DE3851910T2

DE3851910T2 - Abtastsystem zur Bestimmung der Fluoreszenz.

Info

Publication number: DE3851910T2
Application number: DE3851910T
Authority: DE
Inventors: Rudy Johan Dam; James Merrill Prober; Charles William Robertson
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Revvity Health Sciences Inc
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-06-02
Also published as: EP0294996A2; IL86695A; DE3851910D1; AU601048B2; EP0294996B1; US4833332A; EP0294996A3; IL86695A0; CA1299772C; AU1762088A; JPS63317770A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Abtastsystem zur Fluoreszenzerkennung und insbesondere eine Vorrichtung, die zur Verwendung mit einem auf Fluoreszenz basierenden DNA-Sequenzierer geeignet ist. Dieses System ist in der Lage, ähnliche Fluorophore, die verhältnismäßig geringe Strahlungsmengen aufweisen, zu unterscheiden. Eine einzigartige Anordnung aus einem Filter und einer faseroptischen Schirmplatte ermöglicht es dem System, Signale aus verhältnismäßig großen Erkennungsbereichen, die mehrere Probenbereiche umfassen, zu überwachen und gleichzeitig die erforderlichen optischen Charakteristiken der kombinierten Filter zu bewahren.

Hintergrund der Erfindung

Die DNA-Sequenzierung, d.h. das Bestimmen der Sequenz oder Reihenfolge der die DNA beinhaltenden Nukleotide oder Basen, ist eine der wesentlichen Analysetechniken der modernen Molekularbiologie. Die Entwicklung zuverlässiger Seguenzierverfahren hat zu großen Fortschritten im Verständnis der Organisation genetischer Informationen geführt und die Manipulation genetischen Materials, d.h. die Gentechnik, ermöglicht.
Es existieren gegenwärtig zwei allgemeine Verfahren zum Sequenzieren von DNA: das chemische Degradationsverfahren nach Maxam-Gilbert [A.M. Maxam et al., Meth. in Enzym. 65 499-599 (1980)] und das Didesoxy-Kettenterminierungsverfahren nach Sanger [F. Sanger et al., Proc. Mat. Acad. Sci. USA 74 5463-5467 (1977)]. Ein gemeinsames Merkmal dieser beiden Verfahren ist die Erzeugung von vier Gruppen markierter DNA- Fragmente, wobei jede Gruppe eine Familie von markierten DNA-Fragmenten aufweist und jede Familie Fragmente mit unterschiedlichen Anzahlen von Nukleotiden enthält. Die Populationen der Fragmente in diesen Gruppen enden sämtlich in einer der vier Nukleotiden oder Basen, die die DNA enthalten. Beide Verfahren verwenden ebenfalls ein radioaktives Isotop, wie ³²P oder ³&sup5;S, als Mittel zum Markieren der Fragmente. Der Hauptunterschied zwischen den Verfahren liegt in der Art der Herstellung der Fragmente.
Bei beiden Verfahren müssen Basissequenzinformationen, die im allgemeinen nicht direkt durch physikalische Verfahren bestimmt werden können, in Informationen mit Kettenlänge umgewandelt werden. Diese Bestimmung kann durch elektrophoretische Trennung erfolgen. Unter Denaturierungsbedingungen (hohe Temperaturen, vorhandener Harnstoff, etc.) wandern kurze DNA-Fragmente als starre Stäbe durch das Elektrophoresemedium. Wenn für die Elektrophorese ein Gel verwendet wird, werden die DNA-Fragmente der Größe nach geordnet und führen zu einer DNA-Sequenzbestimmung mit einer Einzel-Basis-Trennung bis zu mehreren hundert Basen.
Das Sanger- und das Maxam-Gilbert-Verfahren zur DNA-Sequenzierung sind vom Konzept her elegant und effizient, jedoch sind sie schwierig durchzuführen, zeitaufwendig und oftmals ungenau. Zahlreiche dieser Probleme sind in der Tatsache begründet, daß der einzelne radioisotopische Reporter nicht zwischen Basen unterscheiden kann. Die Verwendung eines einzelnen Reporters zum Analysieren der Sequenz von vier Basen macht den Gesamtprozess in hohem Maße komplex. Zur Bestimmung einer vollen Sequenz werden die entweder nach dem Maxam-Gilbert- oder dem Sanger-Verfahren hergestellten vier Sets von Fragmenten in vier parallelen Bahnen einer Elektrophorese unterzogen. Dies führt zu einer räumlichen Trennung der Fragmente nach ihrer Größe entlang der Länge des Gels. Das Muster der markierten Fragmente wird üblicherweise mittels Autoradiographie gelesen, welche ein oftmals als Sequenzierleiter bezeichnetes Kontinuum von Bändern zeigt, die auf vier Bahnen verteilt sind. Die Leiter wird gelesen, indem der Film visuell beobachtet und für jede Stufe der Leiter die Bahn bestimmt wird, in der das nächste Band auftritt. Thermisch induzierte Verzerrungen der Basismobilität in dem Gel (dies tritt üblicherweise als "Smile-Effekt" im Gel auf) können zu Schwierigkeiten beim Vergleich der vier Bahnen führen. Diese Verzerrungen begrenzen oftmals die Zahl der Basen, die in einem einzelnen Gel gelesen werden können.
Die Probleme bezüglich der Verwendung eines einzelnen radioisotopischen Reporters hängen mit deren mangelnden Empfindlichkeit und der zur Auswertung einer Probe erforderlichen Zeit zusammen. Die zur Erstellung autoradiographischer Bilder erforderlichen langen Zeiträume sowie die Notwendigkeit der Verwendung von vier parallelen Bahnen zwingen zu einer "schnappschußartigen" Visualisierung. Da eine gleichzeitige räumliche Trennung einer großen Zahl von Bändern erforderlich ist, müssen große Gels verwendet werden. Daraus ergeben sich zusätzliche Probleme. Große Gels sind schwer zu handhaben und langsam zu verarbeiten, so daß der Gesamtvorgang noch längere Zeit erfordert.
Sobald das belichtete Bild der Gelstruktur erhalten ist, ergibt sich die Schwierigkeit der visuellen Interpretation. Das Umsetzen einer Sequenzierleiter in eine Basissequenz ist ein zeitaufwendiger, fehlerträchtiger Vorgang, der die volle Aufmerksamkeit eines hochqualffizierten Bedieners erfordert. Es existieren einige mechanische Hilfen, jedoch ist der Prozeß des Interpretierens eines Sequenzgels immer noch mühevoll und langsam. Schließlich birgt die Verwendung radioaktiver Materialien Gesundheitsrisiken, die mit der kontinuierlichen Bestrahlung über lange Zeiträume hinweg einhergehen. Die geeignete Verwendung von Abschirm- und Entsorgungsverfahren bietet eine gewisse Kontrolle über die Bestrahlungspegel, jedoch ist ein Verzicht auf die Verwendung von Isotopen höchst erwünscht.
Zur Lösung dieser Probleme werden Anstrengungen unternommen, die Autoradiographie durch ein alternatives nicht radioisotopisches Reporter-/Erkennungssystem zu ersetzen, das Fluoreszenz verwendet. DNA-Fragmente, die mit einem oder mehreren fluoreszierenden Markierungen (fluoreszierenden Farben) versehen und mittels einer geeigneten Lichtquelle erregt sind, geben von ihren Markierungen charakteristische Emissionen ab, welche die Fragmente identifizieren.
Die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen anstelle von radioisotopischen Markierungen ermöglicht das Spezifizieren eines DNA-Fragmenterkennungssystems, das auf die optischen Parameter reagiert, welche die Markierungsfluoreszenz charakterisieren. Zum Beispiel ermöglicht die Verwendung von vier verschiedenen fluoreszierenden Markierungen, die anhand einer Emissionscharakteristik (z.B. Spektralverteilung, Lebensdauer, Polarisierung) unterscheidbar sind, die kennzeichnende Verbindung einer bestimmten Markierung mit den Sequenzierfragmenten, die einer bestimmten Basis zugeordnet ist. Sobald eine solche Verbindung hergestellt ist, können die Fragmente aus einer einzelnen Probe kombiniert und getrennt werden und die Basiszuordnung kann direkt auf der Grundlage der gewählten Emissionscharakteristik erfolgen. Wenn beispielsweise Elektrophorese als Trennmittel gewählt wird, kann eine einzelne Probe, die DNA-Fragmente mit basis-spezifischen fluoreszierenden Markierungen enthält, in einer einzelnen Gelbahn separiert werden.
