevorzugte anionische Austauschharze erhalten werden, bei dem das darin getragene FTF-Enzym eine hohe Aktivität zeigen wird.
Es mag ebenfalls bevorzugt sein, daß der Grad der Vernetzung in dem Basisharz in geeigneter Weise ausgewählt wird, indem die oben beschriebenen Faktoren, wie die Poreneigenschaften des Harzes und die Natur des verwendeten Anionenaustauschharzes, in Betracht gezogen werden, da ein höherer Vernetzungsgrad dazu neigt, sowohl die Menge als auch die Aktivität des adsorbierten Enzyms zu verringern. Wenn somit ein Harz durch Copolymerisation von Styrol mit einem vernetzbaren Monomeren wie Divinylbenzol hergestellt wird, wird letzteres im allgemeinen in einer Menge von 50 Mol-% oder weniger, vorzugsweise 25 Mol-%, oder weniger eingesetzt.
Auch auf Poly(meth)acrylsäure basierende Acrylsäureharze, welche in herkömmlicher Weise hergestellt werden können, können hier als das poröse Harzsubstrat, wie es angemessen erscheint, angewandt werden.
Bei der vorliegenden Erfindung besitzen die porösen Anionenaustauschharze im allgemeinen eine Teilchengröße im Bereich von etwa 0,841 bis 0,037 mm (20 bis 400 Mesh). Je kleiner die Teilchengröße ist, desto höher wird die Enzymaktivität in der Regel werden.
Das FTF-Enzym kann durch das vorstehend genannte Anionenaustauschharz gemäß mindestens einem der bekannten Verfahren zur Behandlung von Ionenaustauschharzen adsorbiert werden. Am bequemsten kann das Ionenaustauschharz in eine wäßrige FTF-Lösung getaucht werden, die erhalten wird, indem Zellen aus einer Kultur eines obenstehend genannten Bakteriums entferne werden, dann wird, falls notwendig, gerührt, und nach einer geeigneten Zeitdauer der Adsorption herausgenommen und mit Wasser gewaschen. Die wäßrige FTF-Lösung besitzt für gewöhnlich einen pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 10,0. Die Temperatur, bei der der Adsorptionsvorgang durchgeführt wird, liegt im Bereich von 0 bis 60ºC Die für die Adsorption erforderliche Zeitdauer liegt bei etwa 1 bis 20 Stunden.
Der vorstehend genannte Anionenaustauschharzträger kann in Form von verschiedenen Salzen angewandt werden. Zum Beispiel kann das Ionenaustauschharz mit einer wäßrigen Lösung von Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid, Phosphorsäure oder Essigsäure behandelt werden, um die HSO&sub4;&supmin;-, SO&sub4;²&supmin;-, Cl&supmin;-, OH&supmin;-, HPO&sub4;&supmin;-, PO&sub4;²&supmin;- oder CH&sub3;COO&supmin;-Salzform, vorzugsweise die SO&sub4;²&supmin;-, Cl&supmin;-, OH&supmin;- oder PO&sub4;²&supmin;-Salzform, zu bilden. An den Trägern dieser Salzformen kann FTF in wirksamer Weise adsorbiert werden.
Die Menge des durch den Träger adsorbierten Enzyms liegt für gewöhnlich im Bereich von 0,05 bis 30 mg Protein, vorzugsweise 0, 1 bis 10 mg Protein, pro ml Harz im nassen Zustand.
Obgleich der Mechanismus, durch den FTF durch das Anionenaustauschharz adsorbiert wird, und der Mechanismus, durch den FTF gemäß der vorliegenden Erfindung seiner Aktivität beeinflußt, nicht vollständig verstanden worden sind, kann angenommen werden, daß sowohl die physikalische Adsorption durch die Harzporen als auch jede chemische Bindungskraft, die sich zwischen den Anionenaustauschgruppen und FTF ausbilden, in synergistischer Weise in die Mechanismen involviert sind. Dies kann auch von der Tatsache abgeleitet werden, daß herkömmliche gelartige Ionenaustauschharze mit einem geringen spezifischen Oberflächenbereich und einem geringen Porenvolumen von 7,5 nm (75 Å) oder mehr im Radius kaum FTF adsorbieren kann, und daß andererseits die Menge des adsorbierten FTF gering und die Aktivität desselben ebenfalls gering sind bei porösen Harzen mit einem großen spezifischen Oberflächenbereich und einem hohen Porenvolumen von 7,5 nm (75 Å) oder mehr im Radius, die jedoch keine darin eingeführte Anionenaustauschgruppe besitzen.
Die verwendeten Anionenaustauschharze der vorliegenden Erfindung können in einer wäßrigen Lösung quellen, um ein größeres Netzwerk als im trockenen Zustand zu bilden. Allerdings werden jene Harze mit größeren Porenradien und größeren Porenvolumina im trockenen Zustand zu einer besseren Adsorption und Aktivität von FTF führen.
Die derart erhaltenen unlöslich gemachten Enzyme behalten die hohe Aktivität des FTF bei. Darüber hinaus können die immobilisierten FTF-Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung für einen langen Zeitraum ohne signifikante Abnahme der Enzymaktivität eingesetzt werden. Ferner wird das Enzym vom Träger nicht freigesetzt. Folglich kann die Enzymreaktion in vorteilhafter Weise in einem industriellen Maßstab ausgeführt werden. Wenn die immobilisierten FTF-Enzyme der vorliegenden Erfindung industriell genutzt werden, kann jeder beliebige Reaktor vom Packbett-Typ, Rührtyp oder von einem anderen Typ angewandt werden.
Einer der Vorteile der vorliegenden immobilisierten FTF-Enzyme ist der, daß bei solchen Harzen mit immobilisiertem Enzym, die nach langem Einsatz eine verminderte Aktivität besitzen, das FTF-Enzym leicht aus dem Harz, welches dann regeneriert wird, freigesetzt werden kann, und zwar durch einfache Behandlung des Harzes mit immobilisiertem Enzym mit einer wäßrigen Natriumchlorid- oder Kaliumchloridlösung. Nach der Regenerierung kann frische FTF vom regenerierten Ionenaustauschharz adsorbiert und getragen werden, um erneut ein Harz mit immobilisiertem FTF-Enzym mit hoher Aktivität herzustellen.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Es versteht sich, daß die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist, es sei denn, sie weichen von dem Umfang derselben ab, so wie sie in den anhängigen Patentansprüchen definiert ist.

