DE60211105T2

DE60211105T2 - Eine Verbindung die ein Enzym zur asymetrischen Hydrolyse von N-substituierten C3-C4 zyklischen imino-2-carboxylsäureester enthält und deren Verwendung

Info

Publication number: DE60211105T2
Application number: DE60211105T
Authority: DE
Inventors: Tomoyasu Nishinomiya-shi Kawabe; Masashi Toyonake-shi Kamitamari
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-09-03
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2022-08-31
Also published as: US20030124683A1; JP2003070471A; US6936445B2; EP1316610A1; EP1316610B1; DE60211105D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzympräparat, wobei das Enzym ein Enzym ist, das einen N-Benzylazetidin-2-carbonsäureester asymmetrisch hydrolysieren kann, um vorzugsweise eine (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure herzustellen, die ein wertvolles Zwischenprodukt von Arzneimitteln ist, und ein Verfahren zur Herstellung von (S)-N-substituierter cyclischer Iminosäure unter Verwendung des Enzympräparats.
JP-A-2001-46084 (entspricht EP-A-1.057.894) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer (S)-N-substituierten cyclischen Iminosäure durch asymmetrisches Hydrolysieren einer racemischen Verbindung dieser Säure mit einer abgetrennten wässrigen Enzymlösung, aber dieses Verfahren war für die großtechnische Produktion nicht immer zufriedenstellend, da es schwierig war, die hergestellte Iminosäure von der entstehenden wässrigen Phase des Reaktionsgemisches, das diese Säure und von der Enzymlösung stammende Aminosäuren enthält, nach Abschluss der Reaktion abzutrennen.
Kurze Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß ist eine Trennung des bezweckten Produkts unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzympräparats problemlos durchführbar.
Die vorliegende Erfindung stellt Folgendes zur Verfügung:

1. ein Präparat mit einem immobilisierten Enzym (nachstehend als „das vorliegende Enzympräparat" bezeichnet) mit: (I) einem Styren-Divinylbenzen-Copolymer mit feinen Poren mit einem mittleren Durchmesser von 200–500 Å, einer mittleren Korngröße von 50–200 μm, einer spezifischen Oberfläche von 10–1500 m²/g und einem Porenvolumen von 0,1–3 ml/g, wobei das Copolymer ein Copolymer mit 30 % Styren und 70 % Divinylbenzen ist; und (II) einem an dem Copolymer immobilisierten Enzym, das N-substituierten cyclischen C3-C4-Imino-2-carbonsäureester asymmetrisch hydrolysieren kann, um vorzugsweise eine (S)-N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure herzustellen, wobei das Enzym eine der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) aufweist: (a) eine Aminosäuresequenz, die bei SEQ ID NO: 1 angegeben ist; (b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten an den Positionen 35 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht; (c) eine Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten an den Positionen 79 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht; oder (d) eine Aminosäuresequenz, die mit der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu 90 % oder mehr identisch ist, oder vorzugsweise ein Enzympräparat, das (e) eine Aminosäuresequenz hat, die mit einer Nucleotidsequenz codiert ist, die die in 1 angegebenen Restriktionsorte (NcoI, HinFI, FbaI, FbaI, MunI, AccII/SacII, BcnI, AvaII, HincII, HaeIII, HindIII und AccII in der genannten Reihenfolge) hat.

Die Erfindung stellt außerdem Folgendes zur Verfügung:

2. ein Verfahren zur Herstellung einer (S)-N-substituierten cyclischen Iminosäure der Formel (2):
worin R2 eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkylcarbonylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Arylsulfonylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt, wobei die Aralkyl-, Arylcarbonyl-, Aralkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Aryl- oder Arylsulfonylgruppe an deren aromatischen Ring durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Alkylcarbonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und n 1 oder 2 darstellt, das (nachstehend als „das vorliegende Verfahren" bezeichnet) das Reagieren eines N-substituierten cyclischen Imino-2-carbonsäureesters der Formel (1) mit dem vorstehend definierten Enzympräparat umfasst,
worin in Formel (1) R¹ eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, darstellt, wobei die Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Aralkylgruppe oder Arylgruppe an ihrem aromatischen Ring durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und R² und n die gleiche Bedeutung wie vorstehend haben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Restriktionsorte der Nucleotidsequenz (DNA), die durch eine fette Linie dargestellt ist und für die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung codiert, wobei die Restriktionsorte NcoI, HinFI, FbaI, FbaI, MunI, AccII/SacII, BcnI, AvaII, HincII, HaeIII, HindIII und AccII in der genannten Reihenfolge angeordnet sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zunächst werden die Gruppen R¹ und R² und die Substituenten, die hierfür in den Formeln (1) und (2) vorhanden sein können, beschrieben.