Das "Echtzeit"-Wesen der Fluoreszenzerkennung ermöglicht es, entweder ein räumlich getrennte Bänder (räumliche Trennung) enthaltendes Gel in der Elektrophoreserichtung abzutasten oder einen einzigen Punkt des Gels zu überwachen und Bänder getrennter Fragmente zu erkennen, während sie aufeinanderfolgend die Erkennungszone passieren (zeitliche Trennung). Bei der zeitlichen Trennung sind zur Unterscheidung der Fragmente nicht notwendigerweise große Gels erforderlich.
Ferner ist ein "Echtzeit"-Ein-Bahn-Erkennungsmodus für eine vollautomatische Basiszuordnung und Datenübertragung sehr gut geeignet.
Ein bekanntes auf Fluoreszenz basierendes "Echtzeit"-DNA- Seguenziersystem, das von dem California Institute of Technology entwickelt wurde, ist in wenigstens einer Patentanmeldung und wenigstens zwei Artikeln offenbart: L.M. Smith, Deutsche Patentanmeldung DE 3446635 A1 (1985); L.M: Smith et al., Nucleic Acids Research 13 2399-2412 (1985) und L.M. Smith et al., Nature, 321: 674-679 (1986). Dieses System verwendet vier Sets von DNA-Sequenzierfragmenten, die jeweils mit einer von vier spezifizierten fluoreszierenden Farben markiert sind. Leider verteilen sich die Fluoreszenz(emissions)maxima über einen breiten Wellenlängenbereich (ungefähr 100 nm), um eine Unterscheidung der vier Farben zu erleichtern, jedoch sind die Absorptionsmaxima (Erregungs-) der Farben vergleichbar verteilt. Dies erschwert eine effiziente Erregung aller vier Farben mit einer einzigen monochromatischen Quelle und das adäquate Erkennen der resultierenden Emissionen.
Vorzugsweise sollten Farben mit eng beabstandeten Absorptionsspektren (und entsprechenden Emissionsspektren) verwendet werden, die zur Verbesserung der Erregungseffizienz gewählt sind. Jedoch bewirken solche eng benachbarten Spektren andere Schwierigkeiten. Es sei daran erinnert, daß ein Echtzeit-Erkennungssystem für die DNA-Sequenzierung in der Lage sein muß, zwischen vier verschiedenen Farbemissionsspektren zu unterscheiden, um die individuell markierten Fragmente zu identifizieren. Diese Emissionen sind üblicherweise von geringer Intensität. Das Erkennungssystem muß einen hohen Selektivitäts- und Empfindlichkeitsgrad (mehr als 10&supmin;¹&sup6; Mol DNA pro Band) sowie eine Einrichtung zum Minimieren von Streulicht und Hintergrundrauschen aufweisen, um die gewünschten Leistungsanforderungen zu erfüllen. Das System muß ebenfalls in der Lage sein, den Erkennungsbereich oft genug zu überwachen, um zu verhindern, daß Fragmente übersehen werden, die zwischen Abtastungen das Erkennungsfenster passieren.
Zur effizienten Verwendung eines Elektrophorese-Gels werden in einem typischen DNA-Sequenzierexperiment mehrere Proben gleichzeitig in parallelen Bahnen einer Gelplatte abgearbeitet. Daher muß ein Erregungs-/Erkennungssystem ferner in der Lage sein, jede Bahn eines solchen Gels im wesentlichen zur selben Zeit zu überwachen. Das System muß in der Lage sein, einen Erkennungsbereich zu überwachen, der den größten Teil der nutzbaren Gelbreite umfaßt. Typische Sequenziergels haben Bahnen von 4-5 mm Breite und 1-2 mm Abstand zwischen den Bahnen. Um ein Gel mit 10 Bahnen zu überwachen, muß ein Erkennungssystem Emissionen in einem Bereich erregen und erkennen, der üblicherweise bis zu 70 mm breit ist.
Das von Smith et al. beschriebene System verwendet einen feststehenden Lichtstrahl und feststehende Detektoren, Die zusainiiien nur einen einzigen Punkt innerhalb des Überwachungsbereichs überwachen können. Um mehr als eine räumliche Position (Bahn oder Bahnposition) eines Gels überwachen zu können, muß entweder der Lichtstrahl abtastend bewegt werden, während gleichzeitig eine Einrichtung zum Erkennen der Emissionen der Farbe vorgesehen ist, oder das Gel muß bewegt werden, während der Strahl feststeht. Die letztere der beiden Alternativen, das Bewegen des Gels, ist nicht immer praktisch, da große Elektrophorese-Gels mit ihren zugehörigen Pufferreservoirs physisch schwer zu handhaben sind. Die andere Alternative, den Strahl zu bewegen, während das Gel feststeht, birgt eigene Probleme, da die Detektoren in enger Verbindung mit den Emissionsquellen bleiben müssen, um das Eintreten von Streulicht zu verhindern und das bestmögliche Sammeln des emittierten Lichts zu gewährleisten.
Ein Verfahren zum Lösen dieser Aufgabe besteht darin, eines der beiden zuvor erwähnten Erkennungssysteme und die zugehörige Optik und den Lichtstrahl derart physisch zu bewegen, daß mehrere Bahnen in dem Gel wirksam abgetastet werden. Diese Art von System hat den Nachteil, mechanisch komplex zu sein und gleichzeitig zusätzliches Rauschen in das System einzubringen. Auch die Zuverlässigkeit und die mit dieser Art von System einhergehenden hohen Kosten sind nachteilig.
Ein anderes bekanntes "abtastendes" Erkennungssystem ist im US-Patent 3 764 512, erteilt an Green et al., erörtert. Dieses System offenbart ein Laserabtast-Elektrophorese-Instrument und ein System zum Bestimmen des elektrokinetischen oder Zeta-Potentials dispergierter Partikel in einer wässrigen Lösung. Dieses System verwendet einen Galvanometerspiegel, um einen Laserlichtstrahl abtastend über ein Elektrophoresemedium zu bewegen. Das System ist nicht in der Lage, mehrere sich senkrecht zur Abtastrichtung des Strahls bewegende Proben zu erkennen.
Ein anderes Abtastsystem ist im US-Patent 4 162 405, Chance et al., offenbart, das eine Vorrichtung zum Messen der Heterogenität der Sauerstoffausgabe an perfundierte und In-situ- Organe beschreibt. Ein.Laser wird als Lichtpunktabtastungserregungsquelle eingesetzt und verwendet zwei Photodetektoren zum Überwachen des Emissionssignals und des Erregungswellenlängenlichts. Obwohl ein X-Y-Scanner zum Bewegen des Laserstrahls über den Probenbereich verwendet wird, beträgt die Größe des gesamten abgetasteten Bereichs nur 1 cm x 1 cm. (Wie zuvor in Zusammenhang mit einem Mehrproben-DNA- Sequenzierer erwähnt, ist ein 7 mal breiterer Probenbereich erwünscht).
Um die Vorschläge nach Chance et al. auf eine große Fläche anzuwenden, müssen die Detektoren entweder größer oder weiter von der Probe entfernt angeordnet sein, wodurch die Sammeleffizienz verringert wird. Ferner erfordert das Erkennen eng benachbarter Emissionsspektren verhältnismäßig geringer Lichtintensitäten bei einer wesentlich stärkeren Erregungsquelle die Eigenschaften der selektiven Durchlässigkeit, die Interferenzfilter bieten. Um eine relativ große Fläche zu überwachen, müssen sowohl große Detektoren als auch große Filter verwendet werden. Jedoch sind große Interferenzfilter, die Licht selbst in großem Raumwinkel sammeln, Transmissionseigenschaften unterworfen, die sich mit dem Einfallswinkel des Lichts verändern. In der Nähen der Strahlungsquelle kann daher bei Licht, das in das Filter mit einem Einfallswinkel von mehr als ungefähr 22 Grad einfällt, eine erheblich geringere Zurückweisung des Erregungslichts auftreten als bei normal einfallendem Licht. Wenn daher das Filter in bezug zu der Strahlungsquelle einen verhältnismäßig großen Raumwinkel begrenzt, werden die Erregungswellenlängenzurückweisungseigenschaften insgesamt nachteilig beeinflußt, da austretendes Erregungslicht mit größeren Einfallswinkeln eintreten.

