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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Multiplex-Kapillarelektrophorese-Fluoreszenzerfassungssystem
oder Multiplex-CE-Fluoreszenzerfassungssystem (CE – Capillary
Electrophoresis) und ein Verfahren, das zur Abtrennung und Erfassung
von Substanzen verwendet werden kann, die fluoreszierende Eigenschaften
besitzen, z. B. fluoreszenzmarkierte dsDNA, Aminosäuren, Kohlenhydrate,
Fettsäuren, Proteine,
usw.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es
gibt eine breite Palette von im Handel erhältlichen Geräten, die
Elektrophorese anwenden, um DNA-Proben zu analysieren. Bei einer
solchen Art handelt es sich um ein mehrspuriges Slab Gel- oder Gelplatten-Elektrophoresegerät, das,
wie der Name schon vermuten lässt,
eine Gelplatte verwendet, auf der DNA-Proben angeordnet sind. Spannung wird
an die Gelplatte angelegt, was eine Migration in der beschickten
DNA-Probe induziert.
Das Gel wirkt als eine auf Größe beruhende
Siebmatrix, was zu einer Aufteilung der DNA-Probe in DNA-Fragmente
unterschiedlicher Massen führt.
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Bei
einer anderen Art von Elektrophoresegerät handelt es sich um das Kapillarelektrophoresegerät oder CE-Elektrophoresegerät. CE bezieht
sich auf eine Gruppe miteinander verwandter Analyseverfahren, die
sehr starke elektrische Felder verwenden, um Moleküle mit Kapillaren
engen Durchmessers (typischerweise 20–100 μm Innendurchmesser) abzutrennen.
CE-Verfahren werden in zahlreichen Anwendungen sowohl in der Industrie
als auch Wissenschaft eingesetzt. CE auf Gel- und Polymernetzwerkbasis
hat die Nukleinsäurestudien
revolutioniert; Anwendungen umfassen DNA-Sequenzierung, Nucleotidquantifizierung
und Mutations/Polymorphismusanalyse. Wenn Elektrophorese in einer
Quarzglas-Kapillarsäule
geringen Durchmessers angewendet wird, die eine Pufferlösung enthält, ist
die erforderliche Probengrößer deutlich
kleiner und die Abtrennungs- und Auflösungsgeschwindigkeit kann im
Vergleich zum Gel-Elektrophoreseverfahren um ein Vielfaches erhöht werden.
Durch CE analysierte DNA-Fragmente werden oftmals dadurch erfasst,
dass Licht durch die Kapillarwand auf die sich von der Probe abtrennenden
Bestandteile, die mit einem fluoreszierenden Stoff markiert worden
sind, gelenkt wird und die Fluoreszenzemissionen erfasst werden,
die durch das einfallende Licht induziert wurden. Die Stärken der Emission
sind repräsentativ
für Konzentration,
Menge und/oder Größe der Bestandteile
der Probe.
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Einige
der Herausforderungen bei der Auslegung von Geräten auf CE-Basis und der Durchführung von
CE-Analyseprotokollen beziehen sich auf die Probenerfassungsverfahren.
Im Falle von Fluoreszenzerfassung, richteten sich erhebliche Konstruktionsüberlegungen
beispielsweise auf die Strahlungsquelle, optische Erfassung, Empfindlichkeit
und Zuverlässigkeit
der Erfassung, und Kosten und Zuverlässigkeit des Aufbaus der Erfassungsoptik.
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Die
Verwendung von CE bei der Fluoreszenzerfassung bietet eine hohe
Erfassungsempfindlichkeit zur DNA-Analyse. Fluoreszenzerfassung
ist oftmals die Erfassungsmethode der Wahl auf den Gebieten der
Gen- und Proteinbiochemie, und zwar wegen ihrer herausragenden Empfindlichkeit
im Vergleich zu anderen Erfassungsmethoden.
