-
Technisches Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Nachweistechniken in der Bioanalyse,
insbesondere den optischen Nachweis in einem mehrkanaligen Bioseparationssystem
und ganz besonders den Nachweis von Emissionen von Strahlungsanregungsvorgängen bei der
mehrkanaligen Elektrophorese auf Kapillarbasis. Ferner betrifft
die folgende Erfindung ein Bioseparationsinstrument, das das Nachweisschema
der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
-
Stand der Technik
-
Die
Bioanalyse, wie z.B. DNA-Analyse, entwickelt sich gegenwärtig aus
einer rein wissenschaftlichen Suche nach Genauigkeit zu einem Routineverfahren
mit erhöhter,
erwiesener Zuverlässigkeit.
Sowohl medizinische Forscher, Pharmakologen als auch forensische
Ermittler verwenden die DNA-Analyse bei der Verfolgung ihrer Aufgaben.
Allerdings sind aufgrund der Komplexität der Geräte, mit denen DNA-Proben nachgewiesen
und gemessen werden, sowie der schwierigen Herstellung der Proben
die vorhandenen DNA-Analyseverfahren
häufig
zeit- und kostenaufwendig. Daher ist es wünschenswert, die Größe, Anzahl
der Teile und die Kosten der Geräte
zu reduzieren, die Probenhandhabung während des Verfahrens zu erleichtern
und allgemein einen vereinfachten, kostengünstigen Detektor mit hoher Empfindlichkeit
zur Verfügung
zu haben.
-
Bei
einer Art von DNA-Analyseinstrumenten ist man zur Trennung von DNA-Molekülen auf
die Elektrophorese angewiesen. Elektrophoresetechniken können zur
Trennung von Fragmenten von DNA für gentypische Anwendungen, einschließlich dem Identitätstest von
Menschen, der Expressionsanalyse, dem Nachweis von Krankheitserregern,
dem Nachweis von Mutationen und pharmakogenetischen Untersuchungen,
verwendet werden. Dabei bezieht sich der Begriff Elektrophorese
auf die Bewegung eines geladenen Moleküls unter dem Einfluss eines elektrischen
Felds. Die Elektrophorese lässt
sich zur Trennung von Molekülen
verwenden, die gleichwertige Ladungs-/Massen-Verhältnisse,
jedoch unterschiedliche Massen aufweisen. Ein Beispiel für derartige
Moleküle
sind DNA-Fragmente.
-
Es
gibt verschiedene im Handel erhältliche Instrumente,
bei denen die Elektrophorese zur Analyse von DNA-Proben angewandt
wird. Bei einem solchen Typ handelt es sich um ein mehrspuriges Plattengelelektrophoreseinstrument,
das, wie der Name vermuten lässt,
eine Gelplatte verwendet, auf der DNA-Proben aufgebracht werden.
An die Gelplatte wird eine elektrische Ladung angelegt, wodurch
die DNA-Probe in DNA-Fragmente unterschiedlicher Massen getrennt
wird.
-
Ein
weiterer Typ von Elektrophoreseinstrumenten ist das Kapillarelektrophorese
(Capillary Electrophoresis, CE)-Instrument.
CE bezieht sich auf eine Familie verwandter Analysetechniken, bei
denen sehr starke elektrische Felder zur Trennung von Molekülen in Kapillaren
mit enger Bohrung (typischerweise mit einem Innendurchmesser von 20–100 µm) verwendet
werden. CE-Techniken
werden in offenbar zahllosen Anwendungen sowohl in der Industrie
als auch an der Universität
eingesetzt. Die auf Gele und Polymernetzwerke beruhende CE hat die
Untersuchungen von Nukleinsäuren
revolutioniert; zu den Anwendungen gehören die DNA-Sequenzierung, die Nukleotidquantifizierung
sowie die Analyse von Mutationen/Polymorphismen. Bei der Anwendung
der Elektrophorese in einer Quarz ("Fused Silica")-Kapillarsäule, die eine Pufferlösung enthält, wird
eine wesentlich geringere Probengröße benötigt, wobei die Geschwindigkeit
der Trennung sowie die Auflösung
gegenüber
dem Plattengelelektrophoreseverfahren um ein Mehrfaches erhöht werden
können.
Diese DNA-Fragmente werden in der CE häufig dadurch nachgewiesen,
dass man Licht durch die Kapillarwand auf die Komponenten richtet, die
von der Probe, die mit einem Fluoreszenzmaterial versehen wurde,
getrennt werden, und die durch das einfallende Licht induzierten
Fluoreszenzemissionen nachweist. Die Intensitäten der Emission sind dabei repräsentativ
für die
Konzentration, Menge und/oder Größe der Komponenten
der Probe.
-
Einige
der Herausforderungen bei der Konstruktion von auf CE beruhenden
Instrumenten sowie dem Entwurf von CE-Analysevorschriften betreffen Probenachweistechniken.
Beim Fluoreszenznachweis wurden beim Entwurf beispielsweise ganz
besonders die Strahlenquelle, die optische Dichte, die Empfindlichkeit
und Zuverlässigkeit
des Nachweises, die Kosten und die Zuverlässigkeit der Struktur der Nachweisoptik
berücksichtigt.
-
CE
mit Verwendung des Fluoreszenzverfahrens liefert eine hohe Nachweisempfindlichkeit
bei der DNA-Analyse. Auf dem Gebiet der Genomik und Proteomik ist
der Fluoreszenznachweis häufig
das Nachweisverfahren der Wahl, und zwar aufgrund seiner im Vergleich
mit anderen Nachweisverfahren herausragenden Empfindlichkeit. Bei
zwei vorherrschenden Fluoreszenznachweisarten handelt es sich um
die konfokale Rasterlaser-induzierte Fluoreszenz (LIF) und um Sheath
Flow-Detektoren.
