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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem
(S)-Hydroxynitrillyase
aus Manihot esculenta auf einem Träger mit einem hohen Absorptionspotential
immobilisiert ist, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms,
sowie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Cyanhydrin
unter Verwendung dieses immobilisierten Enzyms.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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(S)-Hydroxynitrillyase
ist nützlich
als ein Enzym zur Synthese optisch aktiver Cyanhydrine. In organischen
Lösungsmittelreaktionssystemen,
wie sie gewöhnlich
verwendete enzymatische Synthesen dieser Verbindungen darstellen,
werden die Enzyme z.B. als immobilisierte Enzyme verwendet, um die
Enzyme in dem Reaktionssystem zu verteilen und die Reaktion effektiv
durchzuführen.
Als ein Beispiel, in dem (S)-Hydroxynitrillyase immobilisiert wurde,
ist die Immobilisierung an einem Mikrozellulosepulver und an Nitrocellulose
beschrieben worden. Jedoch besitzen diese Celluloseträger eine
niedrige Absorptionsrate des Enzyms, was das Hindernis begründet, dass
enorme Mengen an Träger
nötig sind,
um das für
die Reaktion benötigte
Enzym zu immobilisieren.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein immobilisiertes
Enzym, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in einem
Immobilisierungsträger
bei einer hohen Absorptionsrate immobilisiert wird, ein Verfahren
zur Herstellung dieses immobilisierten Enzyms, sowie ein Verfahren
zur Herstellung von optisch aktivem Cyanhydrin unter Verwendung
dieses immobilisierten Enzyms bereitzustellen.
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Wehtje
et al., 1993, Biotechnology and Bioengineering, Band 41, Seiten
171–178,
berichten, dass es möglich
ist, den Verlust von Enzymaktivität bei Verwendung eines festen
Trägers
zu vermeiden, indem Proteine und Poly(ethylenglykol) zugegeben werden,
wogegen Aminosäuren,
monomere Kohlenhydrate und Polysaccharide keine Wirkung hatten.
Diese Untersuchung schlussfolgerte, dass die Menge an Zusatzstoff,
die zur Stabilisierung von Enzymen benötigt wird, abhängig von
der Struktur des Trägers
ist, wobei für
einen Träger höherer Porosität mehr Zusatzstoff
benötigt
werde. Die
US 5,177,242 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven (S)-Cyanhydrinen
durch Umsetzung von Aldehyden mit Cyanwasserstoffsäure in Gegenwart
des katalytischen Enzyms S-Oxynitrilase und eines Lösungsmittels,
wenn die Lösung
durch eine chemisch aktivierte, poröse Membran geleitet wird, an
die das S-Oxynitrilase-Enzym chemisch gebunden worden war.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben umfangreich und intensiv
geforscht, um die obigen Probleme zu lösen und haben nun herausgefunden,
dass (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta mittels Verwendung
eines porösen,
anorganischen Trägers,
wie etwa eines gesinterten Tonträgers,
eines Siliciumdioxidträgers,
eines Aluminiumoxidträgers
und eines Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Trägers, als Immobilisierungsträger für das Enzym
bei hoher Absorptionsrate immobilisiert werden kann, wodurch die
vorliegende Erfindung fertig gestellt wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem
(S)-Hydroxynitrillyase
aus Manihot esculenta in einem Träger immobilisiert wird, der
ein poröses
anorganisches Material (z.B. den gesinterten Tonträger, den
Siliciumdioxidträger,
den Aluminiumoxidträger
oder den Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, mit einer Porengröße von 10–80 nm)
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung
des immobilisierten Enzyms, bei dem (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot
esculenta in einem Träger
immobilisiert wird, der ein poröses anorganisches
Material umfasst (z.B. den gesinterten Tonträger, den Siliciumdioxidträger, den
Aluminiumoxidträger
oder den Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger, mit
der Porengröße von 10–80 nm).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
eines optisch aktiven Cyanhydrins, bei dem man das immobilisierte
Enzym in Kontakt mit einer Carbonylverbindung und einer Cyanogenverbindung
in der Gegenwart eines geringfügig
wasserlöslichen
oder wasserunlöslichen
organischen Lösungsmittels
bringt. Das hierbei verwendete, immobilisierte Enzym kann zur Wiederverwendung
aus dem Reaktionsgemisch gesammelt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun wie folgt im Detail beschrieben.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
die Wirkung der Porengröße eines
Immobilisierungsträgers
auf die Absorptionsrate des Enzyms, wenn Toyonite 200 als Träger verwendet
wird.
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2 zeigt
die Wirkung der Porengröße eines
Immobilisierungsträgers
auf die Absorptionsrate des Enzyms, wenn Micro Bead Silicagel als
Träger
verwendet wird.
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3 zeigt
die Wirkung des pH auf die Absorptionsrate und Reaktivität des Enzyms,
wenn Micro Bead Silicagel 300A als Immobilisierungsträger verwendet
wird.
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4 zeigt
die Wirkung der Konzentration eines Puffers auf die Absorptionsrate
des Enzyms, wenn Micro Bead Silicagel 300A als Immobilisierungsträger verwendet
wird.
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5 zeigt
Veränderungen
bei der Umsatzrate in jedem Reaktionszyklus.
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DETAILIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes Enzym, bei dem
(S)-Hydroxynitrillyase
aus Manihot esculenta in/auf einem Träger adsorbiert wird, der ein
poröses
anorganisches Material umfasst. Das immobilisierte Enzym der Erfindung
ist dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsrate des Enzyms
in den Träger
höher ist
als die des konventionellen immobilisierten Enzyms, bei dem das
Enzym an einem Cellulose-Träger
adsorbiert wird. Folglich besitzt das immobilisierte Enzym der Erfindung
eine bemerkenswert hohe Adsorptionsrate an dem Immobilisierungsträger. Dieses
immobilisierte Enzym kann gemäß unten
stehender Beschreibung hergestellt werden.
