DE60105657T2

DE60105657T2 - Immobilisiertes Enzym und Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen

Info

Publication number: DE60105657T2
Application number: DE60105657T
Authority: DE
Inventors: Hisashi Tsukuba-shi Semba; Yukio Tsukuba-shi Dobashi
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2021-01-13
Also published as: EP1116789B1; ATE277173T1; JP2001190275A; JP3709317B2; US20020064840A1; DE60105657D1; EP1116789A1; US6709847B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta auf einem Träger mit einem hohen Absorptionspotential immobilisiert ist, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms, sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Cyanhydrin unter Verwendung dieses immobilisierten Enzyms.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(S)-Hydroxynitrillyase ist nützlich als ein Enzym zur Synthese optisch aktiver Cyanhydrine. In organischen Lösungsmittelreaktionssystemen, wie sie gewöhnlich verwendete enzymatische Synthesen dieser Verbindungen darstellen, werden die Enzyme z.B. als immobilisierte Enzyme verwendet, um die Enzyme in dem Reaktionssystem zu verteilen und die Reaktion effektiv durchzuführen. Als ein Beispiel, in dem (S)-Hydroxynitrillyase immobilisiert wurde, ist die Immobilisierung an einem Mikrozellulosepulver und an Nitrocellulose beschrieben worden. Jedoch besitzen diese Celluloseträger eine niedrige Absorptionsrate des Enzyms, was das Hindernis begründet, dass enorme Mengen an Träger nötig sind, um das für die Reaktion benötigte Enzym zu immobilisieren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein immobilisiertes Enzym, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in einem Immobilisierungsträger bei einer hohen Absorptionsrate immobilisiert wird, ein Verfahren zur Herstellung dieses immobilisierten Enzyms, sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Cyanhydrin unter Verwendung dieses immobilisierten Enzyms bereitzustellen.
Wehtje et al., 1993, Biotechnology and Bioengineering, Band 41, Seiten 171–178, berichten, dass es möglich ist, den Verlust von Enzymaktivität bei Verwendung eines festen Trägers zu vermeiden, indem Proteine und Poly(ethylenglykol) zugegeben werden, wogegen Aminosäuren, monomere Kohlenhydrate und Polysaccharide keine Wirkung hatten. Diese Untersuchung schlussfolgerte, dass die Menge an Zusatzstoff, die zur Stabilisierung von Enzymen benötigt wird, abhängig von der Struktur des Trägers ist, wobei für einen Träger höherer Porosität mehr Zusatzstoff benötigt werde. Die US 5,177,242 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven (S)-Cyanhydrinen durch Umsetzung von Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure in Gegenwart des katalytischen Enzyms S-Oxynitrilase und eines Lösungsmittels, wenn die Lösung durch eine chemisch aktivierte, poröse Membran geleitet wird, an die das S-Oxynitrilase-Enzym chemisch gebunden worden war.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben umfangreich und intensiv geforscht, um die obigen Probleme zu lösen und haben nun herausgefunden, dass (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta mittels Verwendung eines porösen, anorganischen Trägers, wie etwa eines gesinterten Tonträgers, eines Siliciumdioxidträgers, eines Aluminiumoxidträgers und eines Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Trägers, als Immobilisierungsträger für das Enzym bei hoher Absorptionsrate immobilisiert werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung fertig gestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in einem Träger immobilisiert wird, der ein poröses anorganisches Material (z.B. den gesinterten Tonträger, den Siliciumdioxidträger, den Aluminiumoxidträger oder den Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, mit einer Porengröße von 10–80 nm) umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des immobilisierten Enzyms, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in einem Träger immobilisiert wird, der ein poröses anorganisches Material umfasst (z.B. den gesinterten Tonträger, den Siliciumdioxidträger, den Aluminiumoxidträger oder den Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, mit der Porengröße von 10–80 nm).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Cyanhydrins, bei dem man das immobilisierte Enzym in Kontakt mit einer Carbonylverbindung und einer Cyanogenverbindung in der Gegenwart eines geringfügig wasserlöslichen oder wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels bringt. Das hierbei verwendete, immobilisierte Enzym kann zur Wiederverwendung aus dem Reaktionsgemisch gesammelt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun wie folgt im Detail beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Wirkung der Porengröße eines Immobilisierungsträgers auf die Absorptionsrate des Enzyms, wenn Toyonite 200 als Träger verwendet wird.
2 zeigt die Wirkung der Porengröße eines Immobilisierungsträgers auf die Absorptionsrate des Enzyms, wenn Micro Bead Silicagel als Träger verwendet wird.
3 zeigt die Wirkung des pH auf die Absorptionsrate und Reaktivität des Enzyms, wenn Micro Bead Silicagel 300A als Immobilisierungsträger verwendet wird.
4 zeigt die Wirkung der Konzentration eines Puffers auf die Absorptionsrate des Enzyms, wenn Micro Bead Silicagel 300A als Immobilisierungsträger verwendet wird.
5 zeigt Veränderungen bei der Umsatzrate in jedem Reaktionszyklus.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in/auf einem Träger adsorbiert wird, der ein poröses anorganisches Material umfasst. Das immobilisierte Enzym der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsrate des Enzyms in den Träger höher ist als die des konventionellen immobilisierten Enzyms, bei dem das Enzym an einem Cellulose-Träger adsorbiert wird. Folglich besitzt das immobilisierte Enzym der Erfindung eine bemerkenswert hohe Adsorptionsrate an dem Immobilisierungsträger. Dieses immobilisierte Enzym kann gemäß unten stehender Beschreibung hergestellt werden.
1. Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase
(S)-Hydroxynitrillyase, die Gegenstand der Immobilisierung ist, kann durch Extraktion aus biologischen Geweben (z.B. einem Pflanzengewebe, das das Enzym enthält) oder mittels Gentechnik hergestellt werden. Es ist bevorzugt, (S)-Hydroxynitrillyase im Bezug auf seine dauerhafte Bereitstellung durch gentechnische Verfahren herzustellen. Die Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase durch gentechnische Verfahren kann z.B. wie folgt erfolgen.
(1) Quelle eines Gens, das (S)-Hydroxynitrillyase codiert
Quelle eines Gens, das (S)-Hydroxynitrillyase codiert (hier im folgenden auch als „(S)-Hydroxynitrillyase-Gen bezeichnet) ist Manihot esculenta.
(2) Klonierung des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens
Das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen kann wie folgt aus der Quelle aus (1) oben kloniert werden. Zunächst wird in der üblichen Weise cDNA hergestellt. Auf der anderen Seite werden Primer für die Amplifizierung des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens durch PCR entworfen und basierend auf der bekannten Nukleotidsequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens synthetisiert. Beispielsweise können Primer für die Amplifikation des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens, stammend aus Manihot esculenta, wie folgt auf Basis der in „Arch. Biochem. Biophys. 311, 496–502 (1994)" beschriebenen Nukleotidsequenz erstellt werden.
Das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen wird dann mit den synthetisierten Primern für die Amplifikation durch PCR amplifiziert, wobei hierfür cDNA, die aus dem Organismus aus (1) oben präpariert wurde, in der üblichen Weise als Matrize verwendet wird. Nach Ligation des resultierenden, mittels PCR amplifizierten Fragments an einen geeigneten Vektor wird die Nukleotidsequenz bestätigt, wobei diejenige mit der Nukleotidsequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens als ein Klon betrachtet wird, der das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält.
(3) Konstruktion eines (S)-Hydroxynitrillyase-Expressionsvektors
Die Konstruktion eines (S)-Hydroxynitrillyase-Expressionsvektors kann durchgeführt werden, indem eine Region ausgeschnitten wird, die für (S)-Hydroxynitrillyase aus dem das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthaltenden Klon, der in (2) oben erhalten wurde, codiert, und diese Region an einen geeigneten Expressionsvektor ligiert wird. Der Expressionsvektor gemäß der hier vorliegenden Verwendung wird in Abhängigkeit von den für die Expression des (S)-Hydroxynitrillyase-Proteins zu verwendenden Wirtstypen ausgewählt. In dem Fall, in dem z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Wirt verwendet wird, können Expressionsvektoren des Episom-Typs, einschließlich YEp51, YEp351 und pYES2, verwendet werden; und in dem Fall, in dem E. coli als Wirt verwendet wird, können Expressionsvektoren wie etwa pKK223-3, pKK233-2 und pTrc99A verwendet werden.
(4) Herstellung einer Transformanten, die das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält
Eine Transformante, die das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält, kann erzeugt werden, indem der (S)-Hydroxynitrillyase-Gen-Expressionsvektor, der in (3) oben erhalten wurde, in eine Wirtszelle transformiert wird. Im Detail kann die Transformation der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch Verfahren wie etwa Elektroporation, das Spheroplast-Verfahren und das Lithiumacetat-Verfahren durchgeführt werden; die Transformation von E. coli kann durch Verfahren wie das Calciumchlorid-Verfahren und Elektroporation durchgeführt werden. Eine gewünschte Transformante kann nach der Durchführung der Transformation selektiert werden, indem Transformanten auf einem geeigneten Selektionsmedium angeimpft werden und ein gewachsener Stamm ausgewählt wird.
(5) Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase-Protein
(S)-Hydroxynitrillyase-Protein kann erhalten werden, indem die Transformante, die in (4) oben erhalten wurde, in einem Medium kultiviert und die Kultur geerntet wird. Der Begriff „Kultur" in der hier vorliegenden Verwendung meint ein beliebiges von einem Kulturüberstand, einer kultivierten Zelle oder Mikrobenzelle, oder ein aufgeschlossenes Material der kultivierten Zelle oder Mikrobenzelle. Ein Verfahren zur Kultivierung der Transformante in einem Medium kann in einer üblichen Weise, wie sie für die Kultur eines Wirtes verwendet wird, durchgeführt werden.
Beispielsweise ist das Medium zur Kultur einer mit Hefe als Wirt erhaltenen Transformante nicht speziell eingeschränkt, solange ein eingeführtes (S)-Hydroxynitrillyase-Gen stabil in dem Wirt aufrecht erhalten wird, und zur gleichen Zeit (S)-Hydroxynitrillyase durch die Genexpression in dem Wirt produziert wird. Es ist bevorzugt, eine Kohlenstoffquelle und/oder eine Aminosäurezusammensetzung und/oder eine Zusatzstoff-Zusammensetzung einzustellen, die in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Wirts und eines eingeführten Selektionsmarker-Gens für die Kultur verwendet werden soll. Die Kultur wird fortgesetzt, bis die Produktion von (S)-Hydroxynitrillyase durch die mikrobielle Wirtszelle unter Temperatur- und pH-Bedingungen aufhört, bei denen das Wachstum des Wirts nicht inhibiert wird (normalerweise 30°C, pH 4–8).
