DE4316646A1 - Lävansucraseenzym, Verfahren zu dessen Herstellung, Mikroorganismen, die es produzieren und Zusammensetzungen, die es enthalten - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein säure­ beständiges Lävansucraseenzym, auf Mikroorganismen, die es produzieren, ein Verfahren zur Herstellung dieses säurebeständigen Lävansucraseenzyms und auf Zusammen­ setzungen, die es enthalten.

Lävansucraseenzyme katalysieren den Transfer von Fructose. Genauer ausgedrückt katalysieren Lävansucraseenzyme (E.C.2.4.1.10) den Übergang von Fructosylresten aus Sucrose, Raffinose oder Stachyose auf ein geeignetes Cosubstrat, wobei Polymere hergestellt werden, allgemein als Lävane bezeichnet, die verschiedene Mengen an Fructosylresten enthalten, die aus β2→6 Verbindungen bestehen. Lävane finden ein breites Anwendungsgebiet in der chemischen Industrie und Lebens­ mittelindustrie sowie in Medizin und Forschung.

Lävansucraseenzyme wurden von einer Vielzahl von mikrobiellen Ausgangsquellen isoliert, Mikroorganismen wie z. B. Acetobacter suboxydans, Actinomyces viscosus, Aerobacter levanicum, Bacillus amyioliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Glucobacter oxydans, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptomyces griseus, Zymomonas mobilis. In den meisten Fällen liegt das Enzym extrazellulär vor und ist hitzelabil. Eines der wichtigsten Kennzeichen bei der Herstellung von Lävansucraseenzymen ist die Tatsache, daß mindestens 5% Sucrose zu dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden müssen, um die Synthese des Enzyms anzuregen bei der Verwendung von bekannten, Lävansucraseenzyme produzierenden Mikroorganismen.

Dadurch wird es schwierig, das Lävansucraseenzym von dem Nährmedium abzutrennen, da die Viskosität des Nährmediums zunimmt, wenn das Lävan bei der Fermentation hergestellt wird. Daher wird ständig nach Mikroorganismen gesucht, bei denen ein niedriger Gehalt an Sucrose oder überhaupt keine Sucrose zur Herstellung von Lävansucrase benötigt ist.

In der japanischen Patentanmeldung JP-A-52-82781 wird ein Verfahren offenbart zur Herstellung eines extrazellulären Lävansucraseenzyms in Anwesenheit geringer Konzentrationen von Sucrose (0,3 Gewicht-%/Volumen) unter Verwendung von Bacillus licheniformis Stamm AJ 3982 (Institute of Microbial Engineering Hinterlegungsnr. 3373). Bei diesem Enzym wird jedoch noch immer Sucrose benötigt, um induziert und produziert zu werden. Darüber hinaus entwickelt dieses Lävansucraseenzym keine enzymatische Aktivität bei einem pH- Wert von 4,0, wenn es bei einer Temperatur von 55°C gehalten wird. Bei besagter Temperatur entwickelt es nur 50% seiner maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 5,2 und etwa 80% seiner maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7,8. Dieser enge pH-Bereich beschränkt das Anwendungsgebiet dieses Lävansucraseenzyms. Darüber hinaus ist Säurebeständigkeit sehr wichtig für ein breites kommerzielles Anwendungsgebiet des Enzyms.

Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, ein Lävansucraseenzym bereitzustellen, das eine enzymatische Aktivität in einem breiterem pH-Bereich entwickelt als die bekannten Enzyme und das bei sauren pH-Werten beständig ist, bei denen die bekannten Enzyme nicht mehr beständig sind.

Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung ein säurebeständiges Lävansucraseenzym bereit, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zur Spezies Bacillus gehört, und das bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert von 4,0 eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität entwickelt.

Das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung entwickelt darüber hinaus eine nennenswerte enzymatische Aktivität in einem breiten pH-Bereich in Anwesenheit eines Substrats wie z. B. Sucrose. Es entwickelt darüber hinaus bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,3 eine maximale, bei etwa 55°C gemessene enzymatische Aktivität.