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1. Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase
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(S)-Hydroxynitrillyase,
die Gegenstand der Immobilisierung ist, kann durch Extraktion aus
biologischen Geweben (z.B. einem Pflanzengewebe, das das Enzym enthält) oder
mittels Gentechnik hergestellt werden. Es ist bevorzugt, (S)-Hydroxynitrillyase
im Bezug auf seine dauerhafte Bereitstellung durch gentechnische
Verfahren herzustellen. Die Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase durch gentechnische
Verfahren kann z.B. wie folgt erfolgen.
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(1) Quelle eines Gens,
das (S)-Hydroxynitrillyase codiert
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Quelle
eines Gens, das (S)-Hydroxynitrillyase codiert (hier im folgenden
auch als „(S)-Hydroxynitrillyase-Gen
bezeichnet) ist Manihot esculenta.
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(2) Klonierung des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens
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Das
(S)-Hydroxynitrillyase-Gen kann wie folgt aus der Quelle aus (1)
oben kloniert werden. Zunächst wird
in der üblichen
Weise cDNA hergestellt. Auf der anderen Seite werden Primer für die Amplifizierung
des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens durch PCR entworfen und basierend
auf der bekannten Nukleotidsequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens
synthetisiert. Beispielsweise können
Primer für
die Amplifikation des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens, stammend aus
Manihot esculenta, wie folgt auf Basis der in „Arch. Biochem. Biophys. 311, 496–502 (1994)" beschriebenen Nukleotidsequenz
erstellt werden.
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Das
(S)-Hydroxynitrillyase-Gen wird dann mit den synthetisierten Primern
für die
Amplifikation durch PCR amplifiziert, wobei hierfür cDNA,
die aus dem Organismus aus (1) oben präpariert wurde, in der üblichen Weise
als Matrize verwendet wird. Nach Ligation des resultierenden, mittels
PCR amplifizierten Fragments an einen geeigneten Vektor wird die
Nukleotidsequenz bestätigt,
wobei diejenige mit der Nukleotidsequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens als ein Klon
betrachtet wird, der das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält.
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(3) Konstruktion eines
(S)-Hydroxynitrillyase-Expressionsvektors
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Die
Konstruktion eines (S)-Hydroxynitrillyase-Expressionsvektors kann
durchgeführt
werden, indem eine Region ausgeschnitten wird, die für (S)-Hydroxynitrillyase
aus dem das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen
enthaltenden Klon, der in (2) oben erhalten wurde, codiert, und
diese Region an einen geeigneten Expressionsvektor ligiert wird.
Der Expressionsvektor gemäß der hier
vorliegenden Verwendung wird in Abhängigkeit von den für die Expression
des (S)-Hydroxynitrillyase-Proteins
zu verwendenden Wirtstypen ausgewählt. In dem Fall, in dem z.B.
die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Wirt verwendet wird, können Expressionsvektoren des
Episom-Typs, einschließlich
YEp51, YEp351 und pYES2, verwendet werden; und in dem Fall, in dem
E. coli als Wirt verwendet wird, können Expressionsvektoren wie
etwa pKK223-3, pKK233-2 und pTrc99A verwendet werden.
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(4) Herstellung einer
Transformanten, die das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält
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Eine
Transformante, die das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen enthält, kann
erzeugt werden, indem der (S)-Hydroxynitrillyase-Gen-Expressionsvektor,
der in (3) oben erhalten wurde, in eine Wirtszelle transformiert wird.
Im Detail kann die Transformation der Hefe Saccharomyces cerevisiae
durch Verfahren wie etwa Elektroporation, das Spheroplast-Verfahren
und das Lithiumacetat-Verfahren durchgeführt werden; die Transformation
von E. coli kann durch Verfahren wie das Calciumchlorid-Verfahren
und Elektroporation durchgeführt werden.
Eine gewünschte
Transformante kann nach der Durchführung der Transformation selektiert
werden, indem Transformanten auf einem geeigneten Selektionsmedium
angeimpft werden und ein gewachsener Stamm ausgewählt wird.
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(5) Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyase-Protein
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(S)-Hydroxynitrillyase-Protein
kann erhalten werden, indem die Transformante, die in (4) oben erhalten wurde,
in einem Medium kultiviert und die Kultur geerntet wird. Der Begriff „Kultur" in der hier vorliegenden
Verwendung meint ein beliebiges von einem Kulturüberstand, einer kultivierten
Zelle oder Mikrobenzelle, oder ein aufgeschlossenes Material der
kultivierten Zelle oder Mikrobenzelle. Ein Verfahren zur Kultivierung
der Transformante in einem Medium kann in einer üblichen Weise, wie sie für die Kultur
eines Wirtes verwendet wird, durchgeführt werden.
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Beispielsweise
ist das Medium zur Kultur einer mit Hefe als Wirt erhaltenen Transformante
nicht speziell eingeschränkt,
solange ein eingeführtes
(S)-Hydroxynitrillyase-Gen stabil in dem Wirt aufrecht erhalten wird,
und zur gleichen Zeit (S)-Hydroxynitrillyase durch die Genexpression
in dem Wirt produziert wird. Es ist bevorzugt, eine Kohlenstoffquelle
und/oder eine Aminosäurezusammensetzung
und/oder eine Zusatzstoff-Zusammensetzung einzustellen, die in Abhängigkeit
von den Eigenschaften des Wirts und eines eingeführten Selektionsmarker-Gens für die Kultur
verwendet werden soll. Die Kultur wird fortgesetzt, bis die Produktion
von (S)-Hydroxynitrillyase durch die mikrobielle Wirtszelle unter
Temperatur- und pH-Bedingungen aufhört, bei denen das Wachstum
des Wirts nicht inhibiert wird (normalerweise 30°C, pH 4–8).