Wenn (S)-Hydroxynitrillyase-Protein nach der Kultivierung in der Mikrobenzelle produziert wird, wird das Protein durch Zerstörung der Mikrobenzelle oder Zelle extrahiert. Wenn das Enzymprotein bei der Produktion außerhalb der Mikrobenzelle angereichert wird, kann die Kulturflüssigkeit darüber hinaus so verwendet werden wie sie ist, oder die Mikrobenzelle oder Zelle wird durch Zentrifugation oder dergleichen entfernt. Das (S)-Hydroxynitrillyase-Protein kann dann aus der Kultur gereinigt werden, indem allgemeine biochemische Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen, wie etwa Ammoniumsulfat-Präzipitation, Gelchromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie und Hydrophobizitäts-Chromatographie, alleine oder gegebenenfalls in Kombination eingesetzt werden.
2. Immobilisierung von (S)-Hydroxynitrillyase
(1) Träger zur Immobilisierung von (S)-Hydroxynitrillyase
Verschiedene Träger, die poröse anorganische Materialien umfassen, können als Immobilisierungsträger für (S)-Hydroxynitrillyase verwendet werden. Derartige Träger sind gesinterte Tonträger, Siliciumdioxidträger, Aluminiumoxidträger und Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger.
Die gesinterten Tonträger bezeichnen einen porösen Träger, der durch Granulieren und Sintern von Silikat-Rohmaterialien (z.B. Mineralien der Kaolinit-Gruppe einschließlich Kaolinit, Dickit, Nacrit und Halloysit; und Tone einschließlich Pyrophyllit, Montmorillonit, Sericit, Talkum und Chlorit) erhalten wird. Spezifischer ausgedrückt, sind Toyonite200 (Toyo Denka Kogyo) und Toyonite200A (Toyo Denka Kogyo) einbezogen.
Der Siliciumdioxidträger bezeichnet einen porösen Träger mit einem großen Oberflächenbereich, hergestellt aus agglutinierten Mikropartikeln von Siliciumdioxid. Spezifischer ausgedrückt, können Micro Bead Silica Gel (Fuji Silysia Chemical) und Chromatography Silica Gel (Fuji Silysia Chemical) einbezogen werden.
Der Aluminiumoxidträger bezeichnet einen porösen Träger, der ein Aluminiumoxid als den Hauptbestandteil enthält. Spezifischer ausgedrückt, können NeoBead DL (Mizusawa Chemical) und γ-Alumina KHA-34 (Sumitomo Chemical) einbezogen werden.
Der Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger bezeichnet einen porösen Träger mit Aluminiumoxid und Siliciumdioxid als den Hauptbestandteilen. Spezifischer ausgedrückt, können MIZUKASIEVES Y-540 Y-Typ Zeolite (Mizusawa Chemical), MIZUKASIEVES 13X-488 Zeolite 13X (Mizusawa Chemical), HSZ-630HOA H-Mordenite (Tosoh) und Na-Mordenite (Catalysts & Chemical Industries) einbezogen werden.
Es ist bevorzugt, Träger auszuwählen, die eine effektive Porengröße zur adäquaten Immobilisierung von Enzymen besitzen, da die Absorptionsmenge des Enzyms von der Porengröße eines Trägers aus porösem anorganischem Material gemäß obiger Beschreibung abhängt. Um genauer zu sein, beträgt die ausgewählte Porengröße 10–80 nm, bevorzugt 10–60 nm, und am bevorzugtesten 10–40 nm. Darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn die spezifische Oberfläche des porösen anorganischen Materials so groß wie möglich ist, um soviel Enzym wie möglich zu immobilisieren, genauer gesagt, soll diese mehr als 20 m²/g betragen. Die Form des für die Immobilisierung verwendeten Trägers ist nicht speziell eingeschränkt, solange dieser Porosität besitzt; er ist jedoch bevorzugt kugelförmig in dem Fall, in dem das immobilisierte Enzym für den Auffülltyp des Reaktionsgefäßes hergestellt wird. In Anbetracht der Durchführbarkeit bei der Auftrennung des immobilisierten Enzyms oder des erzeugten Druckabfalls, wenn Fluid durch den Reaktor des gepackten Bett-Typs fließt, ist die Partikelgröße bevorzugt, jedoch nicht limitiert auf 10 μm – 5 mm, bevorzugt 100 μm – 2 mm, mit einer relativ engen Größenverteilung.
(2) Immobilisierung der (S)-Hydroxynitrillyase im Träger
Die Immobilisierung der (S)-Hydroxynitrillyase in einem Träger kann wie folgt durchgeführt werden. Lösung, die (S)-Hydroxynitrillyase, wie in (1) oben hergestellt, enthält, wird auf einen pH innerhalb eines Bereiches eingestellt, der die Enzymaktivität bewahrt; dann wird diese mit dem Immobilisierungsträger von (1) oben gemischt, gerührt und stehen gelassen, bis die Absorptionsrate maximiert ist, wodurch die Immobilisierung ermöglicht wird. Normalerweise wird die maximale Absorptionsrate erreicht, wenn die Lösung gerührt und für 6 – 24 Stunden stehen gelassen wird. Es ist weiterhin bevorzugt, die Salzkonzentration während der Immobilisierung niedrig einzustellen, da die Absorption des Enzyms in den Träger dazu neigt, inhibiert zu werden, wenn die Konzentration eines Salzes ansteigt. Beispielsweise ist die Konzentration eines bei der Immobilisierung zu verwendenden Salzes 0,5 M oder geringer, bevorzugt 0,1 M oder geringer. Dann, nach der Immobilisationsbehandlung, kann das resultierende, immobilisierte Enzym durch Filtration oder dergleichen abgetrennt werden. Weiterhin kann Wasser, wenn es in überschießenden Mengen in dem immobilisierten Enzym enthalten ist, die Zusammenballung des Trägers im Reaktionslösungsmittel verursachen, wenn optisch aktives Cyanhydrin synthetisiert wird; es ist daher bevorzugt, das in dem immobilisierten Enzym enthaltene Wasser bis auf das Niveau der Dispergierbarkeit des Enzyms zu entfernen. Wasser aus dem immobilisierten Enzym kann unter vermindertem Druck oder mittels Lufttrocknung entfernt werden.