-
Der
Hauptnachteil eines Sheath-Flow-Detektors ist das zur Sicherstellung
eines zuverlässigen Sheath
Flow benötigte
hochkomplizierte Flussystem. Dabei werden extreme Anforderungen
an die Toleranzwerte der optischen und mechanischen Komponenten
gestellt, um die Forderungen des Endanwenders nach Robustheit zu erfüllen. Zwar
ist die Empfindlichkeit der Vorrichtung sehr gut, doch ist es nicht offensichtlich,
dass sich dieses Prinzip des Fluoreszenznachweises für eine DNA-Analyse mit hohem Durchsatz,
die dennoch kostengünstig
ist, eignet. Der konfokale Rasterdetektor beruht auf dem rasterförmiges Abtasten
(Scanning) des optischen Systems. Dabei ist die Verwendung beweglicher
Teile unter Berücksichtigung
der Einfachheit, Robustheit und geringen Kosten des Instruments
nicht ideal. Auch stellt die geringe Tiefenschärfe des Mikroskopobjektivs
starke Anforderungen an die Toleranzwerte der mechanischen und optischen
Komponenten. Ferner wird durch das optische Scanning-Prinzip der
Arbeitszyklus pro Kapillare reduziert, was sich bei weiterer Vergrößerung des
Instruments zum Zwecke eines sehr hohen Durchsatzes negativ auf
die Empfindlichkeit auswirken kann.
-
Eine
der teuersten Hardware-Komponenten ist bei vielen im Handel erhältlichen
CE-Instrumenten mit LIF-Detektor typischerweise eine Lichtquelle
zur Fluoreszenzanregung, bei der es sich um eine Gasentladungslampe
(Quecksilber oder Xenon) oder einen Laser (Gaslaser, Festkörperlaser
mit zweiter harmonischer Generation, Farbstofflaser oder Halbleiterlaser)
handeln kann, wobei diese sperrig, teuer und ineffizient sind und
deren abgegebenes Licht schwer in optische Fasern einzukoppeln ist,
womit eine Miniaturisierung des optischen Nachweissystems verhindert
wird. Diese Lichtquellen behindern die Entwicklung von kostengünstigen
Analyseinstrumenten mit geringer Größe und hohem Durchsatz sowie
der für
den schnellen Nachweis benötigten Zweckmäßigkeit.
-
Die
Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe unter Verwendung von mit
Gel gefüllten
Kapillaren weist Vorteile gegenüber
den auf dem klassischen Plattengel beruhenden Trennungen hinsichtlich
Geschwindigkeit und Auflösung
auf. Allerding weisen die meisten im Handel erhältlichen CE-Instrumente nur
eine mre-Kapillare auf, wobei zu einem bestimmten Zeitpunkt nur
jeweils eine Probe analysiert werden kann. Bei einem im Handel erhältlichen DNA-Sequenzierautomaten
mit Verwendung eines Plattengelsystems (wie z.B. das Instrument
Applied BioSystems 377) können
36 Proben gleichzeitig analysiert werden. Damit DNA-Fragment-Analyseinstrumente
auf Kapillarelektrophoresebasis hinsichtlich des Durchsatzes konkurrenzfähiger werden,
war es notwendig, Instrumente zu entwickeln, bei denen mehr als
eine Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt gefahren werden kann. Das
den DNA-Fragment-Analyseinstrumenten (wie z.B. PACE 5000 LIF, PACE
MDQ LIF von Beckman Coulter) mit Verwendung eines Ein-Kapillaren-Instruments zugrundeliegende
Prinzip lässt
sich auf ein Mehr-Kapillaren System ausdehnen. Allerdings ist die
Konstruktion eines Mehr-Kapillaren-DNA-Analysegeräts unter
Nutzung von auf LIF beruhenden optischen Nachweissystemen (d.h.
8-Kapillaren-Intrument CEQTM 2000XL von Beckman Coulter) wesentlich
teurer und komplizierter als die auf dem klassischen Plattengel
beruhenden Systeme. Zu weiteren Beispielen von im Handel erhältlichen
Mehr-Kapillaren-CE-Instrumenten gehören von den Firmen ABI, SpectruMedix
und Pharmecia entwickelte Instrumente, die ähnliche Nachteile aufwiesen.
-
In
einem weiteren Fluoreszenznachweisverfahren wird das Innere mehrerer
Kapillaren gleichzeitig beleuchtet und das davon emittierte Licht
gesammelt. Nach dem
US-Patent Nr. 5,790,727 bilden
die Kapillaren in einem parallelen Array einen optischen Wellenleiter,
wobei die Brechung an den zylindrischen Oberflächen das in der Ebene des Arrays
geführte
Einstrahlungslicht auf den Kern jeder benachbarten Kapillare im
Array begrenzt. Da jedoch lediglich eine Lichtquelle für die Belichtung
verwendet wird, besteht ein Übersprechen
(cross talk) zwischen den unterschiedlichen, durch die Kapillaren
definierten Trennungskanälen.
Aufgrund der Existenz von Streulicht kann ein Übersprechen nicht verhindert werden,
wobei durch das Rauschen in der Fluoreszenzemission das Kontrastverhältnis nachgewiesener
Signale schlecht ist. Weiterhin wird durch die einzelne Belichtungsquelle
des Standes der Technik für mehrfache
Kanäle
der LIF-Nachweis bei mehreren Wellenlängen komplizierter.
-
In
der
US 5,324,401 wird
ebenso ein Fluoreszenznachweissystem beschrieben. Dabei wird spezifisch
ein Fluoreszenznachweissystem für
die Kapillarelektrophorese beschrieben, wobei das Nachweissystem
gleichzeitig Fluoreszenz anregen und weitgehend gleichzeitig Trennungen
in mehreren Kapillaren verfolgen kann. Dieser Multiplex-Ansatz beinhaltet
die Laserbestrahlung einer Probe in mehreren Kapillaren über optische
Fasern, die einzeln mit den Kapillaren gekoppelt sind. Der Array
wird orthogonal über
ein Mikroskop auf eine CCD (Charged-Coupled Device)-Kamera zur Signalanalyse
abgebildet.
-
Andererseits
wird in der
WO01/02846 ein System
und ein Verfahren zur molekularen Probenmessung beschrieben. Dabei
wird spezifisch ein System zur Ausrichtung der optischen Komponenten
eines chemischen Analysesystems beschrieben, bei dem Kapillaren
oder optische Fasern von einem Substrat geträgert werden. Das System sieht
die Ausrichtung von Elementen eines Elektrophoresesystems mit der
Fähigkeit
einer effizienten hohen Probennahmegeschwindigkeit vor. Das System
stellt mehrere Quellen, wie z.B. Laser oder LED, zur Verfügung, die optisch
an jede Kapillare bzw. jeden Kanal gekoppelt sind. Eine Mehr-Analyten-Kapazität, eine
Vielfalt von Analysearten sowie DNA-Sequenzierarbeiten stellen Anwendungen
von Systemen mit mehreren Lasern pro Kanal dar.
