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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die ortsaufgelöste Detektion
von Fluoreszenzsignalen, wie sie bei der Untersuchung Proben auf
fluoreszierende Substanzen vorkommt.
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Bei
der Untersuchung von Proben, die fluoreszierende Substanzen enthalten,
wird die zu untersuchende Probe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, der
Anregungswellenlänge,
bestrahlt. Diese Wellenlänge
oder ein schmaler Wellenlängenbereich wird
durch eine Lichtquelle, wie beispielsweise einen Laser, vorgegeben.
Alternativ können
auch spektral breitbandige Lichtquellen zum Einsatz kommen, deren
Spektrum dann durch einen Farbfilter entsprechend gefiltert wird.
Zum Nachweis von Fluoreszenz kommen im Bereich der konventionellen
Technik Versuchsaufbauten gemäß des beispielhaft
in der 3 dargestellten Versuchaufbaus, zum Einsatz.
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Die 3 illustriert
einen Versuchsaufbau 300 zum Nachweis von Fluoreszenz in
einer Probe 305. Der Versuchsaufbau 300 zeigt
eine homogene Lichtquelle 310, die spektral breitbandiges
Licht erzeugt. Das spektral breitbandige Licht wird durch einen
Farbfilter 315 gefiltert, so dass nach dem Farbfilter 315 spektral
schmalbandiges Licht, das näherungsweise
durch eine Wellenlänge
beschrieben werden kann, vorliegt. Das spektral schmalbandige Licht
fällt dann
auf einen Teiler- oder dichroitschen Spiegel 320, von dem
aus es über
ein Objektiv 325 auf die Probe 305 reflektiert
wird. Die fluoreszierende Probe 305 emittiert Fluoreszenzlicht,
das üblicherweise
eine längere
Wellenlänge
als das Anregungslicht aufweist. Ferner wird Anregungslicht von
der Probe reflektiert. Das Fluoreszenzlicht fällt dann zusammen mit dem reflektierten
Anregungslicht durch das Objektiv 325 auf den Teilerspiegel 320 zurück. Der
Teilerspiegel 320 lässt
einen Teil des Fluoreszenzlichtes und des reflektierten Anregungslichtes passieren,
und ein nachgeschaltetes Farbfilter isoliert das Fluoreszenzlicht,
das das Farbfilter 330 ungehindert passieren kann, das
reflektierte Anregungslicht wird jedoch möglichst vollständig unterdrückt. Das
Farbfilter 330 wird gefolgt von einem weiteren Objektiv 335, über das
das Fluoreszenzlicht einer CCD Kamera (CCD = Charged Coupled Detector)
zugeführt
wird.
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Eine
spektrale Trennung des reflektierten Anregungslichtes von dem Fluoreszenzlicht
ist notwendig, da das Fluoreszenzlicht aufgrund des geringeren Wirkungsgrades
der Fluoreszenz wesentlich schwächer
als das Anregungslicht ist. Zur sicheren Detektion sind empfindliche
Fotoempfänger
wie z.B. Photomultiplier, Avalanche-Fotodioden oder für die bildmäßige Erfassung
gekühlte
CCD-Kameras einsetzbar. Bei Fluoreszenzmikroskopen wird die Probe gleichmäßig durch
Licht in einem schmalen spektralen Bereich, wie beispielsweise in
der 3 erzeugt durch einen Farbfilter, beleuchtet und
mittels einer CCD-Kamera, der ein entsprechendes Farbfilter, das auf
das Fluoreszenzlicht abgestimmt ist vorgeschaltet ist, detekiert.
Nachteilig an diesem Verfahren ist die sehr kostenintensive CCD-Kamera,
die ständig gekühlt werden
muss.
