DE68915226T2 - Thrombin bindende Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung. - Google Patents
Thrombin bindende Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf eine neue Thrombin-bindende Substanz und mehr im besonderen auf eine Thrombin-bindende Substanz, die als ein Medikament brauchbar ist, insbesondere ein Medikament zum Heilen von Thrombose, das Antikoagulations- und fibrinolytische Systeme einschließt, die die Blutkoagulation regeln, und sie bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen der Thrombin-bindenden Substanz.
- Es wurde viel über die Rolle gearbeitet, die Thrombin als ein proteolytisches Enzym beim Regelmechanismus der Blutkoagulation spielt, und der Mechanismus der Blutkoagulation ist zum größten Teil aufgeklärt worden.
- In einer Publikation wurde berichtet, daß mit Thrombin aktiviertes Protin C auf die fibrinolytischen und Antikoagulatien-Systeme wirkt. Die Veröffentlichung berichtet auch, daß es eine gewisse Substanz in Extrakten von Kaninchenlungengewebe gibt, die als ein Coenzym für den Aktivierungsmechanismus wirkt. Eine solche Substanz wurde als Thrombomodulin bezeichnet [N.L. Esmon et al, d. Biological Chemistry, 257, (2), 859-864 (1982)].
- N.Aoki, einer der vorliegenden Erfinder und andere haben über menschliches Thrombomodulin, abgetrennt aus menschlicher Plazenta. berichtet, das ähnliche Eigenschaften aufweist wie das Thrombomodelin, über das in d. Biological Chemistry berichtet ist, und ein Molekulargewicht von etwa 71 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen hat [Thromb. Res., 37, 353-364 (1985)].
- Weiter haben I. Maruyama et al berichtet, daß der Vergleich der Aktivitäten von menschlichem Thrombomodulin, abgetrennt aus menschlicher Plazenta, mit einem Molekulargewicht von etwa 71 000 (unter nicht reduzierenden Bedingungen) und der Aktivitäten des oben erwähnten Kaninchen-Thrombomodulins zeigte, daß sie identische Aktivitäten aufwiesen [d. Clin. Invest., 75, 987-991 (1985)].
- Es wurde auch von H. Ishii et al berichtet, das menschliches Plasma und menschlicher Urin Substanzen enthält, die die gleichen Aktivitäten wie Thrombomodulin aufweisen, und die Molekulargewichte solcher Substanzen in Plasma waren 63 000 und 54 000 [d. Clin. Invest., 76, 2178-2181 (1985)].
- Die vorliegenden Erfinder haben in menschlichem Urin zwei Arten von Thrombin-bindenden Substanzen gefunden, die sich von den oben erwähnten Substanzen unterscheiden und geringere Molekulargewichte aufweisen, nämlich etwa 39 000 und 31 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen, und sie haben auf diese Substanzen eine Patentanmeldung eingereicht (JP-OS 146 898/1988).
- Die Erfinder haben weiter ausgedehnte Untersuchungen ausgeführt, um ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung, Isolation und Reinigung von menschlichem Thrombomodulin zu entwickeln, und sie haben als ein Ergebnis aus menschlichem Urin zwei Arten von Thrombin-bindenden Substanzen abgetrennt [im folgenden als Thrombin-bindende Substanzen (A) und (B) bezeichnet], die sich von den oben erwähnten, vorher gefundenen Substanzen unterscheiden. Die Erfinder haben bestätigt, daß die beiden Thrombin-bindenden Substanzen neue Verbindungen sind.
- Die vorliegenden Erfinder haben weitere Untersuchungen ausgeführt, um ein industriell vorteilhaftes Verfahren zum Herstellen und Isolieren dieser Thrombin-bindenden Substanzen zu entwickeln. Als ein Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, daß die gleichen Thrombin-bindenden Substanzen, die in Urin gefunden wurden, in einer Kulturbrühe von Zellen vorhanden sind, die aus menschlichen Geweben stammen und daß die Zielsubstanzen aus der Kulturbrühe unter Anwendung einfacher Verfahren abgetrennt und gewonnen werden können. Diese Feststellungen haben zu der vorliegenden Erfindung geführt.
- Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Thrombin-bindende Substanzen (A) und (B) zu schaffen, die die folgenden Eigenschaften haben:
- (a) Molekulargewicht:
- Thrombin-bindende Substanz (A):
- 90 000-92 000 unter reduzierenden Bedingungen
- 55 000-58 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen
- Thrombin-bindende Substanz (B):
- 98 000-105 000 unter reduzierenden Bedingungen
- 60 000-65 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen
- (b) Isoelektrischer Punkt:
- Thrombin-bindende Substanz (A):pH 6,0-6,8
- Thrombin-bindende Substanz (B):pH 5,8-5,6
- (c) Affinität: Starke Affinität zu Thrombin
- (d) Aktivität: (1) in der Lage, die durch Thrombin katalysierte Aktivierung von Protein C fördern
- (2) verlängert die Gerinnungszeit und
- (e) Stabilität: Gegenüber denaturierenden Mitteln stabil
- (Natriumdodecylsulfat und Harnstoff).
- Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen der Thrombin-bindenden Substanz zu schaffen, das umfaßt: Behandeln von menschlichem Urin mit Kalziumionen und Abtrennen und Reinigen einer Thrombin-bindenden Substanz durch Immunadsorptions-Säulenchromatographie unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der in der Lage ist, strukturelle Veränderungen durch Kalziumionen in der Thrombin-bindenden Substanz zu erkennen und durch ein Molekulargewichts-Fraktionierungsverfahren.
- Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen der Thrombin-bindenden Substanz zu schaffen, das umfaßt: Züchten von aus menschlichen Geweben gewonnen Zellen und Abtrennen und Reinigen der Thrombin-bindenden Substanz aus der Kulturbrühe.
- Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlicher.
- Die Thrombin-bindenden Substanzen der vorliegenden Erfindung sind brauchbar als ein fibrinolytischer Beschleuniger oder als ein Antikoagulationsmittel, da sie sich mit Thrombin kombinieren und spezifisch Protein C aktivieren und die Blutgerinnungszeit verlängern.
- Die Thrombin-bindenden Substanzen dieser Erfindung können z. B. nach den folgenden Verfahren hergestellt werden:
- Behandeln von menschlichem Urin mit Kalziumionen und Abt rennen und Reinigen der Thrombin-bindenden Substanzen durch Immunadsorption-Säulenchromatographie unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der in der Lage ist, die durch die Kalziumionen in den Thrombin-bindenden Substanzen verursachten strukturellen Änderungen zu erkennen, gefolgt von einer Molekulargewichts-Fraktionierung.
- Züchten von aus menschlichen Geweben gewonnenen Zellen und Ausführen der gleichen Trenn- und Reinigungsoperationen wie bei Verfahren (1) oben.
- Bei dem ersten Verfahren wird frischer menschlicher Urin oder menschliches Urinkonzentrat eingesetzt. Sie können nach einem oder mehreren Verfahren, ausgewählt aus Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie unter Einsatz eines an Thrombin-gebundenen Trägers und ähnlichen, vorbehandelt werden.
- Wird Ionenaustausch-Chromatographie für die Vorbehandlung benutzt, dann ist es bevorzugt, daß Urin, dessen pH auf 8-12 eingestellt worden ist, mit DEAE-Sephadex A-50 (Handelsname, Produkt der Pharmacia AB), DEAE-TOYOPEARL 650C, 650M oder 650S (Handelsnamen, Produkte der Toyo Doda Mfg. Co. Ltd.) oder QAE-Sephadex A-50 (Handelsname, Produkt der Pharmacia AB) in Berührung gebracht wird, um die Zielsubstanzen zu adsorbieren, und es wird mit einer Pufferlösung, enthaltend ein Salz, z. B. Natriumchlorid, in einer geringen Konzentration, gewaschen, gefolgt vom Eluieren mit der gleichen Pufferlösung mit einer höheren Salzkonzentration. Gelfiltration wird ausgeführt unter Einsatz von Sephadex® G 150 (Handelsname, Produkt der Pharmacia AB) oder Ultrogel® AcA 34 (Handelsname, Produkt der LKS Co.) als Träger. Die Affinitäts-Säulenchromatographie kann ausgeführt werden, unter Einsatz eines an Thrombin-gebundenen Trägers, bei dem Thrombin inaktiviert ist, z. B. mit Diisopropylfluorphosphat, und es an einen unlöslichen Träger gebunden ist, z. B. Agarose-, Sepharose-, Dextran- und Polyvinylgel.