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Wenn
(S)-Hydroxynitrillyase-Protein nach der Kultivierung in der Mikrobenzelle
produziert wird, wird das Protein durch Zerstörung der Mikrobenzelle oder
Zelle extrahiert. Wenn das Enzymprotein bei der Produktion außerhalb
der Mikrobenzelle angereichert wird, kann die Kulturflüssigkeit
darüber
hinaus so verwendet werden wie sie ist, oder die Mikrobenzelle oder
Zelle wird durch Zentrifugation oder dergleichen entfernt. Das (S)-Hydroxynitrillyase-Protein
kann dann aus der Kultur gereinigt werden, indem allgemeine biochemische Verfahren
zur Isolierung und Reinigung von Proteinen, wie etwa Ammoniumsulfat-Präzipitation,
Gelchromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie
und Hydrophobizitäts-Chromatographie,
alleine oder gegebenenfalls in Kombination eingesetzt werden.
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2. Immobilisierung von
(S)-Hydroxynitrillyase
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(1) Träger zur Immobilisierung von
(S)-Hydroxynitrillyase
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Verschiedene
Träger,
die poröse
anorganische Materialien umfassen, können als Immobilisierungsträger für (S)-Hydroxynitrillyase
verwendet werden. Derartige Träger
sind gesinterte Tonträger,
Siliciumdioxidträger,
Aluminiumoxidträger
und Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger.
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Die
gesinterten Tonträger
bezeichnen einen porösen
Träger,
der durch Granulieren und Sintern von Silikat-Rohmaterialien (z.B.
Mineralien der Kaolinit-Gruppe einschließlich Kaolinit, Dickit, Nacrit
und Halloysit; und Tone einschließlich Pyrophyllit, Montmorillonit,
Sericit, Talkum und Chlorit) erhalten wird. Spezifischer ausgedrückt, sind
Toyonite200 (Toyo Denka Kogyo) und Toyonite200A (Toyo Denka Kogyo)
einbezogen.
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Der
Siliciumdioxidträger
bezeichnet einen porösen
Träger
mit einem großen
Oberflächenbereich,
hergestellt aus agglutinierten Mikropartikeln von Siliciumdioxid.
Spezifischer ausgedrückt,
können
Micro Bead Silica Gel (Fuji Silysia Chemical) und Chromatography
Silica Gel (Fuji Silysia Chemical) einbezogen werden.
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Der
Aluminiumoxidträger
bezeichnet einen porösen
Träger,
der ein Aluminiumoxid als den Hauptbestandteil enthält. Spezifischer
ausgedrückt,
können
NeoBead DL (Mizusawa Chemical) und γ-Alumina KHA-34 (Sumitomo Chemical)
einbezogen werden.
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Der
Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger
bezeichnet einen porösen
Träger
mit Aluminiumoxid und Siliciumdioxid als den Hauptbestandteilen.
Spezifischer ausgedrückt,
können
MIZUKASIEVES Y-540 Y-Typ Zeolite (Mizusawa Chemical), MIZUKASIEVES
13X-488 Zeolite 13X (Mizusawa Chemical), HSZ-630HOA H-Mordenite
(Tosoh) und Na-Mordenite (Catalysts & Chemical Industries) einbezogen
werden.
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Es
ist bevorzugt, Träger
auszuwählen,
die eine effektive Porengröße zur adäquaten Immobilisierung von
Enzymen besitzen, da die Absorptionsmenge des Enzyms von der Porengröße eines
Trägers
aus porösem
anorganischem Material gemäß obiger
Beschreibung abhängt.
Um genauer zu sein, beträgt
die ausgewählte
Porengröße 10–80 nm,
bevorzugt 10–60
nm, und am bevorzugtesten 10–40
nm. Darüber
hinaus ist es bevorzugt, wenn die spezifische Oberfläche des
porösen
anorganischen Materials so groß wie
möglich
ist, um soviel Enzym wie möglich
zu immobilisieren, genauer gesagt, soll diese mehr als 20 m2/g betragen. Die Form des für die Immobilisierung
verwendeten Trägers
ist nicht speziell eingeschränkt,
solange dieser Porosität
besitzt; er ist jedoch bevorzugt kugelförmig in dem Fall, in dem das
immobilisierte Enzym für
den Auffülltyp
des Reaktionsgefäßes hergestellt
wird. In Anbetracht der Durchführbarkeit
bei der Auftrennung des immobilisierten Enzyms oder des erzeugten
Druckabfalls, wenn Fluid durch den Reaktor des gepackten Bett-Typs
fließt,
ist die Partikelgröße bevorzugt,
jedoch nicht limitiert auf 10 μm – 5 mm,
bevorzugt 100 μm – 2 mm,
mit einer relativ engen Größenverteilung.