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Die
DE 101 55 142 offenbart
eine Dunkelfeld-Abbildungsvorrichtung
zur ortsaufgelösten
Dunkelfeld-Abbildung
einer Probe, insbesondere einer fluoreszierenden Probe, die eine
Beleuchtungsanordung zur Beleuchtung der Probe mit Anregungslicht und
ein Raster von getrennt ansteuerbaren Lichtquellen umfasst, wobei
die Verbindungslinien von Lichtquellen und Probe einen Bereich mit
dem Strahlengang des direkten Anregungslichtes und einen Bereich
mit dem Strahlengang des gerichtet reflektierten Anregungslichtes
definieren. Die Dunkelfeld-Abbildungsvorrichtung
umfasst ferner eine Detektionsanordnung zum Erfassen der als optische Antwort
der Probe auf die Beleuchtung ausgesandten Strahlung mit strahlungsaufnehmenden
Elementen, wobei die strahlungsaufnehmenden Elemente der Detektionsanordnung
außerhalb
des Bereiches mit dem Strahlengang des direkten Anregungslichtes und
des Bereichs mit dem Strahlengang des gerichtet reflektierten Anregungslichtes
angeordnet sind.
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Diese
Methode offenbart eine ortsaufgelöste Detektion von Fluoreszenzsignalen
unter Umgehung einer Verwendung einer CCD-Kamera. Hier wird beispielsweise
durch ein LED-Array (LED = Light Emitting Diode) orstaufgelöst angeregt,
wie es in der 4 dargestellt ist. Die 4 zeigt
eine Versuchsanordnung 400, in der ein LED-Array 405 dargestellt ist.
Das von dem LED-Array 405 erzeugte Anregungslicht wird
durch eine Optik 410 und einen Farbfilter 415 auf
eine Probe 420 geleitet. Das von der Probe 420 emittierte
Fluoreszenzlicht überlagert
mit dem von der Probe 420 reflektierten Anregungslicht, wird
von einem Lichtsammler 425 ganzflächig detektiert, wobei das
eingesammelte Licht über
einen Farbfilter 430 und eine Linse 435 auf einen
Fotomultiplier 440 geleitet wird. Nachteilig an diesem
Verfahren ist der geringe Wirkungsgrad, der durch den Lichtsammler
und eine starke Abhängigkeit
der Signale von der Oberflächenstruktur
der Probe 420 bedingt wird, da im sog. Dunkelfeldverfahren
gemessen wird.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung und
ein Verfahren zu schaffen, das eine effizientere Detektion von Fluoreszenzlicht erlaubt.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch
1 oder Anspruch 18 und durch ein Verfahren gemäß Anspruch 16 oder Anspruch
33.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung
umfasst eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten Detektieren von Fluoreszenzsignalen
mit einer Anregungseinrichtung zum Erzeugen eines hinsichtlich eines
Anregungsortes durch ein Anregungssteuersignal ein stellbaren Anregungssignals
und einer Aufnahmeeinrichtung zum Aufnehmen eines sich auf das ortsauflösende Anregungssignal
ergebenden Fluoreszenzsignals, basierend auf einem Aufnahmesteuersignal. Die
Vorrichtung umfasst ferner eine Strahlteilungseinrichtung zur Trennung
des Anregungssignals und des Fluoreszenzsignals und eine Steuereinrichtung zum
Bereitstellen des Anregungssteuersignals und des Aufnahmesteuersignals.
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Der
Kerngedanke der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass mittels
einer hoch geöffneten Optik
mit hohem Wirkungsgrad Fluoreszenzlicht effizient gesammelt werden
kann, und dasselbe auf einen Fotodetektor fokussiert werden kann,
wodurch beispielsweise auf eine teuere CCD-Kamera verzichtet werden
kann, wenn ein Strahlteiler mit einer ortsaufgelösten Bestrahlung kombiniert
wird. Ferner ist der Wirkungsgrad eines Ausführungsbeispiels gegenüber konventionellen
Anordnungen verbessert und die Abhängigkeit der Detektion von
der Oberflächenstruktur
der Probe reduziert. Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung erlauben somit, eine effizientere ortsaufgelöste Detektion
von Fluoreszenzlicht durchzuführen.