- Die Behandlung von Urin mit Kalziumionen wird ausgeführt durch Hinzugeben einer Kalziumverbindung, wie Kalziumchlorid, -carbonat und -hydroxid, entweder unmittelbar vor der Immunadsorption-Säulenchromatographie oder während der Vorbehandlung. Im allgemeinen veranlaßt die Zugabe dieser Verbindungen in einer Menge, um die Kalziumionen-Konzentration auf 2-10 mM zu bringen, die Thrombin-bindenden Substanzen, die eine Kalzium-bindende Stelle aufweisen, sich selektiv mit Kalzium zu kombinieren und ihre Struktur zu ändern.
- Der monoklonare Antikörper, der in der Lage ist, solche strukturellen Änderungen spezifisch zu erkennen, kann z. B. hergestellt werden durch Verschmelzen von Mäuse-Milzzellen, die mit den aus menschlicher Plazenta extrahierten oben erwähnten Thrombin-bindenden Substanzen immunisiert worden sind und ein Molekulargewicht von etwa 71 000 haben, mit Mäuse-Myelomzellen P3-Ag8-Y, Auswählen von Antikörper erzeugenden Hybridomen, Auswählen von Hybridomen, die nicht immunologisch mit den Thrombin-bindenden Substanzen in Gegenwart von EDTA reagieren, d. h. Hybridomen, die einen Antikörper erzeugen, der zur Erkennung solcher strukturellen Änderungen in der Lage ist, gefolgt von konventionellen Verfahren (JP-OS 45 398/1989). Es ist erwünscht, als ein Immunadsoptionsmittel einen an einen Träger gebundenen monoklonalen Antikörper einzusetzen, bei dem ein monoklonaler Antikörper für die Thrombin-bindenden Substanzen an einen unlöslichen Träger gebunden ist, wie Dextran-, Agarose- und Polyvinylgel. Die Elution mittels Immunadsoptions-Säulenchromatographie kann z. B. unter Einsatz einer EDTA enthaltenden Pufferlösung ausgeführt werden.
- Eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz von Ionenaustauscherharz oder Elektrophorese kann zur Molekulargewichts-Fraktionierung benutzt werden. Ein Anionenaustauscherharz, wie TSK-Gel®, z. B. DEAE-5PW®, DEAE- 2SW® oder DEAE-3SW® (Handelsnamen, Produkte der Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.) und Mono Q HR5/5® (Handelsname, Produkt der Pharmacia AB) ist als ein Ionenaustauscherharz für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bevorzugt. Konventionelle Verfahren, z. B. das Laemmli- Verfahren unter Einsatz von SDS-Polyacrylamidgel [Nature, 227, 680-685 (1970)] können als ein Verfahren zur Elektrophorese benutzt werden.
- Zellen, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, können irgendwelche menschlichen Zellen sein, die in der Lage sind, die Thrombin-bindenden Substanzen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Solche Zellen schließen z. B. Zellen aus Nieren, Lungen, Dünndärmen, Häuten und Herzen menschlicher Föten und Zellen aus Nieren, Lungen, Vorhäuten, Plazentas und lymphatischen Körperchen menschlicher Erwachsener ein.
- Das Züchten der Zellen kann nach konventionell auf die Züchtung von Tierzellen angewendeten Verfahren ausgeführt werden, z: B. nach dem in "Tissue Culture Methods and Applications" beschriebenen Verfahren (P. K. Kruse und M. K. Patterson, Academic Press, 1973).
- Das oben erwähnte Verfahren (1) kann zum Abtrennen und Reinigen der Thrombin-bindenden Substanzen aus der Kulturbrühe benutzt werden.
- Die Thrombin-bindenden Substanzen (A) und (B) dieser Erfindung haben Kalzium-bindende Stellen, und sie ändern ihre Struktur durch die Behandlung mit Kalziumionen. Kulturmedien für Gewebe, die allgemein für Tierzellen benutzt werden, enthalten Kalziumionen, und es werden daher in solchen Medien strukturell geänderte Thrombin-bindende Substanzen erzeugt. Wird ein Medium benutzt, das keine Kalziumionen enthält, dann ist eine Behandlung mit Kalziumionen erforderlich, bevor die Kulturbrühe der Immunadsorption-Säulenchromatographie unterworfen wird. Die Behandlung kann ausgeführt werden, durch die Zugabe einer Kalziumverbindung, wie Kalziumchlorid, -carbonat und -hydroxid. Im allgemeinen veranlaßt die Zugabe dieser Verbindungen in einer Menge, um die Kalziumionen-Konzentration auf 2-10 mM zu bringen, die Thrombin-bindenden Substanzen, die eine Kalzium-bindende Stelle aufweisen, sich selektiv mit Kalzium zu kombinieren und ihre Struktur zu ändern.
