DD230938A1 - Verfahren zur bestimmung von kappa-ketten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von kappa-Ketten. Es ist die Aufgabe gestellt, durch den Einsatz eines neuen Immunreagenzes die spezifische Bestimmung von normalen und neoplastischen humanen B-Lymphozyten, die membranstaendiges oder zytoplasmatisches Immunglobulin vom kappa-Typ besitzen, sowie die Bestimmung von kappa-Ketten in Koerperfluessigkeiten unter Verwendung an sich bekannter Analysemethoden wesentlich zu verbessern. Die Aufgabe wird geloest durch den Einsatz des monoklonalen Antikoerpers BL-Ig-k/1, der durch das Hybridom H-BL-Ig-k/1 produziert wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Bestimmung von kappa-Ketten

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung humaner kappa-Ketten sowohl in freier als auch in H-kettengebundener Form.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ea ist bereits bekannt, humane kappa-Ketten mit konventionell hergestellten Antiseren nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Antiserenherstellung ist jedoch problematisch. Es ist üblich, Versuchstiere mit individuellen kappa-Ketten oder mit Gemischen von diesen, die aus dem Harn von Patienten mit Leichtkettenkrankheit (Bence-Jones-Plasmozytom) isoliert werden, zu immunisieren. Die so gewonnenen Antiseren enthalten außer den Antikörpern, die mit der kappa-Determinante reagieren, noch eine Vielzahl von Antikörpern, die mit weiteren Determinanten des Immunogens reagieren. Diese Determinanten sind im Regelfall auch auf dem zweiten humanen L-Kettentyp, den larabda-Ketten, ausgeprägt, so daß die konventionell hergestellten Antiseren mit beiden L-Kettentypen reagieren. Um dias zu · vermeiden, müssen die gegen diese Determinanten gerichteten Antikörper durch Adsorption an lambda-Ketten entfernt werden. -Als recht zuverlässige Methode bietet sich dazu die Immunadsorption an trägerfixierte lambda-Ketten, die ihrerseits aus dem Harn von Bence-Jones-Plasmozytom-

patienten isoliert worden sind, an. Diese Prozedur ist insgesamt material- und zeitaufwendig. Sie führt zwar im Endeffekt zu Äntiseren, die spezifisch mit kappa-Ketten reagieren, jedoch haben sie einen niedrigen Titer und sind - bedingt durch das Herstellungsverfahren - teuer. Hinzu kommt, daß die Änti-kappa-Seren oftmals in Spezies hergestellt werden, deren Antikörper durch die Fc-Rezeptoren humaner Lymphozyten und Leukozyten gebunden werden. Der Nachteil solcher Antiseren besteht darin, daß diese Bindung der Antikörper an Fc-Rezeptoren nicht von der antigenspezifischen Bindung unterschieden werden kann. Die mit solchen Äntiseren ausgeführten Verfahren zur Bestimmung von humanen kappa-Ketten sind auf die Bestimmung im Serum oder im Harn beschränkt. Die diagnostisch wichtige Bestimmung des L-Kettentyps von zytoplasmatischen und/oder zellmembrangebundenem Immunglobulin der B-Lymphozyten, besonders der neoplastischen, ist mit solchen Reagenzien nicht möglich. Die Herstellung von Fab₂-Fragmenten wäre ein möglicher Ausweg, verbietet ,sich jedoch aus wirtschaftlichen Gründen.

Es ist weiterhin ein Nachteil der bisher bekannten, auf herkömmliche Weise hergestellten Anti-kappa-Seren, daß es unmöglich ist, sie in allen wichtigen Parametern, wie z.B. der qualitativen Zusammensetzung der Anti-kappa-Antikörper bezüglich ihrer Affinität, identisch zu reproduzieren. Das ist durch die Heterogenität der humoralen Immunantwort der zur Äntiserengewinnung herangezogenen Tiere bedingt. Deshalb ist eine Standardisierung der diagnostischen Methoden zur kappa-Kettenbestimmung mit den bisher hergestellten Immunreagenzien nicht möglich.

