DE2717965C2

DE2717965C2 - Verfahren zur Herstellung von porösen Zelluloseperlen

Info

Publication number: DE2717965C2
Application number: DE19772717965
Authority: DE
Inventors: Li Fu Lafayette Ind. Chen; George Tsu-Ning Tsao
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1976-04-22
Filing date: 1977-04-21
Publication date: 1986-06-26
Also published as: DK175777A; FR2348942A1; JPS638121B2; SE8204400D0; SE8204400L; FR2348942B3; SE452161B; SE434848B; GB1575700A; SE7704338L; JPS52129788A; CA1076047A; DK158005C; DE2717965A1; DK158005B

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man in Stufe (b) die Lösung durch Versprühen verteilt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Zellulosederivat Zelluloseacetat verwendet und die Hydrolyse in einer kaustischen Lösung durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel eine Mischung von

(a) Aceton, eine Mischung von Aceton und Methanol oder Ethanol, Methylacetat, Methylendichlorid und Methanol, Methylethylketon, Formamid und/oder Dimethylsulfoxid und

(b) Dimethvlsalfoxid, Formamid, Methylacetat Cyclohexanon, Methylendichlorid, Ethylendichlorid, eine Mischung von Methylendichlorid und Methanol und/oder eine Mischung von Ethylendichlorid und Methanol

verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man Perlen mit einem Porenvolumen von 75 bis 95% herstellt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Diisocyanat verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Diisocyanat Tolylen-2,4-diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Epichlorhydrin in einer Natriumhydroxidlösung verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Formaldehyd in einer Salzsäurelösung verwendet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd verwendet.

11. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellten porösen Zelluloseperlen, gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung, zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien und zur Trennung und Reinigung von Enzymen, Proteinen und Nukleinsäuren.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von porösen Zelluloseperlen, die sich als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Agentien eignen. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien und zur Trennung und Reinigung von Enzymen, Proteinen und Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen können auch zur Entfernung von Metallionen aus Lösungen verwendet werden.

(tV, Poröse Zelluloseperlen stellen ein verhältnismäßig billiges stabiles Material mit vielseitigen chemischen

'y Eigenschaften dar. So eignen sie sich z. B. als Träger für immobilisierte Enzyme und andere aktive biologische

!>.; Agentien.

Jv' Wenngleich gewöhnliche Zelluloseteilchen und regenerierte Zellulosepulver die meisten der an gute Träger

' 65 für immobilisierte Enzyme gestellten Anforderungen erfüllen, weisen sie strukturelle Nachteile auf, die bewirken, daß die Packung von Reaktoren zu fest wird, was wiederum zu einer Verringerung des Durchflußcs und .; manchmal zu Kanalbildung und somit zu einem unzulänglichen Kontakt zwischen den immobilisierten Enzymen

und dem strömenden Reaktionsmedium fürt. Die Immobilisierung von Enzymen auf einem unlöslichen Träger ist

eine weit verbreitete Verfahrensweise zur praktischen Anwendung von Enzymen, um zu vermeiden, daß bei jedem Einsatz frische Enzyme verwendet werden müssen. Durch die Immobilisierung der Enzyme wird eine Stabilisierung erreicht, die eine effektive Verwendung von Enzymen und den Einsatz von kontinuierlich arbeilenden Enzymreaktoren ermöglicht.

Die erfolgreiche Anwendung von immobilisierten Enzymen hängt zu einem großen Teil von den Eigenschaften des für die Immobilisierung verwendeten Trägers ab. Dementsprechend soll ein guter Träger billig sein und eine solche Form besitzen, die für die Vewendung in Reaktoren geeignet ist Hinsichtlich dieser Erfordernisse sind kugelförmige Perlen besonders erwünscht, da sie sich besonders für Festbetten, Wirbelbetten, expandierte Betten, Rührkessel und andere übliche Reaktortypen eignen. Ein solcher Träger soll außerdem eine geeignete physikalische und mechanische Festigkeit besitzen, so daß er nicht zerbricht oder deformiert wird, wenn er in eine hohe Säule gepackt wird. Das Zerfallen und die Deformation des Trägers in der Säule führen zu einem zu fest gepackten Bett, wodurch der Durchfluß flüssiger Reagenzien durch die Säule behindert wird und die Effektivität des Reaktors sich vermindert Geeignete Träger sollen ferner vielseitige chemische Eigenschaften besitzen, so daß die Immobilisierung von Enzymen und anderen biologischen Agentien auf dem Träger durch ionische oder kovalente Bindung oder auch durch Obeflächenadsorption leicht erreicht werden kann. Dementsprechend soll der Träger eine hohe Kapazität zur Bildung einer großen Zahl von Bindungen besitzen, so daß jede Trägereinheit große Mengen des gewünschten Enzyms immobilisieren kann. Besonders geeignet, ist also ein Träger mit hoher Porosität und gleichmäßig verteilten inneren Poren. Eine solche Porosität erlaubt eine gute Diffusion von chemischen Reagentien oder Reaktionsprodukten in die inneren Poren er Zelluloseperlen und ebenfalls aus diesen heraus. Träger sollen chemisch stabil, physikalisch fest und aus einem inerten Material hergestellt sein, das mikrobiologischen Angriffen, die eine Zerstörung des Trägers bewirken, v.derstehen, um ein immobilisiertes Enzymsystem mit einer verlängerten Lebensdauer zu liefern.

Zur Zeit werden für die Immobilisierung von Enzymen poröse Glas- und Keramikteilchen verwendet Wenngleich solche Teilchen die meisten Anfordei ungen erfüllen, sind sie jedoch verhältnismäßig teuer. Darüber hinaus ist die Zahl der chemischen Reaktionen, die für die Immobilisierung von Enzymen auf Glas- und Keramikträgern verwendet werden können, begrenzt

In den US-Patentschriften 39 47 325,39 05 954,35 73 277, 35 05 299, 35 01 419, 33 97 198, 32 96 000, 32 51 824, 32 36 669,28 43 583,27 73 027,25 43 928 und 24 65 343 wird die Herstellung einer Vielzahl von Zellulosematerialien in einer Vielzahl von Formen beschrieben, von denen einige für die Fixierung biologisch aktiver Materialien wie Enzyme oder von lonenaustauschgruppen geeignet sein sollen. Diese Verfahren haben jedoch auch den Nachteil, daß sie teuer sind und die Produkte eine für die Verwendung in solchen chemischen Reaktoren wie Fesibetten und Wirbelbetten unerwünschte Körperform besitzen. Insbesondere liefern die bekannten Verfahren keine kugelförmigen Zelluloseperlen mit einer gleichmäßigen Porenverteilung über die gesamte Oberfläche und einem großen, aus gleichförmigen Poren bestehenden, inneren Porenvolumen. Darüber hinaus besitzen die bekannten Zelluloseteilchen und -pulver im allgemeinen so kleine Teilchengrößen, daß sie für die Vewendung in chemischen Reaktoren nicht geeignet sind. Außerdem besitzen die bekannten Zellulosepulver und -teilchen oft eine harie Oberfiächenschicht, die eine ernsthafte Behinderung der Diffusion und eine uneffektive Verwendung in chemischen Reaktoren bewirkt.

