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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Enzympräparat, wobei das Enzym ein
Enzym ist, das einen N-Benzylazetidin-2-carbonsäureester asymmetrisch hydrolysieren
kann, um vorzugsweise eine (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure herzustellen,
die ein wertvolles Zwischenprodukt von Arzneimitteln ist, und ein
Verfahren zur Herstellung von (S)-N-substituierter cyclischer Iminosäure unter
Verwendung des Enzympräparats.
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JP-A-2001-46084
(entspricht EP-A-1.057.894) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
einer (S)-N-substituierten cyclischen Iminosäure durch asymmetrisches Hydrolysieren
einer racemischen Verbindung dieser Säure mit einer abgetrennten
wässrigen
Enzymlösung,
aber dieses Verfahren war für
die großtechnische
Produktion nicht immer zufriedenstellend, da es schwierig war, die
hergestellte Iminosäure
von der entstehenden wässrigen
Phase des Reaktionsgemisches, das diese Säure und von der Enzymlösung stammende
Aminosäuren
enthält,
nach Abschluss der Reaktion abzutrennen.
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Kurze Darstellung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß ist eine
Trennung des bezweckten Produkts unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzympräparats problemlos
durchführbar.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Folgendes zur Verfügung:
- 1.
ein Präparat
mit einem immobilisierten Enzym (nachstehend als „das vorliegende
Enzympräparat" bezeichnet) mit:
(I)
einem Styren-Divinylbenzen-Copolymer mit feinen Poren mit einem
mittleren Durchmesser von 200–500 Å, einer
mittleren Korngröße von 50–200 μm, einer
spezifischen Oberfläche
von 10–1500
m2/g und einem Porenvolumen von 0,1–3 ml/g,
wobei das Copolymer ein Copolymer mit 30 % Styren und 70 % Divinylbenzen
ist; und
(II) einem an dem Copolymer immobilisierten Enzym,
das N-substituierten cyclischen C3-C4-Imino-2-carbonsäureester asymmetrisch hydrolysieren
kann, um vorzugsweise eine (S)-N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure herzustellen,
wobei das Enzym eine der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) aufweist:
(a)
eine Aminosäuresequenz,
die bei SEQ ID NO: 1 angegeben ist;
(b) eine Aminosäuresequenz,
die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten
an den Positionen 35 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht;
(c)
eine Aminosäuresequenz,
die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten
an den Positionen 79 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht; oder
(d)
eine Aminosäuresequenz,
die mit der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu 90 % oder mehr
identisch ist, oder
vorzugsweise ein Enzympräparat, das
(e)
eine Aminosäuresequenz
hat, die mit einer Nucleotidsequenz codiert ist, die die in 1 angegebenen Restriktionsorte
(NcoI, HinFI, FbaI, FbaI, MunI, AccII/SacII, BcnI, AvaII, HincII,
HaeIII, HindIII und AccII in der genannten Reihenfolge) hat.
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Die
Erfindung stellt außerdem
Folgendes zur Verfügung:
- 2. ein Verfahren zur Herstellung einer (S)-N-substituierten
cyclischen Iminosäure
der Formel (2): worin
R2
eine Aralkylgruppe
mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen,
eine Alkylcarbonylgruppe mit
2 bis 5 Kohlenstoffatomen,
eine Arylcarbonylgruppe mit 7 bis
13 Kohlenstoffatomen,
eine Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis
9 Kohlenstoffatomen,
eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis
10 Kohlenstoffatomen,
eine Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis
9 Kohlenstoffatomen,
eine Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13
Kohlenstoffatomen,
eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,
eine
Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen,
eine Arylgruppe
mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder
eine Arylsulfonylgruppe
mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen
darstellt, wobei die Aralkyl-,
Arylcarbonyl-, Aralkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Aryl- oder Arylsulfonylgruppe
an deren aromatischen Ring durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe
mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,
Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die
Alkylcarbonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Alkylgruppe durch mindestens
eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom
und Nitrogruppe substituiert sein kann, und
n
1 oder 2
darstellt,
das (nachstehend als „das vorliegende Verfahren" bezeichnet) das
Reagieren eines N-substituierten
cyclischen Imino-2-carbonsäureesters
der Formel (1) mit dem vorstehend definierten Enzympräparat umfasst, worin in Formel (1)
R1
eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,
eine
Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen,
eine Alkenylgruppe
mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder
eine Arylgruppe mit 6 bis
12 Kohlenstoffatomen,
darstellt, wobei die Alkylgruppe durch
mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen,
Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die
Aralkylgruppe oder Arylgruppe an ihrem aromatischen Ring durch mindestens eine
der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe
mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert
sein kann, und
R2 und n
die gleiche
Bedeutung wie vorstehend haben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
Restriktionsorte der Nucleotidsequenz (DNA), die durch eine fette
Linie dargestellt ist und für
die Aminosäuresequenz
der vorliegenden Erfindung codiert, wobei die Restriktionsorte NcoI,
HinFI, FbaI, FbaI, MunI, AccII/SacII, BcnI, AvaII, HincII, HaeIII,
HindIII und AccII in der genannten Reihenfolge angeordnet sind.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Zunächst werden
die Gruppen R1 und R2 und
die Substituenten, die hierfür
in den Formeln (1) und (2) vorhanden sein können, beschrieben.