Genauer ausgedrückt entwickelt es bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,4 eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagter Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,2 bis etwa 8,0 eine enzymatische Aktivität von mindestens 70% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagter Temperatur und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,8 eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,7 bis etwa 7,2 eine enzymatische Aktivität von mindestens 90% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität.

Das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung hat eine nennens­ werte Wärmebeständigkeit in Anwesenheit eines Substrats wie Sucrose. Es entwickelt darüber hinaus bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55°C bis etwa 64°C eine maximale, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessene enzymatische Aktivität.

Genauer ausgedrückt entwickelt es darüber hinaus bei einem pH- Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis etwa 75°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 45°C bis etwa 68°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 50°C bis etwa 67°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 90% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität.

Das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung ist ein zellgebundenes Enzym. Es hat eine Fructosyl-Transferase- Aktivität und kann somit Fructosylpolymere von Sucrose bilden, die aus β-D(2→6) verbundener Fructose bestehen und die zur "Lävan"-Familie gehören.

Das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung ist kein Sucrose­ induzierbares Enzym, d. h. es benötigt nicht Sucrose, um induziert und produziert zu werden.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Herstellung eines säurebeständigen Lävansucraseenzyms unter Verwendung eines Mikroorganismus ohne Zugabe von Sucrose zum Nährmedium.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung eines säurebeständigen Lävansucraseenzyms umfaßt die folgenden Schritte:

• i) Züchten eines Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, in einem geeigneten Nährmedium durch Bildung einer Fermentationsbrühe, die eine Biomasse umfaßt und ii) Gewinnung des Lävansucraseenzyms aus besagter Fermentationsbrühe,

wobei der Mikroorganismus in Abwesenheit von Sucrose gezüchtet wird.

Die vorliegende Erfindung beabsichtigt auch, einen neuen Mikroorganismus bereitzustellen, der zum Genus Bacillus gehört, der ein säurebeständiges Lävansucraseenzym in Abwesenheit von Sucrose im Nährmedium produziert.

Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung einen neuen Mikroorganismus der Spezies Bacillus licheniformis bereit, der ein säurebeständiges Lävansucraseenzym in Abwesenheit von Sucrose im Nährmedium produziert. Der bevorzugte Mikroorganismus der Spezies Bacillus licheniformis APMC 84 wurde bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Peoria, Illinois, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18962.

Natürliche und künstliche Mutanten und Derivate, die durch natürliche oder genetische Modifikationen des Mikro­ organismuses der Spezies Bacillus licheniformis APMC 84 entstehen, sind auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Das Lävansucraseenzym der vorliegenden Erfindung kann nicht nur vom Stamm Bacillus licheniformis NRRL B-18962 produziert werden, sondern auch von natürlichen oder künstlichen Mutanten und anderen Derivaten dieses Mikroorganismus. Solche Mutanten können durch allgemein bekannte Verfahren erhalten werden, wie z. B. Röntgenstrahlung, ultraviolette Bestrahlung, chemische Mutagene und Gentechnologie.

Das gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellte Lävansucraseenzym wird hergestellt durch Züchten des Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, in einem Nährmedium, das Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen in Abwesenheit von Sucrose und durch anschließendes Gewinnen des Lävansucrase­ enzyms daraus.

Die Bedingungen der Züchtung dieser Mikroorganismen, wie z. B. Bestandteile des Nährmediums, Parameter, Temperatur, pH-Wert, Bewegung, Belüftung, sind für den Fachmann offensichtlich. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose, Maltodextrine, Glycerol, Stärkezuckersirup aus Mais, Stärke, hydrolysierte Stärke oder Mischungen von zwei oder mehr dieser Kohlenstoffquellen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Stärkezuckersirup aus Mais und hydrolysierte Stärke.

Stickstoffquellen, die verwendet werden können, umfassen Sojabohnenmehl, Getreideeinweichflüssigkeit, Kartoffelmehl, Baumwollkernmehl, Fischmehl, Hefe, Hefeextrakt oder Mischungen von zwei oder mehr dieser Stickstoffquellen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Baumwoll­ kernmehl, Hefeextrakt und eine Mischung aus Sojabohnenmehl und Hefeextrakt.