Zusammenfassung der Erfindung

Viele der Probleme der bekannten Strahlungsenergieerkennungssysteme werden durch die vorliegende Erfindung gelöst, die insbesondere bei einem DNA-Sequenziersystem Verwendung findet. Die Erfindung findet Anwendung in einem System zum Erkennen des Vorhandenseins von von verschiedenen Spezies, üblicherweise mit Farbe markierte DNA, abgestrahlter Strahlungsenergie nach zeitlicher und/oder räumlicher Trennung und zum Identifizieren der Spezies, wobei das System aufweist: eine auf die von den Emittern abgestrahlte Strahlungsenergie reagierende erste Erkennungseinrichtung zum Erzeugen eines in einem ersten Sinn in der Amplitude variierenden ersten Signals als eine Funktion der Art der Emitter; eine auf die Strahlungsenergie reagierende zweite Erkennungseinrichtung zum Erzeugen eines in einem vom ersten Sinn verschiedenen zweiten Sinn in der Amplitude variierenden zweiten Signals als eine Funktion der Art der Emitter; und eine auf das erste und das zweite Signal reagierende dritte Einrichtung zum Erhalten eines dritten Signals, das dem Verhältnis zwischen den Funktionen des ersten und des zweiten Signals entspricht, wobei die Amplitude des dritten Signals die Identität jeder der Spezies angibt.
Die Erfindung ist eine Verbesserung eines solchen Systems, wobei die erste und die zweite Einrichtung jeweils aufweisen: einen Detektor mit einem großen Eintritts-Raumwinkel, der den Spezies benachbart angeordnet ist, um von den Spezies emittierte Strahlungsenergie zum Erzeugen des ersten oder des zweiten Signals zu empfangen, und eine wellenlängenselektive Filtereinrichtung, die zwischen jedem Detektor und den Spezies angeordnet ist, wobei die wellenlängenselektiven Filtereinrichtungen zueinander komplementäre Durchlässigkeit-zu-Wellenlänge-Charakteristiken haben, und eine der ersten und zweiten Detektoreinrichtungen ein Durchlaßfilter zum Abweisen von Strahlungsenergie aufweist, die auf einen Detektor in einem Winkel auftrifft, der größer als ein vorbestimmter Wert ist.
Vorzugsweise werden die Spezies mittels eines von einem Laser kommenden Strahlungsenergiestrahls erregt und das System weist eine Einrichtung zum Trennen von Molekülen (üblicherweise DNA-Fragmente) auf, die mit einer Art von abstrahlendem Material markiert sind. Die Erkennungseinrichtungen sind auf gegenüberliegenden Seiten des Ausbreitungsbereichs des Laserenergiestrahls angeordnet, in dem der Strahl die Trenneinrichtung überstreicht, um die Spezies nacheinander zu erregen. Die wellenlängenselektiven Filter haben einen übergang in ihren Durchlässigkeit-zu-Wellenlänge-Charakteristiken, die ungefähr in der Mitte der Strahlungsenergiespektren der Spezies zentriert ist. Das Durchlaßfilter weist einen Außenwand-Absorber unter mehreren optischen Fasern auf, um parallele Erzeugende in Querrichtung zum ersten und zweiten Detektor zu erzielen.
Dieses System ist optisch effizient und erfordert keine Verwendung von Linsen oder anderen Sammeloptiken. Es ist in der Lage, große Flächen, die mehrere Elektrophoresebahnen enthalten, zu überwachen und überwacht diese durch Verwendung von Detektoren mit weitem Eintrittswinkel. Die mehreren Bahnen werden nacheinander und wiederholt abgetastet. Aufgrund dieser Effizienz kann das System mit geringen Mengen abgestrahlte Strahlungsenergie arbeiten. Das einzige bewegbare Teil, das in dem System erforderlich ist, ist ein optisches Element, das die Laserabtastung durchführt. Die Verwendung von Durchlaßfiltern und zugehörigen Außenwand-Absorbern verringert das Einfallen von Streulicht auf den Detektor erheblich. Das System ist in der Lage, die von mehreren Quellen, die Energie mit unterschiedlichen, jedoch eng benachbarten Wellenlängen emittieren, abgestrahlte Strahlungsenergie zu erkennen und zu unterscheiden.
In US-A-4580059 ist ein System zum Erkennen des Vorhandenseins verschiedener Spezies offenbart, das aufweist: eine erste und eine zweite Erkennungseinrichtung, die ein erstes bzw. ein zweites Erkennungssignal erzeugen, eine auf das erste und das zweite Signal reagierende Einrichtung (in Form eines Dividierers) zum Erzeugen eines dritten Signals, das dem Verhältnis zwischen den Funktionen des ersten und des zweiten Signals entspricht, und Interferenzfilter in den Detektoren. Die Erkennung verschiedener Spezies in dem System nach US-A-4580059 hängt vom dem Ausmaß ab, in dem die Spezies die Abstrahlung eines fluoreszierenden Indikators unterdrücken, dessen Abstrahlung anschließend von dem Detektor erkannt wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Ein besseres Verständnis der Erfindung ergibt sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den zugehörigen Zeichnungen, die Bestandteil der Anmeldung sind und welche zeigen:
Figur 1 - eine perspektivische Darstellung der Elektrophoresegelplatte mit mehreren Probenöffnungen und -bahnen;
Figur 2 - eine schematische Teildarstellung eines erfindungsgemäß aufgebauten Systems zum Erkennen des Vorhandenseins von Strahlungsenergie, die von unterschiedlichen Quellen kommt, welche jeweils Energie mit unterschiedlichen, jedoch eng benachbarten Wellenlängen abstrahlen;
Figur 3 - eine Seitenansicht der Detektor-/Filteranordnung zum Erkennen des Vorhandenseins von Strahlungsenergie;
Figur 4 - eine graphische Darstellung der komplementären Filterdurchlaßcharakteristiken als Funktion der Wellenlänge;
Figuren 5A, 5B und 5C - Flußdiagramme zur Beschreibung der Routinen und Subroutinen, die zum Erhalten von Sequenzen von DNA-Fragmenten unter Verwendung der erfindungsgemäßen Systeme verwendet werden.