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Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden anhand der beigefügten Figuren
näher beschrieben.
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Es
zeigen:
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1a ein
Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zum ortsaufgelösten
Detektieren von Fluoreszenzsignalen;
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1b ein
weiteres Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zum ortsaufgelösten
Detektieren von Fluoreszenzsignalen;
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2a ein
weiteres Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zum ortsaufgelösten
Detektieren von Fluoreszenzsignalen;
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2b ein
weiteres Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zum ortsaufgelösten
Detektieren von Fluoreszenzsignalen;
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3 eine
konventionelle Vorrichtung zum Detektieren von Fluoreszenzsignalen;
und
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4 eine
weitere konventionelle Anordnung zur Bestimmung von Fluoreszenzsignalen.
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1a zeigt
ein ein Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung 100 zum ortsaufgelösten Detektieren von Fluoreszenzsignalen.
Die Vorrichtung 100 umfasst eine Anregungseinrichtung 100,
eine Aufnahmeeinrichtung 120, eine Strahlteilungseinrichtung 130 und
eine Steuereinrichtung 140.
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Die
Anregungseinrichtung 120 dient zum Erzeugen eines hinsichtlich
eines Anregungsortes durch ein Anregungssteuersignal einstellbaren
Anregungssignals. Die Vorrichtung 100 umfasst die Aufnahmeeinrichtung 120 zum
Aufnehmen eines sich auf das ortsauflösende Anregungssignal ergebenden Fluoreszenzsignal,
basierend auf einem Aufnahmesteuersignal. Die Strahlteilungseinrichtung 130 dient zur
Trennung des Anregungssignals und des Fluoreszenzsignals und die
Steuersignaleinrichtung 140 dient zum Bereitstellen des
Anregungssteuersignals und des Aufnahmesteuersignals. Die in 1a dargestellte
Vorrichtung 100 kann Fluoreszenzsignale von einer Probe 150 detektieren,
die in der 1a mit gestrichelten Linien
dargestellt ist.
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Ausführungsbeispiele
können
Anregungseinrichtungen 110 mit mehreren Strahlquellen,
beispielsweise mit wenigstens zwei Strahlquellen, aufweisen. Diese
Strahlquellen können
z.B. durch LED-Zeilen oder eine LED-Matrix realisiert sein. Fer ner
können
die Strahlquellen dazu ausgelegt sein, Strahlen unterschiedlicher
Wellenlängen
zu erzeugen. In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann die Anregungseinrichtung 110 eine
Filtereinrichtung aufweisen, um ein Originalsignal zu filtern und
schließlich
das Anregungssignal zu erhalten. In einem weiteren Ausführungsbeispiel
kann die Anregungseinrichtung 110 ferner eine abbildende
optische Einrichtung umfassen, die ein weiteres Originalsignal in
das Anregungssignal umwandelt, beispielsweise durch eine Fokussierung.
In anderen Ausführungsbeispielen
kann die Anregungseinrichtung 110 ein Farbfilter oder ein
Interferenzfilter umfassen, um ein spektral breitbandiges Signal
zu filtern und ein Anregungssignal in einem bestimmten spektralen
Bereich zu erhalten. Das spektral breitbandige Lichtsignal kann
dabei beispielsweise von einer homogenen breitbandigen Licht- oder Strahlquelle
erzeugt werden.
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In
Ausführungsbeispielen
kann die Aufnahmeeinrichtung 120 eine weitere abbildende
optische Einrichtung umfassen, die das Aufnahmesignal optisch wandelt.
Auch hier können
beispielsweise Farbfilter oder Interferenzfilter zum Einsatz kommen.