Der Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, billige, hochporöse, stabile Teilchen mit vielseitigen chemischen Eigenschaften, die sie als Träger für immobilisierte Enzyme oder andere biologisch aktive Materialien geeignet machen, zu liefern. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, poröse Zelluloseperlen mit verbesserter physikalischer und mechanischer Stabilität und ausreichend großer Oberfläche für eine hohe Immobilisierungskapazität für Enzyme zu liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein hvdrolysierbares Zelluloserterivat in einem inerten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 :20 bis 1 :3 Gewicht/Volumen zu einer Lösung mit größerer Dichte als die Ausfällungslösung auflöst,

(b) die so hergestellte Lösung in Form von Tröpfchen in einer aus Wasser, einer wäßrigen Lösung von nicht-ionischen odor ionischen Tensiden, einer Mischung von Wasser und Ethanol oder Methanol oder einem Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch bestehenden Aisfällungslösung verteilt und dadurch das Zellulosederivat in Form von gleichmäßig porösen Perlen ausfällt,

(c) die ausgefällten Perlen von der Lösung abtrennt,

(d) die abgetrennten porösen Perlen mit Wasser wäscht,

(e) die gewaschenen Perlen zur Umwandlung in Zellulose und zur Vermehrung der aktiven Stellen für die Kopplung mit Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien hydrolysiert,

(f) die hydrolysierten Perlen unter Erhalt poröser Zelluloseperlen mit gleichmäßig verteilten Poren und einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-% wäscht und

(h) gegebenenfalls die porösen Zelluloseperlen zur Herstellung vernetztet "oröser Zelluloseperlen vor oder nach der Hydrolyse mit mindestens einem Vernetzungsmittel vernetzt.

Die erfindungsgemäß hergestellten hochporösen Zelluloseperlen mit einer gleichförmigen Porosität eignen sich besonders für die Immobilisierung von Enzymen. Darüber hinaus sind sie auch geeignet zur Reinigung und Trennung von Enzymen, Proteinen, Nukleinsäuren und ähnlichen Verbindungen sowie zur Abtrennung von Mctallionen aus verdünnten Lösungen. Aufgrund ihrer Porosität und ihrer guier mechanischen Stabilität liefern die erfindungsgemäü hergestellten Zelluloseperlen bei Verwendung in Festbettreaktoren einen hervorragenden Durchgang von Flüssigkeiten und unterliegen keinen Zerfalls- und Deformierungserscheinungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert poröse ZelluloseDerlen, die sich als Träeer für Enzvme und andere

biologisch aktive Agentien eignen. Ferner ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Veränderung der chemischen und physikalischen Eigenschaften von aus Zellulosederivaten hergestellten porösen Perlen. Wenngleich gewöhnlich mikrokristalline Zellulose- und andere aus Zellulose hergestellte Teilchen viele der wesentlichen Erfordernisse für geeignete Enzymträger erfüllen, neigen diese Teilchen jedoch dazu, unter Druck eine zu dichte Packung zu ergeben und liefern außerdem keine ausreichende Porosität, um ausreichend große Enzymmengen daran zu koppeln. Zellulosederivate sind im allgemeinen billig und liefern bei erfindungsgemäBer Verarbeitung ein sehr vielseitiges, im allgemeinen biologisch inertes Material für chemische Reaktionen. Dementsprechend besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen viele für die Verwendung als Träger von immobilisierten Enzymen erwünschte Eigenschaften.

Durch das erfindungsgemäße Auflösen eines Zellulosederivats in einem ausgewählten Lösungsmittel und das Verteilen desselben in einer ausgewählten Ausfällungslösung ist es möglich, Zelluloseperlen mit sehr gleichförmiger Porosität und überlegenen chemischen und physikalischen Eigenschaften herzustellen. Die erfindungsgemäß hergestellten Perlen sind hochporös, wobei die Poren im allgemeinen gleichmäßig über die Oberfläche und im Inneren der Perlen verteilt sind. Durch geeignete Auswahl der Lösungsmittel und der Ausfällungslösungen kann die Porengröße reguliert werden. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß sowohl die Porengröße als auch die Porenverteilung kontrolliert werden kann. Aus den F i g. 2, 4a und b geht

hervor, daß die Porenöffnungen gleichmäßig über die Perlenoberfläche verteilt sind und etwa 1000 Ä groß sind, was eine geeignete Größe für die Bewegung von Enzym- und Reagenzmolekülen in den Poren ist.

Das inerte, organische, mit wasser mischbare Lösungsmittel kann eine einzige Fiüssigkeii ouci cine Kornbination von Flüssigkeiten sein. Es ist wichtig, daß man eine richtige Kombination von inertem, organischem Lösungsmittel und Ausfällungslösung verwendet, um poröse Zelluloseperlen mit der gewünschten Form und Porosität zu erhalten. Das inerte, organische, mit Wasser mischbare Lösungsmittel kann eine Kombination von Flüssigkeiten sein, die zusammen mit dem Zellulosederivat eine Lösung liefern, die beim Vermischen mit der Ausfällungslösung zu einer Phaseninversion führt, wodurch das Zellulosederivat in Form von porösen Perlen koaguliert. Das inerte organische Lösungsmittel enthält dementsprechend eine Komponente (a), die gekennzeichnet ist als eine Flüssigkeit, die in der Lage ist, das Zellulosederivat, wie beispielsweise Zelluloseacetat, aufzulösen und in der Ausfällungslösung löslich ist.

Eine zweite Komponente (b) des Lösungsmittelsystems ist eine rlüssigkeit, die in der Komponente (a) und auch in der Ausfällungslösung löslich ist und die in der Lösungsmittellösung in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, so daß die Dichte der fertigen Lösungsmittellösung (einschließlich des Zellulosederivats) ausreichend höher als die Dichte der Ausfällungslösung ist und beim Verteilen der Lösungsmittellosung in Form von Tröpfchen in der Ausfällungslösung die Zellulose koaguliert und als poröse Perlen mit der gewünschten Größe und Porosität ausfällt. Die Komponente (b) des Lösungsmittels wird zur Regulierung der Oberflächenaktivität der Lösungsmittellösung verwendet, so daß die Lösungsmittellösungstropfen ihre Form beim Kontakt mit der Ausfällungslösung behalten. Die Komponente (b) dient ferner dazu, Porengröße und die Porosität der ausgefällten Perlen zu regulieren. In einigen Fällen können die Komponente (a) und die Komponente (b) gleich sein. In anderen Fäüen kann es von Vorteil sein, zur Herstellung von Komponente (a) und/oder Komponente (b) eine oder mehrere Flüssigkeiten zu verwenden.

Der Begriff »Ausfällungslösung« ist definiert als eine flüssige Lösung, die kein Lösungsmittel für das Zellulosederivat und mit dem obigen inerten, organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel mischbar ist. Die Ausfällungslösung kann beispielsweise Wasser oder eine wäßrige Lösung sein. Die Ausfällungslösung ist also sowohl mit der Komoponente (a) als auch mit der Komponente (b) mischbar. Wenn man also das Zellulosederivat in dem organischen Lösungsmittel auflöst und anschließend einen Tropfen der resultierenden Lösungsmittellösung zu der Ausfällungslösung gibt, koaguliert das Zellulosederivat und fällt aufgrund der Phaseninversion unter Bildung der gewünschten porösen Zelluloseperie aus.

Natürlich kann das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung poröser Zelluloseperlen in verschiedener Weise variiert werden. Außer Zelluloseacetat können auch andere Zellulosederivate als Ausgangsmaterial für die Herstellung von porösen Perlen, wie z. B. Zellulosenitrat und Methylzellulose, verwendet werden. Die Bezeichnungen »Zeiiuiosederivat« und »hydroiisierbares Zeliuiosederivat« schließen solche Materialien ein, a<js denen Zellulose beispielsweise durch Hydrolyse oder Hydrierung regeneriert werden kann.