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(2) Immobilisierung der
(S)-Hydroxynitrillyase im Träger
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Die
Immobilisierung der (S)-Hydroxynitrillyase in einem Träger kann
wie folgt durchgeführt
werden. Lösung,
die (S)-Hydroxynitrillyase, wie in (1) oben hergestellt, enthält, wird
auf einen pH innerhalb eines Bereiches eingestellt, der die Enzymaktivität bewahrt;
dann wird diese mit dem Immobilisierungsträger von (1) oben gemischt,
gerührt
und stehen gelassen, bis die Absorptionsrate maximiert ist, wodurch
die Immobilisierung ermöglicht
wird. Normalerweise wird die maximale Absorptionsrate erreicht,
wenn die Lösung
gerührt
und für
6 – 24
Stunden stehen gelassen wird. Es ist weiterhin bevorzugt, die Salzkonzentration
während
der Immobilisierung niedrig einzustellen, da die Absorption des
Enzyms in den Träger
dazu neigt, inhibiert zu werden, wenn die Konzentration eines Salzes
ansteigt. Beispielsweise ist die Konzentration eines bei der Immobilisierung
zu verwendenden Salzes 0,5 M oder geringer, bevorzugt 0,1 M oder
geringer. Dann, nach der Immobilisationsbehandlung, kann das resultierende,
immobilisierte Enzym durch Filtration oder dergleichen abgetrennt
werden. Weiterhin kann Wasser, wenn es in überschießenden Mengen in dem immobilisierten
Enzym enthalten ist, die Zusammenballung des Trägers im Reaktionslösungsmittel
verursachen, wenn optisch aktives Cyanhydrin synthetisiert wird;
es ist daher bevorzugt, das in dem immobilisierten Enzym enthaltene
Wasser bis auf das Niveau der Dispergierbarkeit des Enzyms zu entfernen.
Wasser aus dem immobilisierten Enzym kann unter vermindertem Druck
oder mittels Lufttrocknung entfernt werden.
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3. Synthese
von optisch aktivem Cyanhydrin unter Verwendung des immobilisierten
Enzyms der vorliegenden Erfindung
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Die
Synthese eines optisch aktiven Cyanhydrins unter Verwendung des
immobilisierten Enzyms der vorliegenden Erfindung kann wie folgt
durchgeführt
werden. Zuerst werden das in (2) oben erhaltene, immobilisierte
Enzym und ein reaktives Substrat zu einem Reaktionslösungsmittel
hinzu gegeben und die Reaktion für
20 Minuten bis 24 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 10 bis
50°C durchgeführt, wodurch
das optisch aktive Cyanhydrin synthetisiert wird. Die Reaktionszeit
wird in Abhängigkeit
von der Umsatzrate des Substrats in geeigneter Weise eingestellt.
Nach Beendigung der Synthesereaktion wird das immobilisierte Enzym gesammelt
und zur Synthese des optisch aktiven Cyanhydrins wieder verwendet.
Als Substrat der Reaktion können
eine Carbonylverbindung und eine Cyanogenverbindung verwendet werden.
Die Carbonylverbindung, wie sie hier verwendet wird, ist ein Aldehyd
oder Keton, spezifisch dargestellt durch die folgende Formel (1):
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In
der Formel (1) sind R1 und R2 (i)
ein Wasserstoffatom, (ii) eine substituierte oder unsubstituierte,
lineare oder verzweigtkettige, gesättigte C1-18 Alkylgruppe,
oder (iii) eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe
mit einem 5-22-gliedrigen Ring. Jedoch sind R1 und
R2 nicht zur gleichen Zeit Wasserstoffatome.
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Im
obigen Fall (ii), bei dem R1 und R2 einer substituierten Alkylgruppe entsprechen,
ist der Substituent eine oder mehrere Aminogruppen, Iminogruppen,
Hydroxygruppen, C1-8-Alkoxygruppen, Halogen, Carboxylgruppen,
C3-20-Cycloalkylgruppen oder aromatische
Gruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von nicht mehr als 22, in der
die Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom von N, O oder S substituiert
sein können
(wenn der Substituent ein zyklischer Substituent ist, dann kann
dieser durch ein oder mehrere Halogenatome, Hydroxygruppen, lineare
oder verzweigtkettige C1-8-Alkylgruppen
oder lineare oder verzweigtkettige C2-8-Alkenylgruppen substituiert
sein).
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Im
obigen Fall (iii) kann die aromatische Gruppe eine heteroaromatische
Gruppe sein, bei der nicht mehr als 4 Ringglieder durch N, O und/oder
S substituiert sind. Weiterhin, wenn R1 und
R2 einer substituierten aromatischen Gruppe
entsprechen, ist der Substituent eine oder mehrere Aminogruppen,
Iminogruppen, Hydroxygruppen, C1-8-Alkoxygruppen,
Allyloxygruppen, Halogen, Carboxylgruppen oder lineare oder verzweigtkettige,
gesättigte
oder ungesättigte
Alkylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von nicht mehr als 22 (wobei eine
aromatische Gruppe durch wenigstens 2 Substituenten substituiert
sein kann).
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Weiterhin
beinhaltet die Cyanogenverbindung als Substrat, das zu dem Reaktionssystem
zugegeben wird, ohne hierauf beschränkt zu sein, Salze der Cyanwasserstoffsäure wie
etwa Natriumcyanid und Kaliumcyanid, und Cyanhydrine wie etwa Acetoncyanhydrin,
solange diese Verbindung ein Cyanidion (CN–)erzeugt.
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Weiterhin
ist es bevorzugt, ein Reaktionslösungsmittel
zu verwenden, das ein geringfügig
wasserlösliches
oder wasserunlösliches
organisches Lösungsmittel
als Hauptbestandteil beinhaltet, wenn berücksichtigt wird, dass in Gegenwart
großer
Mengen Wasser im Reaktionssystem eine Neigung zur Racemisierung
eines optisch aktiven Cyanhydrins, das durch die Enzymreaktion erzeugt
wurde, auftritt, oder dass die Effizienz der Produktion abnimmt,
wenn ein Aldehyd oder Keton mit geringer Wasserlöslichkeit als Ausgangsmaterial
verwendet wird. Ein solches organisches Lösungsmittel kann ohne irgendeine
spezifische Einschränkung
verwendet werden, solange es nicht die Synthesereaktion eines optisch
aktiven Cyanhydrins unter Verwendung des Enzyms beeinflusst. Es
kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit
von den physikalischen Eigenschaften des als Ausgangsmaterial der
Synthesereaktion zu verwendenden Aldehyds oder Ketons und/oder den
physikalischen Eigenschaften eines Produkts, dem Cyanhydrin, ausgewählt werden.