Ferner kann auch die Aufnahmeeinrichtung eine abbildende optische
Einrichtung umfassen, die beispielsweise durch eine Linse zur Fokussierung
realisiert sein kann. Die Aufnahmeeinrichtung 120 kann
ferner einen Fotodetektor, einen Photomultiplier oder eine Avalanche-Fotodiode
umfassen. In Ausführungsbeispielen
sind auch andere Realisierungen zur optischen Detektion denkbar.
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Die
Strahlteilungseinrichtung 130 kann in Ausführungsbeispielen
einen dichroitischen Spiegel aufweisen, der eine Trennung des Fluoreszenzsignals
von den reflektierten Anregungssignalanteilen vornimmt. Ferner kann
die Steuereinrichtung 140 ausgebildet sein, um das Anregungssteuersignal
und das Aufnahmesteuersignal derart bereitzustellen, dass das sich
ergebende Fluoreszenzsignal die Ortsauflösung des Anregungssignals aufweist.
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Ein
weiteres Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung 100 zum ortsaufgelösten detektieren von Fluoreszenzsignalen
ist in der 1b dargestellt. 1b zeigt
die Anregungseinrichtung 110, die in diesem Ausführungsbeispiel
durch ein LED-Array 112, eine Linse 114 und ein
Farbfilter 116 realisiert ist. Ferner umfasst die Vorrichtung 100 die
Aufnahmeeinrichtung 120, die in dem in 1b dargestellten
Ausführungsbeispiel
durch einen Photomultiplier 122, einer Optik 124,
und ein Farbfilter 126 realisiert sind. Die Strahlteilungseinrichtung 130 ist
durch einen dichroitischen Spiegel realisiert. Die Vorrichtung 100 umfasst
ferner eine Optik 160 zur Fokussierung des Lichtes auf
eine Probe 150. Die Steuereinrichtung 140 zum
Bereitstellen des Anregungsteuersignals und des Aufnahmesteuersignals
ist in der 3 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt. Die
Anregungseinrichtung 110 kann ausgebildet sein, um das
Anregungssignal derart zu erzeugen, dass im Bereich der Strahlteilungseinrichtung 130 ein paralleler
Strahlverlauf entsteht. Die Optik 160, die als hoch geöffnete Optik
ausgebildet sein kann, kann angepasst sein, um den parallelen Strahlverlauf
auf den Anregungsort zu fokussieren.
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2a zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
eine Vorrichtung 200 zum ortsaufgelösten Detektieren von Fluoreszenzsignalen.
Die Vorrichtung 200 umfasst eine Anregungseinrichtung 210 zum
Erzeugen eines hinsichtlich eines Anregungsortes durch ein Anregungssteuersignal
einstellbaren Anregungssignals. Ferner weist die Vorrichtung 200 eine Aufnahmeeinrichtung 220 zum
Aufnehmen eines sich auf das Anregungssignal ergebenden Fluoreszenzsignals,
basierend auf einem Aufnahmesteuersignal auf und umfasst ferner
eine Steuereinrichtung 240 zum Bereitstellen des Anregungssteuersignals und
des Aufnahmesteuersignals. In der 2a ist eine
Probe 250 mittels gestrichelten Linien angedeutet, die
von der Vorrichtung 200 zum ortsaufgelösten Detektieren von Fluoreszenzsignalen
untersucht werden kann.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
kann die Anregungseinrichtung 210 mehrere Strahlquellen aufweisen,
beispielsweise wenigstens zwei. Die Anregungseinrichtung 210 kann
ferner eine LED-Zeile oder eine LED-Matrix aufweisen, wobei die
Strahlquellen für
Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen ausgelegt sein können. In
einem anderen Ausführungsbeispiel
kann die Anregungseinrichtung 210 auch eine Filtereinrichtung
umfassen, um ein Originalsignal zu filtern, um das Anregungssignal
zu erhalten. Diese Filtereinrichtung könnte beispielsweise durch eine
abbildende optische Einrichtung realisiert sein, die ein Farbfilter
oder ein Interferenzfilter umfasst. Denkbar ist auch eine Linse
oder ein Linsensystem zur Fokussierung bzw. Parallelisierung des Anregungssignals.