Zu den Beispielen für die Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, i-Butyl-, s-Butyl-, t-Butyl-, n-Pentyl-, Neopentyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl- und n-Octylgruppe.
Zu den Beispielen für die Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Benzylgruppe, Phenethylgruppe, Naphthylmethylgruppe und Tritylgruppe.
Zu den Beispielen für die Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe und Pentenylgruppe.
Zu den Beispielen für die Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Phenylgruppe, Naphthylgruppe und Biphenylgruppe.
Zu den Beispielen für die Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, i-Propoxy-, n-Butoxy-, i-Butoxy-, s-Butoxy-, t-Butoxy-, n-Pentyloxy-, Neopentyloxy-, n-Hexyloxy-, n-Heptyloxy- und n-Octyloxygruppe.
Zu den Beispielen für das Halogenatom gehören unter anderem das Fluoratom, Chloratom, Bromatom und Iodatom.
Zu den Beispielen für die Alkylcarbonylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Methylcarbonylgruppe, Ethylcarbonylgruppe, Propylcarbonylgruppe und Butylcarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Phenylcarbonylgruppe, Naphthylcarbonylgruppe und Biphenylcarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Methoxycarbonylgruppe, Ethoxycarbonylgruppe, Propoxycarbonylgruppe, Butoxycarbonylgruppe, Pentyloxycarbonylgruppe, Hexyloxycarbonylgruppe, Heptyloxycarbonylgruppe und Octyloxycarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Benzyloxycarbonylgruppe, Phenethyloxycarbonylgruppe und Phenylpropylcarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Propenyloxycarbonylgruppe, Butenyloxycarbonylgruppe, Pentenyloxycarbonylgruppe, Heptenyloxycarbonylgruppe und Octenyloxycarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Phenyloxycarbonylgruppe, Naphthyloxycarbonylgruppe und Biphenyloxycarbonylgruppe.
Zu den Beispielen für die Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Vinylgruppe, Propenylgruppe, Butenylgruppe, Pentenylgruppe, Hexenylgruppe, Heptenylgruppe und Octenylgruppe.
Zu den Beispielen für die Arylsulfonylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen gehören unter anderem die Phenylsulfonylgruppe, Naphthylsulfonylgruppe und Biphenylsulfonylgruppe. Zu den Beispielen für den cyclischen Iminoester, bei dem n 1 oder 2 darstellt, gehören unter anderem Azetidincarbonsäure und Pyrrolidincarbonsäure.
R¹ stellt vorzugsweise eine C1-C4-Alkylgruppe, besser eine Methylgruppe und Ethylgruppe, dar. R² stellt vorzugsweise eine Benzylgruppe dar.
Spezielle Beispiele für die N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure der Formel (1) sind folgende Verbindungen:
Methyl-N-benzylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-chlorbenzylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-[(S)-phenylethyl]azetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-[(R)-phenylethyl]azetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-β-phenylethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-phenylpropylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzhydrylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-triphenylmethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-acetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-chloracetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-trifluoracetylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzoylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-phenylbenzoylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-t-butoxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-trichlorethyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-2-phenylethyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-allyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-2,4,6-tri-t-butylphenyloxycarbonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-methylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-ethylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-n-propylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-i-propylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-n-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-i-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-sec-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-t-butylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-allylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-phenylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-p-toluensulfonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-benzensulfonylazetidin-2-carboxylat,
Methyl-N-methoxybenzensulfonylazetidin-2-carboxylat und
Methyl-N-nitrobenzensulfonylazetidin-2-carboxylat.
Weitere Beispiele für die Verbindung der Formel (1) sind unter anderem die Verbindungen, die anstelle des Methylrests in den vorstehend beispielhaft genannten Esterverbindungen Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, t-Butyl, Benzyl, (S)-α-Phenethyl, (R)-α-Phenethyl, β-Phenylethyl, Phenylpropyl, Benzhydryl, Triphenylmethyl, Allyl, Phenyl oder Naphthyl haben. Beispiele für die N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure der Formel (1) sind unter anderem die Verbindungen, die anstelle des Azetidin-2-carboxylats in den vorstehenden beispielhaft genannten Verbindungen Pyrrolidin-2-carboxylat haben.
Die Verbindung der Formel (1) ist normalerweise eine racemische Verbindung und kann auch eine Zusammensetzung aufweisen, die (S)-N-substituierten cyclischen C3-C4-Iminosäureester der Formel (2) und einen Antipodenester dieses Esters enthält.
