KR100371976B1

KR100371976B1 - 혈장헤파린결합단백질-70

Info

Publication number: KR100371976B1
Application number: KR1019950006971A
Authority: KR
Inventors: 고야마마사요시; 다카하시미키코; 도이가즈유키
Original assignee: 훽스트쟈판가부시키가이샤
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2003-03-31
Also published as: KR950032281A; EP0675135A3; CA2145960A1; US5545720A; AU689852B2; EP0675135A2; AU1617495A; JPH07267992A

Abstract

상처 치유 활성이 있는 혈장 헤파린 결합 단백질(PHBP)-70 으로 명명된 단백질은 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 이용한 분석에 의해 측정된 분자량이 약 60 내지 80KDa이며 사람을 포함한 포유동물의 태아 및 신생아의 혈액으로부터 수득될 수 있다.

단백질 PHBP-70은 섬유아세포 증식 활성을 지닌 신규 단백질이므로 상처 치유제로서 유용하다.

Description

혈장 헤파린 결합 단백질-70{Protein PHBP-70}

본 발명은 신규 단백질, 더욱 특히 헤파린-결합 특성 및 섬유아세포증식 활성을 지닌 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 단백직은 PHBP-70(혈장 헤파린 결합 단백질-70)으로 명명되며 사람을 포함하는 포유동물의 혈액으로부터 수득할 수 있다.

다양한 성장 인자들이 상처 치유 과정중에 포함되는 것으로 공지되어 있다(참조; Dijke et al,, Biotechnology, vol, 7, p793-798, 1989). 특히, TGF-β(형질전환 성장인자-β) 및 PDGF(혈소판-기원한 성장인자)는 섬유아세포를 증식시키며, 세포를 병변 부위로 유도시켜 상처 치유를 촉진시키는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 현재까지 본 발명의 물질이 섬유아세포의 증식을 향상시키며 상처 치유에 효과적이라는 사실은 보고되어 있지않다.

따라서, 본 발명의 목적은 상처 치유에 효과적인 치료제로서 사용될수 있는 신규 단백질을 제공하는 것이다.

사람을 포함하는 포유동물의 혈액중에는, 포유동물의 세포 조직의 성장을 자극하는 다양한 성장 인자가 함유되어 있는 것으로 사료되고 있다. 양적으로 용이하게 입수가능한 소 혈장은 섬유아세포 증식활성을 지닌 신규한 단백질의 정제 및 분리용의 출발물질로서 사용된다. 예를들어, 세포균주 Balb/3T3은 섬유아세포 증식 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

우선, 염화바륨을 혈장에 가하여 바륨상에 흡착된 칼슘 결합 단백질을 수득한다. 다음, 이러한 단백질을 함유하는 분획을 음이온 컬럼 크로마토그래피에 적용시켜 컬럼에 결합하는 혈액 응집 인자를 제거한다. 다양한 성장 인자가 헤파린에결합하는 것으로 공지되어 있으므로, 플로우-쓰로우(flow-through) 분획을 헤파린 친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용시켜 컬럼에 결합하는 분획을 분리한다. 이 분획은 겔 여과 컬럼, 음이온 컬럼 크로마토그래피 및 역상 액체 크로마토그래피로 더 정제한다. 이 분획을 섬유아세포 증식 활성에 대해 측정한다. 이렇게 수득된 각각의 활성 분획을 N-말단 아미노산 서열 및 아미노산 조성에 대해 측정하고, 특정의 공지된 단백질이 발견되는지의 여부를 단백질 및 유전자 데이타를 참조하여 탐색한다. 그 결과, 이 분획은 신규 단백질임이 밝혀졌다.

이 단백질은 PHBP-70으로 명명된다.

본 발명에 따라 제공된 단백질 PHBP-70은 하기 물리치 특성 및 N-말단 아미노산 서열을 지닌, 동물 혈액으로부터 분리한 신규 단백질이다.

1) 분자량:

약 60 내지 80kDa(환원 조건하에 SDS-PAGE 방법으로 측정)

2) N-말단 아미노산 서열:

서열 목록의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열

3) 특성:

헤파린 결합 특성 및 섬유아세포 증식 활성을 지닌다.