Zur Spezifizierung sind Beispiele für das Reaktionslösungsmittel
lineare oder verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte,
aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
die halogeniert sein können
(z.B. Pentan, Hexan, Toluol, Xylol, Dichlormethan, etc.); lineare
oder verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte aliphatische
oder aromatische Alkohol-Lösungsmittel,
die halogeniert sein können
(z.B. Isopropylalkohol, n-Butanol, iso-Butanol, t-Butanol, Hexanol,
Cyclohexanol, n-Amylalkohol, etc.); lineare oder verzweigte oder
zyklische, gesättigte
oder ungesättigte,
aliphatische oder aromatische Ether-Lösungsmittel, die halogeniert
sein können (z.B.
Diethylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Methyl-t-butylether,
etc.); lineare oder verzweigte oder zyklische gesättigte oder
ungesättigte,
aliphatische oder aromatische Ester-Lösungsmittel, die halogeniert
sein können
(z.B. Methylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat, Methylpropionat,
etc.), wobei diese Lösungsmittel
alleine oder in Kombination verwendet werden können. Die verwendeten Lösungsmittel
können
Wasser oder einen wässrigen
Puffer enthalten oder mit diesem gesättigt sein.
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Weiterhin
können
in dem Reaktionssystem eine der beiden oder beide der folgenden
Behandlungen durchgeführt
werden, um die Sauerstoffkonzentration in dem synthetischen Reaktionssystem
eines optisch aktiven Cyanhydrins zu senken, bzw. um Hydrochinon
oder von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen (z.B. Benzochinon,
Chinhydron, etc.) zu vermindern, um dadurch das immobilisierte Enzym
zu stabilisieren.
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Um
genauer zu sein, bedeutet die Behandlung zur Verminderung der Sauerstoffkonzentration
in dem Reaktionssystem eine Behandlung zur Verminderung von gelöstem Sauerstoff,
indem man das Reaktionslösungsmittel
in Kontakt mit einem Gas bringt, das die Reaktion nicht beeinflusst
(z.B. Stickstoff, Argon, Helium, etc.) und den gelösten Sauerstoff
in dem Reaktionslösungsmittel
durch dieses Gas ersetzt. Diese Behandlung kann in der üblichen
Weise durchgeführt
werden. Beispielsweise wird das Reaktionslösungsmittel bei dieser Behandlung
in einen Behälter
mit einem Rührwerk
gefüllt
und beim Rühren,
wie oben beschrieben, durch Zufuhr eines inaktiven Gases an die
Flüssigkeit
begast. Spezifisch kann die Behandlung durch Gaszufuhr des inaktiven
Gases in einem Belüftungsvolumen
von 1 ml bis 10 l pro Minute pro Liter Reaktionslösungsmittel
für 1 Minute
bis 1 Stunde durchgeführt
werden, bevorzugt mit 10 ml bis 5 l pro Minute pro Liter des Reaktionslösungsmittels
für 5 Minuten
bis 30 Minuten. Es kann auch durchgeführt werden, indem man das Reaktionslösungsmittel
in einer Atmosphäre
des inaktiven Gases destilliert. Es kann auch durchgeführt werden,
indem man ein Deoxidationsmittel wie etwa Natriumsulfit und Hydrosulfit
zugibt. Es kann weiterhin auch durchgeführt werden, indem man die Reaktion
auslöst,
während
man das inaktive Gas in die Gasphase des Reaktionsbehälters im
oben beschriebenen Belüftungsvolumen
einleitet.
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Die
Behandlung zur Verminderung der Konzentration von Hydrochinon und
von von Hydrochinon abgeleiteten Verbindungen in dem Reaktionssystem
wird durchgeführt,
indem das Reaktionslösungsmittel
destilliert und dieses von in dem Reaktionslösungsmittel enthaltenem Hydrochinon
oder von von Hydrochinon abgeleiteten Verbindungen abgetrennt wird.
Die Konzentration von Hydrochinon und von von Hydrochinon abgeleiteten
Verbindungen wird auf weniger als 40 ppm, bevorzugt weniger als
1 ppm, reduziert. Die Destillation kann unter normalem Druck oder
reduziertem Druck unter Temperaturbedingungen durchgeführt werden,
unter denen Hydrochinon und von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen
zurückbleiben
und nur das Reaktionslösungsmittel
abdestilliert wird. Alternativ kann die Behandlung durch Zugabe
eines Adsorptionsmittels (z.B. Aktivkohle) in das Reaktionslösungsmittel,
das Hydrochinon und von Hydrochinon abgeleitete Verbindungen enthält, durchgeführt werden,
oder dadurch, dass das Lösungsmittel
durch z.B. eine Säule
geleitet wird, die mit dem Adsorptionsmittel gefüllt ist, oder indem das Reaktionslösungsmittel
für eine
gewisse Zeitspanne gemäß anderen
Verfahren mit dem Adsorptionsmittel in Kontakt gebracht wird. In
diesem Fall kann die Menge an Adsorptionsmittel in Abhängigkeit
von der Adsorptionskapazität
des Mittels in geeigneter Weise bestimmt werden.
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Das
erzeugte, optisch aktive Cyanhydrin kann dann mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
oder dergleichen gemessen und quantifiziert werden.
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Beispiele
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Ausführungsformen der Erfindung
werden unten beschrieben.