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Zu
den Beispielen für
die Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, i-Butyl-,
s-Butyl-, t-Butyl-, n-Pentyl-, Neopentyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl- und
n-Octylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Benzylgruppe, Phenethylgruppe, Naphthylmethylgruppe
und Tritylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe und Pentenylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Phenylgruppe, Naphthylgruppe und Biphenylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, i-Propoxy-, n-Butoxy-,
i-Butoxy-, s-Butoxy-, t-Butoxy-,
n-Pentyloxy-, Neopentyloxy-, n-Hexyloxy-, n-Heptyloxy- und n-Octyloxygruppe.
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Zu
den Beispielen für
das Halogenatom gehören
unter anderem das Fluoratom, Chloratom, Bromatom und Iodatom.
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Zu
den Beispielen für
die Alkylcarbonylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Methylcarbonylgruppe, Ethylcarbonylgruppe, Propylcarbonylgruppe
und Butylcarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Phenylcarbonylgruppe, Naphthylcarbonylgruppe und Biphenylcarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Methoxycarbonylgruppe, Ethoxycarbonylgruppe, Propoxycarbonylgruppe,
Butoxycarbonylgruppe, Pentyloxycarbonylgruppe, Hexyloxycarbonylgruppe,
Heptyloxycarbonylgruppe und Octyloxycarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Benzyloxycarbonylgruppe, Phenethyloxycarbonylgruppe
und Phenylpropylcarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Propenyloxycarbonylgruppe, Butenyloxycarbonylgruppe,
Pentenyloxycarbonylgruppe, Heptenyloxycarbonylgruppe und Octenyloxycarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Phenyloxycarbonylgruppe, Naphthyloxycarbonylgruppe und
Biphenyloxycarbonylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe, Pentenylgruppe,
Hexenylgruppe, Heptenylgruppe und Octenylgruppe.
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Zu
den Beispielen für
die Arylsulfonylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen gehören unter
anderem die Phenylsulfonylgruppe, Naphthylsulfonylgruppe und Biphenylsulfonylgruppe.
Zu den Beispielen für
den cyclischen Iminoester, bei dem n 1 oder 2 darstellt, gehören unter
anderem Azetidincarbonsäure
und Pyrrolidincarbonsäure.
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R1 stellt vorzugsweise eine C1-C4-Alkylgruppe,
besser eine Methylgruppe und Ethylgruppe, dar. R2 stellt
vorzugsweise eine Benzylgruppe dar.
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Spezielle
Beispiele für
die N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure der
Formel (1) sind folgende Verbindungen:
Methyl-N-benzylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-chlorbenzylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-[(S)-phenylethyl]azetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-[(R)-phenylethyl]azetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-β-phenylethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-phenylpropylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzhydrylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-triphenylmethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-acetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-chloracetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-trifluoracetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzoylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-phenylbenzoylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-t-butoxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-trichlorethyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-2-phenylethyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-allyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-2,4,6-tri-t-butylphenyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-methylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-ethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-n-propylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-i-propylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-n-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-i-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-sec-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-t-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-allylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-phenylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-toluensulfonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzensulfonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-methoxybenzensulfonylazetidin-2-carboxylat
und
Methyl-N-nitrobenzensulfonylazetidin-2-carboxylat.
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Weitere
Beispiele für
die Verbindung der Formel (1) sind unter anderem die Verbindungen,
die anstelle des Methylrests in den vorstehend beispielhaft genannten
Esterverbindungen Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl,
sec-Butyl, t-Butyl, Benzyl, (S)-α-Phenethyl, (R)-α-Phenethyl, β-Phenylethyl,
Phenylpropyl, Benzhydryl, Triphenylmethyl, Allyl, Phenyl oder Naphthyl
haben. Beispiele für
die N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure der Formel (1) sind unter
anderem die Verbindungen, die anstelle des Azetidin-2-carboxylats in den
vorstehenden beispielhaft genannten Verbindungen Pyrrolidin-2-carboxylat
haben.