Beispiele für den (S)-N-substituierten cyclischen C3-C4-Iminosäureester der Formel (2) sind unter anderem (S)-N-substituierte Azetidin-2-carbonsäure oder (S)-N-substituierte Pyrrolidin-2-carbonsäure mit verschiedenen N-Substituenten, die vorstehend beispielhaft genannt sind.
Nachstehend werden die unter (a) bis (e) definierten Aminosäuresequenzen erläutert.
Beispiele für die „Aminosäuresequenz, die aus einem Teil der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz besteht" sind unter anderem folgende Aminosäuresequenzen:

(b) eine Aminosäuresequenz, die an Position 35 bis 255 in SEQ ID NO: 1 angeordnet ist, und
(c) eine Aminosäuresequenz, die an Position 79 bis 255 in SEQ ID NO: 1 angeordnet ist.

Die Aminosäuresequenz von (c) kann unter Verwendung einer DNA gewonnen werden, die der Nucleotidsequenz der Nucleotide an Position 235 bis 765 der SEQ ID NO: 2 entspricht, und die Aminosäuresequenz von (b) kann in ähnlicher Weise, wie in JP-A-2001-46084 beschrieben, gewonnen werden.
Die „DNA, die unter strengen Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert" bezeichnet eine DNA, die ein DNA-DNA-Hybrid mit der DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert, durch Hybridisierung bei einer hohen Ionenkonzentration [beispielsweise 6 × SSC (900 mM NaCl, 90 mM Natriumcitrat) o. Ä.] bei einer Temperatur von 65°C bildet, und das so gebildete Hybrid wird nach der Inkubation bei einer niedrigen Ionenkonzentration [beispielsweise 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat) o. Ä.] durch Southern-Hybridisierung, die beispielsweise in „Cloning and Sequence" („Klonierung und Sequenz") (unter Leitung von Itaru Watanabe, herausgegeben von Masahiro Sugiura, 1989 erschienen bei Noson Bunkasya), beschrieben ist, dessen Inhalt hiermit im Rahmen dieser Anmeldung vollumfänglich als geoffenbart gilt, o. Ä. 30 Minuten auf einer Temperatur von 65°C gehalten.
Das Protein des vorliegenden Enzyms kann in Form eines Fusionsproteins vorliegen, das eine Sequenz, die einem der hier genannten Teile/Homologe der SEQ ID NO: 1 entspricht, und andere Sequenzen aufweist.
Es ist klar, dass unter Bezugnahme auf die Diskussion von Polynucleotiden, die zur SEQ ID NO: 1 hybridisieren, der Begriff „Sequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert" das Komplement der tatsächlichen codierenden Sequenz beinhaltet.
Beispiele für die DNA, die hier entsprechend verwendet wird, sind unter anderem eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert, und ein Nucleotid mit einer Deletion, Substitution oder Addition eines Teils der Nucleotidsequenz in der Nucleotidsequenz, die für die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert. Diese Nucleotide können beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese oder Zufallsmutation zu der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 in bekannter Weise hergestellt werden (W. Kramer et al., Nucleic Acids Research, 1984, Bd. 12, S. 9441; W. Kramer, H. J. Frits, Methods in Enzymology, 1987, Bd. 154, S. 350, oder T. A. Kunkel, Proc. of Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Bd. 82, S. 488). Das Nucleotid kann beispielsweise aus dem E.-coli-Stamm JM105/pYHNK2, der die DNA der SEQ ID NO: 2 trägt, die nachstehend beschrieben wird, oder aus Mikroorganismen, die zu Aspergillus flavus gehören, wie etwa ATCC11492, hergestellt werden.
Ein Beispiel für die Nucleotidsequenz, die für die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert, ist unter anderem die bei SEQ ID NO: 2 angegebene Nucleotidsequenz.
„Eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenz-Identität mit der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz von 90 % oder mehr" bezeichnet eine Aminosäuresequenz, deren Identität in Bezug auf die gesamte bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz 90 % oder mehr beträgt. Diese Aminosäuresequenz kann unter Verwendung der Mikroorganismen (z. B. E. coli), die mit einem die DNA tragenden Vektor transformiert sind, oder durch entsprechende Addition von Aminosäuren zu der unter (c) definierten Aminosäuresequenz gewonnen werden.
Das Protein des vorliegenden Enzyms (nachstehend als „das vorliegende Protein" bezeichnet) kann beispielsweise nach einem in JP-A-2001-46084 beschriebenen Verfahren gewonnen werden.
Das Styren-Divinylbenzen-Copolymer mit feinen Poren mit einem mittleren Durchmesser von 200–500 Å (nachstehend als „der vorliegende Immobilisierungsträger" bezeichnet) wird meistens in Form von Teilchen verwendet. Das Styren-[)ivinylbenzen-Copolymer besteht aus 30 % Styren und 70 % Divinylbenzen.