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In
Ausführungsbeispielen
kann die Aufnahmeeinrichtung 220 eine weitere abbildende
optische Einrichtung umfassen, die ebenfalls durch ein Farbfilter
oder ein Interferenzfilter realisiert sein kann. Ferner sind auch
hier eine Linse oder ein Linsensystem denkbar, wobei in einem anderen
Ausführungsbeispiel
das Linsensystem der Aufnahmeeinrichtung 220 eine geringere
Brennweite als die Linse oder das Linsensystem der Anregungseinrichtung 210 aufweisen
kann, was einer Realisierung einer hoch geöffneten Optik zur verbesserten
Kollektion des Fluoreszenzlichtes dienlich ist. Ferner kann die
Aufnahmeeinrichtung 220 einen Fotodetektor, einen Photomultiplier
oder eine Avalanche-Diode umfassen, wobei generell auch andere Photodetektorendenkbar
sind.
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Die
Steuereinrichtung 240 kann in Ausführungsbeispielen ausgebildet
sein, um das Anregungssteuersignal und das Aufnahmesteuersignal derart
bereitzustellen, dass das sich ergebende Fluoreszenzsignal dem Anregungsort
des Anregungssignals zuordenbar ist, um somit ein ortsaufgelöstes Fluoreszenzsignal
erfassbar zu machen. Generell kann die Vorrichtung 200 ebenfalls
eine bereits oben beschriebene hoch geöffnete Optik umfassen, über die
das Aufnahmesignal erfasst werden kann.
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2b zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
ein Vorrichtung 200 zum ortsaufgelösten Detektieren von Fluoreszenzsignalen.
Die Vorrichtung 200 umfasst dabei eine Anregungseinrichtung 210,
die durch ein LED-Array 212, eine optische Linse 214 und
ein Farbfilter 216 realisiert ist und eine Probe 250 ortsaufgelöst anregt.
Das LED-Array 212 und die optische Linse 214 dienen
dabei der ortsaugelösten
und fokussierten Anregung der Probe 250, das Farbfilter trägt zur Realisierung
einer spektralen Eingrenzung des Anregungssignales bei. Die Probe 250 ist
dabei derart gestaltet, dass das Fluoreszenzlicht auch auf der Rückseite
der Probe detektiert werden kann. Dies kann beispielsweise dadurch
erreicht werden, dass das Probenmaterial transparent ist, bzw. ein
Probenmaterial in einer dünnen
Schicht verwendet wird. Aus Gründen
der Übersichtlichkeit
ist die Steuereinrichtung 240 in der 2b nicht
dargestellt.
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Die
in der 2b dargestellte Vorrichtung 200 umfasst
ferner eine Aufnahmeeinrichtung 220, die durch einen Photomultiplier 222,
eine weitere Linse 224 und ein weiteres Farbfilter 226 realisiert
sind. Der weitere Farbfilter 226 dient der spektralen Filterung
des Fluoreszenzlichtes, welches sich im Ausführungsbeispiel der 2b mit
transmittiertem Anregungslicht überlagert.
Die weitere Linse 224 dient der Fokussierung der Fluoreszenzlichtes
auf den Photomultiplier 222, der das Fluoreszenzsignal
detektiert.