Geeignete Salze umfassen Kaliumsulfat, Mangansulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumcitrat, Kaliumphosphat, Natriummonohydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Natriumcitrat oder Mischungen von zwei oder mehr dieser Salze. Bevorzugte Salze umfassen eine Mischung aus Natriummonohydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid und Natriumcitrat.

Das Medium, das die oben angegebenen Bestandteile enthält, wird auf eine übliche Weise sterilisiert und mit dem geeigneten Mikroorganismusstamm beimpft, vorzugsweise mit dem Stamm B. licheniformis, und noch bevorzugter mit dem Stamm B. licheniformis APMC 84.

Die Anzucht wird aerob durchgeführt durch Schütteln oder Bewegung mit Belüftung, üblicherweise bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 46°C für etwa 6 bis 40 Stunden und bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 8,5. Vorzugsweise wird die Anzucht durchgeführt bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 42°C für etwa 12 bis 30 Stunden und bei einem pH- Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0. Gute Ergebnisse werden erzielt, wenn die Anzucht bei einer Temperatur zwischen etwa 36 und 40°C bei einem pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 8,5 durchgeführt wird.

Nach der Kultivierung entsteht eine Fermentationsbrühe, die eine Biomasse umfaßt. Diese Biomasse, die die Zellen der Mikroorganismen mit dem zellgebundenen Lävansucraseenzym enthält, wird abgetrennt und aus dem Kulturfiltrat gewonnen unter Verwendung von üblichen Verfahren, wie z. B. Zentrifugation, Aussalzung, Ausfällen, Filtration, Ultrafiltration, Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation gefolgt von Ultrafiltration oder Filtration gefolgt von Mikrofiltration.

Die abgetrennte und gewonnene Biomasse wird anschließend gewaschen, vorzugsweise mehrere Male mit Wasser, noch bevorzugter mit entionisiertem, destilliertem Wasser, und homogenisiert. Wiederholtes Waschen der Biomasse hat keine Auswirkung auf die Aktivität des zellgebundenen Lävansucraseenzyms, was zu dem Schluß führt, daß das Enzym fest an die Zelle gebunden ist.

Das Lävansucraseenzym kann, falls notwendig und gemäß den geplanten Anwendungen, zusätzlich gereinigt werden. Solubilisierung des zellgebundenen Enzyms kann erreicht werden in Anwesenheit eines ionischen Detergens, wie z. B. Natriumcholat oder Natriumdodecylsulfat (0,25% bis 2,5%) oder Salzlösungen, wie z. B. Mg⁺⁺ Lösung. Das Enzym kann auch durch Ammoniumsulfat im Bereich von 65-95% der Sättigung bei einer Temperatur von etwa 0°C ausgefällt werden. Falls notwendig kann auch ein Beschallungsverfahren verwendet werden, um das Lävansucraseenzym von den Zellen abzutrennen.

Das Lävansucraseenzym kann zu Zusammensetzungen zubereitet werden, die das in verschiedenen Industrien verwendbare Lävansucraseenzym enthalten, insbesondere in der Lebensmittelindustrie, pharmazeutischen Industrie und chemischen Industrie.

Das Lävansucraseenzym wird gemäß seinen geplanten Anwendungen zubereitet. Gewöhnlich werden auch Stabilisatoren und Konservierungsmittel zu den Enzymzusammensetzungen hinzugefügt. Zum Beispiel kann das Enzym stabilisiert werden durch Zugabe von Glycerol (50 Volumen-%), Ammoniumsulfat (3,2 Mol/l) oder Natriumchlorid (3 Mol/l) zu der wäßrigen Lösung des Enzyms.

Für Anwendungen im Bereich der Medizin kann das Enzym vorzugsweise in gefriergetrockneter Form verwendet werden.