Ziel der Erfindung;

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Bestimmung humaner kappa-Ketten zu entwickeln, das leicht vjDllziehbar, reproduzierbar und standardisierbar ist. E3 soll darüber hinaus kostengünstiger als bisher bekannte Verfahren sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch den Einsatz eines neuen Immunreagenzes die spezifische Bestimmung von normalen und neoplastischen humanen B-Lymphosyten, die membranständiges oder zytoplasmatisches Imtnunglobulin vom kappa-Typ besitzen, sowie die Bestimmung von kappa-Ketten in Körperflüssigkeiten unter Verwendung an sich bekannter Analysenmethoden wesentlich zu verbessern.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Bestimmung von normalen und neoplastischen humanen B-Lymphozyten, die membranständiges o.der zytoplasmatisches Immunglobulin vom kappa-Typ besitzen, sowohl in einer Lymphozytensuspension als auch im histologischen Schnittpräparat sowie die Bestimmung von kappa-Ketten in freier oder H-kettengebundener Form in Körperflüssigkeiten unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers BL-Ig-/C/1 erfolgt. Der monoklonale Antikörper BL-Ig-/C/1 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig unter Verwendung des Hybridoma H-BL-Ig-/C/1 kommerziell hergestellt. Der monoklonale Antikörper reagiert auf Grund seiner besonderen Bindungseigenschaften hochspezifisch mit humanen kappa-Ketten, unabhängig davon, ob diese L-Ketten isoliert vorliegen oder in der H-kettengebundenen Form des humoralen, zytoplasmatischen oder lymphozytenmembrangebundenen Immunglobulins vorhanden sind.

Die spezifische Anlagerung de3 monoklonalen Antikörpers BL-Ig-ζΟΊ an das zellmembrangebundene und/oder zytoplasmatische Immunglobulin humaner B-Lymphozyten kann durch an sich bekannte Techniken sichtbar oder anderweitig auswertbar gemacht werden. Dazu kann der monoklonale Antikörper BL-Ig-K/1 direkt mit einem Marker gekoppelt werden. Als Marker kommen Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. FITC oder !ERITC), Radioisotope (z.B. ¹²⁵J), Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, Galaktosidase, Urease), kolloi- . dales Gold oder Partikel anderer Art (z.B. heterologe Erythrozyten, Latexpartikel oder andere synthetische Par-

tikel) in Betracht. Die Ankopplung der Marker an den Antikörper BL-Ig-^I erfolgt in Abhängigkeit von dem verw.endeten Marker kovalent oder adsorptiv. Die Kombination beider Verfahren ist z.B. derart möglich, daß: ein Antikörper (z.B. Anti-Peroxidase-Antikörper) kovalent mit dem BL-Ig-/t7i gekoppelt wird und dieser Komplex immunspezifisch den Marker (in diesem Beispiel Peroxidase) bindet.

Die erfolgte spezifische Reaktion des monoklonalen Antikörpers BL-Ig-/^/1 mit den kappa-Ketten humaner B-Lymphozyten kann aber auch durch eine indirekte Reaktion sichtbar oder anderweitig auswertbar gemacht werden. Hierbei wird der monoklonale Mausantikörper BL-Ig-AVT. durch Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die allerdings keine Kreuzreaktionen mit humanem Immunglobulin zeigen dürfen und ihrerseits mit einem der beim direkten Nachweis genannten Marker gekoppelt sind, sichtbar oder anderweitig auswertbar gemacht. Es ist aber auch möglich, durch solche Anti-Mäusimmunglobulin-Antikörper an den monoklonalen Antikörper BL-Ig-/</1 immunspezifisch einen weiteren Mausantikörper ßz.B. Antiperoxidase-Antikörper) zu binden, der seinerseits einen effektiven Marker ((z.B. Peroxidase) immunspezifisch bindet.