- So hergestellte Thrombin-bindende Substanzen haben die folgenden Eigenschaften:
- (a) Molekulargewicht:
- Thrombin-bindende Substanz (A):
- 90 000-92 000 unter reduzierenden Bedingungen
- 55 000-58 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen
- Thrombin-bindende Substanz (B):
- 98 000-105 000 unter reduzierenden Bedingungen
- 60 000-65 000 unter nicht reduzierenden Bedingungen.
- Meßverfahren: Molekulargewichte wurden gemäß dem Laemmli-Verfahren auf der Grundlage von SDS-PAGE unter Einsatz von 10% Acrylamid-0,8% Bisacrylamid gemessen. "Bio-Rad SDS-PAGE®-Standard für hochmolekulare Substanzen" (Handelsname, Produkt der Nippon Bio-Rad-Laboratories Inc.) wurde als ein Standard-Protein benutzt.
- (b) Isoelektrischer Punkt
- Thrombin-bindende Substanz (A): pH 6,0-6,8
- Thrombin-bindende Substanz (B): pH 5,8-6,5.
- Meßverfahren: Isoelektrische Punkte wurden gemäß der Elektrophorese beim isoelektrischen Punkt unter Anwendung des Pharmacia Phast Systems [Plate: IFE (3-9)] gemessen.
- (c) Aminosäure-Zusammensetzungen:
- Aminosäure-Zusammensetzungen wurden gemäß dem von Spacksman et al [Anal. Chem., 30, 1190 (1958)] vorgeschlagenen Verfahren bestimmt, wobei der Aminosäure-Analysator Beckman 6300E® (Handelsname, hergestellt durch Beckman Inc.) benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 schließt als Vergleichsdaten Aminosäure-Zusammensetzungen von Thrombin-bindenden Substanzen ein, über die in den folgenden Veröffentlichungen berichtet wurde.
- (I) J. Biol. Chem. 259,12246 (1984)
- (II) Internationale Veröffentlichung WO 87/00050
- (III) JP-OS 6219/1989
- (IV) JP-OS 301 791/1988.
- Die Vergleichsdaten in Tabelle 1 wurden auf der Grundlage der Daten, die in diesen Veröffentlichungen offenbart sind, gemäß dem gleichen Standard errechnet. Tabelle 1 Aminosäuren Anspruch Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin 1/2 Cystin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Tryptophan Arginin
- Bemerkungen zu Tabelle 1:
- 1) Gemessen nach 24-stündiger Hydrolyse in 5,7 N HCl
- 2) Bestimmt durch Extrapolation aus Werten, gemessen nach Hydrolyse in 5,7 N Chlorwasserstoffsäure (HCl) bei 100ºC für 24, 48 und 72 Stunden
- 3) Gemessen nach 72-stündiger Hydrolyse in 5,7 N HCl bei 100ºC
- 4) Oxidiert mit Perameisensäure und gemessen das erzeugte Cystein
- 5) Gemessen nach 24-stündiger Hydrolyse in 4 M Methansulfonsäure bei 115ºC.
- (d) Zucker-Zusammensetzung
- Die Zucker-Zusammensetzungen der Thrombin-bindenden Substanzen (A) und (B) wurden unter Anwendung eines automatischen Zucker-Analysators gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zucker Zucker-Zusammensetzung Neutrale Zucker&sup7;) D-Mannose L-Fucose D-Glucose Aminozucker&sup8;) D-Galactosamin D-Glucosamin Sialinsäure&sup9;) N-acetylneuraminsäure Gesamt
- 6) Proteine wurden nach den UV-Verfahren bestimmt.
- 7) Gemessen nach 4 stündiger Hydrolyse in 2 M Trifluoressigsäure bei 100ºC.
- 8) Gemessen nach 4 stündiger Hydrolyse in 4 M Chlorwasserstoffsäure bei 100ºC.
- 9) Gemessen durch Thiobarbitursäure-Reaktion nach 1 stündiger Hydrolyse in 0,1 N Schwefelsäure bei 80ºC.
- (e) Affinität:
- Die Thrombin-bindenden Substanzen haben eine starke Affinität zu Thrombin. 100% beider Substanzen (A) und (B) wurden bei einer chromatographischen Behandlung unter Verwendung von Diisopropylphosphoro-Thrombin-Agarose [d. Biological Chemistry, 245, 3059-3065 (1979)] absorbiert.