-
Daher
ist es wünschenwert,
ein kostengünstiges
mehrkanaliges Nachweisschema mit hohem Durchsatz für die Bioseparation
zu entwickeln, mit dem die Beschränkungen des Standes der Technik überwunden
würden.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Durch
die vorliegende Erfindung wird ein vereinfachtes kostengünstiges,
effizientes, hochempfindliches und mehrkanaliges Nachweissystem
mit hohem Durchsatz, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, bereitgestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein mehrkanaliges Nachweisschema
bereitgestellt, das auf einer Konfiguration mit mehreren Strahlungsquellen
und einem gemeinsamen Detektor beruht und bei dem der Nachweis als
zeitlich gestaffelter Nachweis für
die Kanäle
ausgeführt
wird. Ein einzelner Detektor ist dabei an eine Vielzahl von Strahlungsquellen
in einer Ein-Detektor/Viel-Strahlungsquellen-Konfiguration
gekoppelt. Jede Strahlungsquelle richtet die Strahlung auf eine
Nachweiszone eines einzelnen Separationskanals, wobei ein einzelner
Detektor zum Nachweis von Lichtemissionen aus den Nachweiszonen
mehrerer Separationskanäle verwendet
wird. Im gesamten Nachweissystem kann mehr als ein Detektor vorhanden
sein, wobei diese jeweils mehrfache Strahlungsquellen bedienen.
-
Die
Bioseparation wird gleichzeitig in allen Kanälen parallel durchgeführt, wobei
der Nachweis im Hinblick auf die Lichtquellen zeitlich versetzt
stattfindet. Die Lichtquellen richten die Strahlung auf die Nachweiszonen
in einer vorbestimmten Abfolge in Form eines Zyklus, wobei die Detektorausgabe
mit den Lichtquellen über
eine Steuereinheit synchronisiert ist. Die Strahlungsquellen und
der Detektor sind synchronisiert gepulst in einer Zeit-Multiplexen
Art. Die Steuereinheit steuert dabei den Detektor und die Strahlungsquellen,
so dass der Nachweis von Strahlungsemissionen aus den mehrfachen
Separationskanälen
in vorbestimmten Nachweiszyklen erfolgt, wobei jeder Nachweiszyklus
mit einer Häufigkeit
wiederholt wird, dass eine gewünschte
Nachweiszeit bzw. Nachweisdauer bereitgestellt wird. Die Steuereinheit
steuert die Strahlungsquellen und den Detektor auf eine Weise, so
dass der Nachweis in der Art eines wiederholten Scannings erfolgt,
und zwar über die
Nachweiszonen der Separationskanäle
hinweg in der Art eines zeitlich versetzten Nachweises. Dabei wird
im Sinne der folgenden Erfindung ein Übersprechen zwischen den Kanälen praktisch
ausgeschlossen. Für
die Ausrichtung der Lichtquelle oder den Nachweis werden keine beweglichen
Teile benötigt.
-
Als
Lichtquellen werden statt teurer Hochleistungslaser kostengünstige lichtemittierende
Dioden (LED) (z.B. superhelle LED) verwendet. Das einfallende Licht
aus den Lichtquellen kann getrennt auf die mehrkanaligen Nachweiszonen
unter Verwendung optischer Fasern gelenkt werden. Das von den mehrkanaligen
Nachweiszonen emittierte Licht kann unter Verwendung optischer Fasern
auf einen oder mehrere allgemeine Detektoren gerichtet werden. Da keine
beweglichen Teile notwendig sind, kann die Anzahl der Komponenten
verringert werden. Durch Ausschließen oder Reduzieren des Übersprechens zwischen
Kanälen
lässt sich
die Konstruktion des optischen Nachweissystems stark vereinfachen.
Dementsprechend wird das Instrument hinsichtlich Kosten, Zuverlässigkeit
und Einfachheit der Verwendung verbessert.
-
Bei
einer besonderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Nachweisschema der vorliegenden
Erfindung für
den strahlungsinduzierten Fluoreszenznachweis in einem mehrkanaligen
Bioseparationsinstrument konfiguriert. In einer weiteren Ausführungsform
wird das Nachweisschema für
den strahlungsinduzierten Fluoreszenznachweis in einem Kapillarelektrophoreseinstrument
konfiguriert.
-
In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird durch die
vorliegende Erfindung ein Bioseparationsinstrument bereitgestellt,
das das Nachweisschema der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
Zum
besseren Verständnis
der Art und der Vorteile der Erfindung ebenso wie der bevorzugten Verwendungsart
wird auf die folgende ausführliche Beschreibung
verwiesen, die in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen gelesen
werden sollte. In den folgenden Zeichnungen bezeichnen gleiche Kennziffern
gleiche oder ähnliche
Teile in allen Zeichnungen.
-
Bei 1 handelt
es sich um eine schematische Ansicht eines Beispiels eines mehrkanaligen
Bioseparationssystems, das das optische Nachweiskonzept der vorliegenden
Erfindung beinhaltet.
-
Bei 2 handelt
es sich um eine perspektivische Ansicht eines mehrkanaligen CE-Systems, das
das optische Nachweisschema der vorliegenden Erfindung gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
-
Bei 3 handelt
es sich um eine vereinfachte Ansicht der Nachweisoptik in Verbindung
mit der Kapillarkartusche gemäß einer
Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung.
-
Bei 4 handelt
es sich um ein Blockdiagramm des Steuersystems für die Einfallstrahlung und
des Emissionsnachweissystems.