Die organischen Lösungsmittelkomponenten (a) und (b) für das Zellulosederivat müssen gegenüber dem Zellulosederivat chemisch inert sein und vollständig oder im wesentlichen mit der Ausfällungslösung mischbar sein. Es ist von besonderer Bedeutung, daß die Dichte der durch Zugabe des Zellulosederivats zum inerten Lösungsmittel gebildeten Lösungsmittellösung größer ist als die der Ausfällungslösung, in der sie verteilt wird, so daß beim Verteilen der Lösungsmittellösungströpfchen in der Ausfällungslösung die Tröpfchen nach unten sinken, wenn die wäßrige Lösung nicht gerührt wird. Geeignete einzelne Lösungsmittel bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung sind u. a. Dimethylsulfoxid und Methylacetat. Es sei darauf hingewiesen, daß im Handel erhältliche Materialien als Lösungsmittelkomponenten (a) und/oder (b) verwendet werden können und daß diese Materialien Feuchtigkeit enthalten können, was sich in einigen Fällen als vorteilhaft erwiesen hat.

Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung kann man vorteilhafterweise als Lösungsmittelkomponente (a) Aceton, Formamid, eine Mischung von Aceton und Methanol oder Ethanol, Methylacetat, eine Mischung von Methylendichlorid und Methanol, Methylethylketon und/oder Dimethylsulfoxid verwenden. Die Lösungsmittelkomponente (b) kann dementsprechend aus folgenden Lösungsmitteln gewählt werden: Dimethylsulfoxid, Formamid. Methylacetat, Cyclohexanon, Methylendichlorid, Ethylendichlorid. eine Mischung von Methylendichlorid und Metanno! und/oder eine Mischung von Ethyiendichiorid und Methanol.

Eine bevorzugte Lösungsmittelkomponente (a) ist Aceton, aber auch andere Lösungsmittel sind geeignet. Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung kann man eine Lösungsmittelkomponente (a) aus den folgenden Materialien auswählen (die Verhältnisse der Mischungen sind das jeweils erwünschte minimale Verhältnis auf

Volunicnbiisis):

Komponente (a)	Minimales Verhältnis
	(Volumen)
Aceton	_
Aceton + Methanol	60:40
Aceton + Ethanol	60:40
Methylacetat	—
Methylendichlorid + Methanol	80:20
Dimethylsulfoxid	—
Methylethylketon	—
Formamid

IO

Komponente (b)	Minimales Verhältnis
	(Volumen)
Dimethylsulfoxid
Ethylendichlorid + Methanol	60:40
Methylendichlorid + Methanol	60:40
Ethylendichlorid	—
Methylendichlorid	—
Formamid	—
Cyclohexanon	—

Wie schon oben angegeben, besteht die Hauptfunktion der Komponente (a) darin, das Zellulosederivat
aufzulösen. Der Zusatz der Komponente (b) ist notwendig, um eine Lösungsmittellösung mit der erforderlichen
Dichte zu liefern, so daß das Zellulosederivat in der Ausfällungslösung ausfällt. Die Komponente (b) ermöglicht
außerdem die Kontrolle der Porengröße und der gleichmäßigen Porosität der Perlen.

Die Lösungsmittelkompoiiente (b) liefert also das gewünschte spezifische Gewicht der Lösungsmittellösung. 20
Bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung wird bevorzugt Dimethylsulfoxid als Komponente (b)
verwendet. In einigen Fällen können Komponente (a) und Komponente (b) gleich sein, d. h. Dimethylsulfoxid,
Formamid oder Methylacetat, wenn wäßrige Ausfällungslösungen verwendet werden. Verschiedene Materialien, die bei Verwendung einer wäßrigen Ausfällungslösung in geeigneter Weise als Komponente (b) verwendet
werden können, sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben: 25

30 35

Die Lösung von Zellulosederivat und inertem Lösungsmittel soll ein kontrolliertes Zellulosederivat-Lösungsmittel-Verhältnis besitzen, da dieses einen Effekt auf die endgültige Porosität der hergestellten Perlen hat. Im 40
allgemeinen führt ein kleines Verhältnis (größerer Gehalt an Lösungsmittel) zu Perlen mit einer größeren
Porosität. Ein Zellulose-Lösungsmittel-Verhältnis von 1 :20 und 1 :3 (Gewicht/Volumen: einschließlich der j; Komponenten (a) und (b) hat sich als geeignet für die Herstellung von Zelluloseperlen mit verschiedenen
bestimmten Anwendungsmöglichkeiten erwiesen. Vorzugsweise wird ein Zellulosederivat-Lösungsmittel-Ver- ^ hältnis von I : 10 bis 1 :6 (Gewicht/Volumen) verwendet, um eine leicht handhabbare Lösung zu erhalten, die zu 45 X Zellulosepcrlen mit den gewünschten Eigenschaften und mit einem Porenvolumen von mindestens 50 Vol.-%, >':. vorzugsweise 75 bis 95 und insbesondere 75 bis 80 VoI.-% führt. Perlen mit höherer Porosität haben im $, allgemeinen einen größeren Anteil an gleichmäßig verteilten inneren Poren und somit geringerer Diffusionsbe- ßhinderung, sind allerdings etwas schwächer hinsichtlich der physikalischen Festigkeit als Perlen mit geringerer 'd Porosität. 50 ;'i

Die bevorzugte Ausfällungslösung, in der die Lösung des Zellulosederivats verteilt wird, besteht im allgemei- g

nen aus Wasser, kann aber auch eine wäßrige Lösung sein, die geeignete Mengen an nichtionischen oder ||

ionischen Tensiden enthält, um die Oberflächenspannung zu verringern und die Bildung der porösen Perlen zu ja

erleichtern. Die Ausfällungslösung kann außerdem eine Mischung von Wasser und Metahnol oder Ethanol ig

(Volumenverhältnis 50 :50) enthalten. Es ist auch möglich, daß die Ausfällungslösung nicht wäßrig ist, solange 55 ΐϊ

das Zellulosederivat darin unlöslich ist und die Erefordernisse hinsichtlich der Dichte erfüllt sind. Demgemäß M

können Kohlenwasserstoffe wie Cyclohexan, Hexan, Octan, Decan, Benzol und ähnliche so lange verwendet %,

werden, wie sie flüssig sein, eine geringere Dichte als das inerte organische Lösungsmittel besitzen und mit Sj

letzterem mischbar sind. Wenn die Zellulosederivatlösung durch Sprühen mittels einer geeigneten Vorrichtung jy

wie einer Sprühdüse verteilt wird, führen der Druckabfall und die Mischbarkeit des inerten Lösungsmittels mit 60 %

der wäßrigen Lösung zu einer Dispersion und schließlich zur Ausfällung poröser Zellulosederivatperlen. pj

Natürlich muß eine ausreichende Menge an Lösungsmittelkomponente (b) vorhanden sein, damit das das ΐ|

Zellulosederivat enthaltende Lösungsmittel die erforderliche höhere Dichte als die Ausfälungslösung hat. In s|

Tabelle 1 sind eine Reihe von inerten organischen Lösungsmitteln für die Ausfällung eines Zellulosederivats in ff

einer wäßrigen Lösung angegeben. Die angegebenen Verhältnisse sind die minimalen erforderlichen Verhältnis- 65 %

se, um eine Lösungsmitteiiösung zu erhalten, die eine größere Dichte als Wasser hat Je größer das spezifische %

Gewicht der Komponente (b) ist, desto weniger Komponente (b) ist erforderlich, um die minimale Dichte zu U

	27 17 965	Minimales
Tabelle I		Vnlumcnvcrhältni.s a : b
Lösungsmittel		70:30
Komponente(a)	Komponente (b)	80:20
Aceton	Dimethylsulfoxid	80:20
Aceton	Ethylendichlorid	75:25
Aceton	Methyiendichlorid	45:55
Aceton	Formamid	35 :65
Aceton	Cyclohexanon
Aceton	Methylacetat

Nach Herstellung der porösen Perlen wird die Zellulose durch Hydrolyse aus dem Derivat regeneriert, um mehr aktive Stellen für die Enzymankopplung zu schaffen. Zur Regenerierung der Zellulose aus dem Zellulosederivat nach der Bildung der Perlen kann man die substituierten Gruppen (wei Acetat bei Zelluloseacetat) entfernen, um alle normalerweise im Zellulosematerial vorhandenen Hydroxylgruppen zu regenerieren. Je höher der Regenerationsgrad ist, desto stabiler erweisen sich die resultierenden Perlen. In einigen Fällen, in denen Enzyme auf den Zelluloseperlenträgern immobilisiert werden sollen, ist es erwünscht, die Hydroxy- oder andere Substituentengruppen in lunktioneüe chemische Gruppen wie Aminogruppen umzuwandein, die die Ankopplung von Enzymen erleichtern.