- (f) Aktivität:
- (1) Die Thrombin-bindenden Substanzen binden Thrombin zur Aktivierung von Protein C.
- Meßverfahren: 10 ul jeder der Substanzen der vorliegenden Erfindung oder von menschlichem Thrombomodulin, extrahiert aus Plazentas (5 ng/ml), gelöst in 0,02 M Tris- HCl-Puffer, enthaltend 0,15 M Natriumchlorid (pH 7,5, im folgenden als TBS bezeichnet), 30 ul einer TBS-Lösung (1 uM) menschlichen Proteins C und 10 ul von TBS, 1% Rinderserumalbumin und 5 mM Kalziumchlorid wurden vermischt. Zu dieser Mischung wurden 50 ul einer TBS-Lösung von menschlichem Thrombin (5U/ml) hinzugegeben und bei 37ºC 30 Minuten lang umgesetzt, gefolgt von einer Zugabe von 100 ul einer TBS- Lösung von menschlichem ATIII (50ug/ml) und einer weiteren Umsetzung bei 37ºC für 10 Minuten. Zu der resultierenden Reaktionsmischung wurden 200 ul einer TBS-Lösung, enthaltend Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCM-Substrat (200 uM) hinzugegeben, um eine Umsetzung bei 37ºC für 10 Minuten zu bewirken. Danach gab man 600 ul 20%ige Essigsäure hinzu, um die Umsetzung zu beenden. Die Konzentration von dissoziiertem AMC wurde bei einer Wellenlänge des anregenden Lichtes von 380 nm und einer Wellenlänge des emittierten Lichtes von 460 nm gemessen, wodurch die Konzentration von aktiviertem Protein C bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
- hrombin-bindende Substanz (A) 13,8
- Thrombin-bindende Substanz (B) 13,6
- Aus Plazenta erhaltenes menschliches Thrombomodulin 14,0
- (2) Thrombin-bindende Substanzen verlängern die Blutgerinnungszeit.
- Meßverfahren: 10 ul einer TBS-Lösung einer Probe (10 ug/ml) wurden zu 200 ul einer 10 mM Kalziumchlorid enthaltenden TBS-Lösung (0,05 U/ml) von Rinderthrombin (Produkt der Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) hinzugegeben. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37ºC wurden 200 ul menschliches Fibrinogen zu der Lösung hinzugegeben und die Gerinnungszeit unmittelbar unter Anwendung eines Fibrometers gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
- Thrombin-bindende Substanz (A) 100
- Thrombin-bindende Substanz (B) 105
- Aus Plazentas erhaltenes menschliches Thrombomodulin 120
- Rinderserumalbumin 78
- (g) Stabilität:
- Thrombin-bindende Substanzen (A) und (B) sind gegenüber den Denaturierungsmitteln (Natriumdodecylsulfat und Harnstoff) stabil.
- Meßverfahren: 45 ug der Substanz wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen Bedingungen 60 Minuten bei 37ºC behandelt. Nach der Behandlung wurde die Substanz mit TBS 100- fach verdünnt, um die Restaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
- Behandlung durch Reduktion mit 1% Mercaptoethanol 0
- Denaturierungsbehandlung 100
- 1% SDS
- 8 M Harnstoff 100
- Da die Thrombin-bindenden Substanzen dieser Erfindung Substanzen hohen Molekulargewichtes mit Kalzium- Bindestellen sind, kann erwartet werden, daß sie natürlichere pharmazeutische Wirkungen zeigen als Thrombin-bindende Substanzen mit geringerem Molekulargewicht. Zusätzlich können solche Thrombin-bindenden Substanzen unter Einsatz von reichlich verfügbarem menschlichen Urin oder aus menschlichen Geweben erhaltenen Zellen als Rohmaterial industriell hergestellt werden.
- Andere Merkmale der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen deutlich, die zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden, diese aber nicht beschränken sollen.