Die spezifische Oberfläche des vorliegenden Immobilisierungsträgers beträgt 10–1500 m²/g, und das Porenvolumen beträgt 0,1–3 ml/g. Ein spezielles Beispiel ist unter anderem das Produkt mit dem Handelsnamen „Diaion HP20SS" von Mitsubishi Chemical Corporation.
Im Hinblick auf die Wirksamkeit der Reaktion werden Polymerteilchen mit einem kleinen Durchmesser bevorzugt verwendet. Insbesondere werden Teilchen mit einer mittleren Korngröße von 50–200 μm verwendet, und es werden die Teilchen mit einer Korngröße von 60– 110 μm, die bei der Korngrößenverteilung 60 % oder mehr ausmachen, bevorzugt. Ein spezielles Beispiel für den vorliegenden Träger, dessen Teilchen diesen geeigneten Durchmesser haben, ist unter anderem das Produkt mit dem Handelsnamen „Diaion HP20SS" von Mitsubishi Chemical Corporation.
Das erfindungsgemäße Enzympräparat kann normalerweise dadurch hergestellt werden, dass das vorliegende Protein mit dem vorliegenden Träger in Kontakt gebracht wird. Der Prozess des In-Kontakt-Bringens des vorliegenden Proteins mit dem Träger wird normalerweise durch Zugeben des Trägers zu einer das vorliegende Protein enthaltenden Lösung durchgeführt, und das entstehende Gemisch wird gerührt.
Das vorstehend verwendete Protein kann in Form eines gereinigten Proteins, eines Rohproteins o. Ä. zum Einsatz kommen.
Das vorliegende Protein oder seine Lösung kann beispielsweise nach bekannten Verfahren, die in JP-A-2001-46084 beschrieben sind, gewonnen werden. Insbesondere kann es durch Kultivieren z. B. des E.-coli-Stamms JM105/pYHNK2, der die DNA der SEQ ID NO: 2 trägt, die aus ATCC11492 in bekannter Weise, wie etwa cDNA-Herstellung, nach einem Protokoll des Bio-sogo-Katalogs 1997/98, Bd. 1, E-24-27, hergestellt wird, das die gewünschte Enzymaktivität, Primer-Herstellung und PCR-Reaktion angibt, die diesen verwendet.
Das gewonnene Protein kann nach bekannten Reinigungsverfahren gereinigt werden. Es werden beispielsweise geeignete Mikrobenzellkulturen aufgespalten. Dieser Prozess zur Aufspaltung kann beispielsweise dadurch durchgeführt werden, dass die Mikrobenzellen z. B. durch Zentrifugieren aus der Mikroorganismenkultur und anschließende physische Aufspaltung der Mikrobenzellen, wie etwa durch Ultraschallbehandlung, sowie Zugabe eines niederen Alkohols, wie etwa Ethanol, zu der Mikroorganismenkultur und eine Weile Absitzenlassen o. Ä. gewonnen werden. Die entstehende Aufspaltungslösung wird zentrifugiert, mit einem Membranfilter o. Ä. filtriert, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und dadurch kann eine klare Lösung, die das vorliegende Protein enthält, hergestellt werden.
Außerdem kann das vorliegende Protein auch durch Fraktionieren der so gewonnenen klaren Lösung wahlweise unter Verwendung eines Trennungs-/Reinigungsverfahrens, wie etwa Kationenaustauschchromatographie, Anionenaustauschchromatographie, Chromatographie und Gelchromatographie, weiter gereinigt werden.
Die Temperatur, die verwendet wird, wenn das vorliegende Protein in Kontakt mit dem vorliegenden Träger gebracht wird, liegt normalerweise in dem Bereich von 1–37°C und vorzugsweise in dem Bereich von 5–15°C. Die Dauer für den Kontakt beträgt normalerweise 1– 48 Stunden. Wenn sie miteinander in Kontakt gebracht werden, kann der pH normalerweise im Bereich von 4–10 und vorzugsweise im Bereich von 6–8 liegen.
Die Menge des Trägers liegt normalerweise im Bereich von 0,01–1 g und vorzugsweise im Bereich von 0,08–0,12 g je 1000 Einheiten des vorliegenden Proteins (1 Einheit ist die Menge des vorliegenden Proteins, mit der ein racemischer N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester hydrolysiert werden kann, um 1 μMol N-Benzylazetidin-2-carbonsäure in 1 Minute herzustellen).