Detaillierte Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels

Die Strahlung aus sehr eng benachbarten Strahlungsbändern kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Systems erkannt werden. Diese eng beieinanderliegenden Strahlungen werden von vorgewählten Spezies erzeugt, die üblicherweise als Reporter wirken und irreversibel mit zu analysierenden Materialien verbunden sind. Zulässige Reporter sind im allgemeinen eine oder mehrere Spezies, die aufgrund ihrer Fähigkeit gewählt werden, Strahlung über einen engen Wellenlängenbereich, üblicherweise zwischen 50 und 100 nm, vorzugsweise zwischen 20 und 50 nm, zu emittieren. Vorzugsweise sollten die Spitzenmaxima nicht näher als 2 nm voneinander beabstandet sein. In Abhängigkeit von der Art der Anbringung an den betreffenden Materialien und den Analysebedingungen in dem System kann eine Reporterspezies in der Lage sein, Energie mit mehr als einer Wellenlänge zu emittieren. Jedoch werden üblicherweise eher einzelne Reporter mit kennzeichnenden Strahlungscharakteristiken in dem System gewählt, um Strahlung in dem zu erkennenden Wellenlängenbereich abzustrahlen. Da das bevorzugte Ausführungsbeispiel der Erfindung das Erkennen von mit Reportern markierten DNA-Sequenzfragmenten betrifft, wird es in diesem Zusammenhang beschrieben werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung zum Erkennen beliebiger Licht abstrahlender markierter Proben verwendet werden kann und besonders vorteilhaft ist, wenn die Emissionsstrahlung eng benachbarte Wellenlängen hat. Die Erfindung kann zum Beispiel zum Erkennen von Fluoreszenz, Chemoluminiszenz und dergleichen verwendet werden. Mit Farbe markierte DNA-Sequenzierfragmente werden zum Trennen durch eine Elektrophoresevorrichtung geleitet. Wie in den Figuren 1 und 2 dargestellt, kann zu diesem Zweck die Elektrophorese mittels einer geeigneten Anordnung mit einer Platte 10 erfolgen, die üblicherweise eine Dicke von ungefähr 0,3 mm und eine Länge von ungefähr 40 Zentimeter sowie eine Breite von 15 Zentimeter aufweist. Gegebenenfalls können andere Abmessungen verwendet werden. Die Platte 10 weist ein geeignetes Gel 11, üblicherweise 6% Polyacrylamid, auf, das zwischen Glas oder gering fluoreszierenden Kunststoffträgern 12 sandwichartig angeordnet ist.
Die Platte 10 wird üblicherweise aufrecht in einem Kalter angeordnet, wobei sich das obere Ende der Platte 10 durch und in einen oberen Behälter 16 erstreckt, der einen Puffer 24 enthält, und die Platte sich nach unten in einen zweiten Behälter 14 erstreckt, der ebenfalls einen Puffer 18 enthält. Die Pufferlösung kann jeder geeignete Puffer sein, beispielsweise ein Puffer, der aus einer Lösung bestehend aus 0,1 M Tris, 0,1 M Borsäure und 0,05 M Na&sub2; EDTA mit einem endgültigen pH-Wert von ungefähr 8,3. Auf diese Weise steht der Puffer an beiden Enden der Platte in Kontakt mit dem Gel, um den elektrischen Kontakt mit diesem herzustellen.
Bei dieser Anordnung kann eine Probe, die mit Reporter-Farben markierte DNA-Fragmente enthält, in Hohlräume 15 pipettiert werden, die in der Oberseite des Gels 11 ausgebildet sind und Trennbahnen bilden. Die Reservoirbehälter 14 und 16 sind mit Pufferlösungen 18 und 24 gefüllt. Die elektrische Schaltung wird schließlich durch die Anschlüsse 20 in den Reservoirbehältern 14 und 16 vervollständigt. Ein geeignetes elektrisches Feld (üblicherweise 50 Volt/cm) ist bei Gels dieser bestimmten Länge und Dicke für Trennungen erforderlich. Die positive Elektrode befindet sich am unteren Ende der Platte, um eine Abwärtsbewegung der DNA-Fragmente zu erreichen. Unter diesen Umständen werden die Fragmente während der Abwärtsbewegung durch das Gel räumlich in (nicht dargestellte) Bänder getrennt.
Diese Bänder werden in einer nahe dem unteren Ende der Platte 10 befindlichen Erkennungszone 19 während ihrer Abwärtsbewegung von dem erfindungsgemäßen System und der erfindungsgemäßen Vorrichtung erkannt. In dieser Zone 19 werden die DNA-Fragmente mit einem Laserstrahl 32 mit geeigneter Erregungswellenlänge bestrahlt und die an den mehreren Fragmenten angebrachten unterschiedlichen Reporter strahlen erkennbare Strahlung ab. Da die Reporter und deren Anbringung an den DNA-Fragmenten nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden sie hierin nicht im einzelnen beschrieben. Ein Beispiel für geeignete Reporter ist in der mitanhängigen Patentanmeldung (IP-0597) Nr. 881 732, eingereicht am 2. Juli 1986 von Prober et.al, beschrieben.
Es wurden vier fluoreszierende Farben ausgewählt, deren Emissionsmaxima bei 505, 512, 519 und 526 nm liegen. Diese Maxima können sich in der Umgebung der Gel-Elektrophorese geringfügig verschieben. Diese Emissionscharakteristiken wurden durch die geeigneten chemischen Gruppensubstitutionen, beispielsweise durch Nethylgruppen, an bestimmten Orten der Stammverbindung (9-Carboxyethyl-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen) erreicht. Jede der vier hergestellten Farben hat reaktionsfähige Carboxy-Gruppen, die durch einen mit der 9-Position der Stammverbindung kovalent verbundene Sarcosinyl-Struktureinheit gebildet und in der Lage sind, kovalente Bindungen mit Amingruppen in verknüpfenden Struktureinheiten zu bilden, die die Farben mit ausgewählten Nukleotiden verbinden. Nützliche verknüpfende Struktureinheiten sind eine Gruppe von Alkinylamin-Derivaten, die eine Amino-Endgruppe enthalten, welche kovalente Bindungen mit den Carboxy-Gruppen der Farbe bilden kann. Ein bevorzugter Linker ist ein 3- Aminopropynyl-Derivat, das kovalent an die 5-Position von Uracil (T) oder Cytosin (C) oder an die 7-Position von Desazaguanin (d-G) oder Desazaadenin (d-A) gebunden ist.
Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen System geeignete Linker-Nukleotid-Derivate wurden mit 2',3'-Desoxyribonukleotiden hergestellt, die bekanntermaßen als DNA-Ketten terminierende Substrate für DNA-Polymerasen dienen. es hat sich gezeigt, daß eine kovalente Bindung der Aminopropynyl-2',3'- Didesoxynukleotide mit den fluoreszierenden Farben in geeigneten Kombinationen die Kettenterminierungseigenschaften der unsubstituierten 2',3'-Didesoxynukleotide nicht wesentlich beeinträchtigt. Die vier gewählten Farben-Linker-Didesoxynukleotide A, G, C, T sind durch die folgenden Strukturformeln dargestellt:
Es hat sich gezeigt, daß diese als nützliche Kettenterminierungssubstrate für die reverse Transcriptase (Geflügel-Myeloblastosis-Virus) in einer Abwandlung des bekannten Sanger- DNA-Sequenzierverfahrens geeignet sind. Das klassische Sanger-Verfahren verwendet einen Primer, eine DNA-Schablone, DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment), der nicht markierte Desoxynukleotide und ein strahlungsmarkiertes Desoxynukleotid in jedem von vier Reaktionsgefäßen, die jeweils eines von vier 2',3'-Didesoxynukleotiden enthalten, welche den vier DNA-Basen (A, C, T, G) entsprechen.
Es werden geeignete Reaktionsbedingungen geschaffen, die es der Polymerase ermöglichen, die Schablone durch Hinzufügen von Nukleotiden an das 3'-Ende des Primers zu kopieren. Es finden gleichzeitig mehrere Reaktionen an zahlreichen Primer-Kopien statt, um DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge zu bilden, die sämtlich die Strahlungsmarkierung an geeigneten Nukleotiden in jedem Fragment enthalten, und die ferner irreversibel in einem der vier Didesoxynukleotide enden. Diese Gruppe von Fragmenten wird üblicherweise auf einer Elektrophorese-Gelplatte aus Polyacrylamid in vier Bahnen getrennt, wobei eine Bahn jeweils einer der vier Didesoxynukleotid-Reaktionsmischungen entspricht. Nach der Trennung der Fragmente wird ein photographischer Film auf das Gel gelegt, unter geeigneten Bedingungen belichtet, und es wird eine DNA-Sequenz geschlossen, indem das auf dem Film durch die Strahlungsmarkierung erzeägte Bandmuster in der Reihenfolge ihres Auftretens in den vier Bahnen vom unteren Ende des Gels her gelesen wird.
Die durch die Verwendung dieser durch Farben markierten Terminatoren möglichen Modifikationen sind das Weglassen der strahlungsmarkierten Nukleotide und das Ersetzen der durch Farben markierten Kettenterminatoren für die nicht markierten 2',3'-Didesoxynukleotide. Die Reaktionsmischungen (es kann auch ein einzelnes Reaktionsteil verwendet werden) enthalten nunmehr Fragmente, deren 3'-Enden mit einem Fluorophor markiert sind, das jeder der vier DNA-Basen entspricht. Die Reaktionsmischung(en) wird kombiniert und elektrophoretisch getrennt. Die Sequenz wird anhand der Reihenfolge des Auftretens der zeit- oder räumlich getrennten Bänder, die durch das Vorhandensein fluoreszenter Strahlung angezeigt werden, geschlossen. daher sind die zuvor beschriebenen mit fluoreszierenden Farben markierten Didesoxynukleotide die bevorzugten Quellen der durch das erfindungsgemäße System und das erfindungsgemäße Verfahren zu erkennenden eng benachbarten emittierten Strahlung. Eine alternative Quelle emittierter Strahlung, die bei dem erfindungsgemäßen System und dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein kann, sind die in der Anmeldung von Smith et al. beschriebenen Fluorophore. Ihre Verwendung erfordert die Auswahl der geeigneten Laserfrequenzen und Wellenlängen der vorgewählten Filter.