3. Synthese von optisch aktivem Cyanhydrin unter Verwendung des immobilisierten Enzyms der vorliegenden Erfindung
Die Synthese eines optisch aktiven Cyanhydrins unter Verwendung des immobilisierten Enzyms der vorliegenden Erfindung kann wie folgt durchgeführt werden. Zuerst werden das in (2) oben erhaltene, immobilisierte Enzym und ein reaktives Substrat zu einem Reaktionslösungsmittel hinzu gegeben und die Reaktion für 20 Minuten bis 24 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 10 bis 50°C durchgeführt, wodurch das optisch aktive Cyanhydrin synthetisiert wird. Die Reaktionszeit wird in Abhängigkeit von der Umsatzrate des Substrats in geeigneter Weise eingestellt. Nach Beendigung der Synthesereaktion wird das immobilisierte Enzym gesammelt und zur Synthese des optisch aktiven Cyanhydrins wieder verwendet. Als Substrat der Reaktion können eine Carbonylverbindung und eine Cyanogenverbindung verwendet werden. Die Carbonylverbindung, wie sie hier verwendet wird, ist ein Aldehyd oder Keton, spezifisch dargestellt durch die folgende Formel (1):
In der Formel (1) sind R₁ und R₂ (i) ein Wasserstoffatom, (ii) eine substituierte oder unsubstituierte, lineare oder verzweigtkettige, gesättigte C_1-18 Alkylgruppe, oder (iii) eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe mit einem 5-22-gliedrigen Ring. Jedoch sind R₁ und R₂ nicht zur gleichen Zeit Wasserstoffatome.
Im obigen Fall (ii), bei dem R₁ und R₂ einer substituierten Alkylgruppe entsprechen, ist der Substituent eine oder mehrere Aminogruppen, Iminogruppen, Hydroxygruppen, C_1-8-Alkoxygruppen, Halogen, Carboxylgruppen, C_3-20-Cycloalkylgruppen oder aromatische Gruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von nicht mehr als 22, in der die Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom von N, O oder S substituiert sein können (wenn der Substituent ein zyklischer Substituent ist, dann kann dieser durch ein oder mehrere Halogenatome, Hydroxygruppen, lineare oder verzweigtkettige C_1-8-Alkylgruppen oder lineare oder verzweigtkettige C_2-8-Alkenylgruppen substituiert sein).
Im obigen Fall (iii) kann die aromatische Gruppe eine heteroaromatische Gruppe sein, bei der nicht mehr als 4 Ringglieder durch N, O und/oder S substituiert sind. Weiterhin, wenn R₁ und R₂ einer substituierten aromatischen Gruppe entsprechen, ist der Substituent eine oder mehrere Aminogruppen, Iminogruppen, Hydroxygruppen, C_1-8-Alkoxygruppen, Allyloxygruppen, Halogen, Carboxylgruppen oder lineare oder verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von nicht mehr als 22 (wobei eine aromatische Gruppe durch wenigstens 2 Substituenten substituiert sein kann).
Weiterhin beinhaltet die Cyanogenverbindung als Substrat, das zu dem Reaktionssystem zugegeben wird, ohne hierauf beschränkt zu sein, Salze der Cyanwasserstoffsäure wie etwa Natriumcyanid und Kaliumcyanid, und Cyanhydrine wie etwa Acetoncyanhydrin, solange diese Verbindung ein Cyanidion (CN^–)erzeugt.
Weiterhin ist es bevorzugt, ein Reaktionslösungsmittel zu verwenden, das ein geringfügig wasserlösliches oder wasserunlösliches organisches Lösungsmittel als Hauptbestandteil beinhaltet, wenn berücksichtigt wird, dass in Gegenwart großer Mengen Wasser im Reaktionssystem eine Neigung zur Racemisierung eines optisch aktiven Cyanhydrins, das durch die Enzymreaktion erzeugt wurde, auftritt, oder dass die Effizienz der Produktion abnimmt, wenn ein Aldehyd oder Keton mit geringer Wasserlöslichkeit als Ausgangsmaterial verwendet wird. Ein solches organisches Lösungsmittel kann ohne irgendeine spezifische Einschränkung verwendet werden, solange es nicht die Synthesereaktion eines optisch aktiven Cyanhydrins unter Verwendung des Enzyms beeinflusst. Es kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den physikalischen Eigenschaften des als Ausgangsmaterial der Synthesereaktion zu verwendenden Aldehyds oder Ketons und/oder den physikalischen Eigenschaften eines Produkts, dem Cyanhydrin, ausgewählt werden. Zur Spezifizierung sind Beispiele für das Reaktionslösungsmittel lineare oder verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, die halogeniert sein können (z.B. Pentan, Hexan, Toluol, Xylol, Dichlormethan, etc.); lineare oder verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte aliphatische oder aromatische Alkohol-Lösungsmittel, die halogeniert sein können (z.B. Isopropylalkohol, n-Butanol, iso-Butanol, t-Butanol, Hexanol, Cyclohexanol, n-Amylalkohol, etc.); lineare oder verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Ether-Lösungsmittel, die halogeniert sein können (z.B. Diethylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Methyl-t-butylether, etc.); lineare oder verzweigte oder zyklische gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Ester-Lösungsmittel, die halogeniert sein können (z.B. Methylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat, Methylpropionat, etc.), wobei diese Lösungsmittel alleine oder in Kombination verwendet werden können. Die verwendeten Lösungsmittel können Wasser oder einen wässrigen Puffer enthalten oder mit diesem gesättigt sein.