Im folgenden soll die Erfindung anhand der Figuren näher erläutert werden; es zeigt

F i g. 1 eine graphische Darstellung der Teilchengrößeverteilung der porösen Perlen,

F i g. 2 eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme einer porösen Zelluloseperle,

F i g. 3 eine graphische Darstellung der Druckabfalleigenschaften der porösen Zelluloseperlen,

Fig.4(A) eine eiektronenmikroskopische Rasteraufnahme der Oberfläche einer porösen Zelluloseperle (20 000 x),

Fig.4(B) eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme des Inneren einer porösen Zelluloseperle (20 000 x).

Die Graphik in F i g. 1 zeigt die Teilchengrößeverteilung der fertigen porösen Perlen, die erhalten werden, wenn man eine Zellulosederivatlösung mittels einer Sprühdüse gemäß dem weiter unten ausführlich beschriebenen Verfahren verteilt. Perlen, die je nach vorgesehener Verwendung zu groß oder zu klein sind, können gesammelt werden und gegebenenfalls wieder in dem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden. Für die Verwendung in einem Säulenreaktor werden im allgemeinen Perlen mit gleichnamiger Größe bevorzugt. Die gewünschte Teilchengröße kann je nach vorgesehener Verwendung der Perlen, z. B. je nach dem zu iir.mobilisierenden Enzym, verschieden sein.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten porösen Zelluloseperlen haben im allgemeinen eine sehr hohe Porosität und eine kontrollierte Porengröße irn Bereich von 0,05 bis 30 μ. Wenn ein Zellulose-Lö sungsmittel-Verhältnis von 1 : 10 (Gewicht/Volumen) zur Herstellung der Zellulose/Lösungsmittel —Lösung verwendet wird, besitzen die fertigen Perlen eine hohe Porosität mit einem Porenvolumen von etwa 90%. Eine elektronenmikroskopische Rasteraufnahme einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten porösen Zelluloseperle ist in den F i g. 2, 4 (A) und 4 (B) gezeigt. Aus diesen Aufnahmen sind verschiedene wichtige Merkmale der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen ersichtlich. Erstens sind die Perlen im allgemeinen kugelförmig, und die Porenöffnungen sind gleichmäßig über die Perlenoberfläche verteilt. Für die meisten Anwendungen ist dies erwünscht, da man einen immobilisierten Enzymkatalysator mit gleichmäßiger Aktivität erhält. Die Hohlraumphase der Zelluloseperlen ist kontinuierlich. Dies ist ein erwünschtes Merkmal, da eine diskontinuierliche, diskrete »Blase« zu einem unbrauchbaren und nicht zugänglichen toten Raum in einem immobilisierten Enzymsystem führen würde. Drittens ist auf der Perlenoberfläche keine harte Schicht vorhanden. Eine harte Oberflächenschicht würde die Diffusion ernsthaft behindern. Schließlich sind die Porengrößen sehr gleichmäßig, so daß die gesamte innere Oberfläche des inneren Porenvolumens der Perlen für die Enzymimmobilisierung und für enzymkatalysierte Rekationen zugänglich ist. Sowohl die hohe Porosität als auch die anderen genannten Merkmale verleihen den erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen eine einzigartige Eignung zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien.

Eine wichtige Eigenschaft eines Enzymträgers ist der Druckverlust, den er bei verschiedenen Flüssigkeitsdurchsätzen durch einen den Träger enthaltenden Enzymreaktor hervorruft. Industriell wird zur Zeit beispicls- weise DEAE-Zellulose als Enzymträger bei der Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet. Bei DEAE-Zellulose ist der Druckabfall jedoch sehr hoch, und dementsprechend können nur flache Betten verwendet werden, um einen vernünftigen Flüssigkeitsdurchsatz zu erhalten. Die Druckabfalleigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen bei Verwendung in einer gepackten Säule sind in F i g. 3, Kurve A. wiedergegeben. Die nominale lineare Durchflußgeschwindigekit ist berechnet durch Division des volumetrisehen Durchsatzes an Einsatzflüssigkeit durch die Säule durch die Säulenquerschnittsfläche. In der Praxis beträgt die nominale lineare Durchflußgeschwindigkeit in industriellen Säulenreaktoren weniger als 0,5 cm/Sekunde. Bei einem Reaktor mit einem Durchmesser von 60,96 cm entspricht eine lineare Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 cm/Sekunge beispielsweise einem volumetrischen Durchsatz von 5254 I/Std. Bei einer typischen industriellen Verfahrensdurchführung zur Herstellung von Fructose aus Glucose beträgt die Zuckerkonzentration im Einsatzstrom etwa 0,5 kg/i. Die obige Durchflußgeschwindigkeit ergibt mehr ais 27 Mio kg Produkt je 61 cm Säule pro Jahr. Aufgrund der erforderlichen Verweilzeit bei der enzymatischen Reaktion beträgt die lineare Durchflußgeschwindigkeit gewöhnlich weniger als 0,5 cm/Sekunde. Daraus ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen hinsichtlich des Druckabfalls keine ernsten verfahrenstech-

nischun Probleme mit sich bringen, wenn sie als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Agentien in .Süulenrcakioren verwendet werden. Wenn die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen nach entsprechender Derivatbildung für andere mögliche Anwendungen (z. B. Entfernung von Tannin aus Furchtsaft, Wein oder Bier sowie von Metallionen aus verdünnten Lösungen) verwendet werden, kann die Durchflußgeschwindigkeit durch einen Säulenreaktor sehr viel größer als die bisher angegebenen 0.5 cm/Sekunde sein.

Die Strömungseigenschaften und andere physikalische und mechanische Eigenschaften der porösen Zelluloseperlen können durch Vernetzung mit bi- und/oder multifunkuonalen Verbindungen verbessert werden. Kurve B in F i g. 3 zeigt den Druckabfall bei den porösen Zelluloseperlen nach Behandlung mit Tolylen-2,4-diisocyanai und anschließender Enzymimmobilisierung. Oberhalb einer nominalen linearen Durchflußgeschwindigkeit von 2cm/Sckunde werden die unbehandelten Zelluloseperlen (Kurve A) zusammengepreßt und erheblicgh deformiert, was zu einer drastischen Zunahme des Druckabfalls führt. Kurve B hingegen zeigt nur eine geringe Krümmung, was. wenn überhaupt vorhanden, eine nur geringe Deformation der behandelten Perlen anzeigt.

Die Behandlung der porösen Zelluloseperlen mit einem Vernetzungsmittel, entweder vor oder nach der Hydrolyse der Perlen, führt zu einer Erhöhung ihrer physikalischen Festigkeit. Auch die Ankopplung von F.n/.ymen erhöht ihre physikalische Festigkeit. Nach der Behandlung mit beispielsweise einem Diisocyanat (ζ. Β. Tolylcn-2,4-Diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat) werden die Perlen in der Tat sehr hart und fest. Die Vernetzung mit Epichlorhydrin verbessert die physikalischen Eigenschaften der porösen Zelluloseperlen ebenfalls. Die Chemie der Vernetzung von Polysacchariden, einschließlich Zellulose und Stärke, ist gut bekannt. Weitere geeignete Vernetzungsmittel sind u. a. Formaldehyd in Salzsäurelösung oder Glutaraldehyd. Viele andere Vernetzungsmittel für Kohlehydrate sind bekannt und z. B. in der US-PS 39 05 954 berschrieben.