Für Anwendungen in Lebensmitteln kann das Enzym immobilisiert verwendet werden durch physikalische oder chemische Kopplung des Enzyms mit im wesentlichen unlöslichen reaktionsträgen Trägersubstanzen, die deren Verwendung in Durchlaufreaktoren erleichtern. Gewöhnlich ist das Enzym an den Träger gebunden. Materialien, die als Träger verwendet werden, umfassen organische und anorganische Substanzen, wie z. B. poröse granulierte Diatomeenerde, die mit einer Lösung aus Polyamin und Glutaraldehyd behandelt wurde, granulierte Aktivkohle, oberflächenaktive Materialien wie Aluminiumoxid, Kohlenstoff, Ton, Zirconiumdioxid, Titandioxid, Ionen-Austauscherharze, Cellulose oder Glas, chemisch aktivierte Trägersubstanzen wie Cellulose, Agarose, synthetische Polymere, Gele von zum Beispiel Polyacrylamiden, Siliciumdioxid und Stärke, wobei das Enzym in einer Polymermatrix festgehalten ist. Vorzugsweise können ganze Bacillus-Zellen, die das Lävansucraseenzym umfassen, direkt im Immobilisierungsprozeß ohne Isolierung und Reinigung des Enzyms verwendet werden.

Die Zusammensetzungen, die das Lävansucraseenzym der vorliegenden Erfindung enthalten, können entweder in fester oder flüssiger Form verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können zu einem Endprodukt verarbeitet werden, das entweder eine flüssige Lösung, fest, granuliert, ein Pulver oder ein Brei ist.

Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können zur Herstellung von Lävanen aus Zuckern verwendet werden, die Fructosylreste enthalten, wie z. B. Sucrose, Raffinose oder Stachyose. Diese Zucker können aus Rohstoffen gewonnen werden, wie z. B. rohe Zuckerrüben, gereinigter Saft aus zerdrückten oder zerschnitzelten Zuckerrüben, Melasse, Rohrzucker, Rübenzucker, Pflanzenzucker.

Die entstehenden Lävane können Lävane mit hohem Molekulargewicht, Lävane mit niedrigem Molekulargewicht (Fructooligosaccharide) und Fructosylpolymere sein.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele zusätzlich veranschaulicht.

Beispiel 1

Ein Anzuchtmedium, das zur Entwicklung der Impfkultur verwendet wird, wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt: Calciumchlorid 0,02 Gewicht-%/Volumen, Natriumcitrat 0,3%, hydrolysierte Stärke 2,6%, verkauft unter dem Warenzeichen MALTRIN 100 (GPC), Baumwollkernmehl 4,6%, verkauft unter dem Warenzeichen PHARMAMEDIA (TRADERS PROTEIN), Natriummonohydrogenphosphat 0,21% und Natriumdi­ hydrogenphosphat 0,54%. Dieses Anzuchtmedium wird bei 125°C für 30 Minuten in Anzuchtkolben sterilisiert, welche 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben mit drei Ablenkflächen sind, die 50 ml des Anzuchtmediums enthalten. Dann werden sie aus einer gefrorenen Glycerolkultur des Stammes von B. licheniformis APMC 84 beimpft.

Die Anzucht dieses Stammes wird bei 37°C 24 Stunden lang mit einer Rotationsschüttelmaschine bereitet, bevor sie als Quelle der Impfkultur für die Produktionskolben verwendet wird.

Das zur Herstellung des Lävansucraseenzyms verwendete Medium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt: Stärkezuckersirup aus Mais 10,3 Gewicht-%/Volumen, verkauft unter dem Warenzeichen STALEY 200 Stärkezuckersirup aus Mais (A. E. STALEY), Sojabohnenmehl 5,5%, verkauft unter dem Warenzeichen PROMOSOY 100 (CENTRAL SOYA), Hefeextrakt (von UNIVERSAL FOODS CORP) 0,32%, Natriummonohydrogenphosphat 0,7% und Natriumdihydrogenphosphat 0,7%.