Die Aktivität des vorliegenden Enzyms kann beispielsweise durch Herstellen einer Reaktionslösung durch Zugabe von 0,02 g racemischer N-Benzylazetidincarbonsäureethylester und 1,0 ml Methyl-t-butylether zu 3,5 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der ein Protein enthält, 1- bis 24-stündiges Schütteln dieser Reaktionslösung bei etwa 30 bis 35°C und anschließendes Analysieren der (S)-Form-Menge der N-Benzylazetidin-2-carbonsäure bestimmt werden, die in der wässrigen Schicht vorhanden ist, die durch Zentrifugieren des so erhaltenen Reaktionsgemisches gewonnen wird.
Die Immobilisierung des vorliegenden Proteins auf den Träger kann beispielsweise durch Verfolgen der Fähigkeit der das vorliegende Protein enthaltenden Lösung, den racemischen N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester zu hydrolysieren, überwacht werden.
Das erfindungsgemäße immobilisierte Enzym, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wird, kann durch Filtrieren, Zentrifugieren o. Ä. abgetrennt werden.
Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Erfindung erläutert. Die Reaktion der vorliegenden Erfindung wird normalerweise durch Reagieren eines racemischen N-substituierten cyclischen Iminoesters der Formel (1) mit dem Enzympräparat oder dem immobilisierten Enzym der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
Die Reaktion wird normalerweise in Gegenwart von Wasser durchgeführt. Wasser kann eine wässrige Pufferlösung sein.
Die Menge des Wassers beträgt normalerweise 0,5 Mol oder mehr je Mol N-substituierte cyclische Iminoesterverbindung der Formel (1 ). Als Lösungsmittel kann Wasser verwendet werden.
Außerdem können außer Wasser auch organische Lösungsmittel, wie etwa hydrophobe organische Lösungsmittel, hydrophile organische Lösungsmittel o. Ä., gleichzeitig bei der Reaktion vorhanden sein. Beispiele für hydrophobe organische Lösungsmittel sind unter anderem Ether, wie etwa t-Butylmethyleter und Isopropylether, sowie Kohlenwasserstoffe, wie etwa Toluen, Hexan, Cyclohexan, Heptan und Isooctan. Beispiele für hydrophile organische Lösungsmittel sind unter anderem Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, 2-Propanol und 1,1- Dimethylethanol; Ketone, wie etwa Aceton; und Nitrile, wie etwa Acetonitril. Diese hydrophoben organischen Lösungsmittel und hydrophilen organischen Lösungsmittel können allein oder als Kombination aus zwei oder mehr Lösungsmitteln zum Einsatz kommen. Es können auch ein hydrophobes organisches Lösungsmittel, ein hydrophiles organisches Lösungsmittel und ein Gemisch daraus verwendet werden.
Wenn ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, beträgt dessen Menge normalerweise 100 Masseteile oder weniger, vorzugsweise 0,1–50 Masseteile, je Masseteil N-substituierte cyclische Iminoester-Verbindung der Formel (1).
Die Reaktion wird normalerweise durch Rühren, Schütteln o. Ä. so durchgeführt, dass die N-substituierte cyclische Iminoester-Verbindung der Formel (1), das erfindungsgemäße immobilisierte Enzym und zusätzlich organisches Lösungsmittel o. Ä. bei Bedarf gemischt werden.
Der pH des Reaktionsgemisches wird unter Berücksichtigung der Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion entsprechend eingestellt, normalerweise in dem Bereich von 4–10 und vorzugsweise in dem Bereich von 6–8. Die Reaktionstemperatur liegt in Anbetracht der Stabilität und der Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion normalerweise in dem Bereich von 0–70°C und vorzugsweise in dem Bereich von 0–40°C.
Die Menge des Enzympräparats bei der Reaktion kann zwar entsprechend der Katalysatoraktivität des Enzympräparats (immobilisiertes Enzym) festgelegt werden, aber sie ist normalerweise so, dass ein Verhältnis von 0,001–0,1 Masseteile je Masseteil N-substituierte cyclische Iminoester-Verbindung der Formel (1) erreicht wird.
Der Endpunkt der Reaktion kann beispielsweise durch Verfolgen des Umsetzungsverhältnisses der N-substituierten cyclischen Iminoester-Verbindung der Formel (1) in dem Reaktionsgemisch mittels Flüssigchromatographie o. Ä. bestimmt werden. Die Reaktion wird in Anbetracht der Selektivität der Reaktion normalerweise an einem Punkt beendet, wo das Umsetzungsverhältnis der N-substituierten cyclischen Iminoester-Verbindung der Formel (1) nicht größer als 50 % ist. Die Reaktionszeit liegt normalerweise in dem Bereich von etwa 5 Minuten bis etwa 4 Tagen.