Im allgemeinen weden die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen nach folgenden Verfahrcnsstiifen hergestellt:

a) Zellulose in einer hydrolysierbaren Form wird in einem inerten, organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst, wobei das Verhältnis von Zellulosederivat zu Lösungsmittel im allgemeinen im Berich von 1 :20 bis 1:3 (Gewicht: Volumen) liegt, um eine Lösungsmittellösung herzustellen. Das vewendete Lösungsmittel soll ganz oder im wesentlichen mischbar sein mit der Ausfällungslösung, und die Dichte der Lösungsmittellösung soll ausre'chend sein, so daß beim Kontakt mit der Ausfällungslösung das Lösungsmittel leicht mit dieser mischbar ist und das Zellulosederivat ausfällt.

b) Eine Lösungsmittellösung wird in Form von Tröpfchen (z. B. durch Sprühen) in einer Ausfällungslösung verteilt. Beim Kontakt mit der Ausfällungslösung, die ein Tensid enthalten kann, wird das Lösungsmittel in der Ausfällungslösung dispergiert, und es bilden sich poröse Zelluloseperlen durch Koagulation. Diese sinken auf den Boden des Behälters für die Ausfällungslösung. Die Zellulosederivatlösung kann geeigneterweise unter Druck durch eine Sprühdüse in ein Ausfällungslösungsbad gesprüht werden. Falls erwünscht, kann das Bad zur Beschleunigung der Perlenbildung gerührt werden.

c) Nach erfolgtem Waschen werden die ausgefällten Perlen zur Regenerierung von Zellulose hydrolisiert, wobei poröse Zelluloseperlen mit aktiven Stellen für die Enzymankopplung erhalten werden. Falls erwünscht, können die Perlen zur Verbesserung der Stabilität oder für den Erhalt geeigneter Reaktionssteilen in verschiedener Weise chemisch modifiziert werden. So können die Perlen z. B. «ernetzt werden, um eine größere Stabilität und eine vergrößerte physikalische Festigkeit zu erhalten. Man kann auch zur Veränderung der Oberflächenabsorptionseigenschaften der Zelluloseperlen entweder positiv geladene oder negativ geladene Gruppen durch Substitution in die Perlen einbringen. Die Zellulose selbst ist im allgemeinen hydrophil, und dementsprechend kann man durch Veränderung der Reaktionsstellen deren hydrophile Eigenschaften verändern.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen zur Immobilisierung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Agentien durch Ankopplung.

So kann man z. B. die porösen Zellulcseperlen zu Diethylaminoethyl(DEAE-)Zellulose umwandeln, indem man die Perlen mit N.N-DietHyl^-rhlorethylamJnhydrochlorid in herkömmlicher Weise umsetzt. Die so erhaltenen Perlen enthalten DEAE-Zellulose und sind erfolgreich zur Ankopplung von Glucoseisomerase verwendet worden, die aus Streptomyces-Kulturen erhalten wurde. Es ist ebenfalls eine Verfahrensweise unter Verwendung von Bromcyan zur Immobilisierung von Glucoseisomerase verwendet worden.

Bei einer anderen Verfahrensweise zur Enzymimmobilisierung auf porösen Zelluloseperlen wird Tolylen-2,4-diisocyanat verwendet. Diisocyanat wurde zur Vernetzung der Zellulose eingesetzt, um die physikalische Festigkeit der porösen Perlen zu verbessern. Es wurde jedoch gefunden, daß erfindungsgemäß hergestellte poröse Zelluloseperlen nach Behandlung mit Diisocyanat Enzyme auf ihre Oberfläche immobilisieren können, indem man einfach die mit Diisocyanat behandelten Perlen und eine Enzymlösung zusammenmischt. Wenn beispielsweise Glucoamylase verwendet wurde, wurden mehr als 1000 internationale Einheiten des Enzyms je g trockene Perlen an den mit Diisocyanat behandelten Perlen angekoppelt und immobilisiert. Angesichts der verbesserten physikalischen Festigkeit der Perlen wird angenommen, daß eine erhebliche Vernetzung eintritt, wenn man trockene poröse Zelluloseperlen in trockenem Aceton in Gegenwart eines Katalysators (z. B. Triethylamin) mit ToIylen-2,4-diisocyanat zusammenbringt. Nach einer ausreichend langen Reaktionszeit wurden die Perlen mit trockenem Aceton gewaschen, um die freien Diisocyanatrückstände zu entfernen. Die Zelluloseperlen scheinen eine große Anzahl von gebundenen Isocyanatgruppen zu besitzen. Beim Mischen der behandelten Perlen mit einer wäßrigen Enzymlösung scheinen die Enzymmoleküle durch die Isocyanatgruppen kovalent an die Zelluloseperlen gebunden zu werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß beim Waschen der Perlen mit Wasser die Isocyanatgruppen zu Aminogruppen umgewandelt werden. Auf diese Weise gelang die Immobilisierung eines Enzyms, Glucoamylase, auf Aminozelluloseperlen mit Glutaraldehyd. der bekannt ist für seine

Fähigkeit, mit Aminogruppen (auf den Perlen und in den Enzymen) zu reagieren und diese zu vernetzen.

Die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen eignen sich außerdem zur Trennung und Reinigung von Enzymen. Proteinen, Nukleinsäuren und ähnlichen Verbindungen. Die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen könen zur Herstellung von porösen DEAE-Zelluloseperlen derivatisiert werden. Derartige Perien besitzen ausgezeichnete Durchflußeigenschaften und sind dennoch in der Lage, Enzyme, Proteine, Nukleinsäuren und ähnliche Verbindungen wirksam zu trennen. Die Wirksamkeit solcher Verfahren entspricht ohne weiteres den zur Zeit üblichen säulenchromatographischen Verfahren.

Man kann die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen auch mit anderen als DEAE-Gruppen

in situ derivatisieren. Dadurch sind die erfindungsgemäß hergestellten Zelluloseperlen für eine Vielzahl von

Λ spezifischen Anwendungen geeignet. So kann man z. B. eine spezielle funktioneile Gruppe an die porösen Zelluloseperlen ankoppeln und die so derivatisierten Perlen dann verwenden, um z. B. Tannin aus Fruchtsaft zu entfernen, indem man Fruchtsaft durch ein Bett von derivatisierten, porösen Zelluloseperlen mit Protein leitet.

Auf ähnliche Weise kann man Metallionen aus verdünnten Lösungen entfernen. Solche Verfahren können z. B. zur Gewinnung von wertvollen Metallionen (z. B. Kupfer- und Goldionen) aus verdünnten Minenlösungen und is -abwassern dienen und würden sich insbesondere für heute übliche Lösungstechniken eignen, bei denen Metalle mittels Säurelösungen aus Erzen extrahiert werden.

