JPS60199819A - トロンビン結合性物質およびその製法 - Google Patents
トロンビン結合性物質およびその製法Info
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- JPS60199819A JPS60199819A JP59055792A JP5579284A JPS60199819A JP S60199819 A JPS60199819 A JP S60199819A JP 59055792 A JP59055792 A JP 59055792A JP 5579284 A JP5579284 A JP 5579284A JP S60199819 A JPS60199819 A JP S60199819A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/7455—Thrombomodulin
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規トロンビン結合性物質およびその製法に関
する。
する。
血液凝固調節機構の中で、蛋白分解酵素としてのトロン
ビンの果たす役割については種々研究がなされ、凝固系
のメカニズムに関しては#ミは解明されている。
ビンの果たす役割については種々研究がなされ、凝固系
のメカニズムに関しては#ミは解明されている。
近年、生体内において、線溶系、抗凝固系に作用すると
首わわているプロティンCをトロンビンが活性化するこ
と、その機構に補酵素的に働く因子がウサギ肺組織抽出
物に存在していることが、N、L、Evmon等によシ
報告さノ1ている( J、Biologleal Ch
emistry+ 257(2) 859〜864(1
982))。
首わわているプロティンCをトロンビンが活性化するこ
と、その機構に補酵素的に働く因子がウサギ肺組織抽出
物に存在していることが、N、L、Evmon等によシ
報告さノ1ている( J、Biologleal Ch
emistry+ 257(2) 859〜864(1
982))。
本発明者らは、ヒトの凝固、線溶系におけるトロンビン
の役割、特に線溶系に及はす作用について研究を重ねた
ところ、ヒトの血管中においても、トロンビンがゾロテ
ィンCの活性化に関与していること、さらにトロンビン
と結合してその活性化機構に働く因子が存在することを
見い出し、当該因子をヒト胎盤よシ分離精製することに
成功し、本発明を完成した。
の役割、特に線溶系に及はす作用について研究を重ねた
ところ、ヒトの血管中においても、トロンビンがゾロテ
ィンCの活性化に関与していること、さらにトロンビン
と結合してその活性化機構に働く因子が存在することを
見い出し、当該因子をヒト胎盤よシ分離精製することに
成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ヒト由来のトロンビン結合性物質
及びその製法を提供するものでおる。
及びその製法を提供するものでおる。
本発明のトロンビン結合性物質は、トロンビンと結合し
てプロティンCの活性化を%異的に増強し、血液凝固時
間を延長することから、線溶促進剤、抗凝固剤として不
用である。
てプロティンCの活性化を%異的に増強し、血液凝固時
間を延長することから、線溶促進剤、抗凝固剤として不
用である。
このトロンビン結合性物質は、例えはヒト胎盤破砕物を
非イオン界面活性剤を含む緩衝液で抽出し、その抽出物
よシ、トロンビン−担体結合物を用いるアフイニテイク
ロマトグラフイーまftは(および)グル許過法によっ
て分離精製することによシ製造される。
非イオン界面活性剤を含む緩衝液で抽出し、その抽出物
よシ、トロンビン−担体結合物を用いるアフイニテイク
ロマトグラフイーまftは(および)グル許過法によっ
て分離精製することによシ製造される。
すなわち、ヒト胎盤をシュークロース、ベンズアミジン
塩酸を含むトリス塩酸緩衝液等で洗浄した後、破砕して
均質化する。次いでとわを遠心分離等に付して沈澱物を
集め、こオlを上記緩衝液にトリトンx−100、ルブ
ロールPX (Lubrol PX )%を加えたもの
で抽出する。この抽出り勿をジインゾロビルフォスフォ
ロートロンビン−アガロース等のトロンビン−担体結合
物を充填したカラムに通して活性区分を吸看させ、塩化