Dieses Produktionsmedium wird bei 125°C für 30 Minuten in Produktionskolben sterilisiert, welche 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben mit drei Ablenkflächen sind, die 50 ml des Produktionsmediums enthalten.

Die Menge der Impfkultur beträgt 2 Volumen-%/Volumen. Die beimpften Produktionskolben werden auf einer Rotations­ schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C für 16 bis 20 Stunden inkubiert.

Eine Zunahme der Viskosität wird nicht beobachtet, wenn Lävan in der Fermentationsbrühe hergestellt wird.

Das hergestellte Enzym kann leicht fast ohne Kleben isoliert werden.

Die Biomasse aus den Kolben wird von der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgetrennt, woraufhin die Zellen mit entionisiertem, destilliertem Wasser zweimal gewaschen und homogenisiert werden.

Das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung wird gewonnen. Lävansucraseenzymeinheit (Levan sucrase enzyme unit, LSU) ist als die Menge der Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um ein Mikromol Glucose pro Minute unter den Bedingungen des Versuchs herzustellen.

Die Enzymaktivität wurde unter Verwendung von Sucrose als Substrat gemessen. Zu einem Milliliter einer Enzymteilmenge wurden 7,5 ml eines 0,01 M Citratpuffers hinzugefügt, pH-Wert 5,5, der 60 Gewicht-%/Gewicht Sucrose enthält. Dann wurde das Volumen des Reaktionsgemisches unter Verwendung von destilliertem Wasser auf 10 ml angeglichen und bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach der vorgegebenen Zeit wurde die Enzymreaktion durch Wärmezufuhr bei 95°C für 10 Minuten beendet. Der Glucosegehalt der Reaktionsprodukte wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie festgestellt (High performance liquid chromatographic analysis, HPLC) (K. M. Brobst und H. D. Schobell, 1982, Starch/Stärke, 34, 117-121).

Die Bewertung der Auswirkung des pH-Werts auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms wurde festgestellt, indem die enzymatische Transfructosylationsreaktion nach Inkubation bei 55°C für eine Stunde bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt wurde, d. h. bei 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 und 8,0 unter Verwendung eines geeigneten Phosphatpuffers (0,01 M). Der Gehalt der gebildeten Glucose wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) festgestellt. Die Aktivität wurde berechnet.

Bei 55°C entwickelt sich eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert um etwa 5,5-6,0. Fig. 1 stellt die Auswirkung des pH-Werts auf die Aktivität des Enzyms bei einer Temperatur von 55°C dar. In dieser Figur zeigt die X-Achse den pH-Wert und die Y-Achse die Aktivität ausgedrückt in Prozent der maximalen Aktivität, die sich bei einem pH-Wert von 5,5 und einer Temperatur von 55°C entwickelt. Das Zeichen O stellt die Meßwerte für das Enzym gemäß der Erfindung dar und zu Vergleichszwecken stellt das Zeichen # die Meßwerte der japanischen Patentanmeldung JP-A-52-82781 dar.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung ist im sauren pH-Bereich stabiler als das Enzym, das in besagter früherer japanischer Patentanmeldung offenbart wurde.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung weist bei 55°C und bei einem pH-Wert von 4,0 über 50% seiner maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität auf, während das Enzym des Standes der Technik bei einem pH-Wert von 4,0 und bei besagter Temperatur keine Aktivität zeigte.

Fig. 1 zeigt, daß das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung eine nennenswerte enzymatische Aktivität in einem breiten pH- Bereich in Anwesenheit von Sucrose entwickelt. Es entwickelt bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,3 eine maximale, bei 55°C gemessene enzymatische Aktivität. Genauer ausgedrückt entwickelt es bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,4 eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagter Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,2 bis etwa 8,0 eine enzymatische Aktivität von mindestens 70% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagter Temperatur und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,8 eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,7 bis etwa 7,2 eine enzymatische Aktivität von mindestens 90% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität.

Die Bewertung der Auswirkung der Temperatur auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms wurde festgestellt, indem die Enzymreaktion bei einem pH-Wert von 5,5 nach Inkubation für eine Stunde bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurde, d. h. bei 40°C, 50°C, 55°C, 60°C, 70°C und 80°C.