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Die
Verbindung der Formel (1) ist normalerweise eine racemische Verbindung
und kann auch eine Zusammensetzung aufweisen, die (S)-N-substituierten
cyclischen C3-C4-Iminosäureester
der Formel (2) und einen Antipodenester dieses Esters enthält.
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Beispiele
für den
(S)-N-substituierten cyclischen C3-C4-Iminosäureester der Formel (2) sind
unter anderem (S)-N-substituierte Azetidin-2-carbonsäure oder
(S)-N-substituierte Pyrrolidin-2-carbonsäure mit verschiedenen N-Substituenten,
die vorstehend beispielhaft genannt sind.
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Nachstehend
werden die unter (a) bis (e) definierten Aminosäuresequenzen erläutert.
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Beispiele
für die „Aminosäuresequenz,
die aus einem Teil der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz
besteht" sind unter
anderem folgende Aminosäuresequenzen:
- (b) eine Aminosäuresequenz, die an Position
35 bis 255 in SEQ ID NO: 1 angeordnet ist, und
- (c) eine Aminosäuresequenz,
die an Position 79 bis 255 in SEQ ID NO: 1 angeordnet ist.
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Die
Aminosäuresequenz
von (c) kann unter Verwendung einer DNA gewonnen werden, die der
Nucleotidsequenz der Nucleotide an Position 235 bis 765 der SEQ
ID NO: 2 entspricht, und die Aminosäuresequenz von (b) kann in ähnlicher
Weise, wie in JP-A-2001-46084 beschrieben, gewonnen werden.
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Die „DNA, die
unter strengen Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die aus einer
Nucleotidsequenz besteht, die für
die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert" bezeichnet eine
DNA, die ein DNA-DNA-Hybrid mit der DNA, die aus einer Nucleotidsequenz
besteht, die für
die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert, durch Hybridisierung
bei einer hohen Ionenkonzentration [beispielsweise 6 × SSC (900
mM NaCl, 90 mM Natriumcitrat) o. Ä.] bei einer Temperatur von
65°C bildet,
und das so gebildete Hybrid wird nach der Inkubation bei einer niedrigen
Ionenkonzentration [beispielsweise 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat)
o. Ä.]
durch Southern-Hybridisierung,
die beispielsweise in „Cloning
and Sequence" („Klonierung
und Sequenz") (unter
Leitung von Itaru Watanabe, herausgegeben von Masahiro Sugiura,
1989 erschienen bei Noson Bunkasya), beschrieben ist, dessen Inhalt
hiermit im Rahmen dieser Anmeldung vollumfänglich als geoffenbart gilt,
o. Ä. 30
Minuten auf einer Temperatur von 65°C gehalten.
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Das
Protein des vorliegenden Enzyms kann in Form eines Fusionsproteins
vorliegen, das eine Sequenz, die einem der hier genannten Teile/Homologe
der SEQ ID NO: 1 entspricht, und andere Sequenzen aufweist.
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Es
ist klar, dass unter Bezugnahme auf die Diskussion von Polynucleotiden,
die zur SEQ ID NO: 1 hybridisieren, der Begriff „Sequenz, die für die Aminosäuresequenz
codiert" das Komplement
der tatsächlichen codierenden
Sequenz beinhaltet.
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Beispiele
für die
DNA, die hier entsprechend verwendet wird, sind unter anderem eine
DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für die bei
SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz
codiert, und ein Nucleotid mit einer Deletion, Substitution oder
Addition eines Teils der Nucleotidsequenz in der Nucleotidsequenz,
die für
die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert. Diese Nucleotide
können
beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese oder Zufallsmutation
zu der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 in bekannter Weise hergestellt
werden (W. Kramer et al., Nucleic Acids Research, 1984, Bd. 12,
S. 9441; W. Kramer, H. J. Frits, Methods in Enzymology, 1987, Bd.
154, S. 350, oder T. A. Kunkel, Proc. of Natl. Acad. Sci. USA, 1985,
Bd. 82, S. 488). Das Nucleotid kann beispielsweise aus dem E.-coli-Stamm
JM105/pYHNK2, der die DNA der SEQ ID NO: 2 trägt, die nachstehend beschrieben
wird, oder aus Mikroorganismen, die zu Aspergillus flavus gehören, wie
etwa ATCC11492, hergestellt werden.