す) IJワム、EDTA 、ベンズアミジン塩酸、ト
リトンX−100を含むトリス塩酸緩衝液で溶出す11
ば本発明物質が得られる。また上記抽出物をグル濾過に
伺して活性区分を採取する方法、あるいは両名を組合せ
る方法を採用することもできる。
塩酸を含むトリス塩酸緩衝液等で洗浄した後、破砕して
均質化する。次いでとわを遠心分離等に付して沈澱物を
集め、こオlを上記緩衝液にトリトンx−100、ルブ
ロールPX (Lubrol PX )%を加えたもの
で抽出する。この抽出り勿をジインゾロビルフォスフォ
ロートロンビン−アガロース等のトロンビン−担体結合
物を充填したカラムに通して活性区分を吸看させ、塩化
す) IJワム、EDTA 、ベンズアミジン塩酸、ト
リトンX−100を含むトリス塩酸緩衝液で溶出す11
ば本発明物質が得られる。また上記抽出物をグル濾過に
伺して活性区分を採取する方法、あるいは両名を組合せ
る方法を採用することもできる。
斯くして得られる本発明のトロンビン結合性物質は次の
性質を有する。
性質を有する。
(a) 分子蓋
還元状態で88,000±10,000非還元状態で7
1.00 Q±10,000測定法: Laernmllの方法(Nature 227e68
0−685.1970 )に準じて、7.5%ドデシル
硫畝ナトリウム(5DF3 ) d?リアクリルアミド
ダルを用いた電気泳動法によシ測定した。
1.00 Q±10,000測定法: Laernmllの方法(Nature 227e68
0−685.1970 )に準じて、7.5%ドデシル
硫畝ナトリウム(5DF3 ) d?リアクリルアミド
ダルを用いた電気泳動法によシ測定した。
標準蛋白としては、バイオランド5DR−PAGEスタ
ンダードにも分子用(日本バイオランドラボラトリ−社
製)を用いた。還元処理は、296ゾテオスレイトール
を用い、100℃で3分間処理した。
ンダードにも分子用(日本バイオランドラボラトリ−社
製)を用いた。還元処理は、296ゾテオスレイトール
を用い、100℃で3分間処理した。
(bj 等電点
pH4,2±05
アンフオライトを用いる等電点電気泳動法によυ等電点
分画を測定した。
分画を測定した。
(c) 親和性
トロンビンに対し強い親和性を有する。ジイソゾロピル
フォスフォロートロンピン−アガロース[J、Biol
ogical Chemistry : 245130
59−3065.(1970)参照〕を用いるクロマト
処理で本発明ははは100%吸着した。
フォスフォロートロンピン−アガロース[J、Biol
ogical Chemistry : 245130
59−3065.(1970)参照〕を用いるクロマト
処理で本発明ははは100%吸着した。
(d)活性
■トロンビンと結合してプロティンCを活性化する。
測定法1:
ゾロテインCC7,32μM)5μt1本発明物質溶液
5 pt (0,055A280 /1nll )、ト
ロンビン(4U/d)50μtを、0.1M塩化ナトリ
ウム及び3.5mM塩化カルシウムをもむ0.02M)
リス塩酸緩衝液(PH7,5)40μt K治訂1し、
37℃で0〜30分間インキュベートスル。アンチトロ
ンビンI (16,1μM)150μtを加え、37℃で15分I
fUインキュベートし反応を停止させる。
5 pt (0,055A280 /1nll )、ト
ロンビン(4U/d)50μtを、0.1M塩化ナトリ
ウム及び3.5mM塩化カルシウムをもむ0.02M)
リス塩酸緩衝液(PH7,5)40μt K治訂1し、
37℃で0〜30分間インキュベートスル。アンチトロ
ンビンI (16,1μM)150μtを加え、37℃で15分I
fUインキュベートし反応を停止させる。
これにBoa −Leu −Ser −Thr −Ar
g −MCA100μM(蛋白奨励金製)を含む緩@液
浴液250μtを加え、37°Cで10分間反応させた
後、20%酢酸50 Q plを加え反応を停止させ、
遊離したAMC濃度を励起波長380nm1発光波長4
60 nmで螢光分光光度計によシ測定し、活性化され
たプロティンC濃度をめた。その結果を第1図に示す。
g −MCA100μM(蛋白奨励金製)を含む緩@液
浴液250μtを加え、37°Cで10分間反応させた
後、20%酢酸50 Q plを加え反応を停止させ、
遊離したAMC濃度を励起波長380nm1発光波長4