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Die
meisten Multiplex-CE-Systeme, wobei mehrfache Kapillaren oder Kanäle verwendet
wurden, um Abtrennungen parallel vorzunehmen, verwenden einen Laser
(Kohärenzlichtquelle)
als Erregungslichtquelle zur Fluoreszenzerfassung (siehe
US-Patent Nr. 5,582,705 ). Ein
Patent (
US-Patent Nr. 6,828,567 )
stellt ein System dar, das eine, jedem Separationskanal zugeordnete
lichtemittierende Diode (LED) umfasst. Andere Publikationen befassen
sich mit Einzelsäulenerfassung
und nicht mit Mehrfachsäulenerfassung.
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Die
Verwendung von Lasern oder einer einzelnen, jedem Kanal und/oder
jeder Kapillare zugeordneten, lichtemittierenden Diode macht das
Gerät komplex
und die damit verbundenen Kosten höher. In der Vergangenheit ging
man davon aus, dass die Verwendung einer einzelnen LED für eine Anordnung von
Kanälen
und/oder Kapillaren sich deshalb nicht bewerkstelligen lässt, weil
eine einzelne LED eine unzureichende Abgabe von Licht bieten würde und keine
Leistung hätte,
die hoch genug wäre,
um die Erfassungsfenster einer ganzen Anordnung von Kapillaren und/oder
Kanälen
auf einmal auszuleuchten.
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Fluoreszenzerfassung
in der Kapillarelektrophorese (CE) bietet eine herausragende Empfindlichkeit
im Vergleich zur standardmäßigen UV-Absorptionserfassung.
Die Signale von Fluoreszenzsensoren stehen in Zusammenhang mit dem
Erregungsprobenvolumen und der Ausgangsleistung mit einer spezifischen
Wellenlänge
der Lichtquelle. CE verwendet Kapillaren engen Durchmessers (typischerweise
20–100 μm Innendurchmesser),
was nL zu erfassende Probenvolumina ergibt. Deshalb ist die Ausgangsleistung
der Lichtquellen ausschlaggebend, um eine niedrige Erfassungsgrenze
(LOD-Limit of Detection) zu erzielen, und um den größten Teil der
Probenmoleküle
zu erregen, werden oftmals Lichtquellen mit hoher Leistung verwendet.
Bei den Fluoreszenzerregungslichtquellen kann es sich um eine (Quecksilber-
oder Xenon-) Gasentladungslampe, einen (Gas-, Festkörper-, Farbstoff-
oder Halbleiter-) Laser oder eine lichtemittierende Diode (LED) handeln.
Wurde eine Gasentladungslampe als Fluoreszenzerregungsquelle verwendet,
war die LOD nur 10 Mal niedriger als bei UV-Absorptionssensoren. Der Durchbruch
in der CE-Fluoreszenzerfassung war auf die Einführung des Lasers als Lichtquelle
zurückzuführen. Die
Kohärenzeigenschaft
des Lasers macht es einfach, ihn auf die bei der CE vorhandenen kleinen
Erfassungsfenster zu fokussieren. Ein Ergebnis dieser Fokussierfähigkeit
und der hohen Leistungsabgabe mit einer spezifischen Wellenlänge besteht
darin, dass die Lichtleistungsdichte viel höher als diejenige einer herkömmlichen
Lampe mit einer bestimmten Wellenlänge ist. Einzelmolekülerfassung
wurde unter Verwendung von Sensoren für laserinduzierte Fluoreszenz
(LIF) mit CE nachgewiesen. Im Hinblick auf Multiplex-Kapillarsysteme
wurden mehrere Fluoreszenzerfassungsarten entwickelt. Die meisten
davon verwendeten einen Laser als Lichtquelle, einschließlich Fluoreszenz,
die von einem konfokalen Abtastlaser induziert wird (z. B.
US-Patent Nr. 6,270,644 ),
Hüllenströmungssensoren (z.
B.