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In
der Anordnung der 2b sind die Anregungseinrichtung 210 und
die Aufnahmeeinrichtung 220 beispielhaft als gegenüberliegend
dargestellt. In anderen Ausführungsbeispielen
sind auch andere Anordnungen denkbar, die beispielsweise die Diffusion
des Fluoreszenzlichtes ausnutzen und nicht exakt gegenüberliegend
angeordnet sind, da die fluoreszierende Probe 250 beispielsweise
als Lambertstrahler betrachtet werden kann, der Fluoreszenzlicht
isotrop emittiert.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
kann beispielsweise die weitere Linse 224 der Aufnahmeeinrichtung 220 eine
geringere oder kürzere
Brennweite als die Linse 214 der Anregungseinrichtung 210 ausweisen
und somit zur Realisierung einer hoch geöffneten Optik zur verbesserten
Kollektion des Fluoreszenzlichtes beitragen.
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Die
Vorrichtungen 100 und 200 bieten somit den Vorteil,
dass die kostenintensive CCD-Kamera vermieden werden kann, und ein
verbesserter Wirkungsgrad erzielt wird. Ferner kann mit Ausführungsbeispielen
die Abhängigkeit
von der Oberflächenstruktur
der Probe 150 bzw. 250 erheblich reduziert werden.
Die zu untersuchende Probe wird durch ein LED-Array 122 bzw. 222 über eine
abbildende Optik 114 bzw. 214 ortsaufgelöst beleuchtet.
Als Farbfilter 116 bzw. 216 können beispielsweise Interferenzfilter zum
Einsatz kommen, die für
eine spektrale Begrenzung des Anregungslichts sorgen. Das Fluoreszenzlicht
wird durch eine hoch geöffnete
Optik 160, die in der Vorrichtung 200 auch mittels
der weiteren Linse 224 bzw. eines weiteren Linsensystems
realisiert werden kann, mit hohem Wirkungsgrad gesammelt und auf
dem Fotodetektor, der in der 1b durch den
Photomultiplier 122 bzw. in der 2b durch
den Photomultiplier 222 realisiert ist, und in Ausführungsbeispielen
auch beispielsweise eine Avalanche-Diode umfassen kann, fokussiert.
Die hoch geöffnete Optik 160 bzw. 224 bietet
dabei den Vorteil, das die Abhängigkeit
von der Oberflächenstruktur
der Probe 150 bzw. 250 im Vergleich zu konventionellen
Systemen reduziert wird. Ferner kann durch das anhand der 2b beschriebene
Durchlichtverfahren eine die Abhängigkeit
der Detektionsqualität
von der Oberflächenstruktur
der Probe 250 erheblich reduziert werden. Durch das weitere
Farbfilter 126 bzw. 226 wird das reflektierte
bzw. transmittierte Anregungslicht unterdrückt. Der dichroitische Spiegel 130,
der die Strahlteilungseinrichtung 130 realisiert, dient
zum Trennen der Strahlengänge.
Je nach Aufgabenstellung können
auch das LED-Array 112 bzw. 212 und der Fotodetektor 122 bzw. 222 räumlich ausgetauscht
werden, wobei auch die Farbfilter 116 bzw. 216 und 126 bzw. 226 entsprechend
getauscht werden und der dichroitische Teilerspiegel 130 entsprechend
modifiziert werden kann.
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Insbesondere
wird darauf hingewiesen, dass abhängig von den Gegebenheiten,
das erfindungsgemäße Schema
auch in Software implementiert sein kann. Die Implementation kann
auf einem digitalen Speichermedium, insbesondere einer Diskette, einer
CD oder einer DVD mit elektronisch auslesbaren Steuersignalen erfolgen,
die so mit einem programmierbaren Computersystem zusammenwirken können, dass
das entsprechende Verfahren ausgeführt wird. Allgemein besteht
die Erfindung somit auch aus einem Computerprogrammprodukt mit auf einem
maschinenlesbaren Träger
gespeicherten Programmcode zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
wenn das Cofmputerprogrammprodukt auf einem Rechner abläuft. In
anderen Worten ausgedrückt,
kann die Erfindung somit als ein Computerprogramm mit einem Programmcode
zur Durchführung
des Verfahrens realisiert werden, wenn das Computerprogrammprodukt
auf einem Computer abläuft.