PHBP-70은 섬유아세포 증식 활성을 상실하지 않으면서도 아미노산 잔기의 일부 변형 및 화학적 변형 또는 분획화에 의해, 제조되기에 더욱 적합한 단백질인 것으로 여겨진다.

PHBP-70은 매우 수용성이며, 가장 적합하게도 적절한 수용성 염기와 배합된상태로 바람직하게는 영향받는 부위에 직접 적용시킴에 의해서 상처 치유를 위해 투여된다. 또한, 이것은 정맥내 주사 또는 피하 제제로서 전신계적으로, 및 미세-분말의 에어로졸 제제로서 비강내 또는 폐를 통과하도록 투여될 수 있다.

용량은 국소 투여의 경우 1 내지 100㎍/투여 부위/개인/일이며 전신투여의 경우 0.1 내지 10mg/kg/일이다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위함이며 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1

소 혈장으로부터 섬유아세포(Balb/3T3 세포)증식 촉진 인자의 정제

1) 소 혈장으로부터 비타민 K-의존성 단백질의 제거

소 혈장 19ℓ에 응고억제제(3.8% 시트르산나트륨, 10mM 벤즈아미딘-HCl) 1ℓ를 가하고 잘 혼합한다. 이 혼합물에 1M 염화바륨 2ℓ를 4℃에서 교반하면서 가한 후 수득되는 혼합물을 1시간 동안 정치시킨다. 원심분리(4000rpm, 5분)에 의해 백색 침전물을 수집하고, 염화나트륨 함유 3mM 벤즈아미딘-HCl, 0.01M 염화바륨 및 0.02% 나트륨아지드로 세척한후, 원심분리하여 침전물을 수득한다. 이 공정을 2회 반복한다.

침전물에 40% 포화된 황산암모늄(pH 7.0) 1.5ℓ를 가하고 이 혼합물을 4℃에서 밤새 교반하면서 정치시킨다. 침전물을 원심분리(4000rpm, 30분)로 제거하고, 고체 황산암모늄을 상층액에 가하여 70% 포화시키고, 1시간동안 정치시키며 원심분리한다(4000rpm, 30분). 침전물을 인산염 완충액 A(0.05M 인산나트륨, 0.2M 염화나트륨, 1mM 벤즈아미딘-HCl, 0.02% 나트륨 아지드, pH 6.0) 100ml중에 용해하고 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 투석이 완료된후, 원심분리(15,000rpm, 30분)하여 상층액을 수득한다[참조: Hashimoto, N., et al., J.Biochem. (1985), Vol. 97, p. 1347-1355]. 상층액은 동일한 완충액으로 예비평형시킨, DEAE-세파로즈 CL-6B 컬럼(컬럼크기: 직경 5cm ×길이 30cm)내에서 전개시켜, 흡착에 의해 비타민 K-의 존성 단백질을 제거함으로써, 통과한 분획을 수득한다.

2) 헤파린 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 및 음이온 컬럼 크로마토그래피에 의한 부분 정제

분획은 인산염 완충액 A로 예비평형시킨, 헤파린-세파로즈 CL-6B 컬럼(직경 1.6cm x 길이 15cm, Pharmacia AB 제조원)내에서 1ml/분의 저속으로 전개시킨다. 이 컬럼을 인산염 완충액 A로 완전히 세척한다.

