DE60218314T2

DE60218314T2 - Thermophiler mikroorganismus bacillus coagulans stamm sim-t dsm 14043 für die herstellung von l(+)-laktat aus fermentierbaren zuckern und deren gemischen

Info

Publication number: DE60218314T2
Application number: DE60218314T
Authority: DE
Inventors: Jaan Simisker; Allan Nurk; Ain Heinaru
Original assignee: Tartu Ulikool (University of Tartu)
Current assignee: Tartu Ulikool (University of Tartu)
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-03-16
Also published as: US7183088B2; RU2003128310A; IL157826A0; RU2288263C2; ES2282388T3; HK1065069A1; ATE354637T1; WO2002074934A8; BR0208110A; AU2002238407A1; EE04529B1; CN1283781C; EP1409642A1; JP4067970B2; KR20030096276A; WO2002074934A1; DE60218314D1; CA2441915A1; US20060040367A1; EP1409642B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung gehört zum Bereich der Biotechnologie und ist für die Herstellung von optisch reinem L(+)-Laktat über mikrobiologische Synthese verwendbar.
STAND DER TECHNIK
Die mikrobiologische Synthese von L(+)-Laktat basiert auf homolaktischer Fermentation, die zu zwei Molekülen Laktat aus einem fermentierten Hexosemolekül führt (zum Beispiel Glukose oder Galaktose).
Die industrielle chemische Synthese von reinem L(+)-Laktat ist bisher nicht gelöst, und daher gibt es keine Alternative zur mikrobiologischen Synthese dieser Verbindung.
In der mikrobiologischen Synthese von L(+)-Laktat ist unter dem Gesichtspunkt der Effizienz des Energieverbrauchs die maximale mögliche Kultivierungstemperatur des mikrobiellen Stamms von entscheidender Bedeutung, wobei eine Einrichtung des Fermentationsprozesses ohne Hochtemperatursterilisationsschritte von Geräten und Fermentationsmedien bevorzugt ist.
In derzeit verfügbaren Prozessen basierend auf der Laktobazillus-Spezies überschreitet die Kultivierungstemperatur 45°C nicht, was eine Kontaminierung mit thermophilen Mikroorganismen nicht ausschließt, wenn die Kultivierung in nährstoffreichen Medien unter nichtsterilen Bedingungen stattfindet (J.H. Litchfield; In Advances in Applied Microbiology; Neidleman S.L. Ed., Vol. 42, S. 45-95, 1996). In Prozessen basierend auf Bacillus coagulans TB/04 beträgt die optimale Kultivierungstemperatur 52°C (T. Payot, Z. Chemaly, F. Fick Enzyme and Microbial Technology, 24, S. 191-199, 1999). In diesem Fall liegt der Nachteil in der Inhibierung des Prozesses bei hohen Zuckerkonzentrationen (über 7,5 %), was die Verwendung dieses Stamms im industriellen Maßstab erschwert.
Der Prototyp der vorliegenden Erfindung ist der mikrobielle Stamm Bacillus coagulans DSM 5196. (US-Patent Nr. 5079164; C12P 7/56, C12R 1/07; Jungbunzlauer Aktiengesellschaft, 1992). In den auf diesem Organismus basierenden Prozessen beträgt die optimale Kultivierungstemperatur 52°C. Es ist möglich, diesen Organismus bei einer anfänglichen Zuckerkonzentration von bis zu 20 % zu kultivieren. Dieser Organismus kann jedoch nur 70 % Glukose oder Sukrose des Wachstumsmediums zu Laktat umwandeln, das heißt weniger als in derzeitigen industriellen Anwendungen (85-90 %).
Weiterhin ist Bacillus coagulans DSM 5196 nicht in der Lage, Stärke zu hydrolysieren, was die Notwendigkeit der Vorbehandlung der Stärke als billiges Rohmaterial (Verflüssigung und Saccharifikation) in einem separaten technologischen Prozess vorschreibt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist der thermophile Mikroorganismenstamm, der bei einer höheren Temperatur wachsen und Laktat produzieren kann, als für analoge Prozesse bisher beschrieben wurde, wobei er resistenter gegenüber hohen anfänglichen Zuckerkonzentrationen ist, Stärke hydrolysieren kann und für die Produktion von L(+)-Laktat sowohl aus fermentierbaren Monosacchariden als auch aus Stärke geeignet ist.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein thermophiler Stamm des Mikroorganismus Bacillus coagulans SIM-7 DSM14043, der aus überhitztem Getreide (Weizen) mit den Merkmalen des mikrobiellen Abbaus isoliert wurde. Weizen wurde gemahlen und Stärke wurde verflüssigt. Das resultierende Hydrolysat mit einem Zuckergehalt von 18-20 % wurde bei 60°C als Anreicherungskultur verwendet. Die weitere Auswahl des mikrobiellen Stamms wurde unter Verwendung von mikrobiologischen Standardverfahren erreicht.
Kulturelle und morphologische Merkmale.