Weiterhin können in dem Reaktionssystem eine der beiden oder beide der folgenden Behandlungen durchgeführt werden, um die Sauerstoffkonzentration in dem synthetischen Reaktionssystem eines optisch aktiven Cyanhydrins zu senken, bzw. um Hydrochinon oder von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen (z.B. Benzochinon, Chinhydron, etc.) zu vermindern, um dadurch das immobilisierte Enzym zu stabilisieren.
Um genauer zu sein, bedeutet die Behandlung zur Verminderung der Sauerstoffkonzentration in dem Reaktionssystem eine Behandlung zur Verminderung von gelöstem Sauerstoff, indem man das Reaktionslösungsmittel in Kontakt mit einem Gas bringt, das die Reaktion nicht beeinflusst (z.B. Stickstoff, Argon, Helium, etc.) und den gelösten Sauerstoff in dem Reaktionslösungsmittel durch dieses Gas ersetzt. Diese Behandlung kann in der üblichen Weise durchgeführt werden. Beispielsweise wird das Reaktionslösungsmittel bei dieser Behandlung in einen Behälter mit einem Rührwerk gefüllt und beim Rühren, wie oben beschrieben, durch Zufuhr eines inaktiven Gases an die Flüssigkeit begast. Spezifisch kann die Behandlung durch Gaszufuhr des inaktiven Gases in einem Belüftungsvolumen von 1 ml bis 10 l pro Minute pro Liter Reaktionslösungsmittel für 1 Minute bis 1 Stunde durchgeführt werden, bevorzugt mit 10 ml bis 5 l pro Minute pro Liter des Reaktionslösungsmittels für 5 Minuten bis 30 Minuten. Es kann auch durchgeführt werden, indem man das Reaktionslösungsmittel in einer Atmosphäre des inaktiven Gases destilliert. Es kann auch durchgeführt werden, indem man ein Deoxidationsmittel wie etwa Natriumsulfit und Hydrosulfit zugibt. Es kann weiterhin auch durchgeführt werden, indem man die Reaktion auslöst, während man das inaktive Gas in die Gasphase des Reaktionsbehälters im oben beschriebenen Belüftungsvolumen einleitet.
Die Behandlung zur Verminderung der Konzentration von Hydrochinon und von von Hydrochinon abgeleiteten Verbindungen in dem Reaktionssystem wird durchgeführt, indem das Reaktionslösungsmittel destilliert und dieses von in dem Reaktionslösungsmittel enthaltenem Hydrochinon oder von von Hydrochinon abgeleiteten Verbindungen abgetrennt wird. Die Konzentration von Hydrochinon und von von Hydrochinon abgeleiteten Verbindungen wird auf weniger als 40 ppm, bevorzugt weniger als 1 ppm, reduziert. Die Destillation kann unter normalem Druck oder reduziertem Druck unter Temperaturbedingungen durchgeführt werden, unter denen Hydrochinon und von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen zurückbleiben und nur das Reaktionslösungsmittel abdestilliert wird. Alternativ kann die Behandlung durch Zugabe eines Adsorptionsmittels (z.B. Aktivkohle) in das Reaktionslösungsmittel, das Hydrochinon und von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen enthält, durchgeführt werden, oder dadurch, dass das Lösungsmittel durch z.B. eine Säule geleitet wird, die mit dem Adsorptionsmittel gefüllt ist, oder indem das Reaktionslösungsmittel für eine gewisse Zeitspanne gemäß anderen Verfahren mit dem Adsorptionsmittel in Kontakt gebracht wird. In diesem Fall kann die Menge an Adsorptionsmittel in Abhängigkeit von der Adsorptionskapazität des Mittels in geeigneter Weise bestimmt werden.
Das erzeugte, optisch aktive Cyanhydrin kann dann mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder dergleichen gemessen und quantifiziert werden.
Beispiele
Ausführungsformen der Erfindung werden unten beschrieben.
Beispiel 1: Präparation von (S)-Hydroxynitrillyase
(S)-Hydroxynitrillyase wurde unter Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae als Wirt mittels Gentechnik wie folgt hergestellt. Zuerst wurde Gesamt-mRNA in der üblichen Weise aus Blättern von Maniok (Manihot esculenta) extrahiert. Dann wurde zur Herstellung von cDNA eine cDNA-Synthese durchgeführt, bei der die erhaltene mRNA als Matrize verwendet wurde. Auf der anderen Seite wurden die unten beschriebenen Primer auf Basis der Sequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens, erhalten aus Maniok und beschrieben in „Arch. Biochem. Biophys. 311, 496–502 (1994)", synthetisiert.
Die PCR wurde unter Verwendung der obigen cDNA als Matrize und mit den synthetisierten Primern (90°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 60 sec; 35 Zyklen insgesamt) durchgeführt, um das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen zu erhalten. Die Analyse der Gensequenz zeigte, dass sie mit der in dem Dokument dargestellten Sequenz übereinstimmte.