60 nmで螢光分光光度計によシ測定し、活性化され
たプロティンC濃度をめた。その結果を第1図に示す。
測定法2ニ
ゾロティンC(7,32μM)5μt5本発明物質0〜
5 pi (0,055Azso/ d )、0.1M
塩化ナトリウム0.596 Lubrol PX (シ
グマ社製)を含有する0、02MIJス塩酸緩衝液(p
H7,5)5〜0μを及びトロンビン(4U/mt)5
0pLを、0,1M塩化ナトリウム、3、5 mM塩化
カルシウムを含む0.02M)リス塩酸緩衝液(pa7
.5)40μtK溶解し、37℃で30分間インキュベ
ートする。次いでアンチトロンビン1150μtを加え
37℃で15分間インキュベートし反応を停止させる。
5 pi (0,055Azso/ d )、0.1M
塩化ナトリウム0.596 Lubrol PX (シ
グマ社製)を含有する0、02MIJス塩酸緩衝液(p
H7,5)5〜0μを及びトロンビン(4U/mt)5
0pLを、0,1M塩化ナトリウム、3、5 mM塩化
カルシウムを含む0.02M)リス塩酸緩衝液(pa7
.5)40μtK溶解し、37℃で30分間インキュベ
ートする。次いでアンチトロンビン1150μtを加え
37℃で15分間インキュベートし反応を停止させる。
以下測定法1と同様にしてMC人基質を用いて遊離した
AMC叙度を測定した。その結果を第2図に示す。
AMC叙度を測定した。その結果を第2図に示す。
こわらの結果から、本発明物質はトロンビンによるゾロ
ティンCの活性化を促進することがわかる。
ティンCの活性化を促進することがわかる。
■血液のttt固時開時間長する。
測定法:
本発明物質溶液(0,、2,5、5,0、10,Opi
) (0,055A25o /ld )をフイプロカ
ツゾに分注し、0.1−のカオリン添加活性化セファロ
シラステン(アクチン; Dads社製)を添加し、3
7℃に加温する。1分後に、37℃に加温したクエン酸
添加乏血小板血漿0、1 rntを加える。更に、3分
後に、37℃に加温した0、 025 M塩化カルシウ
ム溶液を添加し、フィブロメーター(ベクトン・デイツ
キンソン社製)を作動させ、凝固時間を測定した。その
結果を第1表に示す。
) (0,055A25o /ld )をフイプロカ
ツゾに分注し、0.1−のカオリン添加活性化セファロ
シラステン(アクチン; Dads社製)を添加し、3
7℃に加温する。1分後に、37℃に加温したクエン酸
添加乏血小板血漿0、1 rntを加える。更に、3分
後に、37℃に加温した0、 025 M塩化カルシウ
ム溶液を添加し、フィブロメーター(ベクトン・デイツ
キンソン社製)を作動させ、凝固時間を測定した。その
結果を第1表に示す。
以下余白
第1表
この結果に示され、るように、本発明物質の濃度が高く
なるに従って凝固時間が延長することから、本発明物質
は血液の抗凝固作用を有することがわかる。
なるに従って凝固時間が延長することから、本発明物質
は血液の抗凝固作用を有することがわかる。
(@) 安定性
条 件 残存活性
1%p−メルカゾトエタノール
還元処理 29%
変性剤 1%Sos 92 %
8M尿素 100%
6Mグアニゾ9ムクロリド 77%
PH295%
pH1099%
ペゾシン処理 89%
加熱処理 20分
測定法:
本発す」物質(0,073A2110 /me )を上
記各処理条件下、25℃で15Q分処理した。処理後ト
リス−緩衝食塩水で100倍に希釈し活性を測定した。
記各処理条件下、25℃で15Q分処理した。処理後ト
リス−緩衝食塩水で100倍に希釈し活性を測定した。
非処理の活性値から残存活性な嘗4出した。尚、ベゾシ
ンは、終濃度257197 =eX pH2,5を用い
37℃で2時間処理した。加熱処理は100℃、pH7
,5で処理し、半減期で示した。
ンは、終濃度257197 =eX pH2,5を用い
37℃で2時間処理した。加熱処理は100℃、pH7
,5で処理し、半減期で示した。
実施例1
(1) ヒト胎盤約1.0に2(2個分〕を、0.25
Mシュクロース、ln5Mベンズアミシン塩酸を含む
0.02M)リス塩酸緩衝液(pH7,5)で洗浄した
後、破砕し均質化する。均質化した溶液を30,000
Xfで40分間遠心分離して得られる沈澱物を分取し、
上記緩衝液に懸濁させ、再度遠心分離して沈澱物を分取
する。