Das Reaktionsgemisch bestand aus 7,5 ml einer 60% (Gewicht/Volumen) Sucroselösung in 0,01 M Citratphosphat­ puffer bei einem pH-Wert von 5,5 und 1,0 ml gewaschener Biomasse, die 30 LSU/ml Enzymaktivität enthält.

Bei einem pH-Wert von 5,5 entwickelt sich eine maximale Aktivität bei einer Temperatur von etwa 60°C.

Die Auswirkung der Temperatur auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms wird in Fig. 2 gezeigt. In dieser Figur zeigt die X-Achse die Reaktionstemperatur in °C und die Y- Achse die Aktivität ausgedrückt in Prozent der maximalen Aktivität, die sich bei 60°C und bei einem pH-Wert von 5,5 entwickelt. Das Zeichen O stellt die Meßwerte für das Enzym gemäß der Erfindung dar und zu Vergleichszwecken stellt das Zeichen # die Meßwerte der japanischen Patentanmeldung JP-A- 52-82781 dar.

Fig. 2 zeigt, daß das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung eine nennenswerte Wärmebeständigkeit in Anwesenheit von Sucrose aufweist.

Es entwickelt bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55°C bis etwa 64°C eine maximale, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 gemessene enzymatische Aktivität.

Genauer ausgedrückt entwickelt es bei einem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis etwa 75°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 45°C bis etwa 68°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität. Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 50°C bis etwa 67°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 90% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität.

Beispiel 2

Die Auswirkung der Konzentration des Lävansucraseenzyms (LSU/g Sucrose) auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde in verschiedenen Zeitabschnitten bei einer Temperatur von 55°C bei einem pH-Wert von 5,5 gemessen.

In einem typischen Versuch wurden 4,5 g Sucrose in 9,5 ml Wasser mit einer 0,5 ml Teilmenge von Biomasse inkubiert, die verschiedene Anteile des Lävansucraseenzyms enthält, d. h. 4,5, 9,0 und 22,5 LSU bei einer Temperatur von 50°C. In verschiedenen Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die Reaktion wurde durch Erwärmung auf 90°C für 10 Minuten beendet.

Die Zusammensetzung der Produkte wurde durch Hochleistungs­ flüssigchromatographie bestimmt (Tabelle 1).

Tabelle 1

Auswirkung der Lävansucreaseenzymkonzentration (LSU/g Sucrose) auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte

Die Bildungsgeschwindigkeit von Glucose aus Sucrose durch das Lävansucraseenzym stieg mit zunehmender Konzentration des Enzyms an. Ein Gehalt von 35% Lävan wurde in allen Fällen hergestellt. Ein Gehalt von 45% Glucose wurde in allen Fällen hergestellt.

Beispiel 3

Die Wärmebeständigkeit des Enzyms in Anwesenheit eines Substrats ist sehr wichtig für eine weitverbreitete kommerzielle Anwendung des Enzyms. Die Auswirkung der Temperatur auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde bei Temperaturen von 40°C, 50°C und 60°C festgestellt. Das Reaktionsgemisch bestand aus 7,5 ml einer 60% (Gewicht/Gewicht) Sucroselösung in 0,01 M Citratphosphat­ puffer bei einem pH-Wert von 5,5 und 2,5 ml einer Enzymlösung, die 40 Einheiten LSU enthält. In verschiedenen Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die Reaktion wurde durch Erwärmung auf 90°C für 10 Minuten beendet.

Die Produktzusammensetzung wurde durch Hochleistungsflüssig­ chromatographie bestimmt (Tabelle 2).

Tabelle 2

Auswirkung der Temperatur auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte

Die Meßwerte in Tabelle 2 zeigen, daß das Enzym der vorliegenden Erfindung eine gute Wärmebeständigkeit in Anwesenheit eines Substrats zwischen 50 und 65°C bei einem pH-Wert von 5,5 aufweist.