US-Patente Nr. 5,468,364 und
6,048,444 ) oder optische
Seiteneinfallserregungsgeometrie (z. B.
US Patente Nr. 5,582,705 und
5,741,411 ).
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Der
Hauptnachteil des Hüllenströmungssensors
ist das höchst
ausgefeilte Strömungssystem, das
gebraucht wird, um eine zuverlässige
Hüllenströmung sicherzustellen.
Es werden extreme Anforderungen an die Toleranzen der optischen
und mechanischen Bauteile gestellt, um die Widerstandsfähigkeitsanforderungen
von Endverbrauchern zu erfüllen.
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Der
abtastende, konfokale Sensor baut auf einer Abtastung des optischen
Systems auf. Der Einsatz beweglicher Teile ist nicht ideal, wenn
man die Einfachheit, die Widerstandsfähigkeit und die niedrigeren
Kosten des Geräts
bedenkt. Das optische Abtastprinzip reduziert auch den Auslastungsgrad
pro Kapillare, was die Empfindlichkeit beeinträchtigen kann, wenn das Gerät zu Zwecken
sehr hohen Durchsatzes weiter vergrößert wird.
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Optische
Seiteneinfallserregungsgeometrieverfahren beleuchten das Innere
mehrerer Kapillaren gleichzeitig und fangen das Licht auf, das von
ihnen abgegeben wird. Wie im
US-Patent
Nr. 5,790,727 bilden die Kapillaren in einer parallelen
Anordnung einen optischen Wellenleiter, in dem eine Brechung an den
zylindrischen Flächen
das Beleuchtungslicht einschränkt,
das in der Ebene der Anordnung zum Kern jeder angrenzenden Kapillare
in der Anordnung geleitet wird. Um eine Lichtstreuung zu mindern,
wurde ein optischer Wellenleiter verwendet. Darüber hinaus wurde eine Laserquelle
mit hoher Leistung benötigt, weil
der Laserstrahl ausgeweitet wurde, um mehrfache Kanäle auszuleuchten.
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LEDs
wurden als Fluoreszenzerregungslichtquellen in der Einzelkanal-CE
verwendet. Zusätzlich
wurde Multiplex-CE mit Fluoreszenzerfassung unter Verwendung von
LEDs als Lichtquellen im
US-Patent
Nr. 6,828,567 offenbart. Dieses System beruht auf denn
Aufbau Multistrahlungsquelle/gemeinsamer Sensor, bei dem die Erfassung
in einer zeitversetzten und/oder Zeitmultiplex-Erfassung für die Kanäle durchgeführt wurde.
Jede Kapillare wurde über
optische Fasern von einer LED beleuchtet. Das aus den Lichtquellen
einfallende Licht wird separat unter Verwendung von optischen Fasern
auf die Multikanalerfassungsbereiche gelenkt. Das von den Multikanalerfassungsbereichen
abgegebene Licht wird auch unter Verwendung optischer Fasern zu
einem oder mehreren gemeinsamen Sensor/en geleitet. Es kann mehr
als einen Sensor bei mehreren Lichtquellen im gesamten Erfassungssystem
geben, wovon jeder mehrere Strahlungsquellen bedient. Die Einschränkungen
dieses Schemas bestehen darin, dass die Anzahl der Multikanäle durch
Zeitversatzstrategien und den Erfassungszyklus aufgrund der Abtastrateneinschränkungen
eingeschränkt
wurde. Deshalb wurde ein System im Handel eingeführt, das nur über bis
zu 12 Kanäle
verfügt.
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LED-Verfahrenstechniken
haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt. Hochleistungsfähige LED-Lichtquellen
zu niedrigen Kosten sind von vielen Handelsquellen erhältlich.