Mシュクロース、ln5Mベンズアミシン塩酸を含む
0.02M)リス塩酸緩衝液(pH7,5)で洗浄した
後、破砕し均質化する。均質化した溶液を30,000
Xfで40分間遠心分離して得られる沈澱物を分取し、
上記緩衝液に懸濁させ、再度遠心分離して沈澱物を分取
する。
以上の操作を5回行って分取した沈澱物を025Mシュ
クロース、1mMベンズアミシン塩酸及び0.5%(マ
/マ〕トリトンX−100(シグマ社製)を有する0、
02Mトリス塩酸緩衝液(PH7,5)300−で抽出
する。得られた粗抽出液315−の蛋白質濃度は、OD
700値1,17であった。
クロース、1mMベンズアミシン塩酸及び0.5%(マ
/マ〕トリトンX−100(シグマ社製)を有する0、
02Mトリス塩酸緩衝液(PH7,5)300−で抽出
する。得られた粗抽出液315−の蛋白質濃度は、OD
700値1,17であった。
粗抽出液315ゴを、0,1M塩化ナトリウム、0.5
mM塩化カルシウム、O,1mMベンズアミシン塩酸
及び0.596(マ/マ)トリトンX−100を含む0
.02 M )リス塩酸緩衝液(p)I 7.5 )で
平衡化したグイソゾロビルフオスフオロートロンビンー
アガロース(以下、DIP−トロンビン−アガロースと
略称する)カラム[直径2.5cm5長さ20 cm
]に付し、平oU化に月ノいた緩衝液1500 mlで
洗浄する。
mM塩化カルシウム、O,1mMベンズアミシン塩酸
及び0.596(マ/マ)トリトンX−100を含む0
.02 M )リス塩酸緩衝液(p)I 7.5 )で
平衡化したグイソゾロビルフオスフオロートロンビンー
アガロース(以下、DIP−トロンビン−アガロースと
略称する)カラム[直径2.5cm5長さ20 cm
]に付し、平oU化に月ノいた緩衝液1500 mlで
洗浄する。
洗浄液を16.7 meづつフラクションコレクターを
用い分取した。
用い分取した。
次いで浴出液として、1M塩化ナトリウム、0、1 m
M EDTA 、1 mVベンズアミジン塩酸及び0.
596(マ/マ)トリトンX−100を含む0.02h
xトリス塩し緩&液(Pal 7.5 )350dを用
いて溶出しfr−0溶出液を6.7−づつ分取した。洗
浄液及び溶出液の蛋白質濃度及び活性を測定した結果を
第3図に示す。
M EDTA 、1 mVベンズアミジン塩酸及び0.
596(マ/マ)トリトンX−100を含む0.02h
xトリス塩し緩&液(Pal 7.5 )350dを用
いて溶出しfr−0溶出液を6.7−づつ分取した。洗
浄液及び溶出液の蛋白質濃度及び活性を測定した結果を
第3図に示す。
尚第3図中、・−Oは吸光度、○−−−〇は活性を示す
。
。
蛋白質濃度は、 Lowry法によシ測定し、活性は(
d)項の測定法1にに載した方法によシ測定した。
d)項の測定法1にに載した方法によシ測定した。
(2) 上記溶出液中のフラクションi16画分から第
29画分94fnlを用い、カラム平衡化に用いた緩衝
液で透析して得られる溶液103m/ヲ、(11と同様
に処理したDIP −)ロンビン−アガロースカラムに
付した。
29画分94fnlを用い、カラム平衡化に用いた緩衝
液で透析して得られる溶液103m/ヲ、(11と同様
に処理したDIP −)ロンビン−アガロースカラムに
付した。
次いで、0.4M塩化ナトリウム、9.5mM塩化カル
シウム、(11mMベンズアミシン塩酸及び0. s
96トリトンx−iooを含む0.02Mトリス塩酸緩
衝液(pH7,5) 10meを用いて洗浄し、更に塩
化カルシウムの代 4゜9に1 mM =EDTAを用
いた以外は上記と同一の緩衝tK (pH7,5) 1
0dで洗浄する。
シウム、(11mMベンズアミシン塩酸及び0. s
96トリトンx−iooを含む0.02Mトリス塩酸緩
衝液(pH7,5) 10meを用いて洗浄し、更に塩
化カルシウムの代 4゜9に1 mM =EDTAを用
いた以外は上記と同一の緩衝tK (pH7,5) 1
0dで洗浄する。
溶出溶液として、0. l mMKDTA、1 mMベ
ンズアミシン塩酸及び0,5%トリトンX−100を含
む0.02 M トリス塩酸緩@液(pH7,5)に、
塩化ナトリウムi1.4M〜IM)を加えた溶液100
tdを用い、濃度勾配法で浴出液を4.4−づつ分取し
た。溶出液の蛋白質濃度及び活性を(1)と同様にして