Nach Abschluss der Reaktion kann die (S)-N-substituierte cyclische Iminosäure der Formel (2) beispielsweise durch Filtrieren des Reaktionsgemisches, anschließende Phasentrennung des wässrigen Filtrats und der organischen Phase (Hexan, Heptan, t-Butylmethylether, Ethylacetat, Toluen o. Ä.) zum Entfernen der nichtumgesetzten Ausgangsverbindung, gegebenenfalls Ionenchromatographie der wässrigen Schicht zum Eliminieren von Salzen und anschließendes Eindicken abgetrennt werden. Außerdem kann das Produkt durch Säulenchromatographie o. Ä. gereinigt werden.
Homologe
Hier wird auf Homologe der SEQ ID NO: 1 verwiesen. Diese Homologe haben normalerweise eine Homologie von mindestens 70 %, vorzugsweise eine Homologie von mindestens 80 %, 90 %, 95 % oder 97 %, beispielsweise über eine Region von mindestens 15, 20, 30, 100 oder mehr aneinandergrenzenden Aminosäuren der SEQ ID NO: 1 und vorzugsweise über die Region, die von den Aminosäuren an den Positionen 35 bis 255 oder 79 bis 255 der SEQ ID NO: 1 definiert wird. Die Homologie kann aufgrund der Aminosäuren-Identität berechnet werden (gelegentlich als „harte Homologie" bezeichnet).
Das UWGCG-Package stellt beispielsweise das BESTFIT-Programm bereit, das zur Berechnung der Homologie verwendet werden kann (wird beispielsweise mit seinen Standardeinstellungen verwendet) (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Mit den Algorithmen PILEUP und BLAST können die Homologie berechnet oder Sequenzen abgeglichen werden [wie etwa Identifizieren von äquivalenten oder entsprechenden Sequenzen (normalerweise mit ihren Standardeinstellungen)], wie es beispielsweise in S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Evol. 36, 290–300, und S. F. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403– 410, beschrieben ist.
Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus umfasst zunächst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hohem Punktwert (HSPs) durch Identifizieren von Kurzwörtern der Länge W in der Abfrage-Sequenz, die entweder mit einem positiv bewerteten Schwellen-Punktwert T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn sie auf ein Wort der gleichen Länge in einer Datenbank-Sequenz ausgerichtet sind. T wird als Nachbarwort-Punktwertschwelle bezeichnet (Altschul et al., s. o.). Diese anfänglichen Nachbarworttreffer fungieren als Keime zum Initiieren von Suchprozessen zum Auffinden von HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so weit erweitert, wie der kumulative Ausrichtungspunktwert erhöht werden kann. Erweiterungen für die Worttreffer in jeder Richtung werden gestoppt, wenn: der kumulative Ausrichtungspunktwert um die Größe X von seinem erreichten Höchstwert absinkt; der kumulative Punktwert durch Akkumulation einer oder mehrerer Rest-Ausrichtungen mit negativem Punktwert null oder kleiner wird; oder das Ende einer Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellungen eine Wortlänge (W) von 11, die Auswertematrix BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915–10919, Ausrichtungen (B) von 50, einen Erwartungswert (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z. B. Karlin und Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873–5887. Ein Maß für die Ähnlichkeit, das von dem BLAST-Algorithmus geliefert wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit [P(N)], die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Aminosäuresequenzen zufällig auftritt. Beispielsweise wird eine Sequenz als mit einer anderen Sequenz ähnlich angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit beim Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, vorzugsweise kleiner als etwa 0,1, besser kleiner als etwa 0,01 und am besten kleiner als etwa 0,001 ist.
Die homologe Sequenz weicht normalerweise von SEQ ID NO: 1 (oder einer der vorgenannten Regionen von SEQ ID NO: 1) um weniger als 5, weniger als 10, weniger als 20, weniger als 50 oder weniger als 100 Mutationen (die jeweils eine Substitution, Deletion oder Insertion sein können) ab. Diese Mutationen können über eine der vorgenannten Regionen für die Berechnung der Homologie gemessen werden. Die Substitutionen sind vorzugsweise konservative Substitutionen. Diese sind in der nachstehenden Tabelle definiert. Aminosäuren in dem gleichen Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen Zeile in der dritten Spalte können miteinander substituiert werden.
Beispiele
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, aber die vorliegende Erfindung soll die Erfindung nicht darauf beschränken.
Beispiel 1
Mit Wasser gereinigtes Diaion HP20SS (Handelsname von Mitsubishi Chemical Corporation), ein Produkt, das durch Mischen von 12 g Diaion HP20SS und 300 ml Wasser, anschließendes 30-minütiges Rühren, Filtern und weiteres Waschen mit 400 ml Wasser hergestellt worden war, wurde mit 600 g einer klaren Lösung aus dem Protein gemischt, das wie nachstehend beschrieben hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei 10°C gerührt. Dann wurde das Gemisch filtriert und mit 400 g Wasser gereinigt, sodass 12,5 g immobilisiertes Enzym entstanden.