Beispiel 4

Eine hohe Substratkonzentration ist für den kommerziellen Erfolg jeder Umsetzung immer bevorzugt wegen der hohen Energiekosten bei der Verdampfung der Reaktionsprodukte.

Die Auswirkung der Sucrosekonzentration auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde in verschiedenen Zeitabschnitten während der Inkubation der Sucrose mit dem Enzym bei einer Temperatur von 55°C und bei einem pH-Wert von 5,5 untersucht.

Ein Acetatpuffer (0,1 M) wurde bei einem pH-Wert von 5,5 hergestellt, der verschiedene Anteile Sucrose enthält.

Geeignete Anteile des Enzyms wurden zu einer Endkonzentration von 10 LSU/g Sucrose hinzugefügt und bei 55°C inkubiert.

In verschiedenen Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die Enzymreaktion wurde durch Erwärmung auf 90°C für 10 Minuten beendet.

Die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde dann durch Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt (Tabelle 3).

Tabelle 3

Auswirkung der Sucrosekonzentration auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte

Die in Tabelle 3 angeführten Ergebnisse zeigen, daß die Transfructosylation mit zunehmender Sucrosekonzentration anstieg. Das Verhältnis des gebildeten Lävans zu freier Fructose war in jedem Zeitabschnitt bei höherer Substratkonzentration höher verglichen mit dem Verhältnis bei niedrigerer Substratkonzentration. Zum Beispiel liegt das Verhältnis des Lävans zu freier Fructose zwischen 1,4 und 2,2 bei 30% Sucrosekonzentration, während das Verhältnis 4,5- 5,0 bei 75% Sucrosekonzentration beträgt. Das deutet sehr darauf hin, daß die niedrige Wasseraktivität die Lävanherstellung begünstigt.

Claims (18)

1. Säurestabiles Lävansucraseenzym, erhalten von einem Mikroorganismus, der zur Spezies Bacillus gehört, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert von 4,0 eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität entwickelt.

2. Säurestabiles Lävansucraseenzym gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,3 eine maximale, bei etwa 55°C gemessene enzymatische Aktivität entwickelt.

3. Lävansucraseenzym gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus bei etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,4 eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität entwickelt.

4. Lävansucraseenzym gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,8 eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität entwickelt.

5. Lävansucraseenzym gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus bei einem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis etwa 75°C eine enzymatische Aktivität von mindestens 50% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen Aktivität entwickelt.

6. Verfahren zur Herstellung eines säurestabilen Lävansucraseenzyms , das die folgenden Schritte umfaßt

• i) Züchten eines Mikroorganismuses, der zum Genus Bacillus gehört, in einem geeignetem Nährmedium durch Bildung einer Fermentationsbrühe, die eine Biomasse umfaßt und
• ii) Gewinnen des Lävansucraseenzyms aus besagter Fermentationsbrühe,

wobei der Mikroorganismus in Abwesenheit von Sucrose gezüchtet wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus zur Spezies Bacillus licheniformis gehört.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus Bacillus licheniformis NRRL B-18962 ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Schritt (ii) weiterhin umfaßt:

• a) Abtrennen der Biomasse, die die Zellen des Mikro­ organismuses mit dem Lävansucraseenzym umfaßt, von dem Kulturfiltrat, und
• b) Waschen der davon abgetrennten Biomasse.

10. Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, der ein säurestabiles Lävansucraseenzym produziert in Abwesenheit von Sucrose im Nährmedium.

11. Mikroorganismus gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeich­ net, daß er zur Spezies Bacillus licheniformis gehört.

12. Bacillus licheniformis APMC 84, hinterlegt unter der Nummer NRRL B-18962.

13. Zusammensetzung, die das säurestabile Lävansucraseenzym gemäß Anspruch 1 enthält.

14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, die zu einer flüssigen Lösung gemacht wurde.

15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, die zu einem Feststoff gemacht wurde.

16. Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei das Lävansucraseenzym oder die das Lävansucraseenzym enthaltenden ganzen Bacillus-Zellen immobilisiert sind.

17. Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 zur Herstellung von Lävanen.