Die zu testenden humanen Lymphozyten können zur Durchführung des erfindungsgemäßen B.estimmungsverfahrens sowohl als isolierte Zellen, wie z.B. in einer Einzelzellsuspension oder nach Anheften der Lymphozyten an die Oberfläche eines speziell präparierten trägers (z,B^:, eines Mikroskopobjektträgers), als auch als Gewebeschnittpräparate ((z.B. Kryostatschnitte). vorliegen, wenn sie in die Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper BE-Ig -/<7'1 eintreten. ._;

Die Reaktion ist an nativen Zellen oder an nach einem schonenden Verfahren fixierten Zellen möglich. Zum Nachweis von zytoplasmstischen Immunglobulin vom kappa-Typ ist die Behandlung der, Zellen mit Methanol oder Azeton notwendig, um ein Eindringen der Nachweisreagenzien zu

ermöglichen. Die Auswertung erfolgt je nach dem verwendeten Marker entweder lichtoptisch mittels Durchlicht- oder Fluoreszenzmikroskopie durch Auszählen oder fotografisches Dokumentieren der kappa-kettenpositiven Lymphozyten oder durch Registrierung der Strahlung der radiomarkierten Kachweisreagenzien in an sich bekannter Weise.

Wird das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von kappa-Ketten, die in freier Form oder als Immunglobulin in Koäcperflüssigkeiten vorliegen Cz.B. in Serum oder Urin), angewendet, so ist es zweckmäßig, die nachzuweisenden und zu quantifizierenden kappa-Ketten durch eine spezifische Reaktion mit dem BL-Ig-f-C/. 1, der dazu an einen festen Träger adsorptiv oder kovalent gekoppelt ist, von den begleitenden Komponenten spezifisch abzutrennen. Die nunmehr in der vorstehend beschriebenen Art gebundenen kapps-Ketten bzw. kappa-kettentragenden Immunglobuline werden dann durch einen zweiten Antikörper, z.B. einen Anti-L-Kettchen-Antikörper, der gegen eine andere Determinants der L-Kette gerichtet ist und dessen Bindung an die kappa-Ketten durch die erfolgte Reaktion mit dem BL-Ig-/</1 nicht behindert wird, nachgewiesen und/oder quantifiziert. Der zweite Antikörper wird dazu mit einem Marker, wie Radioisotope (z.B. J), Enzyme (z.B. Peroxidase) oder Anti-Enzym-Antikörpern (z.B. Anti-Peroxidase-Antikörper)gekoppelt. Das Verfahren ist derart variierbar, daß ein zweiter Antikörper (z.B. Anti-L-Ketten-Äntikörper) an einen festen Träger ge-, koppelt wird und zur Isolierung der L-Ketten benutzt wird. Hierbei erfolgt die Quantifizierung der kappa-Ketten durch den monoklonalen Antikörper BL-Ig-^I, der zu diesem Zweck mit einem Marker vorsehen wird oder indirekt nach einer der oben aufgeführten Methoden bestimmt wird. Die Auswertung erfolgt dabei über die Messung der Strahlung des Radioisotops oder der enzymatischen Aktivität des jeweiligen Markers.

Die auf der Verwendung des monoklonalen Antikörpers BL-Xg-/^/1 mit seinen günstigen Bindungseigenschaften be-

ruhende Verfahren zur Bestimmung von humanen kappa-Ketten zeichnen sich durch ihre Spezifität aus. Dieses Reagens vermeidet zuverlässig unspezifische Bindungen an Fc-Rezeptoren von humanen Lymphozyten und Leukozyten. Wesentliche Vorteile liegen weiterhin in der praktisch unbegrenzten Reproduzierbarkeit dieses von dem Hybridom-H-BL"-Ig-/t/i sezernierten monoklonalen Antikörpers. Die auch auf lange Sicht hin unbegrenzte Möglichkeit der Produktion dieses monoklonalen Antikörpers gestattet es, das auf seiner Verwendung beruhende Verfahren zur Bestimmung von kappa-Ketten zu standardisieren. Es ist jetzt leicht und unaufwendig möglich festzustellen, ob normale oder neoplastische B-Lymphozyten zytoplasmatisches oder zellmembrangebundenes Immunglobulin mit. L-Ketten vom kappa-Typ besitzen. Es können schnell und zuverlässig Aussagen darüber getroffen werden, ob die kappa-kettentragenden Lymphozyten in normaler Häufigkeit vorkommen oder extrem von den Mittelwerten für Uormalpersonen abweichen. Festgestellte Extremwerte sind z.B^:. eine wichtige Entscheidungshilfe, ob es sich beim verstärkten Auftreten von Lymphozyten im Blut um eine monoklonale B-Zellneoplasie handelt, oder ob die Veränderungen andere Ursachen haben.