Beispiel 1

Arthrobacter ilicis MCI 2297 (FERM BP-2279) wurde in einem 5 Liter großen Sakaguchi-Kolben, der 500 ml eines nachfolgend spezifizierten Mediums enthielt, bei 30ºC 24 Stunden lang kultiviert.
Inulin 50 g
Natriumnitrat 2 g
Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,5 g
Kaliumchlorid 0,5 g
Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g
Eisen(III)-chlorid 0,001 g
Hefeextrakt 0,2 g
Wasser 1 Liter
Nach der Kultivierung wurden Zellen mittels Zentrifugation entfernt, wodurch eine FTF-Lösung mit einer Aktivität von 21 U erhalten wurde.
Dann wurden 150 ml der Enzymlösung 1 ml nassem Ionenaustauschharzes mit den nachstehend in Tabelle 1 aufgeführten physikalischen Eigenschaften hinzugesetzt und unter Schütteln 10 Stunden lang bei 30ºC bewegt, wodurch das Enzym am Harz adsorbiert wurde. Somit wurde eine immobilisierte FTF-Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten.
Das Harz mit immobilisierter FTF wurde mit Wasser gewaschen und dann zweimal mit 10 ml einer Reaktionsmischung (10% Inulin, 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6,0). Zu dem gewaschenen Harz wurden 100 ml der Reaktionsmischung hinzugesetzt, und die Reaktion wurde unter Schütteln und unter Bewegung 1 Stunden lang bei 30ºC durchgeführt.
Die Aktivität des Harzes mit immobilisiertem FTF-Enzym, wie sie mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, wurden 3,29 g DFA III in der Reaktionsmischung hergestellt.
Anschließend wurde das Harz mit immobilisiertem Enzym zweimal mit 10 ml frischer Reaktionsmischung gewaschen und mit 100 ml frischer Reaktionsmischung erneut versetzt. Nach einstündigem Ablauf der gleichen Reaktion wurden 3,01 g DFA III in der Reaktionsmischung hergestellt. In gleicher Weise wurde eine dritte Reaktion durchgeführt, wodurch 3,00 g DFA III erzeugt wurden.
Die Bestimmung der Enzymaktivitäten und der Analyse von DFA III wurden hier entsprechend den nachfolgenden Methoden durchgeführt:

(1) Bestimmung der Enzymaktivität

Inulin (10 g) wurde in 90 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gelöst, und das Gesamtvolumen wurde auf 100 ml eingestellt. Eine Enzymlösung (1 ml) wurde der derart hergestellten Inulinlösung (2 ml) hinzugesetzt, und die Reaktion wurde unter Schütteln 1 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurden der Reaktionsmischung 3 ml Methanol hinzugesetzt; und Wasser wurde zur Einstellung des Volumens auf 30 ml hinzugegeben. Das hergestellte DFA III wurde dann mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Eine Enzymaktivität, die zur Herstellung von 1 g DFA III pro Stunden pro Liter der Enzymlösung führte wurde als ein U (unit) (Einheit) ausgedrückt.

(2) Analyse des hergestellten DFA III

DFA III wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer CK08S-Säule, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan, analysiert, wobei Wasser als Eluent mit einer Fließrate von 1 ml pro Minute und ein Differentialfraktometer als Detektor eingesetzt wurden.