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Ein
Beispiel für
die Nucleotidsequenz, die für
die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert, ist unter
anderem die bei SEQ ID NO: 2 angegebene Nucleotidsequenz.
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„Eine Aminosäuresequenz
mit einer Sequenz-Identität
mit der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz von 90 % oder mehr" bezeichnet eine
Aminosäuresequenz,
deren Identität
in Bezug auf die gesamte bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz
90 % oder mehr beträgt.
Diese Aminosäuresequenz
kann unter Verwendung der Mikroorganismen (z. B. E. coli), die mit
einem die DNA tragenden Vektor transformiert sind, oder durch entsprechende
Addition von Aminosäuren
zu der unter (c) definierten Aminosäuresequenz gewonnen werden.
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Das
Protein des vorliegenden Enzyms (nachstehend als „das vorliegende
Protein" bezeichnet)
kann beispielsweise nach einem in JP-A-2001-46084 beschriebenen
Verfahren gewonnen werden.
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Das
Styren-Divinylbenzen-Copolymer mit feinen Poren mit einem mittleren
Durchmesser von 200–500 Å (nachstehend
als „der
vorliegende Immobilisierungsträger" bezeichnet) wird
meistens in Form von Teilchen verwendet. Das Styren-[)ivinylbenzen-Copolymer
besteht aus 30 % Styren und 70 % Divinylbenzen.
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Die
spezifische Oberfläche
des vorliegenden Immobilisierungsträgers beträgt 10–1500 m2/g,
und das Porenvolumen beträgt
0,1–3
ml/g. Ein spezielles Beispiel ist unter anderem das Produkt mit
dem Handelsnamen „Diaion
HP20SS" von Mitsubishi
Chemical Corporation.
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Im
Hinblick auf die Wirksamkeit der Reaktion werden Polymerteilchen
mit einem kleinen Durchmesser bevorzugt verwendet. Insbesondere
werden Teilchen mit einer mittleren Korngröße von 50–200 μm verwendet, und es werden die
Teilchen mit einer Korngröße von 60– 110 μm, die bei
der Korngrößenverteilung
60 % oder mehr ausmachen, bevorzugt. Ein spezielles Beispiel für den vorliegenden
Träger,
dessen Teilchen diesen geeigneten Durchmesser haben, ist unter anderem
das Produkt mit dem Handelsnamen „Diaion HP20SS" von Mitsubishi Chemical
Corporation.
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Das
erfindungsgemäße Enzympräparat kann
normalerweise dadurch hergestellt werden, dass das vorliegende Protein
mit dem vorliegenden Träger
in Kontakt gebracht wird. Der Prozess des In-Kontakt-Bringens des
vorliegenden Proteins mit dem Träger
wird normalerweise durch Zugeben des Trägers zu einer das vorliegende
Protein enthaltenden Lösung
durchgeführt,
und das entstehende Gemisch wird gerührt.
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Das
vorstehend verwendete Protein kann in Form eines gereinigten Proteins,
eines Rohproteins o. Ä. zum
Einsatz kommen.
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Das
vorliegende Protein oder seine Lösung
kann beispielsweise nach bekannten Verfahren, die in JP-A-2001-46084
beschrieben sind, gewonnen werden. Insbesondere kann es durch Kultivieren
z. B. des E.-coli-Stamms JM105/pYHNK2, der die DNA der SEQ ID NO:
2 trägt,
die aus ATCC11492 in bekannter Weise, wie etwa cDNA-Herstellung,
nach einem Protokoll des Bio-sogo-Katalogs 1997/98, Bd. 1, E-24-27,
hergestellt wird, das die gewünschte
Enzymaktivität,
Primer-Herstellung und PCR-Reaktion angibt, die diesen verwendet.
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Das
gewonnene Protein kann nach bekannten Reinigungsverfahren gereinigt
werden. Es werden beispielsweise geeignete Mikrobenzellkulturen
aufgespalten. Dieser Prozess zur Aufspaltung kann beispielsweise
dadurch durchgeführt
werden, dass die Mikrobenzellen z. B. durch Zentrifugieren aus der
Mikroorganismenkultur und anschließende physische Aufspaltung
der Mikrobenzellen, wie etwa durch Ultraschallbehandlung, sowie
Zugabe eines niederen Alkohols, wie etwa Ethanol, zu der Mikroorganismenkultur
und eine Weile Absitzenlassen o. Ä. gewonnen werden. Die entstehende
Aufspaltungslösung
wird zentrifugiert, mit einem Membranfilter o. Ä. filtriert, um unlösliche Substanzen
zu entfernen, und dadurch kann eine klare Lösung, die das vorliegende Protein
enthält,
hergestellt werden.