Weiterhin sind mit monoklonalen Antikörpern BL-Ig-/<71 arbeitende Verfahren besonders geeignet, den Harn von Fatienten auf die Anwesenheit von Bence-Jones-Proteinen vom kappa-Iyp zu testen und bei Patienten-mit kappa-Ketten-Plasmozytom durch Quantifizierung des kappa-Kettengehaltes des Harns den Zustand des Patienten bzw. die Wirksamkeit eingeleiteter therapeutischer Maßnahmen zu kontrollieren. Die Anwendung des monoklonalen Antikörpers BL-Ig-Vi/1 zur Bestimmung von kappa-Ketten soll anschließend an einigen Beispielen er 1 ".'.atert werden.

Anwendungsbeispiele Beispiel 1

Erfassung von normalen oder neoplastischen B>Lymphozyten, die Zelloberflächenimmunglobulin mit kappa-Ketten tragen, mittels BL-Ig-/Vi and indirekter Immunfluoreszenz

1, Mikroskopobjektträger werden durch Beschichtung mit einer geeigneten Substanz (z.B. polykationische BSeagentien wie Poly-L-Lysin oder Poly-dimethyl-diallylammoniumchlorid) so vorbereitet, daß Lymphozyten quantitativ adhärieren.

'2?· Angereicherte Lymphozytenpräparationen werden durch Dichtegradientenzentrifuga.tion aus peripherem Blut oder lymphoiden Gewebe des Probanden hergestellt.

3. Auf die beschichteten Objektträger werden 20/Ul der zu untersuchenden Zellsuspension (ca. 5 σ TO Zellen/ ml) aufgetropft. Die nach 10 min noch nicht adhärenten Zellen werden durch kurzes Eintauchen in gepufferte Natriumchloridlösung (CPBS 0,15 M NaGl, Ο,θΐ Phosphat pH 7,4) abgespült. Alle nachfolgenden Inkubationen der Zellen erfolgen in einer feuchten Kammer bei +4⁰C

C.

4. Inkubation der adhärenten Zellen mit 20/Ul BL-Igin Gebrauchskonzentration für 20 min.

5. Spülen der Präparate durch Einstellen in PBS/O,1 % NaH-, für jeweils 5 min bei +4⁰C Die Waschlösung wird 3-mal gewechselt.

6. Inkubation der Zellen mit 20 ,ul Fluorochrom- (z.B. 5!ITC)-markiertem Anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchskonzentration für 20 min.

7. Dreimaliges Spülen der Präparate iür jeweils 5 min in PBS/O, 1 % NaN₃ bei +4⁰C

8. Auszählen des Anteils der fluoreszenzimmunologisch markierten Lymphozyten mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Beispiel 2.

Erfassung von normalen oder neoplastischen Bi-Ly mp ho zy ten, die Zelloberflächenimmunglobulin mit kappa-Ketten tragen, mittels des monoklonalen Antikörpers BL-Ig-ZC/1 und goldmarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikö'rpern

1. - 5. Gleiches Vorgehen wie in Punkt 1. bis 5. im Beispiel 1.

6. Inkubation der Zellen mit 20/ul goldmarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern in Gebrauchskonzentration für 20 min.

7. Dreimaliges Spülen der Präparate in PBS/0,1 HaH, für jeweils 5'min bei + 4 C.

8. Lichtmikroskopische Auszählung des Anteils der goldmarkierten Lymphozyten an der Gesamtmenge der Lymphozyten. -^:

Beispiel 3

Bestimmung' normaler und neoplastischer B-Lymphozyten, die •Zelloberflächenimmunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ tragen, mittels BL-Ig-/C/1 und enzymimmunologischer Reaktionen

1.-5· Gleiches Vorgehen wie in den Punkten 1. bis 5. im Beispiel 1.