Beispiele 2 bis 9 und Vergleichsbeispiele 1 bis 7

Verschiedene Harze mit immobilisierter FTF wurden durch Wiederholung der Vorgehensweise des Beispiels 1 hergestellt, außer daß die Natur und der Ionentyp der verwendeten Austauscherharze wie in Tabelle 1 abgeändert wurden.
Die Aktivitäten der resultierenden Harze mit immobilisierter FTF sind ebenfalls in Tabelle 1 aufgezeigt.
In Tabelle 1 sind die angewandten Einheiten wie folgt: 1) Modusradien in nm (Å), 2) Volumen der Poren mit einem Radius von 7,5 bis 300 nm (75 bis 3000 Å) in ml/g, 3) spezifischer Oberflächenbereich in m²/g, und 4) Aktivitäten der immobilisierten FTF-Enzyme in Gewicht (g) des hergestellten DFA III pro 100 ml pro ml Harz pro Stunde. Tabelle 1 Eigenschaften des Ionenaustauschharzes Typ der Anionenaustauschgruppe Modusradius Porenvolumen Spezifischer Oberflächenbereich Salzform Aktivität des Immobilisierten FTF-Enzyms Beispiel Dimethylethanolammonium-; Trimethylammonium-; Dimethylamino-; Hexamethylendiamin-; Vergleichsbeispiel Keine Austauschgruppe Kationisches Austauschharz vom Sulfonsäure-Typ(m)
In der Tabelle 1 bezeichnet der in Klammern gesetzte Buchstabe (a) DIAION HPA 75, (b) DIAION HPA 25, c) Amberlite IRA 904, im Handel von Rohm & Haas Co. erhältlich, (d) DIAION WA 30, (e) SEPHABEADS FPDA 13, (f) SEPHABEADS FPHA 13, (g) SEPHABEADS FPHA 20, (h) SEPHABEADS FPHA 05, (i) DIAION HP 20, (j)poröses Adsorbens MPX-01, (k) SEPHABEADS FP-HG 13, (m) DIAION HPK 25, (n) DIAION SA 21 A und (p) DIAION PA 406; diese Harze sind im Handel von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan, erhältlich, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 10

Ein weiteres Harz mit immobilisierter FTF der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt, indem die Vorgehensweise des Beispiels 1 wiederholt wurde, außer daß der verwendete Stamm Arthrobacter aurescens IFO 12136 war. (Die durch die Kultur dieses Stamms erhaltene Enzymlösung besaß eine Aktivität von 7,4 U). Die Aktivität des resultierenden immobilisierten Enzyms ist in Tabelle 2 angegeben.

Beispiel II und Vergleichsbeispiele 8 und 9

Einige andere Harze mit immobilisierter FTF wurden hergestellt, indem die Vorgehensweise des Beispiels 10 wiederholt wurde, außer daß die Natur der Ionenaustauschgruppe der verwendeten Austauschharze wie in Tabelle 2 angegeben, abgeändert wurde.
Die Aktivitäten der resultierenden immobilisierten FTF-Enzyme sind ebenfalls in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Eigenschaften des Ionenaustauschharzes Typ der Anionenaustauschgruppe Modusradius Porenvolumen Spezifischer Oberflächenbereich Salzform Aktivität des Immobilisierten FTF-Enzyms Beispiel Hexamethylendiamin-; Dimethylethanolammonium-; Vergleichsbeispiel In der Tabelle 2 haben die Einheiten 1) bis 4) und die Harztypen (a), (f), (h) und (n) die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1.
Wie aus den vorstehenden Beispielen ersichtlich ist, zeigt das Enzym, das durch die erfindungsgemäßen Harze mit immobilisiertem Enzym getragen wird, eine befriedigend hohe Aktivität, was eine höhere Produktion von DFA III ermöglicht. Darüber hinaus wird es industriell von Vorteil sein, daß die immobilisierten Enzyme der vorliegenden Erfindung wiederholt eingesetzt werden können, um DFA III herzustellen.

Claims

1. Immobilisiertes Enzym, gemäß welchem ein Inulin-D-Fructotransferaseenzym in einem Anionenaustauschharz getragen wird, welches Poren mit einem Modusradius im Bereich von 7,5 bis 200 nm (75 bis 2000 Å) besitzt, wobei die Enzymmoleküle nicht miteinander vernetzt sind.

2. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 1, wobei das Volumen von Poren mit einem Radius von 7,5 bis 300 nm (75 bis 3000 Å) mindestens 0,1 ml/g des Anionenaustauschharzes beträgt.

3. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 2, wobei das Anionenaustauschharz eine spezifische Oberfläche von mindestens 0,1 m²/g besitzt.

4. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 1, wobei die Inulin-D-Fructotransferase aus einer Kultur von Arthrobacter ilicis MCI 2297 (FERM BP-2279) abgeleitet ist.

5. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 1, wobei die Inulin-D-Fructotransferase aus einer Kultur von Arthrobacter aurescens IFO 12136 abgeleitet ist.