測定した結果を第4図に示す。尚第4図中・−・は吸光
度、0−m−〇は活性を示す。
ンズアミシン塩酸及び0,5%トリトンX−100を含
む0.02 M トリス塩酸緩@液(pH7,5)に、
塩化ナトリウムi1.4M〜IM)を加えた溶液100
tdを用い、濃度勾配法で浴出液を4.4−づつ分取し
た。溶出液の蛋白質濃度及び活性を(1)と同様にして
測定した結果を第4図に示す。尚第4図中・−・は吸光
度、0−m−〇は活性を示す。
溶出フラクション第38画分〜第57画分を分取し、蛋
白)J1gt度of)yoo値0.057の本発明物質
溶液88tn1.をイ好た。
白)J1gt度of)yoo値0.057の本発明物質
溶液88tn1.をイ好た。
第1図及び第2図は本発明トロンビン結合性物質のトロ
ンビンによるプロティンCの活性化促進作用を、第3図
はヒト胎盤抽出物をアフイニテイクロマトグラフイーに
伺したときの溶出、Qターンを、第4図は上記溶出液の
第16〜29画分をアフイニテイカラムクロマトグラフ
イーに伺したときの溶出ノ9ターンを示す図でおる。 以上
ンビンによるプロティンCの活性化促進作用を、第3図
はヒト胎盤抽出物をアフイニテイクロマトグラフイーに
伺したときの溶出、Qターンを、第4図は上記溶出液の
第16〜29画分をアフイニテイカラムクロマトグラフ
イーに伺したときの溶出ノ9ターンを示す図でおる。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 次の性質を有するヒト由来のトロンビン結合性物
質。 (a) 分子量:娯元状態で88,000±10,00
0非還元状態で71,000±10,000(bl 等
電点:pH4,2土0,5 (c)親和性ニトロンビンに対し強い親和性を有する。 (d) 活 性二〇)トロンビンと結合し2てゾロティ
ンCを活性化する。Q)血液の凝固 時間を延長する。 (@)安定性: pu 2〜10で安定。変性剤(ドデ
シル、硫酸ナトリワム、尿素) 及びペゾシン処理に対して安定。 2、 ヒト胎盤破砕物を非イオン界面活性剤を含む緩衝
液で抽出し、その抽出物よシ、トロンビン−担体結合物
を用いるアフイニテイクロマトグラフイーまたは(およ
び)ダル濾過法によって分1ilII精製することを特
徴とする次の性質を有するトロンビン結合性物質の製法
。 (a) 分子it:M元状態−?’ 88,000:f
:10,000非還元状態で71,000±10,00
0(bl 等電点:14.2±0.5 (c) 親和性:トロンビンに対し強い親和性を翁する
。 (dl 活a:uノドロンピンと結合してプロティンC
を活性化する。■血液の凝固 時間を延長する。 (al 安定性:pH2〜10で安定。変性剤(ドデシ
ル、hpルナトリウム尿素) 及びペゾシン処理に対して安定。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59055792A JPS60199819A (ja) | 1984-03-23 | 1984-03-23 | トロンビン結合性物質およびその製法 |
US06/713,821 US4638050A (en) | 1984-03-23 | 1985-03-20 | Thrombin-binding substance and process for its production |
DE8585301959T DE3577399D1 (de) | 1984-03-23 | 1985-03-21 | Thrombinbindender stoff und verfahren zu seiner herstellung. |
EP85301959A EP0155852B1 (en) | 1984-03-23 | 1985-03-21 | Thrombin-binding substance and process for its production |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59055792A JPS60199819A (ja) | 1984-03-23 | 1984-03-23 | トロンビン結合性物質およびその製法 |
Publications (2)
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