Die Eigenschaften des LED-Lichts unterscheiden sich von Lasern oder herkömmlichen
Lampen. Die LED-Lichtabgabe ist nicht kohärent wie bei der Laserlichtquelle,
LEDs haben aber ein enges Lichtspektrum und eine viel höhere Lichtleistung
als herkömmliche
Lampen mit einer bestimmten Wellenlänge.
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Ein
elektrophoretisches Nachweissystem, welches beispielsweise eine
LED Lichtquelle verwendet, wird in der
US 6,856,390 beschreiben. Das System
zum Erfassen von Analyten in einer Probe, weist eine oder mehrere
Probenkanäle
in einer Erfassungszone auf. Weiter sind eine oder mehrere Beleuchtungsquellen
vorgesehen, die die Erfassungszone mit nicht-kohärenter Strahlung zum Nachweis beleuchten
und auch als LED Lichtquellen ausgeführt sein können. Die Konditionierung des
Lichtes der Beleuchtungsquellen wird mittels eines Filters vorgenommen,
welcher vorbestimmte Lichtfrequenzen unterdrückt. Zudem kann ein Fokusiersystem vorgesehen
sein, welches eine verbesserte Bündelung
der zu untersuchenden Probe bzw. der Erfassungszone bewirkt. Dieses
Fokusiersystem, welches im Sinne eines klassischen optischen Systems
die freie Strahlung durch Luft konditioniert, erweist sich jedoch
als unzufriedenstellend in Bezug auf seine Kollimationseigenschaften,
da LED Lichtquellen bekanntermaßen
eine nur sehr schwach gerichtete Strahlung abgeben.
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Ein
weiteres Elektrophoresesystem beschreibt die
EP 1 055 925 A2 in der Form
einer BioChip-Elektrophoresevorrichtung, in welcher Licht einer
allgemeinen Lichtquelle auf einen Chip aufgestrahlt wird, welcher
zahlreiche Fluoreszenzproben enthält. Die Proben sind entweder
in Punkten oder in vorbestimmten linearen Feldern auf denn Chip
aufgebracht und die Nachweisinformation der analysierten Proben
auf dem Chip wird mittels eines optischen Detektors erfasst. Das
Licht kann von der Lichtquelle mittels einer einfachen optischen
Faser an die Nachweisstelle geleitet werden, um die Kollimationseigenschaften
zu verbessern. Jedoch erweisen sich einfache optische Fasern aufgrund
der relativ starken Strahlungsdivergenz von LED Lichtquellen auch
als nicht hinreichend, um eine ausreichende große Lichtmenge auf die Proben
für eine
rauscharme Fluoreszenzmessung aufstrahlen zu können.
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Eine
weitere Vorrichtung für
die Durchführung
einer Kapillarelektrophorese wird auch in der
DE 696 21 608 T2 beschrieben,
die zudem ein entsprechendes Verfahren offenbart. Auch diese Vorrichtung kann
keine weiterreichende Verbesserung bezüglich der Strahlungskonditionierung
vermitteln.
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Es
ist also zu sehen, dass in der andauernden Verbesserung von Multiplex-CE-Systemen deshalb
ein Bedarf nach einem kostengünstigeren
und von der Auslegung her weniger komplexen System besteht, das
genaue Abtrennung, hohe Auflösung, mit
geeigneter Strahlungskonditionierung und einer empfindlichen Erfassung
zu niedrigen Betriebskosten an den Tag legt. Primäres Ziel
dieser Erfindung ist es, diesen Bedarf zu stillen.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein vereinfachtes, kostengünstiges,
hochempfindliches, für
hohen Durchsatz ausgelegtes Multiplex-Kapillarelektrophoresefluoreszenzerfassungssystem
bereit, das aus einer einzelnen nicht kohärenten Lichtquelle als Erregungslichtquelle
für alle
Kanäle
besteht, welche eine lichtemittierende Diode (LED) ist; Die lichtemittierende
Diode (LED) gibt Licht durch ein Bündel optischer Fasern an ein
Erfassungsfenster mit einem lichtdurchlässigen Fenster zwischen der
lichtemittierenden Diode (LED) und den mehreren Separationskanälen ab,
wobei das Ausgangsende des Bündels
optischer Fasern eine dem Erfassungsfenster ähnliche Form hat, um den Ausleuchtungswirkungsgrad
größtmöglich auszulegen.