3,5 ml 100 mM Monokaliumhydrogenphosphat-Dikaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) wurden mit 50 mg des vorstehend beschriebenen immobilisierten Enzyms und 1,0 ml t-Butylmethylether versetzt, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei 35°C inkubiert. Dies wurde mit 0,02 g N-Benzylazetidin-2-carbonsäureethylester versetzt und anschließend 16 Minuten bei 35°C hin- und hergeschüttelt (120 Stöße/min). Anschließend wurden 400 μl dieses Reaktionsgemisches mit 1 ml t-Butylmethylether versetzt, und das Gemisch wurde 5 Minuten mit 12.000 U/min zentrifugiert. 200 μl der so erhaltenen wässrigen Schicht wurden in 20 mM Monokaliumhydrogenphosphat/Acetonitril (90110) gelöst, und die Lösung wurde durch ein 0,2-μm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterzogen. Durch Nachweisen der (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure wurde bestätigt, dass das so gewonnene immobilisierte Enzym die gewünschte Aktivität hatte.
Beispiel 2
77 g Wasser wurden mit 0,5 g des in Beispiel 1 hergestellten immobilisierten Enzyms und 65 g Etyhl-N-benzylazetidin-2-carboxylat versetzt, und das Gemisch wurde anschließend 10 Stunden bei 10°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 65 g Methylisobutylketon und 36 g Ethanol versetzt und 30 Minuten weitergerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 65 g Methylisobutylketon und 6,5 g Ethanol versetzt und anschließend 30 Minuten gerührt und dann getrennt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die so entstandene wässrige Schicht wurde unter reduziertem Druck (10 kPa oder weniger) eingedickt, sodass 60 g rohe (S)-N-Benzylazetidin-2-carbonsäure (43 Masse-%) entstanden.
Bedingungen für die Analyse von N-Benzylazetidin-2-carbonsäure:
Hochleistungs-Flüssigchromatographie:

Säule: ODS-A212 (hergestellt von Sumika Analysis Center Co., Ltd.)
Mobile Phase: 20 mM Monokaliumhydrogenphosphat/Acetonitril (90/10)
Flussgeschwindigkeit: 1 ml/min
Säulentemperatur: 40°C
Detektor: UV (220 nm)
Retentionszeit der N-Benzylazetidin-2-carbonsäure: 5,5 min

Herstellung der klaren Lösung des vorliegenden Enzyms
10 ml sterilisiertes Medium (hergestellt durch Auflösen von 5 g Glycerol, 6 g Hefeextrakt, 4 g Monokaliumhydrogenphosphat, 9,3 g Dikaliumphosphat in 1000 ml Wasser) wurden mit 10 μl einer wässrigen Ampicillin-Lösung (50 mg/ml) und 0,1 ml Glycerol-Ausgangsmaterial des E.-coli-Stamms JM105/pYHNK2 (siehe JP-A-2001-46084) versetzt. Das Gemisch wurde dann 9 Stunden bei 30°C geschüttelt. Die entstandene Kulturlösung wird als „Kulturlösung A" bezeichnet.
15.000 ml sterilisiertes flüssiges Medium (hergestellt durch Auflösen von 225 g Glycerol, 150 g Hefeextrakt, 225 g Multi-Aminosäuren F, 60 g Monokaliumhydrogenphosphat, 36 g Magnesiumsulfat, 0,6 g Eisen(II)-sulfatheptahydrat und Calciumchloriddihydrat in 13.000 ml Wasser und weiteres Zugeben von Wasser, sodass eine Gesamtmenge von 150.000 ml entstand) wurden mit einer wässrigen 4 M Phosphorsäurelösung und 14 Masse-% wässriger Ammoniak versetzt, um den pH auf 7,0 einzustellen. Dies wurde mit 7,5 ml der vorstehend beschriebenen Kulturlösung A versetzt, und unter Rühren wurde eine aerobe Kultivierung bei 30°C durchgeführt. 14 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde ein sterilisiertes flüssiges Medium (hergestellt durch Auflösen von 280 g Hefeextrakt und 420 g Multi-Aminosäuren F in einem Gemisch aus 1100 g Wasser und 1500 g Glycerol) schrittweise zugegeben. Außerdem wurde 18 Stunden nach Beginn der Kultivierung Isopropyl-thio-β-D-galactosid bis zu einer Konzentration von 50 μM zugegeben.