- 600 l frischer Urin wurde unter Verwendung von 6 N wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt und bei 4ºC über Nacht aufbewahrt. Nach der Entfernung ausgefallener Niederschläge wurden 8 l QAE-Sephadex A-50, dessen pH vorher auf 9,0 eingestellt worden war, hinzugegeben und die Mischung 2 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde unter Anwendung eines Glasfilters abgetrennt, mit 10 l von 0,02 M Tri-HCl- Puffer (pH 7,6), der 0,07 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und unter Verwendung von 20 l von 0,02 M Tris-HCl-Puffer (ph 7,6), der 2 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Zu dem Eluat gab man Ammoniumsulfat bis zu einer 80%igen Sättigung und ließ die Mischung über Nacht bei 4ºC stehen. Die ausgefallenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 10 l von 0,02 M Tris-HCl Puffer (pH 7,6), der 0,05 M Natriumchlorid enthielt, gelöst und dreimal gegen 100 l des gleichen Puffers dialysiert. Zu der dialysierten Lösung wurde Kalziumchlorid bis zu einer Konzentration von 5 mM hinzugegeben und die resultierende Lösung auf eine Diisopropylphosphoro-Thrombin-Agarose-Säule gegeben. Nach dem Waschen mit 20 l von 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,05 M Natriumchlorid und 5 mM Kalziumchlorid enthielt, wurde die Säule mit einem Gradienten zwischen 5 l von 0,02 M Tris-HCl- Puffer, der 0,05 M Natriumchlorid (Mindestkonzentration von NaCl) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure enthielt und dem gleichen Puffer, enthaltend 1 M Natriumchlorid (maximale NaCl-Konzentration) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml-Portionen fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dreimal gegen 100 l des gleichen Puffers, der 0,05 M Natriumchlorid enthielt, dialysiert. Die so erhaltene dialysierte Lösung wurde auf eine Säule gegeben, die mit 500 ml eines Aminoadsorptionsmittels gepackt war, umfassend einen monoklonaren Antikörper (TM-A91) und Agarose (JP-OS 45398/1989). Nach dem Waschen mit 300 l des Puffers, enthaltend 1 M Kalziumchlorid, wurde die Säule mit 5 l des gleichen Puffers, enthaltend 3 M Natriumthiocyanat und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure. eluiert. Das Eluat wurde dreimal mit 50 ml des gleichen Puffers, enthaltend 0,05 M Natriumchlorid, gewaschen, gegen 100 l von entionisiertem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, um 10 mg Pulver zu erhalten. Das Pulver wurde in 80 ml von 0,01 M Tris-HCl-Puffer, enthaltend 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5% Glycerin und 0,01% Bromphenol blau, gelöst, und die Lösung erhitzte man 5 Minuten auf 100ºC. Nach dem Erhitzen wurde SDS-PAGE gemäß dem Laemmli-Verfahren ausgeführt [Nature, 227, 680-685 (1979)] wobei man 10% Acrylamid-0,8% Bisacrylamid benutzte, um aktive Fraktionen abzutrennen. Jede der so erhaltenen zwei Fraktionen wurde mit Wasser gewaschen, in 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1% Natriumdodecylsulfat, eingetaucht und über Nacht bei 4ºC belassen, um die Zielsubstanzen zu eluieren. Das Eluat wurde kondensiert und gefriergetrocknet und ergab 6 mg Thrombin-bindende Substanz (A) und 2 mg Thrombin-bindende Substanz (B).
- 1 l frischen Urins wurde dreimal gegen 5 l von 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,05 M Natriumchlorid, dialysiert. Zu der dialysierten Lösung wurde Kalziumchlorid bis zu einer Konzentration von 5 mM hinzugegeben. Die so erhaltene dialysierte Lösung wurde auf eine Säule gegeben, die mit 1 ml Immunoadsorptionsmittel der gleichen Art gepackt war, wie es in Beispiel 1 benutzt wurde. Nach dem Waschen mit 100 ml des genannten Puffers, enthaltend 0,05 M Natriumchlorid, 5 mM Kalziumchlorid und 0,05% Tween 20 und dann mit 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 1 M Natriumchlorid und 5 mM Kalziumchlorid, wurde die Säule unter Anwendung von 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 3 M Natriumthiocyanat und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, eluiert. Das Eluat wurde dreimal gegen 500 ml des gleichen Puffers, enthaltend 0,05 M Natriumchlorid, dialysiert und gefriergetrocknet, wobei 5 ug Pulver erhalten wurden. Die gleiche SDS-PAGE wie in Beispiel 1 wurde ausgeführt, und man erhielt 3 ug der Thrombin-bindenden Substanz (A) und 1 ug der Thrombin-bildenden Substanz (B).