-
Bei 5 handelt
es sich um ein Zeitdiagramm, das die Impulsgebung für das zeitliche
Multiplexing von Strahlungsquellen gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER DARGESTELLTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
vorliegende Erfindung richtet sich auf eine neuartige Nachweiskonfiguration,
bei der mehrere Lichtquellen Anregungslicht über entsprechende optische
Fasern auf eine entsprechende Flüssigkeitsprobe
in einer Vielzahl von Flüssigkeitsproben
in einem zeitlichen Multiplex-Vorgang emittieren; dabei wird in
jeder der Flüssigkeitsproben
als Antwort auf das Anregungslicht Fluoreszenz erzeugt, und zwar zu
unterschiedlichen Zeiten, die den Zeiten entsprechen, zu denen das
Licht auf die Proben übertragen wird,
wobei die Fluoreszenz von einer einzelnen Probe dem Detektor zugeführt wird,
der ein Signal ausgibt, das zur Intensität des nachgewiesenen Fluoreszenzlichts
proportional ist. Daher wird zum Nachweis von Licht von einer Vielzahl
lichtemittierender Vorrichtungen ein einzelner Detektor verwendet.
Zur Veranschaulichung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung,
ohne diese jedoch zu beschränken,
wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf auf CE, strahlungsinduzierte
Fluoreszenz und mehrfache Separationskanäle gerichtete Ausführungsformen
beschrieben. Dabei versteht sich, dass der Umfang der vorliegenden
Erfindung nicht auf den Nachweis fluoreszenzartiger Emission beschränkt ist,
sondern sich auch auf den Nachweis anderer Arten von Emissionsstrahlung,
wie beispielsweise Phosphoreszenz, Lumineszenz und Chemilumineszenz,
anwenden lässt.
-
Der
Mechanismus der Elektrophorese sowie die strahlungsinduzierte Fluoreszenz
liegen bei alleiniger Betrachtung außerhalb des Umfangs der vorliegenden
Erfindung. Der Vollständigkeit
halber reicht es aus, CE mit Bezug auf das mehrkanalige CE-System 200 in
bezug auf 1 und 2 zu beschreiben.
Wie in 1 dargestellt, umfasst das CE-System 200 im
Allgemeinen wenigstens eine Kapillarseparationssäule 140, die einen
Separationskanal und einen eine Nachweiszone 406 definierenden
Nachweisabschnitt aufweist. Der Separationskanal ist mit einem Separationsträgermedium
gefüllt,
bei dem es sich einfach um einen Laufpuffer oder um eine im Fachgebiet
bekannte Siebgelmatrix handeln kann. Beim strahlungsinduzierten
Fluoreszenznachweis enthält
die Gelmatrix einen bekannten Fluorophor, wie beispielsweise Ethidiumbromid.
-
Im
Betrieb wird eine vorbereitete biologische Probe (z.B. eine DNA-Probe)
in das von der Nachweiszone 406 entfernte Ende der Kapillarsäule 140 eingeführt, wobei
dies auf verschiedene Weisen geschehen kann, die nicht Teil der
vorliegenden Erfindung sind (z.B. elektrokinetische Injektion aus
einem Probenreservoir oder Injektion mit physikalischem Druck unter
Verwendung einer Spritzenpumpe). Die Probe bindet an den Fluorophor.
Wird zwischen die Elektroden 111 und 112 ein Gleichstrompotential
angelegt, so wandert die Probe unter dem angelegten elektrischen
Potential entlang des Separationskanals und trennt sich in Banden
der Probenbestandteile auf. Das Ausmaß der Separation und die Strecke
der Bewegung entlang des Separationskanals hängen dabei von einer Reihe
von Faktoren ab, wie beispielsweise der Wanderungsmobilität der Probenbestandteile,
der Masse und Größe bzw.
Länge der
Probenbestandteile und dem Separationsträgermedium. Bei den treibenden
Kräften
im Separationskanal zur Separation der Proben könnte es sich um Mittel der Elektrophorese,
des Drucks oder des elektroosmotischen Flusses (EOF) handeln.
-
Wenn
die Probe die Nachweiszone 406 erreicht, wird Anregungsstrahlung
von der Lichtquelle 420 über die Anregungsfaser 422 auf
die Nachweiszone gerichtet. Die Probenbestandteile würden mit Intensitäten fluoreszieren,
die den Konzentrationen der jeweiligen Probenbestandteile proportional
wären (proportional
zur Menge des Fluoreszenz-Tag-Materials). Die emittierte Fluoreszenz
wird von der Nachweisfaser 428 bei einer Wellenlänge, die
sich von der der Einfallstrahlung unterscheidet, gesammelt und auf
einen Detektor 450 gelenkt.
-
In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird mit Bezug auf 2 eine mehrkanalige Kartusche 100 und
ein CE-System 200, das an die Verwendung mit der vorliegenden
Erfindung angepaßt
ist, schematisch dargestellt. Das vollautomatische DNA-Analyseinstrument 200 weist
eine Basis 74 auf, die einen modularen X-Z-Probenhandhabungstrogmechanismus 76 trägt, der
zwei 96-Loch-Mikrotiterplatten 70 und 72 in
bezug auf die auf eine Traghalterung 164 gestützte mehrkapillaren Kartusche 100 bewegt.
Das System 200 sorgt für eine
einfache Handhabung mehrkanaliger Separationssäulen und gestattet eine einfache
optische Kopplung der Nachweiszonen an die Nachweisoptik des CE-Instruments 200.
-
Die
Kartusche 100 enthält
ein zwölfkanaliges Quarzkapillararray,
das zur Trennung und zum Nachweis der Proben als Teil einer Einweg-
und/oder tragbaren, gegeneinander austauschbaren Kartuschenkonstruktion 100 verwendet
wird. Das mehrkanalige Kapillararray enthält zwölf, durch Mikrokanäle in der Kartusche 100 definierte
Nachweiszonen. Die in 2 dargestellte mehrkanalige
Kartusche 100 hält bis
zu zwölf
Kapillaren 140 mit einer Länge von 12–16 cm. Die mehrkanalige Kartusche 100 ist
mit einem oben liegenden Auslasspufferreservoir 124 integriert,
das allen Kapillaren 140 gemein ist und das direkt an eine
modulare Luftdruckpumpe 78 gekoppelt ist. Die Druckpumpe 78 sorgt
für den
benötigten
Luftdruck, um alle zwölf
Kapillaren mit dem im Reservoir 124 enthaltenen Siebgel
aufzufüllen.