Kolonien des Stamms des Mikroorganismus Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 sind rund mit Buckel, glänzend, lichtdurchlässig und weisen eine glatte Oberfläche, eine trockene Zusammensetzung und einen Durchmesser von 2...3 mm auf. Lange gram-positive stabförmige Zellen bilden Ketten. Zellen sind motil und bilden subterminale ovale Endosporen.
Physiologische und biochemische Merkmale.
Der Mikroorganismenstamm wächst auf den Monosacchariden Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose und auf den Disacchariden Sukrose, Maltose, Zellobiose. Von den Polysacchariden wächst er auf Stärke. Laktose wird nicht fermentiert. Er kann Kasein und Gelatine nicht abbauen.
Er hat einen fermentativen Metabolismus. Er fermentiert Glukose und Stärke zu L(+)-Laktat, ohne CO₂ zu bilden. Eine Bildung von D(-)-Laktat ist nicht vorhanden. Sauerstofftolerant. Katalase-positiv und Cytochrom-c-negativ. Indolbildende Fähigkeit ist nicht vorhanden.
Wachstumstemperatur.
Der Mikroorganismenstamm wächst bei einer Temperatur von bis zu 65°C, und die Wachstumsfähigkeit der Sporen bleibt bei 85°C für mindestens 40 Minuten erhalten. Seine optimale Kultivierungstemperatur beträgt 57°C, und er wandelt fermentierbare Zucker einschließlich Stärke zu hochreinem L(+)-Laktat um, wobei die Ausbeute aus dem metabolisierten Zucker 95 % erreicht. Er ist in der Lage, bei einer Temperatur von bis zu 65°C zu wachsen und L(+)-Laktat zu erzeugen, das ist 5-10°C höher als im Fall der anderen Stämme, über die bisher berichtet wurde.
Identifizierung des Mikroorganismenstamms als Aufgabe der Erfindung.
Durch Verwendung eines gram-positiven mikrobiellen Identifikationssystems der Firma Biolog Inc. basierend auf dem Muster der metabolischen Aktivitäten (GP2 MicroPlate) der Datenbank GP Database (Version 4.01A) wurde der Stamm SIM-7 mit der höchsten Wahrscheinlichkeit (99 %) als Spezies Bacillus thermoglucosidasius identifiziert. Diese Daten stehen jedoch im Widerspruch zu den 16S rRNA-Gensequenzdaten des Stamms SIM-7 (Gene Bank Kontonr. AF346895). Die Genbankdaten weisen auf die nächsten Verwandten des SIM-7-Stamms, den Stamm Bacillus sp HC 15 (AC252329) mit zwei Unterschieden, Bacillus coagulans NCDO 1761 (X60614) mit sechs Unterschieden, Bacillus coagulans IAM 12463 (D16267) mit sieben Unterschieden und Bacillus coagulans JCM2257 (D8313) mit acht Unterschieden der insgesamt 1464 Nukleotide hin. Gleichzeitig unterscheidet sich Bacillus thermoglucosidasius (AB021197) in 131 der getesteten Nukleotide. Dr. Watanabe et al. [Watanabe, K., Kitamura, K., Suzuki, Y. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2066-2073] haben Nukleotidsequenzen eines katabolischen Gens, oligo-1,6-Glukosidase in Stämmen Bacillus thermoglucosidasius KP1006 und Bacillus coagulans ATCC 7050 verglichen. Die Gesamtsequenzähnlichkeit dieser Proteine betrug 59 % (Watanabe et al.). Sowohl die 16S rRNA-Gensequenz als auch die partielle Nukleotidsequenz des oligo-1,6-Glukosidasegens des Stamms SIM-7 zeigen deutlich seine Zugehörigkeit zu der Spezies Bacillus coagulans. Zwischen den Nukleotidpositionen 643 und 1287 dieses Gens des Stamms Bacillus coagulans ATCC 7050 und Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 bestehen nur zwei Unterschiede, die beide zu dem Austausch der Aminosäure Met₃₉₉/Ile bzw. Gln₄₀₂/His führen (entsprechende Nukleotidsequenzen, GeneBank D78342, a an Position 1244 anstelle von g und t an Position 1253 anstelle von a). Folglich ist der Stamm SIM-7 eine nicht-typische thermophile Variante der Spezies Bacillus coagulans, trotz der generellen metabolischen Ähnlichkeit mit der Spezies Bacillus thermoglucosidasus. Der Stamm Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 weist außerdem keine beta-Galaktosidaseaktivität auf und kann, anders als der Stamm Bacillus coagulans DSM 5196 (Kirkovits et al.) nicht auf Laktose wachsen, kann aber auf Galaktose wachsen.
Der Mikroorganismus mit den oben erwähnte Eigenschaften wurde in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Registrierungsnummer DSM 14043 hinterlegt, 08.02.2001.
Die Fähigkeit des Mikroorganismenstamms, bei hoher Temperatur zu wachsen und Dextrine zu verwenden, vereinfacht die Herstellung von Laktat aus Stärke, wobei ermöglicht wird, Saccharifikation der Stärke als separaten technologischen Schritt zu vermeiden, und spart dadurch Glukoamylase, die zur Saccharifikation benötigt wird, und macht den Prozess billiger.