Die optische Anordnung zum Bestrahlen der Bahnen der Elektrophoreseplatte 10 ist in Figur 2 dargestellt. Das System und die Vorrichtung nach Figur 2 sind mit jedem beliebigen Fluoreszenzsystem oder einem anderen System dieser Art verwendbar, um die Intensität eng benachbarter Emissionsstrahlungsbänder zu unterscheiden und zu messen. Es wird jedoch anhand des Beispiels der Erkennung der Emissionen von DNA- Fragmenten beschrieben, die mit den besonderen Reportern (Farben markiert sind, welche,in der Anmeldung von Prober et al. beschrieben sind, die durch Bezugnahme Teil der vorliegenden Anmeldung ist. Die in Prober et al. beschriebenen Farben haben Spitzenemissionswellenlängen von ungefähr 505, 512, 519 und 526 nm. Es weist einen Laser 30 auf, der derart gewählt ist, daß er einen Erregungsstrahl 32 liefert, der eine bestimmte Wellenlänge hat, welche als Funktion der Erregungswellenlängen der verwendeten Fluorophore bestimmt ist. Die mit den in Prober et al. offenbarten Farbenfluorophore verwendete spezifische Quelle ist ein Argon-Ionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einem Lichtstrahl 32 mit einem Durchmesser von 0,8 mm, der mit 50 mW betrieben wird. Der Lichtstrahl 32 durchquert ein Erregungsfilter 34 und wird sodann in eine Abtastoptik 36 gelenkt. Das Filter 34 ist derart gewählt, daß es jegliche unerwünschte Erregungswellenlängen abweist, die ansonsten den Erkennungsvorgang stören könnten. Bei spektral ausreichend reinen Lasern kann dieses Filter jedoch wegfallen.
Die Abtastoptik 36 weist ein Prisma oder einen Spiegel 38, die an einem (nicht dargestellten) feststehenden Träger montiert sind, eine astigmatische Fokussierlinse 40, ein zweites Prisma oder einen zweiten Spiegel 43, und einen zylindrischen optischen Träger 44 auf, die sämtlich an der Welle eines Schrittmotors 46 angebracht sind. Der Strahl 32 wird beim Eintritt in die Abtastoptik 36 zunächst von dem Prisma 38 bach unten in die zylindrische öffnung des optischen Trägers 44 und durch die Fokussierlinse 40 geleitet. Das Prisma 38 lenkt den Strahl des Lasers in die Abtastoptik 36, wodurch eine bequemere Anbringung des Lasers 30 möglich ist. Der die Fokussierlinse 40 durchquerende Lichtstrahl wird zu einem elliptischen Fleck konzentriert, der vorzugsweise eine Querschnittsfläche von ungefähr 0,2 mm x 1,2 mm hat. Der fokussierte Lichtstrahl 32 wird durch das zweite Prisma 43 durch eine Austrittsöffnung 42 geleitet. Der optische Träger 44 ist derart an der Welle des Schrittmotors 46 angebracht, daß durch Betätigen des Schrittmotors 46 die Linse 40 und das Prisma 43 gedreht werden, um zu bewirken, daß der Lichtstrahl 32 in einer zur Wellenachse und der Ebene des Gels 10 senkrechten horizontalen Ebene in einem Winkel abtastet. Dieser Lichtstrahl 32 ist auf die Erkennungszone 19 der Elektrophoreseplatte 10 gerichtet.
Beim Eintritt in die Platte 10 erregt der Lichtstrahl 32 das Reportermaterial, hier mit fluoreszierender Farbe markierte DNA-Fragmente, während diese durch die Erkennungszone 19 wandern, wodurch sie mit Wellenlängen fluoreszieren, die gegenüber der Erregungswellenlänge verschoben sind. Die Spitzenemissionswellenlängen der in Prober et al. beschriebenen Farben liegen bei ungefähr 505, 512, 519 und 526 nm; jedoch kann das System derart eingestellt werden, daß es zwischen Wellenlängen unterscheiden kann, die anderen Gruppen von Farben mit eng benachbarten Strahlungsbändern zugeordnet sind. Obwohl vorzugsweise eine Laserquelle bevorzugt wird, da sie ein Minimum an zusätzlicher Filterung und zusätzlichen Optiken ermöglicht, können auch andere Quellen, einschließlich einer nicht-kohärenten Quelle wie eine Xenonbogenlichtlampe verwendet werden.
Um die von der fluoreszierenden Spezies emittierte Gesamtstrahlungsenergie zu erhöhen, kann der Erregungsquelle gegenüberliegend eine reflektierende Fläche 50 (Fig. 3) angeordnet werden. Bei der bevorzugten Vorrichtung wird einer verspiegelte Fläche direkt auf der Außenseite der das Gel stützenden oder enthaltenden äußeren Platte 12 vorgesehen. Das nicht von der abstrahlenden Spezies absorbierte Erregungslicht 32 setzt seinen Weg durch die Platte 12 fort und wird von der Oberfläche 50 zur Spezies zurück reflektiert, um im wesentlichen das Doppelte des Erregungslichts zu ergeben. Darüber hinaus wird das von den fluoreszierenden Fragmenten abgegebene Licht in sämtliche Richtungen abgestrahlt, so daß auf die reflektierende Fläche 50 gerichtetes Licht ebenfalls reflektiert wird. Der reine Zuwachs an für die Erkennung verfügbarem fluoreszierendem Signal beträgt ungefähr das Vierfache der ohne die reflektierende Fläche verfügbaren Menge. Das bevorzugte Verfahren des Bildens einer reflektierenden Fläche wird realisiert, indem die Außenseite der das Gel 10 stützenden Platte beschichtet wird. Alternativ kann auf der Außenseite des Glases ein Spiegel angebracht sein, jedoch würde die erhöhte Zahl an Grenzflächen, die das Licht zu durchqueren hat, zusätzliches unerwünschtes gestreutes Erregungslicht erzeugen. Die von den fluoreszierenden Spezies emittierte Strahlungsenergie oder das Licht wird durch zweit in geeigneter Weise positionierte obere bzw. untere Photodetektormodule 52 bzw. 54 gesammelt. Diese Detektormodule sind am besten in Figur 3 zu erkennen, welche die Details ihres Aufbaus zeigt.
Erfindungsgemäß sind die Module 52 und 54 oberhalb und unterhalb der Abtastebene des Lichtstrahls angeordnet. Die Nodule sind in der Hinsicht lichtdicht, daß sie Streulicht, das nicht direkt von dem Erregungsbereich kommt, ausschließen. Jedes Modul weist eine herkömmliche Photovervielfacherröhre (PNT) 56 mit einem breiten Eintrittsbereich auf. Eine geeignete Photovervielfacherröhre ist Hamamatsu R1612. Jedes Modul 52, 54 weist ferner ein wellenlängenselektives Filter 58 auf, das zwischen dem PMT 56 und der in der Gelplatte 10 enthaltenen fluoreszierenden Spezies angeordnet ist. Die Filter 58 sind vorzugsweise übliche Interferenzfilter, die von Barr Associates in Westford, MA, erhältlich sind und, wie in Figur 4 dargestellt, komplementäre Durchlaßbandcharakteristiken aufweisen und quer (gewöhnlich vorzugsweise senkrecht) zum von den Spezies emittierten Licht 60 angeordnet sind. Wie im folgenden noch beschrieben wird, ermöglicht es diese Anordnung den Detektoren, mit optimaler Effizienz zu arbeiten. Ein Filter 58, das eine in Figur 4 mit der Wellenform A bezeichnete Durchlaßcharakteristik aufweist, läßt die unteren Emissionswellenlängen durch und weist die höheren Emissionswellenlängen ab. Das andere Filter 58, das eine mit der Wellenform B (Fig. 4) bezeichnete Durchlaßcharakteristik hat, bewirkt exakt das Gegenteil - es läßt im wesentlichen die höheren Wellenlängen durch und weist im wesentlichen die unteren Wellenlängen ab.
Schließlich weist jedes Modul 52, 54 ein zwischen dem wellenlängenselektiven Filter 58 dieses Moduls und der emittierenden Spezies angebrachtes Durchlaßfilter 62 auf. Diese Filter sind reversibel. Jedes Durchlaßfilter 62 weist einfallendes Licht ab, das in seitlich der Achse gelegenen Winkeln eintritt, die größer sind als ein vorbestimmter Winkel. Die beiden wellenlängenselektiven Filter 58 versetzen das System in die Lage, eng beieinanderliegende Emissionsspektren zu unterscheiden. Auf diese Wellenlängenfilter 58 auftreffendes Licht wird entweder durchgelassen, absorbiert oder reflektiert. Die Emissionsspektren der vier gewählten Beispielfarben, nämlich G505, A512, C519 und T526, sind in Figur 4 dargestellt. Die Durchlaßfilter 58 sind derart gewählt, daß sie Durchlaßcharakteristiken (entsprechend den Kurven A und B in Figur 4, wie beschrieben) aufweisen, die zu denjenigen des dem anderen Photodetektor zugeordneten wellenlängenselektiven Filters im Wellenlängenbereich der von den verschiedenen Spezies emittierten Strahlungsenergie komplementär sind.
Die beiden Filter 58 haben etwa komplementäre Durchlässigkeit-zu-Wellenlänge-Charakteristiken im Emissionswellenlängenbereich der vier Farben, wobei die Übergangswellenlängen nahe des Zentrums oder der Mitte der Strahlungsenergiespektren der Spezies auftreten. Mit der Verschiebung des Fluoreszenzspektrums von den kürzeren zu den längeren Wellenlängen verändert sich das Verhältnis des durch das (in der Zeichnung) obere Filter 58 hindurchgelassenen Lichts zu dem durch das (in der Zeichnung) untere Filter 58 hindurchgelassenen Licht kontinuierlich. Die für diese Anwendung geeignetsten Filter sind Interferenzfilter, die sowohl eine hohe relative Durchlässigkeit als auch eine hohe Abweisungsfähigkeit bei der Erregungswellenlänge haben. Obwohl diese besonderen Filter zur Verwendung mit den für diese Anmeldung ausgewählten besonderen Farben gewählt wurden, kann eine andere Gruppe von Farben auf diesen Prinzipien basierend mit anderen Filtersets in geeigneter Weise differenziert werden.