Beispiel 1

50 g Zelluloseacetat wurden in 400 ml Lösungsmittel A (zusammengesetzt aus Aceton und Dimethylsulfoxid in einem Volumenverhältnis von 6 :4) unter Bildung einer 12^>%igen (Gewicht/Volumen) Lösung aufgelöst. Die Zelluloselösung wurde dann mit einer Spritzpistole (Farbspritzpistole) unter einem Luftdruck von 1,41 bar in Form feiner Tröpfchen in einen Wassertank gesprüht, der 151 1 Wasser und 4 Tropfen eines üblichen Haushaltsspülmittels enthielt Beim Kontakt mit der Wasseroberfläche koagulieren die Zelluloseacetattröpfchen zu porösen Perlen und sinken auf den Behälterboden. Die porösen Perlen wurden dann gesammelt und gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur mit einer etwa 0,15 η Natriumhydroxidlösung deacetyliert Die deacetylierten Perlen wurden dann gewaschen und sauggetrocknet. Die so erhaltenen pcrösen Zelluloseperlen besaßen ein Porenvolumen von mehr als 50 VoL-% ur.d waren für die Enzymimmobilisierung einsatzbereit. F i g. 1 gibt die Teilchengrößeverteilung der erhaltenen porösen Perlen wieder. Elektronenmikroskopische Aufnahmen ergaben, daß die Perlen im allgemeinen kugelförmig waren und das Innere und die Oberfläche der Kugeln die gleiche Struktur besaßen. Die Porengrößen waren sehr gleichmäßig, und die Poren waren gleichmäßig über die gesamten Perlen, wie in den Fig.2. 4(A) und 4(B) gezeigt, verteilt. Die Porengröße der Perlen wurde mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Rasteraufnahmen bestimmt. Die Aufnahme von elektronenmikroskopischen Rasteraufnahmen erfordert trockene Proben, und da das Trocknen der Perlen in Luft zu einer Schrumpfung führt, wurden die Perlen nach der kritischen Punkt-Technik mit flüssigem Kohlendioxid getrocknet. Die Porengröße wurde zu etwa iööO Λ bestimmt.

Beispiel 2

Gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1 wurden unter Verwendung einer 10%igen (Gewicht/Volumen) Zelluloseacetatlösung in Lösungsmittel A ebenfalls poröse Perlen hergetellt. Auch diese Perlen eigneten sich gut für die Enzymimmobilisierung.

Beispiel 3

Es wurde eine 10%ige (Gewicht/Volumen) Zelluloseacetatlösung in Lösungsmittel B (Aceton und Formamid in einem Volumenverhältnis von 7 :3) hergestellt. Die Zelluloseacetatlösung wurde dann nach der Verfahrensweise gemäß Beispiel 1 versprüht und hydrolysiert. Es wurden hochporöse Zelluloseperlen mit einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-% erhalten.

Beispiel 4

Beispiel 2 wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß eine Lösung mit einem anderen im Handel erhältlichen Zelluloseacetat hergestellt wurde. Die erhaltenen porösen Perlen besaßen ausgezeichnete Eigenschaften für die Enzymimmobilisierung.

Beispiel 5

Die Verfahrensweise gemäß Beispiel 2 wurde unter Verwendung einer 10%igen (Gewicht/Volumen) Lösung von Zellutosetriaeetat in Lösungsmittel A wiederholt. Die resultierenden Perlen besaßen eine ausgezeichnete Porosität für die Enzymimmobilisierung.

Wie schon mehrfach erwähnt, kann Zellulose als Trägermaterial für die Immobilisierung von Enzymen und

anderen biologisch aktiven Agentien verwendet werden. Zellulose ist oft als Träger gewählt worden, weil sie billig, chemisch stabil und gegenüber mikrobiologischer Verunreinigung resistent ist. Außerdem besitzt ZcIIuIose drei Hydroxylgruppen in jeder Glucoseanhydrideinheit. die die Vielseitigkeit der Zellulose und auch die große Kapazität für die Immobilisierung einer gewünschten Substanz liefern.

Der Hauptnachteil bei der Verwendung von Zellulose als ein Trägermaterial ist der. daß Zellulose eine faserige Form besitzt und ihr die erforderliche mechanische Festigkeit fehlt. Mit Zellulose gepackte Rcnkiori:n

besitzen schlechte Durchflußeigenschaften, weisen einen hohen Druckverlauft auf und führen zur Kanalbildung. Diese Probleme sind durch die erfindungsgemäß hergestellten Zeüuloseperlen, die eine größere mechanische Festigkeit und verbesserte Durchflußeigenschaften als bekannte Materialien besitzen, gelöst. Da jedoch die Slrukliir der erfindungsgemäß hergestellten Zelluloscperlen sich von normaler Zellulose unterscheidet, kann auch die Beladung mit Enzymen und die Stabilität der immobilisierten Enzyme anders sein als bei normaler Zellulose. Die chemischen Vorgänge bei der Herstellung von immobilisierten Enzymen beeinflussen nicht nur die Beladung und die Stabilität des Enzyms auf den Zelluloseperlen, sondern auch deren mechanische Festigkeit Jede chemische Verfahrensweise für die Immobilisierung von Enzymen, die die mechanische Festigkeit von Zelluloseperlen erhöht, verbessert gleichzeitig die Durchflußeigenschaften in einem Reaktor. Dies ergibt sich auch aus den folgenden Beispielen:

Beispiel 6

1 g poröse Zelluloseperlen wurden bei 50°C mit 10 ml Acrylnitril (CH₂ = CH-C=N) cyanethyliert Die so behandelten Zelluloseperlen wurden dann bei einem pH—Wert von 6,5 bis 6,7 bei 50 bis 100°C 4 Stunden lang mit Hydroxylamin behandelt Das resultierende modifizierte, poröse Perlenprodukt enthielt

NH₂

I
— C = NOH-Gruppen

und eignet sich zur Absorption von schweren Ionen wie Eisen(II), Eisen(III) und K.upfer(II)-Ionen.

Beispiel 7

Eine Suspension von 2,5 g porösen Zelluloseperlen wurde mit 2,5 ml Hexamethylendiisocyanat und Triäthylamin behandelt und anschließend in Wasser hydrolysiert Das Produkt wurde dann bei einem pH-Wert von 5 mit 50 ml 0,5 m O-Methylisoharnstoff behandelt Das erhaltene Produkt besitzt die folgende funktionell Gruppe:

NH₂ ^θ

I poröse Zelluloseperlen —N — C — NH₂

die sich als Anionenaustauscher eignet.

Beispiel 8

5 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden zu 100 ml 36% Formaldehyd und 200 ml 37% Salzsäure gegeben. Nach l'^stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurden die Perlen abfiltriert und anschließend mit Wasser und 0,2% Natriumcarbonatlösung gewaschen. Dann wurden die Perlen bei 75 bis 8O⁰C getrocknet. Die resultierenden vernetzten, porösen Zelluloseperlen zeigten eine große physikalische Festigkeit.

Beispiel 9

3 g poröse Zelluloseperlen wurden gemäß Beispiel 8 mit Formaldehyd vernetzt. Die Perlen wurden dann mit 3 g 2-Chlortriäthylamin behandelt. Nach 35minütigem Erhitzen der Mischung auf eine Temperatur von 80 bis 85°C wurden die Perlen nacheinander mit Natriumchloridlösung, Natriumhydroxidlesung, Salzsäure, Wasser und Ethanol gewaschen. Die so erhaltenen vernetzten porösen DEAE-Zelluloseperlen besaßen eine ausgezeichnete Porosität bei einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-%.

Beispiel 10

0,5 g poröse Zelluloseperlen wurden in 5 ml 0,2 η Natriumhydroxid und 5 ml Epichlorhydrin dispergiert. Die Dispersion wurde dann für mehrere Minuten auf eine Temperatur von 80°C erwärmt. Anschließend wurden die Perlen gewaschen. Die so behandelten vernetzten porösen Perlen besaßen eine größere Festigkeit als die porösen Perlen vor der Vernetzung. Nasse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in Aceton gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden dann in trockenem Aceton suspendiert, das 0,6 ml Triethylamin je g Zellulose enthielt. Zu dieser Suspension wurden bei O⁰C 1,6 ml TolyIen-2,4-diisocyanat je g Zelluloseperlen gegeben. Nach 30 Minuten wurden die Perlen mit trockenem Aceton gewaschen und anschließend abfiltriert. Die resultierenden porösen Zelluloseperlen enthielten reaktive Isocyanatgruppen. die dann durch Zusatz von Wasser zu Aminogruppen hydrolisiert werden konnten.