Das Bündel
optischer Fasern lenkt das von der LED abgegebene Licht in einem
Winkel von vorzugsweise ca. 45° in
Bezug auf den Kapillaranordnungshalter zum Erfassungsfenster für die Kapillaranordnung.
Die von den Proben am Erfassungsfenster abgegebene Emission wird
von einer Kameralinse aufgenommen und mit einem zweidimensionalen
bilderzeugenden Sensor wie einem ladungsgekoppelten(CCD-) Sensor
aufgezeichnet.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Schemadarstellung eines Multiplex-Elektrophoresesystems der
vorliegenden Erfindung, das eine Fluoreszenzerfassung mit einer
einzelnen LED-Lichtquelle
nutzt, die in einem Winkel als Erregungslichtquelle für die Separationskanäle angeordnet
ist.
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2 stellt
ein 2D-Bild dar, das vom CCD-Sensor ausgegeben wurde.
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3 ist
ein Elektropherogrammergebnis, das eine erfolgreiche Abtrennung
und Erfassung unter Verwendung des Systems von 1 zeigt.
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AUSFÜHRICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORM
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Eine
spezielle Ausführungsform
der Erfindung wird in Zusammenhang mit 1 beschrieben. Es
sollte jedoch klar sein, dass 1 nur beispielhaft ist
und auch andere reale Ausführungsformen
des Systems eingesetzt werden können,
ohne dass dabei vom Rahmen und Aussagegehalt der Erfindung abgewichen
würde.
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Wie
bereits vorher erwähnt,
stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches, kostengünstiges,
effizientes, hochempfindliches und für hohen Durchsatz ausgelegtes
Erfassungssystem bereit, dass allgemein mit 10 angegeben
ist, das auf einem Bündel 12 optischer
Fasern beruht, das dazu verwendet wird, eine einzelne LED-Lichtquelle 14,
anstelle eines kostspieligen Hochleistungslasers in einem Multikanalerfassungssystem, über ein
Fenster 18 Licht mit vorzugsweise einem spitzen Winkel,
wobei der Winkel am bevorzugtesten 45° beträgt, abgeben zu lassen. Der
Winkel dieses Systems ist mit 16, das Fenster mit 18 und
eine Kapillare mit 20 dargestellt. Eine optische Kameralinse 22 wird
zum Auffangen des Fluoreszenzsignals verwendet, das auf einem zweidimensionalen bilderzeugenden
Matrixsensor wie einem ladungsgekoppelten (CCD-) Sensor 24 aufgezeichnet
wird. Zusätzlich
wird eine Pixel-Klasseneinteilung vom Sensor über das Erfassungsfenstersignal
verwendet, um den Rauschabstand des Signals zu verbessern, ohne
dabei Trennungsauflösung
zu verlieren. Wenn das Fluoreszenzsignal aus dem Erfassungsfenster
der Kapillaranordnung oder -matrix zum CCD-Sensor abgebildet wird,
deckt jedes Kapillaremissionssignal mehr als einen Bildpunkt auf
dem CCD-Sensor ab. Beispielsweise stellt 2 ein 2D-Bild
dar, das vom CCD-Sensor während
der Überwachung
des Erfassungsfensterfluoreszenzsignals abgegeben wurde. Das Fluoreszenzlicht
aus dem Erfassungsfenster bestrahlt die mehrfachen Bildpunkte des
CCD-Sensors. Indem die entsprechenden Signale (horizontal und vertikal)
miteinander kombiniert werden, lässt
sich ein höherer
Rauschabstand des Erfassungssignals erzielen.