Die Detektoren und entsprechenden Filter sind derart gewählt, daß sie für diese Anwendung eine verhältnismäßig große Fläche haben. Die Detektoren 56, vorzugsweise Photovervielfacherröhren, haben große Eintrittsfenster von nominell 8 mal 3,5 cm. Auf diese Weise kann eine verhältnismäßig große Fläche 19 der Gelplatte überwacht werden, ohne daß Abbildungsoptiken erforderlich Sind- die inhärent das Lichtsammeln beeinträchtigen und Quellen von Streulicht sind. Die Detektoren 56 in diesem System sind ungefähr 2-3 cm von den emittierenden Spezies entfernt derart angeordnet, daß mehrere Proben kontinuierlich mit hoher Lichtsammeleffizienz überwacht werden können. Unter diesen Bedingungen kann gesagt werden, daß die Detektoren einen großen Raum-Eintrittswinkel haben.
Wie bereits erwähnt, würde dies im Normalfall zum Durchlassen von unerwünschtem gestreutem Erregungslicht, das in von der Normalen (auf die Detektoren) in hohem Maße abweichenden Winkeln einfällt, führen. Dies tritt ein, da bei seitlich von der Normalen gelegenen Winkeln die Weglänge durch die aufgebrachten Schichten (Hohlräume) der Filter 58 erheblich verändert ist, wodurch die Filtercharakteristiken zu den kürzeren Wellenlängen hin verschoben werden. (Die Veränderungen in der Bandbreite und der Spitzendurchlässigkeit sind bei in bezug auf die Normale der Detektoren kleinen Einfallswinkeln gering.) Da die Probe Strahlung aus der Erkennungszone in alle Richtungen emittiert, ist das Erkennen einiger außeraxialer Strahlung unvermeidbar. Zwar ist in der Nähe des Normalwinkels auf die Durchlaßfilter 58 auftreffendes Licht erwünscht, jedoch ermöglicht die Verwendung großer Detektoren, die in fester Entfernung von den emittierenden Spezies angeordnet sind, daß gestreutes Erregungslicht und emittiertes fluoreszierendes Licht auf die gesamte Fläche des Filters in verhältnismäßig schiefem Winkel auftreffen kann. Dieses Licht wird sodann unabhängig von den spezifizierten Filtercharakteristiken durch das Filter durchgelassen.
Diese Problem wird erfindungsgemäß durch die Verwendung spezieller Durchlaßfilter 62 gelöst, die mit den wellenlängenselektiven Filtern 58 derart gekoppelt sind, daß das auf die wellenlängenselektiven Filter 58 auftreffende Licht auf einen bestimmten, der normalen Richtung nahen Winkelbereich begrenzt ist. Der Hauptteil des in einem Winkel, der größer als ein Grenzwert ist, auftreffenden Lichts wird entweder zurückgewiesen oder absorbiert. Wenn eine zusätzliche Zurückweisung von außerhalb eines bestimmten Winkelbereichs liegendem Licht vonnöten ist, kann die vorliegende Erfindung mit geeigneten Blenden, farbigem Filterglas oder anderen bekannten Einrichtungen kombiniert werden.
Eine andere anstelle der Durchlaßfilter 62 verwendbare bekannte Vorrichtung 62, die Charakteristiken aufweist, welche das Zurückweisen von außerhalb eines Winkelbereichs liegendem Licht ermöglichen, wird von INCOM, Southbridge, Nass., hergestellt. Diese Vorrichtung besteht aus einem dicht gepackten Bündel miteinander verschmolzener optischer Fasern, wobei jede Faser einen Durchmesser von ungefähr 10 Mikrometer hat. Das Bündel ist in Querrichtung der Fasern geschnitten, um ein optisches Element gewünschter Dicke zu erhalten. Da jede der Fasern eine nominelle numerische Apertur von ungefähr 0,35 hat, kann lediglich Licht durchgelassen werden, das innerhalb eines Winkelbereichs von ±21º einfällt. Licht, das in einem größeren Winkel als dem zulässigen Winkel einfällt, wird entweder durch Vorderseitenreflexion abgewiesen oder durch den Mantel der Übertragungsfaser gelenkt. Durch den Mantel gehendes Licht kann seinen Weg in der gleichen Weise durch die nächste Faser fortsetzen und erreicht schließlich die gegenüberliegende Fläche der Platte und tritt in dem ursprünglichen Eintrittswinkel ähnlichem Winkel aus. Dieses besondere Licht trifft in unerwünschtem Winkel auf die wellenlängenselektiven Filter 58 und jedem Modul 52, 54 und umgeht die festgelegten Filtercharakteristiken. Um das Auftreten dieser Art von Lichtdurchlaß durch die Faserplatte zu vermeiden, werden 3-6% "Außenwand-Absorber"-Fasern (EMA) gleichmäßig im gesamten Bündel verteilt. Die normale Verteilung dieser Fasern erzeugt eine absorbierende Sperre, die durch die Wände der optischen Fasern gehendes Licht absorbiert, jedoch das innerlich reflektierte Licht, das sich durch jede Filter in der Platte ausbreitet, nicht beeinträchtigt.
Wie in den Figuren 2 und 3 gezeigt, wird durch die jeweiligen Filtersysteme 62-58 durchgelassenes Licht zu den jeweiligen Detektoren 56 geleitet. Die elektrischen Signale der Detektoren werden sodann über jeweilige Vorverstärker 66, 68 jeweiligen Analog-zu-Digital-Wandlern (A/D) 70, 72 und schließlich einer Systemsteuerung 80 zugeführt. Die Aufgabe der Systemsteuerung 80 kann von einem Kleincomputer, beispielsweise einem IBM PC, wahrgenommen werden. Eine Funktion der Systemsteuerung 80, die in den Flußdiagrammen der Fign. 5A, 5B und 5C beschrieben ist, ist, unter anderen Steueraufgaben, das Berechnen des Verhältnisses zwischen den beiden Signal funktionen (den Strahlungsintensitäten an den PMT 56 für jede unterschiedliche Emissionswellenlänge). Die wellenlängenselektiven Filter 62 modulieren die Stärke der Signale in jedem der verschiedenen Wellenlängenbereiche entsprechend der Wellenlänge, d. h. bei einem der Detektoren haben die Emissionen mit kürzeren Wellenlängen einen niedrigeren Signalamplitudenwert und die Emissionen mit längeren Wellenlängen haben eine höhere Amplitude. Das Umgekehrte gilt für den anderen Detektor, da die Filter, wie beschrieben, komplementäre Charakteristiken haben.
Wenn eine bestimmte Spezies, d.h. ein mit Farbe markiertes DNA-Fragment, nach der räumlichen Trennung in der Gelplatte die Erkennungszone 19 der Gelplatte 10 passiert, erzeugen ihre Emissionsspektren zwei Signale - jeweils eines an dem Ausgang jedes Detektors 56 - die in der Amplitude in Abhängigkeit von der emittierten Wellenlänge und der Zeit variieren (wegen der Bewegung durch die Gelplatte 10). Die amplitudenmodulierten Lichtsignale werden zu diesem Zeitpunkt in elektrische Signale umgewandelt, die für die beschriebene Verarbeitung digitalisiert werden. Nach der Umwandlung werden die Funktionen der beiden digitalen Signale ins Verhältnis gesetzt, d.h. es wird der Quotient des ersten und des zweiten Signals des fluoreszierenden Lichts für jedes Fluorophor gebildet. Der Betrag jedes Quotientensignals gibt die Identität der Spezies an. Die Amplituden der Quotientensignale für jede Farbe neigen dazu, zu deutlich erkennbaren Cluster oder Gruppen zusammenzufallen, die leicht zu unterscheiden sind.
Der hierin in Zusammenhang mit den Emissionscharakteristiken der Farben oder Fluorophore verwendete Ausdruck "eng benachbart" ist in gewissem Sinne ein relativer Ausdruck. Der Mindestabstand zwischen der Emissionsmitte der Farben ist ausreichend groß, so daß die Differenz zwischen den Verhältnissen der Signale der beiden Detektoren für zwei beliebige benachbarte Farben auch in dem inhärenten Systemrauschen erkennbar ist.
Zur Verbesserung der Farberkennungsselektivität können die Filtercharakteristiken weiter optimiert werden. Dies kann erreicht werden, indem Filter mit Charakteristiken gewählt werden, die sich über die verschiedenen Farbemissionsspektren erheblich verändern. Um jedoch eine Gruppe eng benachbarter Farben in sich unterscheiden zu können, ist es vorteilhaft, relativ abrupte Filterübergänge vorzusehen, die nahe der Mittelwellenlänge der Farbemissionsgruppe auftritt, um so die Veränderung des Signalverhältnisses in den beiden Filtern für die verschiedenen Emissionsspektren gleichmäßig zu verteilen. Die Charakteristiken eines einzelnen Filters können aufgrund der zuvor beschriebenen Idiosynkrasie der Interferenzfilter ebenfalls bis zu einem gewissen Grad feinabgestimmt werden, indem der Einfallswinkel des Ausgangsflusses des Faserbodens in bezug auf die Normale des Interferenzfilters geringfügig variiert wird,
In vielen Fällen muß die Außenwand-Absorption des Durchlaßfilters 62, das für das wellenlängenselektive Filter verwendet wird, das ein der Erregungswellenlänge des Lasers nächstgelegenes Durchlaaßband hat, größer sein als bei dem anderen Durchlaßfilter. In diesem Beispiel, in dem der Laser mit 488 um arbeitet, erfordert das wellenlängenselektive Filter 58 mit dem Paßband A (Fig. 4) ein Durchlaßfilter 62, wie es mit dem wellenlängenselektive Filter 58 mit dem Paßband B (Fig. 4) verwendet wird. In manchen Fällen ist nur ein Durchlaßfilter erforderlich.