Beispiel 11

Die porösen Zelluloseperlen gemäß Beispiel 6 wurden zu einer 0,05 m Natriumacetatlösung (pH =5,2) gegeben, die 1600 ppm Kupfer(ll)lonen enthielt. Nach 1 Stunde hatten die Zelluloseperlen, bezogen auf ihr Gewicht, 6,3% Kupfer(ll)lonen aufgenommen.

Es wurde ferner gefunden, daß, wenn die erfindungsgemäß hergestellten porösen Zelluloseperlen vor ihrer Verwendung getrocknet und/oder erhitzt (z.B. auf 100°C) werden, die resultierenden Perlen eine erhöhte physikalische Festigkeit besitzen.

Anwendungsbeispiel 1

1 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in 15 ml Wasser dispergiert, das mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11,5 eingestellt worden war und auf einer konstanten Temperatur von ?0°C gehalten wurde. Zu dieser Dispersion wurde 1 g Bromcyan gegeben. Der pH-Wert wurde mit 1 η NaOH auf 11,5 ίο gehalten. Nach 15 Minuten wurden die Perlen mit einem Phosphatpuffer (0,1 n) bei pH 7,0 und 0°C gewaschen. Dann wurden 15 ml Glucoamylaselösung (30 mg/ml) zu den Perlen gegeben. Die Mischung wurde über Nacht stehengelassen. Die so hergestellten Perlen enthielten bei 60⁰C und unter Verwendung von 5% Maltose als Substrat 1830 Enzymaktivitätseinheiten je g Trockengewicht an Zelluloseperlen. Eine Enzymaktivitätseinheit ist definiert als diejenige Menge, die 1 Mikromol Produkt pro Minute erzeugt.

Anwendungsbeispiel 2

Gemäß Beispiel 1 hergestellte poröse Zelluloseperlen (0,2 g) wurden in 5 ml Aceton dispergiert. Zu dieser Dispersion wurden 0,2 ml Triethylamin und 0,2 ml Tolylen-2,4-diisocyanat gegeben. Nach 30 Minuten wurden die Perlen mit Aceton und dann mit einem Acetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,75 gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 5 ml Glucoamylaselösung (25 mg/ml) versetzt Das dadurch auf den Perlen immobilisierte Enzym ergab eine Aktivität von 2000 Einheiten/g Zelluloseperlen.

Anwendungsbeispiel 3

200 mg Glucoseisomerase in Nialeinsäurepufferlösung wurden auf 2 g gemäß Anwendungsbeispiel 2 hergestellten Zelluloseperlen immobilisiert. Die Zelluloseperlen enthielten bei 60° C unter Verwendung von 9% Fructose als Substrat 90 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.

Anwendungsbeispiel 4

300 mg Invertase in 5 R/l Acete<puffer wurden auf 05 g porösen, gemäß Anwendungsbeispiel 2 hergetelltcn Zelluloseperlen immobilisiert. Die Zelluloseperlen enthielten 3000 Aktivitätseinheiten pro g verwendete Zellulose.

Anwendungsbeispiel 5

50 mg Lactase in einem Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurden auf 0,5 g gemäß Anwendungsbeisp'el 1 hergestellten Zelluioseperlen immobilisiert. Die resultierenden Zelluloseperlen enthielten bei 30°C unter Verwendung von 1 % Lactose als Substrat etwa 80 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.

, Anwendungsbeispiel 6

500 mg Glucoseisomerase wurden in 15OmI Maleinsäurepuffer (0,01 m, pH = 5.5) gelöst. Die Enzymlösung wurde durch 5 g poröse, gemäß Anwendungsbeispiel 11 hergestellte vernetzte Zelluloseperlen gepumpt. Die DEAE-Zelluloseperlen enthielten daraufhin 100 Enzymaktivitätseinheiten pro g Zelluloseperlen.

Anwendungsbeispiel 7

0,25 g poröse, gemäß Beispiel 1 hergetellte Zelluloseperlen wurden in eine 3%ige Glutaraldehyd- und 0.1 m MgCb-Lösung eingeweicht. Nach dem Trocknen durch Absaugen in einem Büchner-Trichter wurden die Proben 30 Minuten auf 8O⁰C erwärmt. Dann wurden 5 ml Glucoamylaselösung (25 mg/ml) zu den Perlen gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht enthielten die so hergestellten Perlen etwa 200 Enzymaktivitätseinheiten pro g trockene Zelluioseperlen.

Anwendungsbeispiel 8

0,2 g gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluioseperlen wurden in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert, der pH-Wert wurde bei 20°C durch Zusatz von 1 η NaOH auf 11,5 eingestellt. 0,2 g CNBr wurden zu der Zeliuloscperlensuspension gegeben. Dies geschah in kleinen Portionen, und der pH-Wert wurde mit Hilfe einer automati-•|. sehen Tariervorrichtung unter Verwendung von 1 η NaOH konstant gehalten. Nach 20 Minuten wurden die

:j; Perlen mit eiskaltem destilliertem Wasser und einer geeigneten Pufferlösung gewaschen. In einer geeigneten

]§ Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den gewaschenen Zelluioseperlen gegeben. Die bei diesem Verfahren

; ' verwendete Zellulose wurde 4 Stunden mit 18% (Gewicht/Volumen) NaOH mercerisiert und dann mit dcstillier-

;. 65 tem Wasser gewaschen.

27 Yl 965

Anwendungsbeispiel 9

2 g sauggetrocknete, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden zur Entfernung von feuchtigkeit mit Aceton gewaschen und in 10 ml Aceton suspendiert. Dann wurden 0,1 ml Triäthylamin oder Dibutylzinndiacetat als Katalysator zugesetzt Anschließend wurde die Zelluloseperlensuspension mit 0,1 ml ToIylen-2,4-diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat versetzt Nach 45minütiger Reaktion bei Raumtemperatur wurden die Zelluloseperlen zur Entfernung von überschüssigem Diisocyanat mit Aceton gewaschen und anschließend zur Entfernung des Acetons mit Wasser gewaschen. In einer geeigneten Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den Zelluloseperlen gegeben. Die Zelluloseperlen wurden bei 4° C über Nacht gelagert

10 Anwendungsbeispiel 10

Aryldiisocyanat wurde an gemäß Anwendungsbeispiel 9 hergestellte Zelluloseperlen angekoppelt Bevor die Enzymlösung zugesetzt wurde, wurden die Zelluloseperlen in destilliertem Wasser suspendiert Es wurden 0,1 ml Triethylamin zugesetzt, um die Reaktion zwischen Isocyanat und Wasser zur Bildung von Arylaminzelluloseperlen zu katalysieren. Das Arylaminderivat wurde dann diacetiert mit NaNOj in HCl. In einer geeigneten Pufferlösung suspendierte Enzyme wurden dann an die Zelluloseperlen angekoppelt

Anwendungsbeispiel 11

Gemäß Anwendungsbeispiel 9 an Zellulose angekoppeltes Diisocyanat reagiert mit Wasser n<it oder ohne Zusatz eines tertiären Amins als Katalysator tu Aminogruppen. Glutaraldehyd wird verwendet, um uas Enzym durch Vernetzung der Aminogruppen des Enzyms und der Zelluloseperlen an die Zelluloseperlen zu koppeln.