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Außerdem kann
das vorliegende Protein auch durch Fraktionieren der so gewonnenen
klaren Lösung wahlweise
unter Verwendung eines Trennungs-/Reinigungsverfahrens, wie etwa
Kationenaustauschchromatographie, Anionenaustauschchromatographie,
Chromatographie und Gelchromatographie, weiter gereinigt werden.
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Die
Temperatur, die verwendet wird, wenn das vorliegende Protein in
Kontakt mit dem vorliegenden Träger
gebracht wird, liegt normalerweise in dem Bereich von 1–37°C und vorzugsweise
in dem Bereich von 5–15°C. Die Dauer
für den
Kontakt beträgt
normalerweise 1– 48
Stunden. Wenn sie miteinander in Kontakt gebracht werden, kann der
pH normalerweise im Bereich von 4–10 und vorzugsweise im Bereich
von 6–8
liegen.
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Die
Menge des Trägers
liegt normalerweise im Bereich von 0,01–1 g und vorzugsweise im Bereich
von 0,08–0,12
g je 1000 Einheiten des vorliegenden Proteins (1 Einheit ist die
Menge des vorliegenden Proteins, mit der ein racemischer N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester
hydrolysiert werden kann, um 1 μMol N-Benzylazetidin-2-carbonsäure in 1
Minute herzustellen).
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Die
Aktivität
des vorliegenden Enzyms kann beispielsweise durch Herstellen einer
Reaktionslösung durch
Zugabe von 0,02 g racemischer N-Benzylazetidincarbonsäureethylester
und 1,0 ml Methyl-t-butylether zu 3,5 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer
(pH 7,0), der ein Protein enthält,
1- bis 24-stündiges
Schütteln
dieser Reaktionslösung
bei etwa 30 bis 35°C
und anschließendes
Analysieren der (S)-Form-Menge der N-Benzylazetidin-2-carbonsäure bestimmt
werden, die in der wässrigen
Schicht vorhanden ist, die durch Zentrifugieren des so erhaltenen
Reaktionsgemisches gewonnen wird.
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Die
Immobilisierung des vorliegenden Proteins auf den Träger kann
beispielsweise durch Verfolgen der Fähigkeit der das vorliegende
Protein enthaltenden Lösung,
den racemischen N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester zu hydrolysieren, überwacht
werden.
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Das
erfindungsgemäße immobilisierte
Enzym, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wird, kann durch
Filtrieren, Zentrifugieren o. Ä.
abgetrennt werden.
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Nachstehend
wird das Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Erfindung erläutert. Die
Reaktion der vorliegenden Erfindung wird normalerweise durch Reagieren
eines racemischen N-substituierten cyclischen Iminoesters der Formel
(1) mit dem Enzympräparat
oder dem immobilisierten Enzym der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
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Die
Reaktion wird normalerweise in Gegenwart von Wasser durchgeführt. Wasser
kann eine wässrige Pufferlösung sein.
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Die
Menge des Wassers beträgt
normalerweise 0,5 Mol oder mehr je Mol N-substituierte cyclische
Iminoesterverbindung der Formel (1 ). Als Lösungsmittel kann Wasser verwendet
werden.
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Außerdem können außer Wasser
auch organische Lösungsmittel,
wie etwa hydrophobe organische Lösungsmittel,
hydrophile organische Lösungsmittel
o. Ä.,
gleichzeitig bei der Reaktion vorhanden sein. Beispiele für hydrophobe
organische Lösungsmittel
sind unter anderem Ether, wie etwa t-Butylmethyleter und Isopropylether,
sowie Kohlenwasserstoffe, wie etwa Toluen, Hexan, Cyclohexan, Heptan
und Isooctan. Beispiele für
hydrophile organische Lösungsmittel
sind unter anderem Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, 2-Propanol und
1,1- Dimethylethanol;
Ketone, wie etwa Aceton; und Nitrile, wie etwa Acetonitril. Diese
hydrophoben organischen Lösungsmittel
und hydrophilen organischen Lösungsmittel
können
allein oder als Kombination aus zwei oder mehr Lösungsmitteln zum Einsatz kommen.
Es können
auch ein hydrophobes organisches Lösungsmittel, ein hydrophiles
organisches Lösungsmittel
und ein Gemisch daraus verwendet werden.