6. Inkubation der Zellen mit 2G/Ul Ziege-anti-Mausimmun-• globulin-Serum in Gebrauchskonzentration für 20 min.

7. Dreimaliges Spülen der Präparate in PBS für jeweils 5 min bei +4⁰C

8. Inkubation der Zellen mit 20/Ul 'Maus-anti-Meerrettichperoxidase-Ancikörpern (z.B. BL-POD/11); in Gebrauchakonzentration für 20 min.

9. Dreimaliges Spülen der Präparate in PBS für jeweils 5 min bei + 4⁰C.

10. Inkubation der Zellen mit 20/Ul Meerrettichperoxidase in Gebrauchskonzentration für 20 min.

11. Dreimaliges Spülen der Präparate in PBS für jeweils 5 min bei + 4⁰C.

12. Zugabe einer Substratlösung, bestehend aus Diaminobenzidintetrahydrochlorid in Tris/HCL-Puffer (pH 7,6) und HpOp? für 5 bis 10 min bei Raumtemperatur.

13. Abstoppen der Reaktion durch Einstellen in kalte

14. Lichtmikroskopische Auszählung der Lymphozyten mit deutlicher Membranmarkierung.

Beispiel 4

Bestimmung normaler und neoplastischer B-Lymphozyten, die Zelloberflächenimmunglobulin mit L-Eetten vom kappa-Typ tragen, nach Fixierung mit Glutardialdehyd mittels enzymimmunologischer Reaktionen:

1 ♦ - 3. Gleiches Vorgehen wie in den Punkten 1. bis 3. im Beispiel 1.

4. Inkubation der Zellen mit 20/Ul 0,05 % Glutardialdehyd für 15 min.

5. Dreimaliges Spülen der Zellen in PBS für jeweils 5 min bei + 4⁰C.

6. Abblocken freier Aldehydgruppen durch Inkubation der Zellen in Glyzinpuffer für 1Q min bei + 4⁰C.

7. Dreimaliges Spülen der Zellen in PBS für jeweils 5 min bei + 4⁰C.

8. Inkubation der Zellen mit 20 ,al BL-Ig-<ΌΛ in Gebrauchskonzentration für 20- min.

9. Dreimaliges Spülen der Zellen in PBS für jeweils 5 min bei + 4°C.

10. Die weitere Behandlung erfolgt wie in den Punkten 6. bis '14. des Beispiels 3 beschrieben.

Beispiel 5

Bestimmung normaler oder neoplastischer B-Iymphozyten, die zytoplasmatisches Immunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ besitzen, mittels BL-Ig-/</1 u.nd indirekter Nachweisreaktionen.

1. Gleiches Verfahren wie in den Punkten 1. bis 3* des Beispiels 1.

2. Fixierung der Zellen durch Behandlung mit kaltem Azeton für 3-10 min.

3. Dreimaliges Spülen der Zellen in PBS.

4. Die weitere Behandlung erfolgt entweder wie in den Punkten 4. bis 7. des Beispiels 1 oder wie in den

Punkten 4. bis 13« des Beispiels 3.

5. Die Auswertung erfolgt durch Auszählung des Anteils der Lymphozyten, die eine Markierung ihres zytoplasmatischen Immunglobulins aufweisen. Die Auswertung erfolgt entweder fluoreszenzmikroskopisch oder mittels Durchlichtmikroskopie.

Beispiel 6

Bestimmung normaler oder neoplastischer B-Lymphozyten, die membrangebundenes und/oder zytoplasmatisches Immunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ besitzen, in histologischen Schnittpräparaten mittels dem monoklonalen Antikörper BL-Ig-K/1 und indirekter Immunfluoreszenz

1. 4-6 ,um starke Kryostatschnitte des zu untersuchenden Gewebes werden für 5 min in Azeton oder Ethanol fixiert und anschließend gründlich mit PBS gespült.