Je nach der Viskosität
des Gels können
Drücke
von bis zu 40 PSI an die Kapillaren 140 über das
gelgefüllte
Reservoir 124 angelegt werden. Das Kartuschengelreservoir 124 ist mit
einer eingebauten allgemeinen Elektrode (Anode; nicht dargestellt)
für alle
zwölf Kapillaren
ausgerüstet,
die automatisch bei Installation im Instrument 200 mit
einem Hochspannungsnetzteil 80 zur Elektrophorese verbunden
wird. Für
die Temperaturkontrolle der Kartusche sorgt ein Ventilator oder
ein Peltier-Kühlelement 63 auf
der Traghalterung 164 neben der Kartusche 100.
Die Injektion der Proben erfolgt mit elektrokinetischen Verfahren.
Das Hochspannungsnetzteil 80 wird zur Zuführung von
0 bis 20 kV elektrisches Feld an die gelgefüllten Kapillaren für die elektrokinetische
Injektion und Separationen der DNA-Fragmente verwendet. Die Breitbandlichtenergie
(FWHM = 47 nm) der 12 LED wird jeweils über individuelle lichtübertragende
optische Fasern ("Multi-Mode"-Silica- oder -Kunststoff-200-Mikrometer-Core-Fasern,
0,22 N.A.) an jede der Nachweiszonen der Kapillaren im Innern der
Kartusche 100 zur Anregung der separierten DNA-Fragmente weitergeleitet.
Ein Netzteil 66 liefert Gleichstrom an das CE-System 200.
Zusätzliche
Einzelheiten zur Kartusche 100 und dem CE-System 200 können der
gleichzeitig anhängigen
Patentanmeldung, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, entnommen
werden.
-
In 3 ist
schematisch die Nachweisoptik sowie die Verbindung zur Kartusche 100 dargestellt, wenn
die Kartusche 100 (in vereinfachter Ansicht dargestellt)
am CE-System 200 angebracht wird, in dem es zur Verwendung
vorgesehen ist, und Anregungsfasern 422 (d.h. Multi-Mode-Silica- oder -Kunststoffasern,
0,22 N.A.) in den Systemen auf die Nachweiszone 406 der
Kapillaren 140 gerichtet werden. Jeder Kanal ist dabei
separat an eine LED 420 gekoppelt.
-
Während der
Elektrophorese ist die Geschwindigkeit, mit der die separaten Bestandteile oder
Analyten durch das Siebgel wandern, umgekehrt proportional zu deren
Masse. Wenn die Fragmente sich der Nachweiszone 406 nähern, wird
die Anregungslichtenergie von jedem der zwölf LED 420, die in
einem LED-Modul 433 geträgert sind, über individuelle lichtübertragende
optische Fasern 422 (z.B. in einem Bündel 423 gruppiert)
zugeführt,
um die separierten Bestandteile oder Analyten an der Nachweiszone 406 zu
bestrahlen. Das Anregungslicht wird den entsprechenden zwölf Kapillaren
direkt mit oder ohne Verwendung von Mikrolinsen zugeführt. Die
Anregungsfasern 422 können
an die LED 420 jeweils über
eine Mikrolinse gekoppelt sein, um die optische Kopplung zwischen
den LED und den Fasern zu verbessern. Die Fasern 422 werden
von einem Montierungsmodul bzw. -block 431 gestützt und
in bezug auf die Kapillare ausgerichtet. Während die separierten Bestandteile
oder Analyten durch das Siebgel (oder eine lineare Polymerlösung) wandern, gestattet
ein interkalierender Farbstoff (Ethidiumbromid) im Siebgel den Nachweis
der separierten Bestandteile oder Analyten durch Nachweis der lichtinduzierten
Fluoreszenz.
-
Das
emittierte Fluoreszenzlicht von der Nachweiszone 406 der
Kapillare wird dann mit mehreren Mikrolinsen mit hoher N.A. (Numerische
Apertur) 436 (z.B. High-Index
Sapphire Micro-lens), die im Fasermontierungsblock 431 geträgert und
ausgerichtet sind, gesammelt. Das gesammelte Fluoreszenzlicht, das
eine höhere
Wellenlänge
(große Stokes-Verschiebung)
als das Anregungslicht aufweist, wird dann durch 12 optische Fasern
mit größerem Kern 428 (OD:
370 µm,
0,22 NA-Fasern, die jedoch auch im folgenden Bereich liegen könnten: OD 100–1000 µm, 0,12–0,5 NA)
von jeder der Nachweiszonen 406 der 12 Kapillaren geführt und
in einem einzelnen Detektor 450 (R5984 Hamamatsu Photomultiplier-Röhre) in
Form einer einzelnen gegabelten Bündelkonstruktion 452 gebracht.
Vor dem Nachweis wird ein einzelner optischer Filter, z.B. ein 570–630-nm-Langpassfilter, 454 (OG-590)
verwendet, um das Emissionssignal aus dem Ausgabesignal der Faserbündel (Einzelfaser)-Konstruktion 428 zu filtern.
-
Die
LED 420 werden so betrieben, dass sie Licht zu unterschiedlichen
Zeiten emittieren (d.h. moduliert). Somit wird zu einem gegebenen
Zeitpunkt Licht von nur einer LED 420 aus dem LED-Modul 433 einer
einzelnen Kapillare 140 zugeführt und vom Detektor 450 nachgewiesen,
welcher ein Signal ausgibt, das proportional zur Intensität der nachgewiesenen Fluoreszenzemission
ist. Der lichtinduzierte Fluoreszenznachweis wird in einer vorbestimmten
Abfolge sowie auf zyklische Weise für alle Nachweiszonen 406 an
den Kapillaren 140 ausgeführt, und zwar synchronisiert
mit den Aktivierungen der LED 420. Daher wird ein einzelner
Detektor 450 zum Nachweis von Fluoreszenzemissionen von
einer Vielzahl von strahlungsemittierenden Vorrichtungen verwendet.
-
Die
zwölf LED 420 werden
im zeitlichen Multiplex-Modus in bezug auf den Detektor gepulsed/moduliert.