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Wenn
ein organisches Lösungsmittel
verwendet wird, beträgt
dessen Menge normalerweise 100 Masseteile oder weniger, vorzugsweise
0,1–50
Masseteile, je Masseteil N-substituierte
cyclische Iminoester-Verbindung der Formel (1).
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Die
Reaktion wird normalerweise durch Rühren, Schütteln o. Ä. so durchgeführt, dass
die N-substituierte cyclische Iminoester-Verbindung der Formel (1),
das erfindungsgemäße immobilisierte
Enzym und zusätzlich
organisches Lösungsmittel
o. Ä. bei
Bedarf gemischt werden.
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Der
pH des Reaktionsgemisches wird unter Berücksichtigung der Anfangsgeschwindigkeit
der Reaktion entsprechend eingestellt, normalerweise in dem Bereich
von 4–10
und vorzugsweise in dem Bereich von 6–8. Die Reaktionstemperatur
liegt in Anbetracht der Stabilität
und der Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion normalerweise in dem
Bereich von 0–70°C und vorzugsweise
in dem Bereich von 0–40°C.
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Die
Menge des Enzympräparats
bei der Reaktion kann zwar entsprechend der Katalysatoraktivität des Enzympräparats (immobilisiertes
Enzym) festgelegt werden, aber sie ist normalerweise so, dass ein
Verhältnis von
0,001–0,1
Masseteile je Masseteil N-substituierte cyclische Iminoester-Verbindung
der Formel (1) erreicht wird.
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Der
Endpunkt der Reaktion kann beispielsweise durch Verfolgen des Umsetzungsverhältnisses
der N-substituierten cyclischen Iminoester-Verbindung der Formel
(1) in dem Reaktionsgemisch mittels Flüssigchromatographie o. Ä. bestimmt
werden. Die Reaktion wird in Anbetracht der Selektivität der Reaktion
normalerweise an einem Punkt beendet, wo das Umsetzungsverhältnis der
N-substituierten cyclischen Iminoester-Verbindung der Formel (1)
nicht größer als
50 % ist. Die Reaktionszeit liegt normalerweise in dem Bereich von
etwa 5 Minuten bis etwa 4 Tagen.
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Nach
Abschluss der Reaktion kann die (S)-N-substituierte cyclische Iminosäure der
Formel (2) beispielsweise durch Filtrieren des Reaktionsgemisches,
anschließende
Phasentrennung des wässrigen
Filtrats und der organischen Phase (Hexan, Heptan, t-Butylmethylether,
Ethylacetat, Toluen o. Ä.)
zum Entfernen der nichtumgesetzten Ausgangsverbindung, gegebenenfalls
Ionenchromatographie der wässrigen
Schicht zum Eliminieren von Salzen und anschließendes Eindicken abgetrennt
werden. Außerdem
kann das Produkt durch Säulenchromatographie
o. Ä. gereinigt
werden.
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Homologe
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Hier
wird auf Homologe der SEQ ID NO: 1 verwiesen. Diese Homologe haben
normalerweise eine Homologie von mindestens 70 %, vorzugsweise eine
Homologie von mindestens 80 %, 90 %, 95 % oder 97 %, beispielsweise über eine
Region von mindestens 15, 20, 30, 100 oder mehr aneinandergrenzenden
Aminosäuren
der SEQ ID NO: 1 und vorzugsweise über die Region, die von den
Aminosäuren
an den Positionen 35 bis 255 oder 79 bis 255 der SEQ ID NO: 1 definiert
wird. Die Homologie kann aufgrund der Aminosäuren-Identität berechnet werden (gelegentlich
als „harte
Homologie" bezeichnet).
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Das
UWGCG-Package stellt beispielsweise das BESTFIT-Programm bereit,
das zur Berechnung der Homologie verwendet werden kann (wird beispielsweise
mit seinen Standardeinstellungen verwendet) (Devereux et al., 1984,
Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Mit den Algorithmen
PILEUP und BLAST können die
Homologie berechnet oder Sequenzen abgeglichen werden [wie etwa
Identifizieren von äquivalenten
oder entsprechenden Sequenzen (normalerweise mit ihren Standardeinstellungen)],
wie es beispielsweise in S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Evol. 36,
290–300,
und S. F. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403– 410, beschrieben
ist.
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Software
zum Durchführen
von BLAST-Analysen ist über
das National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich
erhältlich.