Bei der Fermentierung von partiell verflüssigter Stärke bei einer Temperatur von 57°C nimmt die Mischungsenergie aufgrund der niedrigeren Viskosität des Mediums ab. Die Fähigkeit, mehrere Mono- und Disaccharide zu fermentieren, macht den Stamm für die Herstellung von L(+)-Laktat aus den komplexen Substraten von Zuckern oder aus ihrer Gemischen verwendbar. Wenn Getreide als Stärkequelle verwendet werden, werden die Bedürfnisse des Stamms nach den Mineral- und Stickstoffverbindungen im Wesentlichen durch die von den Getreiden abstammenden Verbindungen gedeckt. Der Mikroorganismenstamm ist gegen hohe Anfangskonzentrationen von Zuckern (17-20 %) im Wachstumsmedium resistent, er akkumuliert Glukose in dem Wachstumsmedium, aber akkumuliert 13-14 % Kalziumlaktat in dem Medium. Dank der besseren Löslichkeit von Kalziumlaktat bei einer höheren Fermentationstemperatur ist es möglich, die Konzentration von Kalziumlaktat auf bis zu 160-170 g 1^-1 zu erhöhen, wenn der Prozess Ca²⁺ zur Neutralisierung beinhaltet.
Verfahren zur Herstellung von (L)+-Laktat aus fermentierbaren Zuckern und ihren Gemischen basiert auf der Kultivierung des Mikroorganismenstamms in dem Temperaturbereich zwischen 53-65°C, wobei die optimale Kultivierungstemperatur 57°C in Medien beträgt, die aus teilweise fermentierbaren Zuckern einschließlich Dextrinen, Stärke und anderen Nährstoffen bestehen. Als Ergebnis der Fermentation beträgt die erhaltene Endkonzentration von L(+)-Laktat 12 % bei einer Ausbeute von 95 %. Die Kultivierung des Mikroorganismenstamms wird ohne Hochtemperatursterilisierung von Geräten und Medium ausgeführt. Unter Verwendung von Getreidemehl als Zuckerquelle bei der Fermentation werden die Bedürfnisse des Mikroorganismenstamms nach Mineral- und Stickstoffverbindungen im Wachstumsmedium durch von dem Getreide abstammende Verbindungen gedeckt.
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
1. Isolierung des thermophilen Stamms des Mikroorganismus Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043.
Der Mikroorganismenstamm wurde aus überhitztem Getreide (Weizen) mit den Merkmalen mikrobiellen Abbaus isoliert. Weizenmasse wurde gemahlen und verflüssigt. Das resultierende Stärkehydrolysat mit einem Zuckergehalt von 18-20 % wurde als Anreicherungskultur bei einer Temperatur von 60°C verwendet. Die Kultur wurde auf die einzelnen Kolonien aufgetragen, die Kolonien mit der Fähigkeit, das Medium zu azidifizieren, wurden aufgenommen und anschließend nach ihrer homolaktischen Fermentationsfähigkeit durch die Abwesenheit von CO₂-Produktion ausgewählt. Die Herstellung von Z(+)-Laktat wurde enzymatisch durch L-Laktat-Dehydrogenase getestet. Unter den thermotoleranten, sauerstoffresistenten und L(+)-Laktat herstellenden Kolonien wurde die reine Kultur von Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 isoliert.
2. Herstellung von L(+)-Laktat
Das Triticale-Mehl (285 g) wurde in einem Liter Wasser suspendiert, und die Stärke wurde mit α-Amylase bei 85°C bis zu DE = 22,5 verflüssigt. Die verflüssigte Stärke wurde mit Glukoamylase bei 60°C saccharifiziert. Nicht-lösliches Fasermaterial und Protein wurde von der sacchararifizierten Stärke durch Zentrifugation getrennt. Zu dem pasteurisierten Überstand mit einem Glukosegehalt von 14,8 g 1^-1 wurde bis zu 0,6 % Hefeextrakt hinzugefügt und als Fermentationsmedium für Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 verwendet. Die gebildete Milchsäure wurde mit dem zu dem Fermentationsmedium hinzugefügten Kalziumcarbonat neutralisiert. Der pH-Wert der Fermentation lag zwischen 5,3-6,2, Temperatur 57°C und Rühren mit 100 Umdrehungen pro Minute. Unter diesen Bedingungen wurde nach 98 Stunden Fermentation eine Endkonzentration an L(+)-Laktat von 12,3 % erreicht. Die Ausbeute an L(+)-Laktat aus metabolisierter Glukose betrug 95,5 %.

Claims

Stamm des Mikroorganismus Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043.
Verfahren zur Herstellung von L(+)-Laktat aus fermentierbaren Zuckern und ihren Gemischen durch Mikroorganismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismenstamm bei einer Temperatur zwischen 53-65°C fermentiert wird und das Fermentationsmedium teilweise fermentierbare Zucker einschließlich Dextrinen und Stärke und anderen Nährstoffen enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des Mikroorganismenstamms bei einer Temperatur von 57°C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des Mikroorganismenstamms ohne Hochtemperatursterilisierung von Geräten und Medien durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Quelle fermentierbarer Zucker Getreidemehl verwendet wird.