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Bestimmte
Grenzen und Parameter des Systems sind einer Erwähnung wert. Der Strahlungsfluss der
lichtemittierenden Diode (LED) kann im Allgemeinen 100 mW bis 1000
mW betragen und beträgt
vorzugsweise 700 mW. Obwohl man auch einen höheren Strahlungsfluss zur Erregung
verwenden könnte, um
das Signal zu verstärken,
würde höheres Hintergrundrauschen,
das sich aus der verstärkten
Lichtstreuung an der Kapillarerfassungsfläche ergibt, den Gewinn wieder
wettmachen. Man könnte
deshalb einen höheren
Strahlungsfluss verwenden, wenn sich die stärkere Lichtstreuung senken
ließe.
Licht aus der Diode wird aufgefangen und mit einem Winkel von 20° bis 90°, bevorzugter
von 30° bis
60°, und
am bevorzugtesten mit einem Winkel von ca. 45° auf das Erfassungsfenster 18 abgestrahlt.
Das LED-Licht kann parallel gerichtet und auf das ganze Erfassungsfenster
fokussiert werden; oder es kann ein Bündel optischer Fasern verwendet
werden, um das von der LED-Lichtquelle abgegebene Licht direkt am Erfassungsfenster
zu sammeln. Die Verwendung des Bündels
optischer Fasern ist bevorzugt, weil es schwierig ist, das von der
LED abgegebene Licht so umzuformen, dass es sich der Form des Erfassungsfensters
anpasst. Allerdings kann das Bündel
optischer Fasern so hergestellt werden, dass das Eingangsende einen ähnlichen
Auffangbereich hat wie die LED-Lichtquelle, um den Lichtauffangwirkungsgrad
größtmöglich zu
gestalten, und dass das Ausgangsende eine dem Erfassungsfenster ähnliche Form
hat, um den Ausleuchtungswirkungsgrad größtmöglich auszulegen. Wird das
Bündel
optischer Fasern verwendet, können
Linsen verwendet werden, um das vom Bündel optischer Fasern abgegebene
Licht parallel auf das Erfassungsfenster zu richten. Im Falle, dass
keine Linsen verwendet werden, wird das Ausgangsende des Bündels optischer
Fasen so nah wie möglich
am Erfassungsfenster positioniert, um divergentes abgegebenes Licht
auf ein Mindestmaß zu
reduzieren. Das letztere ist wegen seiner einfachen Auslegung das
bevorzugte Verfahren.
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Bei
den Separationskanälen
kann es sich um eine wie in
1 dargestellte
Kapillarmatrix
28 handeln, oder auch einfach nur um Kanäle, die
in einem Block hergestellt wurden (nicht gezeigt). Ein System, das
erfolgreich verwendet wurde, ist beispielsweise die im
US-Patent Nr. 6,788,414 vom 7. September 2004
von Yeung aufgezeigte 96-Kapillarmatrix.
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Das
System von 1 wurde für die Fluoreszenzerfassung
einer abgetrennten dsDNA-Probe als Beispiel verwendet. Die Siebmatrix
enthielt einen Farbstoff wie Ethidiumbromid, das sich an die dsDNA bindet
und fluoresziert, wenn es durch die Lichtquelle erregt wird. Der
CCD-Sensor zeichnete die aus dem Erfassungsfenster abgegebene Fluoreszenz
auf. Es wurden Software-Algorithmen verwendet, um das abgegebene
Signal zu extrahieren und als Elektropherogramme zu rekonstruieren. 3 stellt
eine Leiterseparation einer dsDNA mit 100 Basispaaren dar. Das System
wies eine mindestens 20 bis 100 Mal bessere Empfindlichkeit auf
als ein von den Kosten her vergleichbares UV-Absorptionserfassungssystem.
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Es
ist also zu sehen, dass die Erfindung zumindest alle ihrer genannten
Ziele erreicht.