Systemsteuerung

Die Systemsteuerung 80 wandelt die von den A/D-Wandlern 70 und 72 empfangenen digitalen Signale in DNA-Sequenzinformationen um. In den meisten Fällen erfolgt dies durch einen Computer, der Programme in Echtzeit abarbeitet. Dies bedeutet, daß die Erfassung der Roh-Daten von den Detektoren und die Verarbeitung der Daten sowie die Auswertung der Sequenzinformationen gleichzeitig erfolgt.
Theoretisch kann die Funktion der Systemsteuerung 80 in drei verschachtelte Verfahren unterteilt werden: Datenerfassung oder -eingabe, Datenanalyse und Datenausgabe. Die Vorgänge greifen ineinander, indem sie Daten und Zeitsteuerungsinformationen, die sie "im Gleichschritt" halten und gegenseitige Störungen vermeiden, gemeinsam nutzen. Die Einzelheiten der Realisierung dieser Interaktionen sind von der jeweiligen Programmiersprache und der gewählten Hardware abhängig und sind nicht von wesentlichem Interesse.
Die derart zum Erhalten von DNA-Basissequenzinformationen durchgeführte Datenerfassung und -verarbeitung ist am besten unter Bezugnahme auf die Flußdiagramme der Figuren 5A, 5B und 5C zu verstehen. Diese stellen ein allgemeines Verfahren dar, mittels dem das Roh-Detektoreingangssignal des abtastenden Fluoreszenzerkennungsystems in ein Ausgangssignal umgewandelt werden kann, d.h. in die DNA-Sequenz einer Probe. In dieser Erörterung bedeuten die folgenden Ausdrücke:
1. i ist der Index des gegenwärtig erfaßten Datenpunkts. Dieser Punkt wird zum Zeitpunkt t(i)min erfaßt.
2. k ist der Index des gegenwärtig verarbeiteten Datenpunkts bei t(k)min. In einem allgemeinen Datenverarbeitungsschema muß k nicht gleich i sein, d.h. die Datenverarbeitung kann der Datenerfassung nacheilen.
3. t(i) bezeichnet eine Gruppe von Zeitpunkten, zu denen Daten erfaßt wurden. Beispiel: t(5)=6,2 Min gibt an, daß der fünfte Datenpunkt 6,2 Minuten nach Beginn des Durchlaufs erfaßt wurde.
4. D1(i) bezeichnet die Datenmatrix für den ersten Detektor.
5. D2(i) bezeichnet die Datenmatrix für den zweiten Detektor.
6. J ist der Zählwert der erkannten Spitzen.
7. N bezeichnet die Zahl der Datenpunkte an einer bestimmten Spitze.
8. m ist ein Index für Punkte an einer bestimmten Spitze in D1(i) oder D2(i). m=1 zu Beginn einer Spitze; m=n am Ende einer Spitze.
9. W ist eine Funktion (z. B. das Verhältnis) der Detektorausgänge D1(i) und D2(i), deren Wert die Identität der einer bestimmten Spitze entsprechenden DNA-Basis angibt.

Datenerfassung

Ein allgemeiner Datenerfassungsvorgang für einen einzelnen Kanal ist in dem Flußdiagramm der Figur 5A dargestellt. Der Index i, der die gegenwärtig erfaßten Daten angibt, wird initialisiert. Das Programm nimmt eine Eingabe auf, die bestimmt, wie lange der Durchgang dauert, d.h. die Gesamtzahl der Datenpunkte I(gesamt) Nachdem die Rohdatenmatrizen D1 und D2 initialisiert sind, tritt der Ablauf in eine Erfassungsschleife ein. Zum Zeitpunkt t(i) erfaßte Daten werden aus den Detektoren gelesen, digitalisiert und als D1(i) und D2(i) in die Matrizen für die Detektoren 53 bzw. 54 plaziert. (Für die Zwecke der vorliegenden Erörterung erfolgen die beiden Lesevorgänge gleichzeitig.) Zu diesem Zeitpunkt wird der Index i inkrementiert und mit I(gesamt) verglichen. Wenn i kleiner als I(gesamt) ist, wird die Erfassungsschleife wiederholt. Wenn i gleich I(gesamt) ist, kann das Programm erkennen, wann der Durchlauf automatisch angehalten werden soll, indem mehrere Betriebsparameter (beispielsweise Signal-/Rauschverhältnis, Spitzenauflösung, oder Unsicherheit bei der Zuweisung von Basen) bei jeder Spitze des Durchlaufs gemessen werden, Wenn eine Kombination solcher Faktoren voreingestellte Bedingungen nicht erfüllt, beendet der Computer den Durchlauf.
Der primäre Dateneingang sind die Rohdaten der Detektoren und der Ausgang wird in den Datenmatrizen D1(i) und D2(i) gespeichert, die von den Erfassungs- und Datenanalysevorgängen gemeinsam genutzt werden. Dieses Schema ist schematisch in Figur 5B dargestellt. Obwohl die beiden Programm unabhängig voneinander ablaufen, müssen Steuerungsinformationen zwischen ihnen ausgetauscht werden, um eine geeignete Zeitsteuerung aufrechtzuerhalten. Beispielsweise dürfen die Verarbeitungsschritte die Datenerfassungsschritte nicht überholen, da sonst versucht würde, nicht existierende Daten zu verarbeiten.

Analyse

Der in den Figuren 5B und 5C dargestellte Datenverarbeitungsalgorithmus ist ein Beispiel für ein allgemeines Schema zum Erkennen und Identifizieren von mit Farben markierten Spezies. Es ist nicht umfassend. Es stellt vielmehr die Hauptmerkmale dar, die zur Entwicklung eines beliebigen realen Analysierprogramms erforderlich sind und dient als Beispiel für das vom Anmelder bevorzugte Ausführungsbeispiel.
Nach dem Initialisieren des Verarbeitungsindex k (im Unterschied zum Erfassungsindex i), tritt das Programm in eine einfache Schleife ein, in der die Daten D1(k) und D2(k) aus den im Erfassungsvorgang erstellten Datenmatrizen ausgelesen werden. Das Programm fragt sodann, ob sich der gegenwärtige Punkt auf einer Spitze befindet. Es existiert eine Anzahl von Algorithmen zur Bestimmung dieses Zustands; die Details sind hier nicht erforderlich. Der Ausdruck "Spitze" ist hier in allgemeiner Bedeutung zu verstehen. Eine Spitze in D1 wird im allgemeinen von einer Spitze in D2 begleitet. Je nach der Identität der Farbe können die Spitzen in diesen beiden Kanälen jedoch erheblich in ihrer Intensität verschieden sein. Jedoch fallen sie mit der Zeit zusammen. Daher kann ein gewichteter Mittelwert der beiden Signale, das stärkere der beiden Signale oder eine andere Kombination von D1(k) und D2(k) zum Definieren einer "Spitze" in bezug auf die Zeit verwendet werden.
Befindet sich der gegenwärtig verarbeitete Punkt nicht auf einer Spitze, wird der Index k inkrementiert und mit dem Erfassungsindex i verglichen. Wenn k gleich I(gesamt) ist, ist der Durchgang beendet und das Programm hält an. Wenn k kleiner als i ist, werden die nächsten Datenpunkte aus den Matrizen D1 und D2 gelesen und die Schleife wird erneut abgearbeitet. Wenn k gleich i ist, bedeutet dies, daß die Datenverarbeitung die Datenerfassung eingeholt hat. In diesem Fall wartet das Verarbeitungsprogramm eine kurze Zeit (üblicherweise eine Sekunde) und prüft die werte von k und i erneut, bis die Verarbeitung neu aufgenommen werden kann.
Befindet sich der gegenwärtig verarbeitete Punkt auf einer Spitze, wird der Index m inkrementiert. Der Index m zählt die Zahl der Punkte an der gegenwärtigen Spitze. Die Werte D1(k) und D2(k) werden in einer temporären Matrix gespeichert, die D1spitze(m) bzw. D2spitze(m) genannt werden. Das Programm prüft sodann, ob der gegenwärtige Punkt der letzte Punkt der Spitze ist. Wenn er nicht der letzte Punkt der Spitze ist, kehrt die Programmsteuerung zur oberen Schleife zurück, in der k inkrementiert wird, sein Wert mit i verglichen wird und das nächste Datenpaar aus den Matrizen D1 und D2 gelesen wird.
Wenn der gegenwärtige Pünkt der letzte Punkt der Spitze ist, wird der Spitzenzähler inkrementiert und das Programm geht zur Feststellung der Identität der Spitze über. Das Ergebnis ist die Identität der nächsten Basis in der DNA-Sequenz. Das Programm berechnet die Funktion W für die gegenwärtige Spitze, wie zuvor beschrieben, wobei die Matrizen D1spitze(m) bzw. D2spitze(m) als Eingangsdaten verwendet werden.Jeder Nukleotidbasis wird ein Spitzenpaar zugeordnet, das eine Charakteristik W ergibt. Basierend auf dem Wert W für diese Spitze gibt das Programm als Ausgang die Identität der DNA- Basis A, T, C, G aus. Der Spitzenpunktindex m und die Matrizen D1spitze(m) bzw. D2spitze(m) werden auf 0 zurückgesetzt und das Programm tritt erneut in die obere Datenerfassungsschleife ein, wie in der Figur 5B dargestellt.
Das obige Schema kann auf einen Mehrproben-Abtaster ausgeweitet werden. Bei einem Mehrkanal-Instrument wird der Laserstrahl zur nächsten Probenposition bewegt, bevor die Datenerfassungsschleife nach Figur 5A erneut abgearbeitet wird. Darüber hinaus werden jeder Bahn oder Probenposition separate Datenmatrizen zugeordnet (zum Beispiel D1A(i), D1B(i), ..., D1Ki) und (D2A(i), D2B(i), ..., D2Ki) für die Bahnen A, B, ..., K). Die Datenerfassung und die Datenverarbeitung erfolgen für jede Bahn nacheinander in ähnlicher Weise wie zuvor beschrieben.