40 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde die Kulturlösung mit 1950 ml Ethanol versetzt und dann 24 Stunden bei 30°C weitergerührt. Anschließend wurden 6000 g dieses Gemisches zurückgewonnen und mit 6200 g Wasser gemischt. Die Lösung wurde kontinuierlich zentrifugiert (20.000 U/min, Durchflussgeschwindigkeit: 130 ml/min), sodass ein Zentrifugierungsüberstand von 11.200 g entstand. Dieser Zentrifugierungsüberstand wurde mit 220 g Radiolyte # 200 (Handelsname von Showa Chemical Industry Co., Ltd.) versetzt und dann gerührt. Die Lösung wurde dann mit Radiolyte # 200 filtriert, sodass eine klare Lösung des vorliegenden Proteins entstand.
Mit dem erfindungsgemäßen immobilisierten Enzym können (S)-N-substituierte cyclische Iminosäuren der Formel (2) effizient großtechnisch hergestellt werden. SEQUENCE LISTING

Claims

Präparat mit einem immobilisierten Enzym mit: (I) einem Styren-Divinylbenzen-Copolymer mit feinen Poren mit einem mittleren Radius von 200–500 Å, einer mittleren Korngröße von 50–200 μm, einer spezifischen Oberfläche von 10–1500 m²/g und einem Porenvolumen von 0,1–3 ml/g, wobei das Copolymer ein Copolymer mit 30 % Styren und 70 % Divinylbenzen ist; und (II) einem an dem Copolymer immobilisierten Enzym, das N-substituierten cyclischen C3-C4-Imino-2-carbonsäureester asymmetrisch hydrolysieren kann, um vorzugsweise eine (S)-N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäure herzustellen, wobei das Enzym eine der folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) aufweist: (a) eine Aminosäuresequenz, die bei SEQ ID NO: 1 angegeben ist; (b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten an den Positionen 35 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht; (c) eine Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz dargestellt wird, die den Aminosäureresten an den Positionen 79 bis 255 bei SEQ ID NO: 1 entspricht; oder (d) eine Aminosäuresequenz, die mit der bei SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu 90 % oder mehr identisch ist.
Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Aminosäuresequenz hat, die mit einer Nucleotidsequenz codiert ist, die die in 1 angegebenen Restriktionsorte hat.
Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der N-substituierte cyclische C3-C4-Imino-2-carbonsäureester ein N-substituierter cyclischer Imino-Ester der Formel (1) ist:
worin R¹ eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt, wobei die Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Aralkylgruppe oder Arylgruppe an ihrem aromatischen Ring durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und R² eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkylcarbonylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Arylsulfonylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt, wobei die Aralkylgruppe, Arylcarbonylgruppe, Aralkyloxycarbonylgruppe, Aryloxycarbonylgruppe, Arylgruppe oder Arylsulfonylgruppe an einem oder mehreren Wasserstoffatomen, das/die an deren aromatischen Ring gebunden ist/sind, durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Alkylcarbonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und n 1 oder 2 darstellt.
Enzympräparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ eine C1-C4-Alkylgruppe und R² eine Benzylgruppe darstellt.
Enzympräparat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ eine Methyl- oder Ethylgruppe darstellt, R² eine Benzylgruppe darstellt und n 1 ist.
Verfahren zur Herstellung einer (S)-N-substituierten cyclischen Iminosäure der Formel (2):
worin R² eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkylcarbonylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkyloxycarbonylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 8 bis 14 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyloxycarbonylgruppe mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Aryloxycarbonylgruppe mit 7 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Arylsulfonylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt, wobei die Aralkylgruppe, Arylcarbonylgruppe, Aralkyloxycarbonylgruppe, Aryloxycarbonylgruppe, Arylgruppe oder Arylsulfonylgruppe an einem oder mehreren Wasserstoffatomen, das/die an deren aromatischen Ring gebunden ist/sind, durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Alkylcarbonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und n 1 oder 2 darstellt, das das Reagieren eines N-substituierten cyclischen Imino-2-carbonsäureesters der Formel (1)
worin R¹ eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, darstellt, wobei die Alkylgruppe durch mindestens eine der Gruppen Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und wobei die Aralkylgruppe oder Arylgruppe an ihrem aromatischen Ring durch mindestens eine der Gruppen Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Halogenatom und Nitrogruppe substituiert sein kann, und R² und n die gleiche Bedeutung wie vorstehend haben, mit einem Enzympräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ eine C1-C4-Alkylgruppe darstellt und R² eine Benzylgruppe darstellt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ eine Methyl- oder Ethylgruppe darstellt, R² eine Benzylgruppe darstellt und n 1 ist.