- Eine Tonne frischen menschlichen Urins wurde mit einer Säule aus Immunoadsorptionsmittel, umfassend einen monoklonaren Antikörper (TM-A73) und QAE-Sephadex A-50, dann mit einer Diisopropylphosphoro-Thrombin-Agarose-Säule gereinigt und unter Anwendung von Milipore Immersible CX-10 auf ein Volumen von 5 ml kondensiert. Das Kondensat wurde auf eine Ultrogel AcA 34-Säule (2,7·90 cm) gegeben und mit Tris-HCl-Puffer eluiert, um in 2,4 ml-Portionen zu fraktionieren. 5 mg Thrombin-bindende Substanz (B) wurden aus den Fraktionen 90-97 und 3 mg Thrombin-bindende Substanz (A) aus den Fraktionen 127-145 erhalten.
- 2·10&sup5; von erwachsenen Menschen erhaltene Nierenzellen wurden in einen flachen Behälter von 75 cm² Boden inokuliert, in den 25 ml MEM enthaltend 10% Rinderfötenserum, 30 Minuten bei 56ºC wärmebehandelt, hinzugegeben waren. Die Zellen wurden unter Anwendung eines Kohlendioxid-Inkubators bei 37ºC unter einer Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid gezüchtet, bis die Zellen unter Bildung einer Schicht wuchsen. Nach Bestätigung des Zellwachstums wurde die Flüssigkeit entfernt und die Zelloberflächen wurden gründlich mit einem Phosphat- Puffer gewaschen. Die Zellen wurden weiter in einem MEM-Medium, enthaltend 20 mg/ml Proteosepepton, 7 Tage lang gezüchtet.
- Thrombin-bindende Substanzen, die im Überstehenden enthalten waren, wurden nach dem ELISA-Verfahren unter Einsatz monoklonarer Antikörper A-59 und A-73 gemessen, und der Gehalt wurde zu 10 ng/ml bestimmt.
- Wurden Vorhautzellen menschlicher Erwachsener in der gleichen Weise wie oben gezüchtet, dann enthielt das Überstehende der Kulturbrühe 40 ng/ml Thrombin-bindende Substanzen.
- 1 l Kulturbrühe von Nierenzellen, erhalten von menschlichen Erwachsenen und in der gleichen Weise gezüchtet wie in Beispiel 4, wurde durch eine Säule geschickt, die mit 1 ml Sepharose, 2 mg IgG/ml Harz) gepackt war, an die monoklonarer Antikörper A-73 gebunden war. Nach dem Waschen mit 20 ml von 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 1 M Natriumchlorid enthielt, wurde die Säule mit 5 ml des gleichen Puffers, enthaltend 2 M Natriumthiocyanat und 5 mM EDTA, eluiert, und das Eluat dialysierte man gegen 0,02 M Tris-HCl- Puffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid.
- Die dialysierte Lösung wurde auf eine Ultrogel AcA 34-Säule (1,7·90 cm) gegeben und mit 0,02 M Tris-HCl (pH 7,4)-Puffer, enthaltend 0,15 M Natriumchlorid, mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min eluiert, um in 2,4 ml-Portionen zu fraktionieren. Die Fraktionen Nr. 90-95 (Fraktion I) wurde gesammelt, und sie enthielt 4 ug Thrombin-bindende Substanzen gemäß dem ELISA-Verfahren, das in der gleichen Weise ausgeführt wurde wie in Beispiel 4. In gleicher Weise wurden in den Fraktionen Nr. 125-135 (Fraktion II) 3 ug Thrombin-bindende Substanzen gefunden.
- SDS-PAGE wurde nach dem Laemmli-Verfahren (Nature, 227, 680-685) an den in Beispiel 5 erhaltenen Fraktionen I und II und an den Thrombin-bindenden Substanzen (A) und (B), die in den Beispielen 1-3 hergestellt waren, ausgeführt. Das Gel wurde gemäß dem Verfahren von Matsudaira (d. Biol.