Es wurde dann der episomale Hefe-Expressionsvektor YEp352-GC hergestellt, indem das erhaltene PCR-Fragment zwischen dem YEp352-GAP-Promotor und -Terminator eingesetzt wurde. Dieser Vektor wurde in der üblichen Weise in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae Inv-Sc1 transformiert, und der rekombinante Hefestamm YEp352-GC-S2, der den Expressionsvektor YEp352-GC enthält, wurde erhalten, indem ein Stamm selektiert wurde, der in einem Minimal-Selektionsmedium ohne Uracil wächst.
Dann wurde der erhaltene rekombinante Hefestamm YEp352-GC-S2 für 24 Stunden in YNBDCas Flüssigmedium (6,7 g/l Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäure (Difco), 20 g/l Glukose, 20 g/l Casaminosäure, 40 mg/ml L-Tryptophan) inkubiert, wobei er (S)-Hydroxynitrillyase in den Zellen produzierte. Die mikrobiellen Zellen wurden mittels Zentrifugation aus dem Kulturmedium des rekombinanten Pilzes gesammelt und unter Verwendung einer Perlmühle aufgebrochen. Die Suspension der aufgebrochenen mikrobiellen Zellen wurde zentrifugiert, um einen Rohextrakt herzustellen, und dieses Produkt, grob gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, wurde als (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung für die folgenden Versuche verwendet.
Beispiel 2: Überprüfung des Immobilisierungsträgers für (S)-Hydroxynitrillyase
(1) Immobilisierung auf dem gesinterten Tonträger und dem Siliciumdioxidträger
(S)-Hydroxynitrillyase, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde in den verschiedenen Immobilisierungsträgern des Enzyms immobilisiert und der Typ, des Trägers untersucht, der für die Immobilisierung des Enzyms geeignet war. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte durch Zugabe von 0,1 g der verschiedenen Träger zu 0,5 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 64 U/ml, 0,02 M HEPES-Na-Puffer (pH 6,0)) und Bewegen des Ansatzes für 24 Stunden bei 4°C, wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an jeden der Träger ermöglicht wurde. Dann wurde die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger überprüft. Die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger wurde durch Messung der verbleibenden (S)-Hydroxynitrillyase-Aktivität (verbleibende Aktivität) im flüssigen Überstand nach der Immobilisierung und der (S)-Hydroxynitrillyase-Aktivität (Kontrollaktivität) in einer Kontrolle (einem Enzymgemisch ohne den Träger) und Einsetzen der gemessenen Werte in die folgende Formel berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Enzymaktivität wurde durch Messung der Änderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 249,6 nm berechnet, wenn DL-Mandelonitril als Substrat von dem Enzym zerlegt wird, um Benzaldehyd zu erzeugen. Eine Einheit (Unit, U) der Aktivität wurde als Äquivalent zur Erzeugung von 1 μmol Benzaldehyd pro Minute definiert.
Formel (1)
Tabelle 1: Absorptionsrate des Enzyms bei verschiedenen Immobilisierungsträgern
Während die Absorptionsraten an zuvor als Immobilisierungsträger für (S)-Hydroxynitrillyase bekannten Immobilisierungsträgern aus Cellulose-Materialen 20,19% (gezeigt für Avicel Cellulose Microcristalline, (Merck)) bzw. 9,75% (für Cellulose w-200G (Nippon Paper Industries)) betrugen, betrug die Absorptionsrate bei dem gesinterten Tonträger Toyonite 200 (Toyo Denka Kogyo) 100%, und die Absorptionsrate bei Chromatography Silica Gel FL60D (Fuji Silysia Chemical) betrug 99,88%.
(2) Immobilisierung in einem Träger, der andere poröse, anorganische Materialien umfasst
Die Immobilisierung von (S)-Hydroxynitrillyase in Trägern, die ein breiteres Spektrum an porösen anorganischen Materialien umfassen, wurde untersucht. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte mittels derselben Arbeitsabläufe wie in (1) oben. Das bedeutet, es wurde 0,1 g des jeweiligen Trägers zu 1 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 35 U/ml, 0,02 M HEPES-Na Puffer (pH 6,0)) hinzu gegeben, gefolgt von 24 Stunden Bewegen des Ansatzes bei 4°C, wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an dem jeweiligen Träger ermöglicht wird. Es wurde dann die Absorptionsrate des Enzymproteins an dem Träger untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Absorptionsrate des Enzyms in verschiedenen Immobilisierungsträgern
Die Absorptionsrate des Aluminiumoxidträgers NeoBead DL (Mizusawa Chemical) betrug 46,4 %; bei dem Gegenstück MIZUKASIEVES Y-540 Y-Typ Zeolite (Mizusawa Chemical) betrugt sie 46,45%. Somit wurde herausgefunden, dass ein Aluminiumoxidträger und ein Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger jeweils Immobilisierungsträger mit höheren Absorptionsraten als vorherige Träger aus Cellulose-Materialien darstellen.
Beispiel 3: Wirkung der Porengröße auf die Absorptionsrate des Enzyms
Die Beziehung zwischen der Porengröße eines Trägers und der Absorptionsrate des Enzyms wurde unter Verwendung von Toyonite 200, einem gesinterteerten Tonträger, und Micro Bead Silica Gel, einem Siliciumdioxidträger, untersucht. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte in derselben Weise wie in (1) oben. Das bedeutet, es wurden 0,05 g eines jeden Trägers zu 1 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 50 U/ml, 0,02 M HEPES-Na Puffer (pH 6,0)) hinzu gegeben, gefolgt von einer Bewegung des Ansatzes für 24 Stunden bei 4°C, wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins bei jedem der Träger ermöglicht wurde. Dann wurde die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger bestimmt. Die Ergebnisse für die Verwendung von Toyonite 200 sind in Tabelle 3 und 1 dargestellt, die Ergebnisse für die Verwendung von Micro Bead Silica Gel sind in Tabelle 4 und 2 dargestellt.