세척후, 헤파린-세파로즈 CL-6B 컬럼상에 흡착된 펩타이드 또는 단백질을 0 2 내지 1.5M 염화나트륨 선형 농도 구배로 용출시킨다. 분광광도계를 사용하여 280nm에서 용출물의 흡광도를 기록한다. 용출 양식은 제1도에 나타나 있다. 약 120ml의 활성 분획을 수집한다. 이후, 분획을 필트론 한외여과기(Filtron ultrafilter)를 사용하여 농축시키고 농축물은 트리스 완충액(20mM 트리스-HCl, 0.1M 염화나트륨, pH8.0)로 예비-평형화시킨, 세파크릴 S-200HR 겔 여과 컬럼(직경 2.6cm x 길이 92cm, Pharmacia AB)상에 적용시킨후, 1ml/분의 유속으로 전개한다. 분광광도계를 사용하여 280nm에서 용출물의 흡광도를 기록한다. 약 51ml의 제1활성 피크를 수집한다. 용출양식은 제2도에 나타나 있다. 다음, 분획 일부는 상기 트리스 완충액으로 예비 평형화시킨 모노 Q 컬럼(직경 0.5cm x 길이 10cm, Pharmacia AB)내에서 전개시킨다. 트리스 완충액으로 세척한후, 0.1 내지 1.0M 염화나트륨선형 농도 구배로 용출시킨다. 분광광도계를 사용하여 280nm에서 용출물의 흡광도륵 기록한다. 약 8ml의 활성 분획을 수집한다. 용출 양식은 제3도에 나타낸다.

3) 역상 HPLC에 의한 정제

상기 방법 2)에 따라 수득한 용출물은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 함유하는 10% 아세토니트릴로 예비-평형화시킨, 코스모실(Cosmosil) 5C_18-300컬럼(직경 4.6mm x 길이 250mm, NACALAI TESQUE INC. 제조원)위에서 전개시킨후, 이 컬럼을 동일한 용액으로 완전히 세척한다. 다음, 흡착된 펩파이드 또는 단백질을 10 내지 70% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 214nm에서 이 용출물의 흡광도를 기록하여 매 피크의 분획을 수집한다. 활성 피크(화살표)를 수집한다. 용출 양식은 제4도에 나타낸다.

실시예 2

섬유아세포 증식 촉진 활성의 측정

섬유아세포 세포주, Balb/3T3 세포(ATCC로부터 구입 카탈로그 번호 CCL163 Balb/3T3-클론 A31)를 5x10³세포/웰로 96-웰 배양 플레이트내에 접종시키고 10% 송아지 혈청-함유 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium; 이후부터 DME로 언급) 100㎕를 첨가하고 37℃의 배양기내에서 24시간 동안 배양한다. 이후 배양 배지를 제거하고 세포를 세척한후, 저하된 혈청 배지(0.2% 송아지 혈청-함유 DME) 100㎕를 웰에 가하고 추가로 3일간 계속 배양한다. 실시예 1에서 수득한 각각의 분획 10㎕를 여기에 가하고 15시간 동안 배양한다. 다음,³H-티미딘을 74KBq/ml가 되게 첨가하고 6시간동안 배양한다. 배양이 완료된후, 세포를 수집하고 세포중에 혼입된³H-티미딘의 양을 측정한다.

그 결과, 세포 증식 촉진 활성이 제4도의 피크 1(화살표)의 분획중에서 관측된다.

실시예 3

피크 1에서 펩파이드의 물리-화학적 특성의 측정

1) N-말단 아미노산 서열에 대한 분석.

실시예 2에서 이의 활성이 확인된, 분획중의 펩타이드를 아미노산 서열 분석기, 모델 477A(Applied Biosystems Inc, 제조원)를 사용하여 N-말단 아미노산 서열에 대해 분석함으로써 서열 목록중 서열 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 측정한다. 이 서열은 특정의 상응하는 단백질이 확실히 신규한 것으로 밝혀질 수 있는지의 여부를 단백질 데이타 베이스로 탐색한다.

2) 아미노산 조성 분석

피크 1에서 펩타이드의 아미노산 조성은 아미노산 분석기를 사용하여 조사한다. 아미노산 조성 분석의 결과는 표 1에 나타낸다.

표 1

(*1) 70,000 달톤의 분자량 기준으로 계산됨

(*2) 측정되지 않음

3) 전기 영동을 사용한 분석

피크 1에서의 펩타이드 분자량은 환원 조건하 SDS-PAGE로 평가할 때 약 60 내지 80kDa의 분자량을 나타낸다(제5도). 제5도에서의 레인 1은 피크 1에서의 펩타이드 밴드를 나타내며 레인 2는 분자량 마커를 나타낸다.