Die LED werden in Impulsen betätigt
(gepulsed), und analog wird auch der Detektor in Impulsen betätigt. Dabei
liest der Detektor lediglich eine LED bzw. einen Kanal zeitversetzt
zu einem bestimmten Zeitpunkt. Da die LED in Impulsen betätigt werden
und den Fluorophor, an dem als Tag die separierten DNA-Fragmente
hängen, über alle
parallel verlaufenden Kanäle
hinweg kontinuierlich anregen, testet bzw. liest auch der Detektor
jeweils nur einen Kanal, und zwar zeitversetzt. Im Wesentlichen
wird der Nachweis in Form eines wiederholten Scanning über die
Nachweiszonen des Arrays von Kapillaren 140 hinweg ausgeführt. Dabei
erreichen zwölf
Emissionssignale den einzelnen PMT 450 zeitversetzt über eine
einzelne Faserbündelkonstruktion,
oder es könnte
sich dabei um individuelle Emissionssammelfasern handeln, die alle
zu einem einzelnen Detektor kombiniert werden. Diese Nachweisfasern
brauchen nicht in Form einer 1 × 12-Faserbündelkonstruktion vorliegen.
-
Es
könnte
sich hierbei um 12 individuelle Fasern handeln, die einzeln durch
einen einzelnen mechanischen Block auf einem einzelnen Detektormodul
angebracht werden, so dass sie entweder in Form eines zwölfteiligen
geschlossenen Kreises oder in Form eines linearen Arrays gepackt
werden könnten, wobei
insgesamt 12 Emissionssignale von der Kartusche einem einzelnen
PMT zugeführt
werden. Die lichtemittierenden Dioden 420 werden so betrieben, dass
sie mit mehreren hundert Hertz getaktete Lichtimpulse emittieren,
dabei aber voneinander durch eine Verzögerung getrennt sind.
-
Im
Allgemeinen erfolgt die Impulsgebung der LED gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in der nachstehenden Abfolge. Wird die LED
Eins eingeschaltet, so schaltet sich der Detektor ein oder weist
Emissionslicht für
die LED Nummer Eins nach; anschließend ist die LED Eins die nächsten 11
Male abgeschaltet, da insgesamt 12 Kanäle vorliegen. Somit ist die
Impulsgebung der LED an den Detektor gekoppelt, der einem Test-
und Halteschema unterliegt. Die Testfrequenz kann 100 Hz pro Kanal
betragen, so dass die Gesamtmodulationsfrequenz aller 12 Kanäle 1200
Hz beträgt,
wobei es sich um die Frequenz für
die beiden aufeinanderfolgenden Kanäle bei einem Arbeitszyklus
von 1:12 handelt. Diese Testfrequenz kann unterschiedlich sein, solange
der zeitliche Multiplex-Modus der LED und das zeitversetzte Nachweisschema
bewahrt werden. Die Bearbeitungsrate der Datensammlung in der Software
kann auf 10 Hz eingestellt werden, und zwar mit einer einstellbaren
Anstiegszeit (d.h. 0,1 s-ls). (Um die gleiche Testfrequenz zu besitzen,
kann eine Testfrequenz von 10 Hz statt 100 Hz verwendet werden,
doch sind Testfrequenz und Datensammlungsbearbeitungsrate unabhängig voneinander.) Dann
wäre die
LED bei einem Arbeitszyklus von 1:12 nur etwa 10 ms an und 100 ms
aus. (Dieser Arbeitszyklus ändert
sich mit steigender bzw. fallender Zahl von Kapillaren.)
-
In 5 ist
das Zeitdiagramm der Impulsgebung der LED und analog für den Detektor
gemäß einer
Ausführungsform
des zeitversetzten/zeitlichen Multiplex-Nachweisschemas der vorliegenden
Erfindung dargestellt. Dabei handelt es sich um das Zeitdiagramm
für das
folgende Beispiel. Die Impulsgebung der LED erfolgt in einem Arbeitszyklus
von 1:12. Ist eine LED an, so ist sie 1/12 der Zeit (8,3%) an und
danach 11 mal aus. Die Testfrequenz beträgt 100 Hz/Kanal. 100 Hz entspricht
10 ms (T = 1/f = 1/100 Hz = 10 ms), wobei dann bei einem Arbeitszyklus
von 1:12 die LED etwa 0,83 ms oder ungefähr 1 ms an ist. Alle 12 LED
werden im zeitlichen Multiplex-Modus zeitversetzt betrieben. So
beträgt
die Frequenz für
insgesamt 12 Kanäle
1,2 kHz (1200 Hz). Der Antriebsstrom für die Anzeit der LED beträgt etwa
15–35
mA. Die Testfrequenz und die Datensammlungsbearbeitungsrate in der
Software können unabhängig voneinander
sein.
-
Wie
man in 5 erkennen kann, läuft die Impulskette für den zeitlichen
Multiplex-Betrieb der LED für
einen Zyklus bis zur Zeit T ab und wiederholt sich danach. Das gleiche
Konzept wird bei der Nachweisseite angewandt. Die Impulsgebung der
LED und der Detektor sind synchronisiert. Somit wird beim Einschalten
von LED Eins das Testen und Halten für die produzierten (gesammelten/nachgewiesenen) Emissionssignale
gestartet und dann für
alle 12 Signale/LED wiederholt, womit sich die zeitversetzte Art des
Nachweises erklärt.
Liegt ein kurzer Arbeitszyklus vor oder schaltet sich die LED für einen
solchen kurzen Zeitraum ein, so können dadurch hohe Spitzenimpulse
im nachgewiesenen Signal produziert werden. Somit ist die LED-Auszeit
während
des Impulsgebungsmodus lang gegenüber einem Betrieb mit konstantem
Eingeschaltetsein/Gleichstrom, was bedeutet, dass die LED eine längere Lebenszeit
aufweisen kann, da die Abkühlzeit(-dauer)
lang ist. Man kann diesen Impulsgebungsmodusbetrieb der LED vorteilhaft
nutzen und höhere
(bis zu 100 mA) Antriebsströme
zur Erzeugung höherer
Intensitäten oder
Spitzenleistungen anlegen. Ebenso kann man die LED kühlen, um
sie noch härter
für höhere Spitzenleistungen
zu fahren. Entsprechenderweise hilft die Impulsgebung der LED dabei,
die Lebensspanne der LED zu verlängern
und die Spitzenleistung/-intensität zu erhöhen.