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Beispiel 1: Präparation
von (S)-Hydroxynitrillyase
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(S)-Hydroxynitrillyase
wurde unter Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae als Wirt
mittels Gentechnik wie folgt hergestellt. Zuerst wurde Gesamt-mRNA
in der üblichen
Weise aus Blättern
von Maniok (Manihot esculenta) extrahiert. Dann wurde zur Herstellung
von cDNA eine cDNA-Synthese durchgeführt, bei der die erhaltene
mRNA als Matrize verwendet wurde. Auf der anderen Seite wurden die
unten beschriebenen Primer auf Basis der Sequenz des (S)-Hydroxynitrillyase-Gens,
erhalten aus Maniok und beschrieben in „Arch. Biochem. Biophys. 311,
496–502
(1994)", synthetisiert.
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Die
PCR wurde unter Verwendung der obigen cDNA als Matrize und mit den
synthetisierten Primern (90°C,
30 sec; 55°C,
30 sec; 72°C,
60 sec; 35 Zyklen insgesamt) durchgeführt, um das (S)-Hydroxynitrillyase-Gen
zu erhalten. Die Analyse der Gensequenz zeigte, dass sie mit der
in dem Dokument dargestellten Sequenz übereinstimmte.
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Es
wurde dann der episomale Hefe-Expressionsvektor YEp352-GC hergestellt,
indem das erhaltene PCR-Fragment zwischen dem YEp352-GAP-Promotor
und -Terminator eingesetzt wurde. Dieser Vektor wurde in der üblichen
Weise in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae Inv-Sc1 transformiert,
und der rekombinante Hefestamm YEp352-GC-S2, der den Expressionsvektor
YEp352-GC enthält,
wurde erhalten, indem ein Stamm selektiert wurde, der in einem Minimal-Selektionsmedium
ohne Uracil wächst.
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Dann
wurde der erhaltene rekombinante Hefestamm YEp352-GC-S2 für 24 Stunden
in YNBDCas Flüssigmedium
(6,7 g/l Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäure (Difco), 20 g/l Glukose,
20 g/l Casaminosäure, 40
mg/ml L-Tryptophan) inkubiert, wobei er (S)-Hydroxynitrillyase in
den Zellen produzierte. Die mikrobiellen Zellen wurden mittels Zentrifugation
aus dem Kulturmedium des rekombinanten Pilzes gesammelt und unter Verwendung
einer Perlmühle
aufgebrochen. Die Suspension der aufgebrochenen mikrobiellen Zellen
wurde zentrifugiert, um einen Rohextrakt herzustellen, und dieses
Produkt, grob gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, wurde als (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung für die folgenden
Versuche verwendet.
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Beispiel 2: Überprüfung des
Immobilisierungsträgers
für (S)-Hydroxynitrillyase
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(1) Immobilisierung auf
dem gesinterten Tonträger
und dem Siliciumdioxidträger
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(S)-Hydroxynitrillyase,
die in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde in den verschiedenen
Immobilisierungsträgern
des Enzyms immobilisiert und der Typ, des Trägers untersucht, der für die Immobilisierung
des Enzyms geeignet war. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte
durch Zugabe von 0,1 g der verschiedenen Träger zu 0,5 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 64 U/ml,
0,02 M HEPES-Na-Puffer (pH 6,0)) und Bewegen des Ansatzes für 24 Stunden
bei 4°C,
wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an
jeden der Träger
ermöglicht
wurde. Dann wurde die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger überprüft. Die
Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger wurde durch Messung der
verbleibenden (S)-Hydroxynitrillyase-Aktivität (verbleibende Aktivität) im flüssigen Überstand
nach der Immobilisierung und der (S)-Hydroxynitrillyase-Aktivität (Kontrollaktivität) in einer
Kontrolle (einem Enzymgemisch ohne den Träger) und Einsetzen der gemessenen
Werte in die folgende Formel berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
dargestellt. Die Enzymaktivität
wurde durch Messung der Änderung
der Extinktion bei einer Wellenlänge
von 249,6 nm berechnet, wenn DL-Mandelonitril als Substrat von dem
Enzym zerlegt wird, um Benzaldehyd zu erzeugen. Eine Einheit (Unit,
U) der Aktivität
wurde als Äquivalent
zur Erzeugung von 1 μmol
Benzaldehyd pro Minute definiert.
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Tabelle
1: Absorptionsrate des Enzyms bei verschiedenen Immobilisierungsträgern
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Während die
Absorptionsraten an zuvor als Immobilisierungsträger für (S)-Hydroxynitrillyase bekannten Immobilisierungsträgern aus
Cellulose-Materialen 20,19% (gezeigt für Avicel Cellulose Microcristalline, (Merck))
bzw. 9,75% (für
Cellulose w-200G (Nippon Paper Industries)) betrugen, betrug die
Absorptionsrate bei dem gesinterten Tonträger Toyonite 200 (Toyo Denka
Kogyo) 100%, und die Absorptionsrate bei Chromatography Silica Gel
FL60D (Fuji Silysia Chemical) betrug 99,88%.