Dieser Algorithmus umfasst zunächst
das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hohem Punktwert (HSPs)
durch Identifizieren von Kurzwörtern
der Länge
W in der Abfrage-Sequenz, die entweder mit einem positiv bewerteten
Schwellen-Punktwert T übereinstimmen
oder diesen erfüllen,
wenn sie auf ein Wort der gleichen Länge in einer Datenbank-Sequenz
ausgerichtet sind. T wird als Nachbarwort-Punktwertschwelle bezeichnet
(Altschul et al., s. o.). Diese anfänglichen Nachbarworttreffer
fungieren als Keime zum Initiieren von Suchprozessen zum Auffinden
von HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen
entlang jeder Sequenz so weit erweitert, wie der kumulative Ausrichtungspunktwert
erhöht
werden kann. Erweiterungen für
die Worttreffer in jeder Richtung werden gestoppt, wenn: der kumulative
Ausrichtungspunktwert um die Größe X von
seinem erreichten Höchstwert
absinkt; der kumulative Punktwert durch Akkumulation einer oder
mehrerer Rest-Ausrichtungen mit negativem Punktwert null oder kleiner
wird; oder das Ende einer Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter
W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der
Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellungen eine
Wortlänge
(W) von 11, die Auswertematrix BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff, 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915–10919, Ausrichtungen (B) von
50, einen Erwartungswert (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich
beider Stränge.
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Der
BLAST-Algorithmus führt
eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z. B. Karlin und Altschul,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873–5887. Ein Maß für die Ähnlichkeit,
das von dem BLAST-Algorithmus geliefert wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit
[P(N)], die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der
eine Übereinstimmung
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
zufällig
auftritt. Beispielsweise wird eine Sequenz als mit einer anderen
Sequenz ähnlich
angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit beim Vergleich
der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, vorzugsweise
kleiner als etwa 0,1, besser kleiner als etwa 0,01 und am besten
kleiner als etwa 0,001 ist.
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Die
homologe Sequenz weicht normalerweise von SEQ ID NO: 1 (oder einer
der vorgenannten Regionen von SEQ ID NO: 1) um weniger als 5, weniger
als 10, weniger als 20, weniger als 50 oder weniger als 100 Mutationen
(die jeweils eine Substitution, Deletion oder Insertion sein können) ab.
Diese Mutationen können über eine
der vorgenannten Regionen für
die Berechnung der Homologie gemessen werden. Die Substitutionen
sind vorzugsweise konservative Substitutionen. Diese sind in der
nachstehenden Tabelle definiert. Aminosäuren in dem gleichen Block
in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen Zeile in
der dritten Spalte können
miteinander substituiert werden.
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Beispiele
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, aber
die vorliegende Erfindung soll die Erfindung nicht darauf beschränken.
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Beispiel 1
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Mit
Wasser gereinigtes Diaion HP20SS (Handelsname von Mitsubishi Chemical
Corporation), ein Produkt, das durch Mischen von 12 g Diaion HP20SS
und 300 ml Wasser, anschließendes
30-minütiges
Rühren, Filtern
und weiteres Waschen mit 400 ml Wasser hergestellt worden war, wurde
mit 600 g einer klaren Lösung aus
dem Protein gemischt, das wie nachstehend beschrieben hergestellt
worden war. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei 10°C gerührt. Dann wurde das Gemisch
filtriert und mit 400 g Wasser gereinigt, sodass 12,5 g immobilisiertes
Enzym entstanden.
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3,5
ml 100 mM Monokaliumhydrogenphosphat-Dikaliumphosphat-Puffer (pH
7,0) wurden mit 50 mg des vorstehend beschriebenen immobilisierten
Enzyms und 1,0 ml t-Butylmethylether versetzt, und das Gemisch wurde
15 Minuten bei 35°C
inkubiert. Dies wurde mit 0,02 g N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester versetzt
und anschließend
16 Minuten bei 35°C
hin- und hergeschüttelt (120
Stöße/min).
Anschließend
wurden 400 μl
dieses Reaktionsgemisches mit 1 ml t-Butylmethylether versetzt,
und das Gemisch wurde 5 Minuten mit 12.000 U/min zentrifugiert.
200 μl der
so erhaltenen wässrigen
Schicht wurden in 20 mM Monokaliumhydrogenphosphat/Acetonitril (90110)
gelöst,
und die Lösung
wurde durch ein 0,2-μm-Filter
filtriert. Das Filtrat wurde einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie
unterzogen. Durch Nachweisen der (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure wurde
bestätigt,
dass das so gewonnene immobilisierte Enzym die gewünschte Aktivität hatte.