상기 실시예 1), 2) 및 3)에 나타낸 결과를 고려할 때 섬유아세포 증식 활성을 지닌 피크 1에서의 펩타이드는 신규 단백질임이 확인된다.

실시예 4

PHBP-70의 섬유아포 증식 활성의 측정

실시예 2에서 수득한 PHBP-70의 용량-의존성 세포 증식 촉진 활성을 추가로 시험하기 위하여, PHBP-70을 실시예 2에 기술된 방법과 동일하게 웰당 0.3 내지 10μg/ml으로 동일한 배양 플레이트에 가하고,³H-티미딘의 혼입을 측정한다.

PHBP-70의 섬유아세포 증식 활성의 측정 결과는 표 2에 나타내며, 여기에 나타낸 데이타는 평균 및 이의 표준 편차(1개의 그룹당 4가지 경우)이다.

표 2

PHBP-70은 결과에 의해 용량-의존성 세포 증식 촉진 활성을 지니는 것으로 확증된다.

본 발명에 따라서 제공된 단백질 PHBP-70은 섬유아세포 증식 촉진 활성을 지니므로 상처-치유제로서 유용하다.

서열목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 :

(A) 명 : 훽스트 저팬 리미티드

(B) 가 : 아카사카 8초메 10-16 뉴 훽스트 빌딩

(C) 시 : 도쿄도

(E) 국 : 일본국

(F) 우편번호(ZIP): 107

(G) 전화번호 : 0081-3-3479-5137

(H) 팩시밀리번호 : 0081-3-3479-7859

(ii) 발명의 명칭: 혈장 헤파린 결합 단백질(PHBP)-70

(iii) 서열 1

(iv) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 운용 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : Patent In Release #1.0, Version #1.30(EPO)

(vi) 선 출원 데이타:

(A) 출원번호: 일본국 특허원 제94-61905호

(B) 출원일: 1994년 3월 31일

(2)서열 1에 대한 정보

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 17개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 펩타이드

(iii) 가정치: 없음

(v) 단편 유형: N-말단

(vi) 공급원:

(A) 유기체: 보스 타울루스(Bos taulus)

(F) 조직 유형: 혈장

(xi) 서열 기술: 서열1

제1도는 역상 액체 크로마토그래피에 의해 전개된 분획의 용출 양식을 도시한 것이다. 이 분획은 헤파린 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 수득된다. 화살표는 단백질을 함유하는 활성 분획을 나타낸다.

제2도는 분광광도계를 사용하여 280nm에서의 흡광도를 기록한 세파크릴 S-200HR 겔 여과의 용출 양식을 도시한 것이다.

제3도는 분광광도계를 사용하여 280nm에서의 흡광도를 기록한 모노 Q 컬럼의 용출 양식을 도시한 것이다. 용출은 0.1 내지 1.0M 염화나트륨의 선형 농도 구배로 수행한다.

제4도는 분광광도계를 사용하여 214nm에서의 흡광도를 기록한 5C_18-300의 용출 양식을 도시한 것이다. 용출은 10 내지 70% 아세토니트릴의 선형농도 구배로 수행한다.

제5도는 피크 1에서 펩타이드의 전기영동 양식을 도시한 것이다.

Claims

소를 포함하는 포유동물 혈장으로부터 비타민 K 의존성 단백질을 제거하고 헤파린 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼, 음이온 컬럼 크로마토그래피 및 역상 HPLC를 수행하여 분리하고 정제시킴으로써 제조되며, 헤파린 결합 특성 및 섬유아세포 증식 활성을 갖고, 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 이용한 분석에 의해 측정한 분자량이 약 60 내지 80kDa이며, 서열 목록의 서역 1에 기술된 N-말단 아미노산 서열을 갖고, 하기 표에서 나타낸 바와 같은 아미노산 조성을 가짐을 특징으로 하는, 혈장 헤파린 결합단백질(PHBP)-70.
제1항에 있어서, 헤파린 결합 성장인자인 혈장 헤파린 결합 단백질-70.
제1항 또는 제3항에 따른 혈장 헤파린 결합 단백질-70을 포함하는 상처 치유제.