Tabelle 3: Wirkung der Porengröße auf die Absorptionsrate bei Toyonite 200
Tabelle 4: Wirkung der Porengröße auf die Absorptionsrate bei Micro Bead Silica Gel
Wie aus Tabelle 3 und 1 ersichtlich ist, wurden im Fall von Toyonite 200, dem gesinterten Tonträger, im Bereich einer Porengröße von 28 bis 60 nm relativ hohe Absorptionsraten erhalten, wobei die höchste Absorptionsrate unter diesen bei etwa 38 nm erhalten wurde. Im Fall von Micro Bead Silica Gel, einem Siliciumdioxidträger, wurden im Bereich einer Porengröße von 18,9 bis 50 nm relativ hohe Absorptionsraten erhalten, wobei die höchste Absorptionsrate unter diesen bei etwa 20 nm erhalten wurde.
Beispiel 4: Wirkung des pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate des Enzyms und die Ausbeute des optisch aktiven Cyanhydrins
Die Wirkung des pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate des Enzyms und die Ausbeute des optisch aktiven Cyanhydrins wurden unter Verwendung von Micro Bead Silica Gel 300A, einem Siliciumdioxidträger als Immobilisierungsträger, untersucht. Zuerst wurden je 0,05 g des Trägers zu 1 ml eines Citrat-Phosphat-Puffers, enthaltend (S)-Hydroxynitrillyase (Aktivität: 50 U/ml), hinzu gegeben, der auf verschiedene pH-Werte im Bereich von pH 3,81 bis pH 7,73 eingestellt wurde; danach wurden die Ansätze für 24 Stunden bei 4°C bewegt, wodurch die Adsorption und Immobilisierung des Enzymproteins bei jedem Träger erfolgte. Die Absorptionsrate wurde dann entsprechend der zuvor beschriebenen Weise überprüft.
Nachfolgend wurde das immobilisierte Enzym, das bei den jeweiligen pH-Werten präpariert worden war, durch Filtration gesammelt, dann mit 0,15 M Natriumcitratpuffer (pH 5,0) gewaschen und stehen gelassen, bis das immobilisierte Enzym gelöst und trocken vorlag. 2,5 ml Ethylacetat als Reaktionslösungsmittel, sowie 99 μl 3-Phenoxybenzaldehyd (0,5 mmol) und 57 μl Cyanwasserstoffsäure (1,5 mmol) als Substrat wurden zu dem erhaltenen, immobilisierten Enzym hinzu gegeben, und die Synthesereaktion des optisch aktiven Cyanhydrins wurde durch Rotieren einer Roller-Flasche mit dem Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Menge an erzeugtem (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin mittels HPLC gemessen. Die Absorptionsrate und die relative Reaktivität sind in Tabelle 5 und 3 dargestellt, wobei die Fläche des HPLC-Peaks, die der maximalen, bei pH 5,44 gebildeten Menge an (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin entspricht, als 100 gesetzt wird.
Tabelle 5: Wirkung des pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung des Enzyms auf die Absorptionsrate und die Ausbeute an optisch aktivem Cyanhydrin
Wie aus Tabelle 5 und 3 ersichtlich, war die Absorptionsrate an Micro Bead Silica Gel 300A in einem relativ weiten Bereich von pH 4,83–6,79 günstig, wobei der Maximalwert der Ausbeute bei pH 5,5 gezeigt wurde.
Beispiel 5: Wirkung der Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate des Enzyms
Die Wirkung der Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate des Enzyms wurde unter Verwendung von Micro Bead Silica Gel 300A, einem Siliciumdioxidträger als Immobilisierungsträger, untersucht. Jeweils 0,05 g des Trägers wurden zu 1 ml an Citrat-Phosphatpuffer, enthaltend (S)-Hydroxynitrillyase (Aktivität: 50 U/ml) hinzu gegeben, der auf verschiedene Konzentrationen im Bereich von 0,02 bis 0,5 M eingestellt wurde, gefolgt von einem Bewegen des Ansatzes für 24 Stunden bei 4°C, wobei die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an den jeweiligen Träger ermöglicht wird. Die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger wurde dann entsprechend der zuvor beschriebenen Weise untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und 4 dargestellt.
Tabelle 6: Wirkung der Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung des Enzyms auf die Absorptionsrate
Wie aus Tabelle 6 und 4 ersichtlich ist, wurde herausgefunden, dass die Absorptionsrate bei 0,02 M am höchsten war, und weiterhin, dass die Absorptionsrate umso höher wurde, je niedriger die Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung des Enzyms war.
Beispiel 6: Synthesereaktion, die bearbeitet wurde, um die Sauerstoffkonzentration und die Hydrochinonkonzentration in dem Reaktionssystem zu vermindern
Nach Entfernen des Hydrochinons durch Destillation wurde die Synthese von (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin unter Verwendung von Diisopropylether durchgeführt, der mittels Stickstoff gereinigt und von Sauerstoff befreit worden war.