-
Es
wird festgestellt, dass elektrophoretische Separationen von Fragmenten
im CE-Instrument 200 gemäß der vorliegenden Erfindung
in Sekunden erfolgen gegenüber
Millisekunden für
die mit Impulsen betätigte
LED zur selben Zeit. Da die Impulsgebungsfrequenz wesentlich höher ist
als die tatsächlichen Fragmentspitzenseparationen,
wirkt sich das zeitversetzte/zeitliche Multiplex-Nachweisschema
der vorliegenden Erfindung nicht negativ auf die Empfindlichkeit
und Leistung der Nachweisauflösung
aus. Die Auflösung
der Nachweisergebnisse (z.B. Spitzenwerte im nachgewiesenen Signal)
würde teilweise
von der Gelmatrixkonzentration, dem Innendurchmesser der Separation,
der Länge
und Geschwindigkeit der Wanderung durch die Nachweiszone 406 abhängen. Es
konnte experimentell gezeigt werden, dass Nachweisempfindlichkeiten
von 100 ng/ml (0,02 ng des DNA-Fragments) mit guter Auflösung unter Verwendung
des erfindungsgemäßen Nachweisschemas
erzielt werden könnten.
-
Beispielsweise
lässt sich
für eine
das ϕX174-DNA-Fragment
umfassende Testprobe mit einer Kapillare von 75 µm mal 16 cm bei einem elektrischen
Potential von 300 V/cm eine Grundlinienauflösung für die 271/281 Basenpaare erzielen.
Die STR-Loci in einer individuellen DNA-Identifizierungstyp-Separation
mit Standardmarkern zeigen eine Separationsauflösung von etwa 4 Basenpaaren unter
Verwendung des zeitlichen Multiplex-Ein-Farben-Fluoreszenznachweisabsatzes
gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Die Separationszeit für alle 12
parallell laufenden Kanäle beträgt weniger
als 10 Minuten bei einem guten Signal/Rausch-Verhältnis (S/N
= 150 für
das größte Fragment,
bezogen auf "Peak-to-Peak"-Rauschen).
-
Die
Impulsgebung der Strahlungsquellen und die Nachweistestgeschwindigkeit
bzw. der Nachweistestzeitraum sollten so synchronisiert werden, dass
der gewünschte
Nachweis für
einen Kanal einen Zeitraum abdeckt, wenn nur die damit verbundene
Strahlungsquelle in bezug auf den Detektor an ist.
-
Während die
oben beschriebene Ausführungsform
zeigt, dass das einfallende Licht von den Quellen-LED auf die Kapillaren über die
optischen Fasern 422 gelenkt wird, liegt es im Umfang der
vorliegenden Erfindung, die Strahlungsquellen, wie z.B. die LED,
neben der Nachweiszone 406 zu positionieren, wobei kurze
optische Faserausrichtungsleitungen 427 verwendet werden,
um das einfallende Licht auf die Nachweiszone auszurichten, oder
die Faseroptik überhaupt
nicht verwendet wird (z.B. indem Mikrolinsen eingesetzt werden,
um einfallendes Licht von den LED direkt auf die Kapillarennachweiszone 406 auszurichten).
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird in 4 eine Steuereinheit 300 gezeigt,
die eine CPU 210, einen A/D-Umwandler 212 zur
Umwandlung von Nachweissignalen aus dem PMT 450 in entsprechende
digitale Signale sowie eine I/O-Schnittstelle 214 zur Übertragung
und zum Empfang von Signalen zu bzw. von den jeweiligen Teilen des
CE-Instruments 200 nach Anweisungen von der CPU 210 umfasst.
Eine Temperatursteuereinheit 65 steuert den Ventilator
bzw. das Peltier-Kühlelement 63,
mit dem die Temperatur der Elektrophoresekammer für die Mikrokanal-/Kapillararray-Kartusche 100 gesteuert
wird. Die I/O-Schnittstelle 214 ist
mit der Temperatursteuereinheit 65 gekoppelt, die ebenso
das Hochspannungsnetzteil für
die Probeninjektion und die Elektrophoresefunktionen des CE-Instruments 200,
einen Schaltkreis 421 zur Modulation der LED 420,
Sensoren, ein Luftpumpe, ein Luftventil sowie Motoren für die X-Z-Bühne des
CE-Instruments 200 steuert.
Die CPU 210 kann ferner an einen externen PC 218 gekoppelt
werden, der wiederum Datenbearbeitungs- oder zusätzliche Kontrollfunktionen
für das CE-System 200 ausführt. Die
CPU 210 und/oder der PC 218 können mit von der von National
Instruments Corporation erhältlichen
Software LabVIEWTM diktierten Steuerfunktionen
programmiert werden, um verschiedene Merkmale und Funktionen des
mehrkanaligen DNA-Analyseautomaten 200 zu
steuern.
-
Die
Komponenten der Steuereinheit 300 können mit Ausnahme des PC 218 in
Form einer elektronischen Platine 64 (2)
und Kühlventilator 62 an
board des CE-Systems 200 verpackt und elektrisch über einen
seriellen Anschluß (nicht
gezeigt) an den PC 218 gekoppelt werden, oder sie können Teil
eines separaten Steuermoduls außerhalb
des CE-Systems 200 sein. Die CPU 210 und/oder
der PC 218 werden so programmiert, dass sie die verschiedenen
Steuerfunktionen und Merkmale für
das CE-System 200 durchführen. In einer Ausführungsform
kann der PC 218 so konfiguriert werden, dass er die vordere
Steuertafel (d.h. Benutzerschnittstelle) für das Instrument 200 bereitstellt,
wobei die Platine 64 so konfiguriert werden kann, dass
dadurch die Steuereinheiten des zeitversetzten/zeitlichen Multiplex-Nachweises
bereitgestellt werden. Dabei wäre der
Fachmann in der Lage, mit den hier offenbarten Funktionen und Merkmalen
den Programmcode zu realisieren. Für das Instrument 200 wird
ein Wechselstromfilter/-schalter 68 (2)
bereitgestellt.
-
Einfallsstrahlung
für den
Nachweis kann auf die Nachweiszone gerichtet und/oder Strahlungsemissionen
von der Nachweiszone können
axial entlang des Separationsmediums abgegeben werden.