- Chem., 262 (21), 10035-10038) auf eine PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde dann in TBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, bei Raumtemperatur 2 Stunden lang umgesetzt. Nach dem Verwerfen der Lösung wurde der Rest gründlich mit einem 0,05% Tween 20-TBS gewaschen, in einem 0,05% Tween 20-TBS 50 mM, das monoklonaren Antikörper A-73, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und gründlich mit 0,05% Tween 20-TBS gewaschen. Die Flüssigkeit wurde verworfen und der Rest gründlich mit einem 0,05% Tween 20-TBS gewaschen und in 50 ml eines Essigsäure-Puffers pH 5,0 gegeben, der 5 mg-Amino-9-ethylcarbazol und 25ul 30%iges Wasserstoffperoxid enthielt, wobei er gefärbt wurde. Die Fraktion I hatte eine Farbe an der gleichen Stelle wie die Thrombin-bindende Substanz (B), die aus Urin gewonnen war, und die Fraktion II hatte eine Farbe an der gleichen Stelle, wie Thrombin-bindende Substanz (A) die aus Urin gewonnen war.
- Jeweils 100 ug der Thrombin-bindenden Substanzen (A) und (B) wurden unter Anwendung eines Gasphasen-Aufreihers (Sequenzers) einem Edmon-Abbau unterworfen, und die erhaltenen PTH-Aminosäuren wurden unter Anwendung eines PTH-Analysators analysiert. Es wurde kein Aminosäure-Peak festgestellt, was zeigte, daß die N-Enden der Thrombin-bindenden Substanzen (A) und (B) geschützt waren.
Claims (7)
1. Thrombin bindende Substanz mit den folgenden
Charakteristika:
(a) Molekulargewicht:
90.000-92.000 unter reduzierten Bedingungen
55.000-58.000 unter nicht reduzierten
Bedingungen
(b) Isoelektrischer Punkt pH 6,0-6,8
(c) Affinität: hat starke Affinität zu Thrombin
(d) Aktivität:
(1) in der Lage, die durch Thrombin
katalysierte Aktivierung von
Protein C zu fördern,
(2) verlängert die Gerinnungszeit,
und
(e) Stabilität: stabil gegenüber denaturierenden
Mitteln (Natriumdodecylsulfat und
Harnstoff).
2. Thrombin bindende Substanz mit den folgenden
Charakteristika:
(a) Molekulargewicht:
98.000-105.000 unter reduzierten Bedingungen
60.000-65.000 unter nicht reduzierten
Bedingungen
(b) Isoelektrischer Punkt pH 5,8-6,5
(c) Affinität: hat starke Affinität zu Thrombin
(d) Aktivität:
(1) in der Lage, die durch Thrombin
katalysierte Aktivierung von
Protein C zu fördern,
(2) verlängert die Gerinnungszeit,
und
(e) Stabilität: stabil gegenüber denaturierenden
Mitteln (Natriumdodecylsulfat und
Harnstoff).
3. Verfahren zum Herstellen der Thrombin bindenden
Substanz, die in Anspruch 1 definiert ist, umfassend:
Behandeln menschlichen Urins mit Calciumionen und
Abtrennen und Reinigen einer Thrombin bindenden Substanz
mittels Immunadsorptions-Säulenchromatographie unter
Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der strukturelle
Änderungen in der Thrombin bindenden Substanz durch
Calciumionen zu erkennen in der Lage ist und mittels eines
Molekulargewichts-Fraktionierungsverfahrens.
4. Verfahren zum Herstellen der Thrombin bindenden
Substanz, die in Anspruch 2 definiert ist, umfassend:
Behandeln menschlichen Urins mit Calciumionen und
Abtrennen und Reinigen einer Thrombin bindenden Substanz
mittels Immunadsorptions-Säulenchromatographie unter
Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der strukturelle
Änderungen in der Thrombin bindenden Substanz durch
Calciumionen zu erkennen in der Lage ist und mittels eines
Molekulargewichts-Fraktionierungsverfahrens.
5. Verfahren zum Herstellen der Thrombin bindenden
Substanz, die in Anspruch 1 definiert ist, umfassend:
Züchten von Zellen aus menschlichen Geweben und Abtrennen
und Reinigen der Thrombin bindenden Substanz aus der
Kulturbrühe.
6. Verfahren zum Herstellen der Thrombin bindenden
Substanz, die in Anspruch 2 definiert ist, umfassend:
Züchten von Zellen aus menschlichen Geweben und Abtrennen
und Reinigen der Thrombin bindenden Substanz aus der
Kulturbrühe.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin die Trennung
und Reinigung der Thrombin bindenden Substanz umfaßt, daß
die Kulturbrühe einer
Immunadsorptions-Säulenchromatographie unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der
zum Erkennen struktureller Änderungen in der Thrombin
bindenden Substanz durch Calciumionen in der Lage ist,
und dann einer Molekulargewichts-Fraktionierung
unterworfen wird.
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