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Beispiel 2
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77
g Wasser wurden mit 0,5 g des in Beispiel 1 hergestellten immobilisierten
Enzyms und 65 g Etyhl-N-benzylazetidin-2-carboxylat versetzt, und
das Gemisch wurde anschließend 10
Stunden bei 10°C
gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit 65 g Methylisobutylketon und 36 g Ethanol
versetzt und 30 Minuten weitergerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch
filtriert, und das Filtrat wurde getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 65
g Methylisobutylketon und 6,5 g Ethanol versetzt und anschließend 30
Minuten gerührt
und dann getrennt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die
so entstandene wässrige
Schicht wurde unter reduziertem Druck (10 kPa oder weniger) eingedickt,
sodass 60 g rohe (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure (43 Masse-%) entstanden.
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Bedingungen
für die
Analyse von N-Benzylazetidin-2-carbonsäure:
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Hochleistungs-Flüssigchromatographie:
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- Säule:
ODS-A212 (hergestellt von Sumika Analysis Center Co., Ltd.)
- Mobile Phase: 20 mM Monokaliumhydrogenphosphat/Acetonitril (90/10)
- Flussgeschwindigkeit: 1 ml/min
- Säulentemperatur:
40°C
- Detektor: UV (220 nm)
- Retentionszeit der N-Benzylazetidin-2-carbonsäure: 5,5
min
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Herstellung der klaren
Lösung
des vorliegenden Enzyms
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10
ml sterilisiertes Medium (hergestellt durch Auflösen von 5 g Glycerol, 6 g Hefeextrakt,
4 g Monokaliumhydrogenphosphat, 9,3 g Dikaliumphosphat in 1000 ml
Wasser) wurden mit 10 μl
einer wässrigen
Ampicillin-Lösung
(50 mg/ml) und 0,1 ml Glycerol-Ausgangsmaterial des E.-coli-Stamms JM105/pYHNK2
(siehe JP-A-2001-46084) versetzt. Das Gemisch wurde dann 9 Stunden
bei 30°C
geschüttelt.
Die entstandene Kulturlösung
wird als „Kulturlösung A" bezeichnet.
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15.000
ml sterilisiertes flüssiges
Medium (hergestellt durch Auflösen
von 225 g Glycerol, 150 g Hefeextrakt, 225 g Multi-Aminosäuren F,
60 g Monokaliumhydrogenphosphat, 36 g Magnesiumsulfat, 0,6 g Eisen(II)-sulfatheptahydrat
und Calciumchloriddihydrat in 13.000 ml Wasser und weiteres Zugeben
von Wasser, sodass eine Gesamtmenge von 150.000 ml entstand) wurden
mit einer wässrigen
4 M Phosphorsäurelösung und
14 Masse-% wässriger
Ammoniak versetzt, um den pH auf 7,0 einzustellen. Dies wurde mit
7,5 ml der vorstehend beschriebenen Kulturlösung A versetzt, und unter
Rühren
wurde eine aerobe Kultivierung bei 30°C durchgeführt. 14 Stunden nach Beginn
der Kultivierung wurde ein sterilisiertes flüssiges Medium (hergestellt durch
Auflösen
von 280 g Hefeextrakt und 420 g Multi-Aminosäuren F in einem Gemisch aus
1100 g Wasser und 1500 g Glycerol) schrittweise zugegeben. Außerdem wurde
18 Stunden nach Beginn der Kultivierung Isopropyl-thio-β-D-galactosid
bis zu einer Konzentration von 50 μM zugegeben.
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40
Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde die Kulturlösung mit
1950 ml Ethanol versetzt und dann 24 Stunden bei 30°C weitergerührt. Anschließend wurden
6000 g dieses Gemisches zurückgewonnen und
mit 6200 g Wasser gemischt. Die Lösung wurde kontinuierlich zentrifugiert
(20.000 U/min, Durchflussgeschwindigkeit: 130 ml/min), sodass ein
Zentrifugierungsüberstand
von 11.200 g entstand. Dieser Zentrifugierungsüberstand wurde mit 220 g Radiolyte
# 200 (Handelsname von Showa Chemical Industry Co., Ltd.) versetzt
und dann gerührt.
Die Lösung
wurde dann mit Radiolyte # 200 filtriert, sodass eine klare Lösung des
vorliegenden Proteins entstand.
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Mit
dem erfindungsgemäßen immobilisierten
Enzym können
(S)-N-substituierte cyclische Iminosäuren der Formel (2) effizient
großtechnisch
hergestellt werden. SEQUENCE
LISTING