Anwendungsbeispiel 12

2 g sauggetrocknete, gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden in 10 ml 3% Glutaraldehyd suspendiert Die Konzentration der Suspension an MgCb betrugt 0,1 m. Die Suspension wurde dann 30 Minuten auf 100⁰C erhitzt Dann wurden die Zelluloseperlen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zelluloseperlen wurden mit in einer geeigneten Pufferlösung gelösten Enzymen versetzt Die Reaktionsmischung wurde bei 4° C über Nacht stehengelassen.

Anwendungsbeispiel 13

1 g gemäß Beispiel 1 hergestellte Zelluloseperlen wurden mit 10 ml 10% 3-AminopropyltriethoxysiIan in Toluol 4 Stunden am Rückfluß gekocht Die Zelluloseperien wurden dann filtriert und mit Aceton gewaschen. Die Zelluloseperien wurden dann mit ener 2,5%igen (Gewicht/Volumen) Glutaraldehydlösung in 0,1 m Phosphatpuffer (pH = 7,0) versetzt und unter gelegentlichem Rühren 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden die Zelluloseperien sorgfältig mit Wasser und einer geeigneten Pufferlösung gewaschen, !n einer geeigneten Pufferlösung aufgelöste Enzyme wurden dann zu den Zelluloseperien gegeben. Die Reaktionsmischung wi—de bei 4°C über Nacht stehengelassen.

Anwendungsbeispiei 14

Gemäß Beispiel 1 hergestellte poröse Zelluloseperlen wurden zuerst mit 36% Formaldehyd und 37% HCI in einem Volumenverhältnis von 5 :1 vernetzt. Die vernetzten Zelluloseperien (5 g Trockengewicht) wurden in 50 ml kalter 1,5 η NaOH-Lösung suspendiert Dann wurden 6 g 2-Chlortriethylaminhydrochlorid zugesetzt, und die Mischurg wurde 35 Minuten lanj auf 80 bis 85°C erwärmt. Dann wurde die Mischung in einem Eisbad abgekühlt und filtriert. Die Zelluloseperien wurden dann 3mal abwechselnd mit 500 ml 2 m NaCl-Lösung, 200 ml 1 η NaOH und 200 ml 1 η NaOH gewaschen. Nach nochmaligem Waschen mit 200 ml 1 η NaOH wurden die Zelluloseperien mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Waschwassers neutral war. Die Reaktion mit 2-Chlortrielhylaminhydrochlorid wurde wiederholt, um einen höheren Substitutionsgrad zu erzielen. In einer geeigneten Pufferlösung gelöste Enzyme wurden zu den Zelluloseperien gegeben. Die Reaktionsmischung wur^e bei 4 ^JC über Nacht stehengelassen.

Anwendungsbeispiel 15

Hexamethylendiisocyanat wurde an Zelluloseperien, wie in Beispiel 7 beschrieben, angekoppelt, und dann wurden die Isocyanatgruppen, wie in Anwendungsbeispiel 10 beschrieben, zu Aminogruppen hydrolisiert O-Methylisoharnstoff wurde zu den Zellu'oseperlen gegeben, um die Guanidinfunktion in die derivatisierten Perlen einzubringen.

Die Enzymimmobilisierung in den Anwendungsbeispielen 8—13 erfolgt durch kovalente Bindungen, während in den Anwendungsbeispielen 14 und 15 eine ionische Adsorption stattfindet. Die Perlen gemäß Anwendungsbeispielen 13 bis 15 wurden mit Glucoamylase, Glucoseisomerase und Invertase beladen, und es wurde die jeweilige Enzymbeladung gemessen.

Die durch kovalente Bindungen immobilisierten Enzyme wurden mit 2 m NaCl-Lösung zur Entfernung der adsorbierten Enzyms gewaschen. Einige Eigenschaften der immobilisierten Enzyme sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß die für normale Zellulose verwendete Chemie auch für Zelluloseperien verwendet werden kann. Die 'Ursache, daß die Zelluloseperien eine höhere Enzymbeladungskapazität als normale Zellulose besitzen, deutet darauf hin, daß die porösen Zelluloseperien eine größere Oberfläche besitzen.

27 M

Anwendungsbeispiel

Proteine und Enzyme können nach der folgenden Verfahrensweis getrennt und gereinigt werden. 2 g Glucoseisomerase (Strep, albus) wurden in 20 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) suspendiert, und die Suspension wurde zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde in eine mit gemäß Beispiel 9 hergestellten porösen DEAE-Zelluloseperlen gepackte Säule gegeben. Das Bettvolumen betrug 30 ml und der Säulendurchmesser 1,5 cm. Die Säule wurde mit 0.01 m Phosphatpuffer (pH = 7,0) gewaschen. Die Säule wurde dann mit einer NaCI-Gradientlösung in 0,01 m Phosphatpuffer eluiert. Die Konzentration an Glucoseisomerase in den aus der Säule austretenden Fraktionen betrug 0,25 bis 0,45 m.

Tabelle

Enzymbeladung von porösen Zelluloseperlen

Enzyme	Immobilisierungs	Hierzu 3 Blatt	Enzymbelaclung der	Zeichnungen	Versuchsbedingungen
	verfahren:	Zellulose. IU*)/g
	Anwendungsbeispiel	(berechnet aus der
		Anfangsreaktions
		geschwindigkeit)
		normale poröse
		Zellulose Zellulose
		perlen
Glucoamyiase (A. Oryzae)	8	800 1800	10% M al tose, 60° C
	9	550	10% Maltose, 60° C
	10	275	10% Maltose,40°C
	11	530	5% Maltose,60°C
	12	80 190	10% M al tose, 60° C
	13	200	10% M al tose, 60° C
	14	3000 9000	10% MaItOSe₁OO⁰C
Glucoamylase (A. Niger)	15	1000	10% MaItOSe₁OO¹C
Glucoseisomerase	9	90	0,5 M Fructose, b0° C
(Strep, albus)	14	300	0,5 M Fructose. 60° C
	15	160	0,5 M Fructose. 60° C
Invertase (Candida utilis)	9	1140	0.125 M Sucrose. 45°C
	14	2000	0,125 M Sucrose. 45° C
	15	1840	0,125 M Sucrose. 45" C
·) IU = Internationale Einheiten

12

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von porösen Zelluloseperlen, die sich als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Agenden eignen, dadurchgekennzeichnet, daß man

(a) ein hydrolysierbares Zellulosederivat in einem inerten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 :20 bis 1 :3 Gewicht/Volumen zu einer Lösung mit größerer Dichte als die Ausfällungslösung auflöst

(b) die so hergestellte Lösung in Form von Tröpfchen in einer aus Wasser, einer wäßrigen Lösung /on ίο nicht-ionischen oder ionischen Tensiden, einer Mischung von Wasser und Ethanol oder Methanol oder

einem Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch bestehenden Ausfällungslösung verteilt und dadurch das Zellulosederivat in Form von gleichmäßig porösen Perlen ausfällt,

(c) die ausgefällten Perlen von der Lösung abtrennt,

(d) die abgetrennten porösen Perlen mit Wasser wäscht,

(e) die gewaschenen Perlen zur Umwandlung in Zellulose und zur Vermehrung der aktiven Stellen für die

Kopplung mit Enzymen und anderen biologisch aktiven Agenden hydrolysiert,
(f) die hydrolysierten Perlen unter Erhalt poröser Zelluloseperlen mit gleichmäßig verteilten Poren und einem Porenvolumen von mehr als 50 Vol.-°/o wäscht und

(h) gegebenenfalls die porösen Zelluloseperlen zur Herstellung vernetzter poröser Zelluloseperlen vor oder k**A\ der Hydrolyse mit mindestens einem Vernetzungsmittel vernetzt