Claims

1. System zum Erkennen des Vorhandenseins von von verschiedenen Emittern abgestrahlter Strahlungsenergie nach zeitlicher und/oder räumlicher Trennung, mit:

- einer auf die von den Emittern abgestrahlte Strahlungsenergie reagierenden ersten Erkennungseinrichtung (52) zum Erzeugen eines in einem ersten Sinn in der Amplitude variierenden ersten Signals als eine Funktion der Art der Emitter;

- einer auf die Strahlungsenergie reagierenden zweiten Erkennungseinrichtung (54) zum Erzeugen eines in einem vom ersten Sinn verschiedenen zweiten Sinn in der Amplitude variierenden zweiten Signals als eine Funktion der Art der Emitter; und

- einer auf das erste und das zweite Signal reagierenden dritten Einrichtung (80) zum Erhalten eines dritten Signals, das dem Verhältnis zwischen den Funktionen des ersten und des zweiten Signals entspricht;

- einem wellenlängenselektiven Filter (58), das sowohl in der ersten als auch in der zweiten Erkennungseinrichtung im Weg der Strahlungsenergie angeordnet ist;

dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Emitter verschiedenen Spezies angehören, deren Vorhandensein und Identität derart erkannt werden soll, daß die Amplitude des dritten Signals die Identität jeder der Spezies angibt;

daß die erste und die zweite Erkennungseinrichtung jeweils aufweisen:

- einen Detektor (56) mit einem großen Eintritts-Raumwinkel, der den Spezies benachbart angeordnet ist, um von den Spezies emittierte Strahlungsenergie zum Erzeugen des ersten oder des zweiten Signals zu empfangen, und wobei

- der im Weg der Strahlungsenergie zwischen jedem Detektor (56) und den Spezies angeordnete wellenlängenselektive Filter eine Durchlässigkeit-zu-Wellenlänge-Charakteristik hat, die zu derjenigen des dem anderen Photodetektor zugeordneten wellenlängenselektiven Filters im Wellenlängenbereich der von den verschiedenen Spezies emittierten Strahlungsenergie komplementär ist; und

daß eine (52) der ersten und zweiten Detektoreinrichtungen (52, 54) ein Durchlaßfilter (62) zum Abweisen von Strahlungsenergie aufweist, die auf das Durchlaßfilter in einem Winkel auftrifft, der größer als ein vorbestimmter Wert ist.

2. System nach Anspruch 1, ferner mit einem Laser (30), der einen Erregungsstrahl (32) aus Strahlungsenergie auf die Spezies richtet, wobei der Strahlungsenergie-Laserstrahl eine Wellenlänge aufweist, die innerhalb des Erregungsbereichs der Spezies liegt.

3. System nach Anspruch 2, bei dem das Durchlaßfilter (6) mit demjenigen wellenlängenselektiven Filter (58) verbunden ist, das ein der Wellenlänge der Strahlungsenergie des Laserstrahls (32) am nächsten liegendes Durchlaßband aufweist.

4. System nach einem der Ansprüche 2 und 3, bei dem die erste und die zweite Erkennungseinrichtung (52, 54) auf gegenüberliegenden Seiten des Abtastlaserstrahls angeordnet sind.

5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einer Einrichtung (15) zum Trennen von DNA-Segmenten oder anderen Molekülen, die mit fluoreszenten Materialien markiert sind,

wobei die Einrichtung derart angeordnet ist, daß sie durch Strahlungsenergie erregbar ist.

6. System nach Anspruch 5 in Kombination mit Anspruch 2, bei dem die Strahlungsenergie, welche die Einrichtung zum Trennen von DNA-Fragmenten oder anderen mit einer Art von abstrahlendem Material markierten Moleküle erregt, Strahlungsenergie des Lasers ist.

7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch das Nichtvorhandensein einer Linse zwischen der ersten und der zweiten Erkennungseinrichtung (52, 54) und der abstrahlenden Spezies.

8. System nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit einer Einrichtung (36) zum Führen des Strahlungsenergie-Laserstrahls (32) über die Trenneinrichtung (15), um die Spezies nacheinander zu erregen.

9. Vorrichtung zum Erkennen des Vorhandenseins von fluoreszenter Strahlung, die von DNA-Fragmenten oder anderen Molekülen abgeleitet wird, die ihrer Art gemäß mit unterschiedlichen fluoreszierendefr Arten von Materialien markiert sind, mit:

- einer Trenneinrichtung (15) zum räumlichen Trennen der Moleküle;

- einer Einrichtung, die einen Laser (30) aufweist, zum Führen eines Strahlungsenergiestrahls in einer ersten Ebene über die Trenneinrichtung, um die Spezies zu erregen;

- einer ersten und einer zweiten Erkennungseinrichtung (52, 54), mit:

(i) einem ersten und einem zweiten Photodetektor (56), die jeweils einen großen Eintritts-Raumwinkel haben und auf gegenüberliegenden Seiten der ersten Ebene angeordnet sind, um von den Spezies abgestrahlte fluoreszente Strahlung in ein erstes und zweites Signal umzuwandeln;

(ii) zwischen den jeweiligen Photodetektoren (56) und der Trenneinrichtung (15) angeordneten ersten und zweiten Wellenlängenfiltern (58) mit Durchlässigkeit-Wellenlängen-Charakteristiken, die zu denjenigen des dem anderen Photodetektor zugeordneten wel1enlängenselektiven Filters im Wellenlängenbereich der von den verschiedenen Spezies emittierten Strahlungsenergie komplementär sind; und

(iii) einem zwischen einem der jeweiligen Photodetektoren (56) und seiner Trenneinrichtung angeordneten Durchlaßfilter (62) zum Abweisen von Strahlung, die auf den Photodetektor (56) in einem Winkel auftrifft, der größer als ein vorbestimmter Wert ist; und

- einer auf das erste und das zweite Signal reagierenden Einrichtung (80) zum Ableiten eines dritten Signals, das den Verhältnis zwischen den Funktionen des ersten und des zweiten Signals entspricht, wobei das dritte Signal die Identität der fluoreszierenden Spezies angibt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch das Nichtvorhandensein einer Linse zwischen dem ersten und dem zweiten Photodetektor (56) und der abstrahlenden Spezies.

11. System nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, bei denen die wellenlängenselektiven Filter (58) eine Durchlässigkeit-zu-Wellenlänge-Charakteristik haben, die ungefähr um die Mitte der Strahlungsenergiespektren der Spezies zentriert ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der die Durchlässigkeitscharakteristik ungefähr um die Mitte der Fluoreszenzstrahlung der Spezies zentriert ist.

13. System oder Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei denen das Durchlaßfilter (62) einen Außenwand-Absorber unter mehreren optischen Fasern aufweist, um parallele Erzeugende in Querrichtung zu der ersten und der zweiten Erkennungseinrichtung zu erzielen.

14. System oder Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei denen der vorbestimmte Wert des Rückweisungswinkels des Durchlaßfilters (62) ungefähr 22º beträgt.

15 System nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem beiden Photodetektoren (54) ein Durchlaßfilter (62) zugeordnet ist.