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(2) Immobilisierung in
einem Träger,
der andere poröse,
anorganische Materialien umfasst
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Die
Immobilisierung von (S)-Hydroxynitrillyase in Trägern, die ein breiteres Spektrum
an porösen
anorganischen Materialien umfassen, wurde untersucht. Die Immobilisierung
des Enzyms erfolgte mittels derselben Arbeitsabläufe wie in (1) oben. Das bedeutet,
es wurde 0,1 g des jeweiligen Trägers
zu 1 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 35 U/ml,
0,02 M HEPES-Na Puffer (pH 6,0)) hinzu gegeben, gefolgt von 24 Stunden
Bewegen des Ansatzes bei 4°C,
wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an dem
jeweiligen Träger
ermöglicht
wird. Es wurde dann die Absorptionsrate des Enzymproteins an dem
Träger untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
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Tabelle
2: Absorptionsrate des Enzyms in verschiedenen Immobilisierungsträgern
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Die
Absorptionsrate des Aluminiumoxidträgers NeoBead DL (Mizusawa Chemical)
betrug 46,4 %; bei dem Gegenstück
MIZUKASIEVES Y-540 Y-Typ Zeolite (Mizusawa Chemical) betrugt sie
46,45%. Somit wurde herausgefunden, dass ein Aluminiumoxidträger und
ein Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Träger jeweils Immobilisierungsträger mit
höheren
Absorptionsraten als vorherige Träger aus Cellulose-Materialien
darstellen.
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Beispiel 3: Wirkung der
Porengröße auf die
Absorptionsrate des Enzyms
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Die
Beziehung zwischen der Porengröße eines
Trägers
und der Absorptionsrate des Enzyms wurde unter Verwendung von Toyonite
200, einem gesinterteerten Tonträger,
und Micro Bead Silica Gel, einem Siliciumdioxidträger, untersucht.
Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte in derselben Weise wie in
(1) oben. Das bedeutet, es wurden 0,05 g eines jeden Trägers zu
1 ml der (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 50 U/ml, 0,02
M HEPES-Na Puffer (pH 6,0)) hinzu gegeben, gefolgt von einer Bewegung
des Ansatzes für
24 Stunden bei 4°C,
wodurch die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins bei
jedem der Träger ermöglicht wurde.
Dann wurde die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger bestimmt.
Die Ergebnisse für
die Verwendung von Toyonite 200 sind in Tabelle 3 und 1 dargestellt,
die Ergebnisse für
die Verwendung von Micro Bead Silica Gel sind in Tabelle 4 und 2 dargestellt.
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Tabelle
3: Wirkung der Porengröße auf die
Absorptionsrate bei Toyonite 200
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Tabelle
4: Wirkung der Porengröße auf die
Absorptionsrate bei Micro Bead Silica Gel
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Wie
aus Tabelle 3 und 1 ersichtlich ist, wurden im
Fall von Toyonite 200, dem gesinterten Tonträger, im Bereich einer Porengröße von 28
bis 60 nm relativ hohe Absorptionsraten erhalten, wobei die höchste Absorptionsrate
unter diesen bei etwa 38 nm erhalten wurde. Im Fall von Micro Bead
Silica Gel, einem Siliciumdioxidträger, wurden im Bereich einer
Porengröße von 18,9
bis 50 nm relativ hohe Absorptionsraten erhalten, wobei die höchste Absorptionsrate
unter diesen bei etwa 20 nm erhalten wurde.
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Beispiel 4: Wirkung des
pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate des
Enzyms und die Ausbeute des optisch aktiven Cyanhydrins
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Die
Wirkung des pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate
des Enzyms und die Ausbeute des optisch aktiven Cyanhydrins wurden
unter Verwendung von Micro Bead Silica Gel 300A, einem Siliciumdioxidträger als
Immobilisierungsträger,
untersucht. Zuerst wurden je 0,05 g des Trägers zu 1 ml eines Citrat-Phosphat-Puffers,
enthaltend (S)-Hydroxynitrillyase
(Aktivität:
50 U/ml), hinzu gegeben, der auf verschiedene pH-Werte im Bereich
von pH 3,81 bis pH 7,73 eingestellt wurde; danach wurden die Ansätze für 24 Stunden
bei 4°C
bewegt, wodurch die Adsorption und Immobilisierung des Enzymproteins
bei jedem Träger erfolgte.
Die Absorptionsrate wurde dann entsprechend der zuvor beschriebenen
Weise überprüft.
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Nachfolgend
wurde das immobilisierte Enzym, das bei den jeweiligen pH-Werten
präpariert
worden war, durch Filtration gesammelt, dann mit 0,15 M Natriumcitratpuffer
(pH 5,0) gewaschen und stehen gelassen, bis das immobilisierte Enzym
gelöst
und trocken vorlag. 2,5 ml Ethylacetat als Reaktionslösungsmittel,
sowie 99 μl
3-Phenoxybenzaldehyd (0,5 mmol) und 57 μl Cyanwasserstoffsäure (1,5
mmol) als Substrat wurden zu dem erhaltenen, immobilisierten Enzym
hinzu gegeben, und die Synthesereaktion des optisch aktiven Cyanhydrins
wurde durch Rotieren einer Roller-Flasche mit dem Reaktionsgemisch
bei Raumtemperatur durchgeführt.
Nach Abschluss der Reaktion wurde die Menge an erzeugtem (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin mittels
HPLC gemessen. Die Absorptionsrate und die relative Reaktivität sind in
Tabelle 5 und 3 dargestellt, wobei die Fläche des
HPLC-Peaks, die der maximalen, bei pH 5,44 gebildeten Menge an (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin
entspricht, als 100 gesetzt wird.
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Tabelle
5: Wirkung des pH zum Zeitpunkt der Immobilisierung des Enzyms auf
die Absorptionsrate und die Ausbeute an optisch aktivem Cyanhydrin
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Wie
aus Tabelle 5 und 3 ersichtlich, war die Absorptionsrate
an Micro Bead Silica Gel 300A in einem relativ weiten Bereich von
pH 4,83–6,79
günstig,
wobei der Maximalwert der Ausbeute bei pH 5,5 gezeigt wurde.
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Beispiel 5: Wirkung der
Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung auf die Absorptionsrate
des Enzyms
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Die
Wirkung der Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung
auf die Absorptionsrate des Enzyms wurde unter Verwendung von Micro
Bead Silica Gel 300A, einem Siliciumdioxidträger als Immobilisierungsträger, untersucht.