-
Superhelle
LED (d.h. Agilent's
InGaN LED in den Farben blau, grün
usw.) sind Kandidaten für
kostengünstige,
kompakte, wenig Energie verbrauchende Lichtquellen zur Verwendung
im Nachweisschema der vorliegenden Erfindung. Diese auf der InGaN-Materialtechnologie
basierenden superhellen LED (HLMP-CB15 und HLMP-CM15 von Agilent) weisen
eine mittlere Lichtabgabeleistung von 2,5–3 mW auf. Diese Spektraleigenschaften
dieser blaugrünen
InGaN-LED mit ihren Spitzenwellenlängen von 470 und 530 nm und
Halbwärtsbreiten
(nm) von 30 bis 50 nm stellen gute Kandidaten zur Verwendung für die Anregung
von Farbstoffen (z.B. Fluorescin, Rhodamin, Ethidiumbromid, Thiazolorange)
mit Anregungsspektren im Bereich von 450 bis 550 nm dar. Jede Festkörperlichtquelle,
die sich durch Impulse betätigen
lässt,
könnte
auch mit einem beliebigen Farbstoff oder Fluorophor für diese
Art des zeitlichen Multiplex-Nachweises
verwendet werden. Da die Reaktionszeit dieser LED sehr hoch ist
(einige wenige 100 Nanosekunden bei Frequenzbereichen von 1 Hz bis
100 MHz), könnten
sie mit Impulsen bei größeren Vorwärtsströmen (z.B.
15–30
mA, wobei jedoch bis zu 100 mA Vorwärtsstrom im Impulsmodusbetrieb möglich sind)
betätigt
werden, um hohe Strahlungsspitzenwerte zu erhalten. Der Impulsbetrieb
von LED lässt
sich typischerweise über
die transistorbetriebenen Schaltkreise erzielen. Eine signifikant
höhere Spitzenwert-LED-Lichtabgabe
lässt sich
von großen Antriebsstromimpulsen
bei niedrigeren Arbeitszyklen als beim Gleichstrombetrieb realisieren.
Ein weiteres Beispiel ist ein LED-Arraymodul, das aus grünen (524
nm) LED besteht, die auch als Anregungslichtquellen für den Fluoreszenznachweis
eines kostengünstigen
CE-Instruments angenommen
werden können.
-
Obgleich
in den oben beschriebenen Ausführungsformen
die mehrfachen Strahlungsquellen die gleiche Wellenlänge aufweisen,
liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die mehrfachen Strahlungsquellen
mit unterschiedlichen Wellenlängen
zu konfigurieren, um die spezifischen Proben, Nachweisanwendungen
auf Probenbasis oder gelchemischen Reaktionen in den unterschiedlichen
Kapillaren zu komplementieren. So können beispielsweise benachbarte
Strahlungsquellen einander abwechselnde Wellenlängen aufweisen, so dass Separationen
mit identischen Proben in zwei benachbarten Kapillaren mit unterschiedlichen
gelchemischen Reaktionen und/oder Fluoreszenz-Tags gefahren werden
können,
ein Vergleich der Nachweisergebnisse zur Bestimmung anderer oder
zusätzlicher
separierter Bestandteile in der Probe gestattet wird, oder als Grundlage
für die
Validierung der Nachweisergebnisse. Als weiteres Beispiel kann eine
benachbarte Gruppe von vier Kapillaren mit Strahlungen von vier
unterschiedlichen Wellenlängen
für die
gleiche Probe bestrahlt werden (womit im oben beschriebenen 12-kanaligen System
drei Gruppen von jeweils vier Kanälen vorliegen würden). Dies
kann ebenso für
den Nachweis von Emissionen von den Kanälen, die mit Strahlung derselben
Wellenlänge
zeitversetzt und/oder im zeitlichen Multiplex-Modus wie oben beschrieben
bestrahlt werden, angewandt werden. Als Alternative liegen mehrfache
Detektoren mit gleicher oder unterschiedlicher Leistung und/oder
Nachweischarakteristik vor, die jeweils für den Nachweis von Emissionen
von den Kanälen,
die mit Strahlungen der gleichen Wellenlänge zeitversetzt und/oder im zeitlichen
Multiplex-Modus wie oben beschrieben bestrahlt werden, angewandt
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung kann auf ein System ausgedehnt werden, bei
dem eine Anregung und ein Nachweis mit mehrfachen Wellenlängen für einen einzelnen
Kanal vorliegt. Dabei können
mehrfache Strahlungsquellen bei verschiedenen Wellenlängen auf
einen einzelnen Separationskanal in einem mehrkanaligen System angewandt
werden, wobei ein oder mehrere Detektoren mit gleicher oder unterschiedlicher Nachweischarakteristik
zum Nachweis der Strahlungsemissionen bei gleichen oder unterschiedlichen
Wellenlängen
von den Kanälen
zeitversetzt und/oder im zeitlichen Multiplex-Modus ähnlich wie
beim oben beschriebenen Verfahren für eine Anregungsstrahlung bei
einer einzigen Wellenlänge
angewandt werden können.
-
Der
neue Nachweisansatz weist viele Vorteile gegenüber den existierenden kommerziellen CE-Instrumenten
auf. Das Nachweissystem nutzt kostengünstige nichtemittierende Dioden
(LED) als Anregungslichtquellen für den Nachweis vom Fluoreszenztyp.
Die attraktiven Merkmale von LED als Lichtquellen liegen in ihren
geringen Kosten, ihrer geringen Größe, ihrer langen Lebensdauer,
ihrer guten Intensitätsstabilität, was zu
geringem Rauschen führt,
sowie die Möglichkeit
einer direkten elektronischen Modulation. Diese kleineren Festkörperanregungslichtquellen
erleichtern die Faserkopplung, was zur Miniaturisierung der Nachweisoptik
führt.
Die Verwendung eines zeitversetzten Nachweisansatzes durch Multiplex-Betrieb
mehrerer LED bietet einen großen
Vorteil in Form der Reduzierung der Anzahl von Detektoren (z.B.
PMTs) bis zu möglicherweise
einen Detektor für
den mehrkanaligen Nachweis. Durch die reduzierte Komponentenzahl
und durch Vereinfachung der Konstruktion des optischen Nachweissystems
werden die Kosten, Zuverlässigkeit
und Einfachheit der Verwendung des Instruments verbessert. Es gibt
kein oder nur vernachlässigbares Übersprechen
zwischen den Separationskanälen.