235,8 ml Diisopropylether, 11,9 g 3-Phenoxybenzaldehyd, 64 ml Cyanwasserstoff-Diisopropylether-Lösung (37,85 g HCN/500ml) wurden zu dem immobilisierten Enzym hinzu gegeben, das in derselben Weise wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Toyonite 200, dem gesinterten Tonträger als Immobilisierungsträger, hergestellt worden war, worauf dann eine Bewegung des Ansatzes bei 25°C folgte.
Das immobilisierte Enzym wurde abgetrennt, als die Reaktion weitgehend abgeschlossen war; es wurden dann Lösungsmittel und Substrat derselben Menge wie oben zugegeben, um die Reaktion wiederholt durchzuführen. Wie in 5 dargestellt, war keine Verminderung der Reaktionsrate zu beobachten, auch wenn die Reaktion 4mal wiederholt wurde. Weiterhin sind die Umsatzrate und die optische Reinheit des erzeugten (S)-3-Phenoxybenzaldehyds in Tabelle 7 gezeigt, wenn die Reaktion jeweils abgeschlossen war. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass keine Verminderung der optischen Reinheit auftrat.
Tabelle 7: Umsatzrate und optische Reinheit in jedem Reaktionszyklus
Beispiel 7: Wiederverwertbarkeit des immobilisierten Enzyms
1,5 g Micro Bead Silica Gel 200A (Porengröße: 20 nm) wurde zu 14 ml (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 43 U/ml), erhalten in dem Verfahren wie in Beispiel 1, hinzu gegeben, dann leicht geschüttelt, um dadurch die Immobilisierung des Enzyms zu ermöglichen. Die immobilisierten Enzyme wurden durch Filtration gesammelt, und die überschüssige Menge an Wasser wurde an der Luft getrocknet, um diese zu entfernen. 5 ml t-Butylmethylether, enthaltend 1,5 M an Cyanwasserstoff wurde zu diesem immobilisierten Enzym hinzu gegeben, wonach Benzaldehyd zugegeben wurde, bis die Konzentration 1 M erreicht hatte. Die Synthese von (S)-Mandelonitril wurde mittels Rühren und Mischen bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurden die immobilisierten Enzyme und die Reaktionslösung getrennt und die Reaktionslösung durch HPLC analysiert. Die Analyse zeigte an, dass 1,5 Stunden nach dem Reaktionsstart (S)-Mandelonitril mit einer optischen Reinheit von nicht weniger als 99,9%ee bei der Umsatzrate von 97,8% für Benzaldehyd erreicht worden war. Lösungsmittel und Substrat derselben Menge wie zuvor erwähnt, wurden zu dem abgetrennten, immobilisierten Enzym hinzu gegeben, um die Reaktion wiederholt durchzuführen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurden die hohe Umsatzrate und die hohe optische Reinheit des erzeugten (S)-Mandelonitrils trotz der wiederholten Reaktionen beibehalten. Wie in der obigen Beschreibung dargestellt, wurde herausgefunden, dass das immobilisierte Enzym der Erfindung bei der Synthesereaktion optisch aktiver Cyanhydrine wieder verwendbar und in einem großen Ausmaß hochstabil ist.
Tabelle 8: Umsatzrate und optische Reinheit bei jedem Reaktionszyklus
VORTEIL DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein immobilisiertes Enzym bereit, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase bei hoher Absorptionsrate immobilisiert wird, ein Verfahren zur Herstellung des immobilisierten Enzyms, sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen unter Verwendung der immobilisierten Enzyme.
Freier Text des Sequenzprotokolls:
SEQ ID NO:1: Synthese-DNA
SEQ ID NO:2: Synthese-DNA
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immobilisiertes Enzym, welches (S)-Hydroxynitrillyase umfaßt, die von Manihot esculenta abgeleitet ist, adsorbiert auf einem Träger, wobei (i) der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus gesintertem Tonträger, einem Siliciumdioxidträger, einem Aluminiumoxidträger und einem Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, (ii) der Träger eine Porengröße von 10–80 nm und eine Oberfläche von mehr als 20 m2/g hat und (iii) das immobilisierte Enzym durch Adsorbieren der (S)-Hydroxynitrillyase auf dem Träger bei einem pH-Wert im Bereich von 4,83 bis 6,79 hergestellt ist.
Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 1, wobei der Träger eine Porengröße von 10–60 nm hat.
Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms, bei dem man (S)-Hydroxynitrillyase, die von Manihot esculenta abgeleitet ist, auf einem Träger adsorbiert, wobei (i) der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus gesintertem Tonträger, einem Siliciumdioxidträger, einem Aluminiumoxidträger und einem Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, (ii) der Träger eine Porengröße von 10–80 nm und eine Oberfläche von mehr als 20 m²/g hat und (iii) das immobilisierte Enzym durch Adsorbieren der (S)-Hydroxynitrillyase auf dem Träger bei einem pH-Wert im Bereich von 4,83 bis 6,79 hergestellt ist.
Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms nach Anspruch 3, wobei der Träger eine Porengröße von 10–60 nm hat.
Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem (S)-Cyanhydrin, bei dem man das immobilisierte Enzym nach Anspruch 1 oder 2 in Kontakt mit einer Carbonylverbindung und einer Cyanogenverbindung in der Gegenwart eines geringfügig wasserlöslichen organischen Lösungsmittels bringt.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven (S)-Cyanhydrins nach Anspruch 5, wobei das immobilisierte Enzym nach dem Abschluß einer Reaktion zur Herstellung eines optisch aktiven Cyanhydrins zur Wiederverwendung aus einem Reaktionsgemisch gesammelt wird.