Jeweils 0,05 g des Trägers
wurden zu 1 ml an Citrat-Phosphatpuffer, enthaltend (S)-Hydroxynitrillyase
(Aktivität:
50 U/ml) hinzu gegeben, der auf verschiedene Konzentrationen im
Bereich von 0,02 bis 0,5 M eingestellt wurde, gefolgt von einem
Bewegen des Ansatzes für
24 Stunden bei 4°C,
wobei die Absorption und Immobilisierung des Enzymproteins an den
jeweiligen Träger
ermöglicht
wird. Die Absorptionsrate des Enzymproteins in dem Träger wurde
dann entsprechend der zuvor beschriebenen Weise untersucht. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 6 und 4 dargestellt.
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Tabelle
6: Wirkung der Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung
des Enzyms auf die Absorptionsrate
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Wie
aus Tabelle 6 und 4 ersichtlich ist, wurde herausgefunden,
dass die Absorptionsrate bei 0,02 M am höchsten war, und weiterhin,
dass die Absorptionsrate umso höher
wurde, je niedriger die Pufferkonzentration zum Zeitpunkt der Immobilisierung
des Enzyms war.
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Beispiel 6: Synthesereaktion,
die bearbeitet wurde, um die Sauerstoffkonzentration und die Hydrochinonkonzentration
in dem Reaktionssystem zu vermindern
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Nach
Entfernen des Hydrochinons durch Destillation wurde die Synthese
von (S)-3-Phenoxybenzaldehyd-Cyanhydrin
unter Verwendung von Diisopropylether durchgeführt, der mittels Stickstoff
gereinigt und von Sauerstoff befreit worden war.
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235,8
ml Diisopropylether, 11,9 g 3-Phenoxybenzaldehyd, 64 ml Cyanwasserstoff-Diisopropylether-Lösung (37,85
g HCN/500ml) wurden zu dem immobilisierten Enzym hinzu gegeben,
das in derselben Weise wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Toyonite
200, dem gesinterten Tonträger
als Immobilisierungsträger,
hergestellt worden war, worauf dann eine Bewegung des Ansatzes bei
25°C folgte.
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Das
immobilisierte Enzym wurde abgetrennt, als die Reaktion weitgehend
abgeschlossen war; es wurden dann Lösungsmittel und Substrat derselben
Menge wie oben zugegeben, um die Reaktion wiederholt durchzuführen. Wie
in 5 dargestellt, war keine Verminderung der Reaktionsrate
zu beobachten, auch wenn die Reaktion 4mal wiederholt wurde. Weiterhin
sind die Umsatzrate und die optische Reinheit des erzeugten (S)-3-Phenoxybenzaldehyds
in Tabelle 7 gezeigt, wenn die Reaktion jeweils abgeschlossen war.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass keine
Verminderung der optischen Reinheit auftrat.
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Tabelle
7: Umsatzrate und optische Reinheit in jedem Reaktionszyklus
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Beispiel 7: Wiederverwertbarkeit
des immobilisierten Enzyms
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1,5
g Micro Bead Silica Gel 200A (Porengröße: 20 nm) wurde zu 14 ml (S)-Hydroxynitrillyase-Lösung (Aktivität: 43 U/ml),
erhalten in dem Verfahren wie in Beispiel 1, hinzu gegeben, dann
leicht geschüttelt,
um dadurch die Immobilisierung des Enzyms zu ermöglichen. Die immobilisierten
Enzyme wurden durch Filtration gesammelt, und die überschüssige Menge
an Wasser wurde an der Luft getrocknet, um diese zu entfernen. 5 ml
t-Butylmethylether, enthaltend 1,5 M an Cyanwasserstoff wurde zu
diesem immobilisierten Enzym hinzu gegeben, wonach Benzaldehyd zugegeben
wurde, bis die Konzentration 1 M erreicht hatte. Die Synthese von (S)-Mandelonitril
wurde mittels Rühren
und Mischen bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen
war, wurden die immobilisierten Enzyme und die Reaktionslösung getrennt
und die Reaktionslösung
durch HPLC analysiert. Die Analyse zeigte an, dass 1,5 Stunden nach
dem Reaktionsstart (S)-Mandelonitril mit einer optischen Reinheit
von nicht weniger als 99,9%ee bei der Umsatzrate von 97,8% für Benzaldehyd
erreicht worden war. Lösungsmittel
und Substrat derselben Menge wie zuvor erwähnt, wurden zu dem abgetrennten,
immobilisierten Enzym hinzu gegeben, um die Reaktion wiederholt
durchzuführen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Wie in Tabelle 8 gezeigt,
wurden die hohe Umsatzrate und die hohe optische Reinheit des erzeugten
(S)-Mandelonitrils trotz der wiederholten Reaktionen beibehalten.
Wie in der obigen Beschreibung dargestellt, wurde herausgefunden,
dass das immobilisierte Enzym der Erfindung bei der Synthesereaktion
optisch aktiver Cyanhydrine wieder verwendbar und in einem großen Ausmaß hochstabil
ist.
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Tabelle
8: Umsatzrate und optische Reinheit bei jedem Reaktionszyklus
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VORTEIL DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein immobilisiertes Enzym bereit, bei
dem (S)-Hydroxynitrillyase
bei hoher Absorptionsrate immobilisiert wird, ein Verfahren zur
Herstellung des immobilisierten Enzyms, sowie ein Verfahren zur
Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen unter Verwendung der
immobilisierten Enzyme.
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Freier
Text des Sequenzprotokolls:
SEQ ID NO:1: Synthese-DNA
SEQ
ID NO:2: Synthese-DNA
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