2. Inkubation der Präparate mit 50/Ul BL-Ig-</1 in Gebrauchskonzentration bei + 4⁰C für 60 min.

3. Gründliches Spülen der Präparate mit PBS.

4. Inkubation der Präparate mit einem Fluorochrom (z.B. FITC)-markiertem Anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchskonzentration für 30 min bei + 4⁰C.

5. Gründliches Spülen der Schnittpräparate, Eindecken und fluoreszenzmikroskopische «Auswertung.

Beispiel 7

Bestimmung von normalen und neoplastischen B-Lymphozyten, die metnbrangebundenes und/oder zytoplasmatisch.es Imrnunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ besitzen, mittels BL-Ig-K/I und enzymimmunologischer Reaktionen an Gewebeschnitten.

1 . 4-6/lim starke Kryostatschnitte werden auf Mikroskop-Objektträger aufgezogen und 5 min mit Azeton oder Ethanol fixiert, anschließend gründlich mit PBS gespült.

2. Inkubation der Präparate mit 50/Ul BL-Ig-K/1 in Gebrauchskonzentration für 60 min.

3. Gründliches Spülen der Präparate mit PBS.

4. Blockierung der endogenen Peroxidase, z.B. durch eine Behandlung mit 0,5 % HpO₂-Methanollösung für 10-30 min.

5. Inkubation der Schnitte für 30 min mit einem Anti-Mausimmunglobulin-Serum in Gebrauchsverdünnung.

6. Spülen der Schnitte mit PBS.

7. Inkubation der Schnitte für 30 min mit einem Mausanti-Meerrettichperoxidase-Antikörper (z.B. BL-POD/11) in Gebrauchskonzentration.

8. Spülen der Schnitte mit PBS.

9. Inkubation der Schnitte mit Meerrettichperoxidaselösung in Gebrauchskonzentration für 30 min.

10. Spülen der Schnitte mit PBS.

11. Einstellen der Schnitte in eine Substratgemischlösung, bestehend aus H₂O₂ und Diarninobenzidinhydrochlorid in Tris/HCI-Püffer (pH 7,6) für 10-15 min.

12. Gründliches Spülen der Schnitte mit PBS/0,1 % und Entwässern der Schnitte. Nach Einbettung er-

folgt die lichtmikroskop.ische Auswertung.

Beispiel 8

Bestimmung normaler oder neoplastischer B-Lymphozyten, die Membranimmunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ tragen, mit FITC-markiertem BL-Ig-K/1

1. Gleiches Vorgehen wie in den Punkten 1. bis 3. des Beispiels 1.

2. Inkubation der adhärenten Zellen mit 20/Ul FITC-markiertem BI-Ig-Zi/1 in Gebrauchskonzentration für 20 min.

3. Dreimaliges Spülen der Präparate für jeweils 5 min in PBS/0,1 % NaN₃.

4. Fluoreszenzmikroskopische Auszählung der markierten lymphozyten·

Beispiel 9

Bestimmung normaler und neoplastischer B-Lymphozyten, die Membranimmunglobulin mit L-Ketten vom kappa-Typ tragen, mit goldmarkiertem BL-Ig-/£/1

1.2x10 Zellen werden mit 50 ,ul goldmarkiertem BL-Ig-/C/1 in Gebrauchskonzentration vermischt und für 20 min bei + 4⁰C unter mehrmaligem Aufschütteln inkubiert.

2. Dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS der 1 % Kälberserum und 0,1 % NaSu zugesetzt sind.

3. Eindecken eines Tropfens der resuspendierten Zellen und Auszählen der markierten'Zellen.

Beispiel 10

Bestimmung der Konzentration von kappa-Ketten in Körperflüssigkeiten mittels BL-Ig-K^I im Festphasenradiobindungstest

1. Mikrotiterplatten aus Plaste · (Polystyren oder Polyvinylchlorid) werden mit BL-Ig-/£/1 beschichtet. Dazu wird der Antikörper in PBS gelöst in Konzentrationen von 1 bis 50/Ug/ml eingesetzt. Die Beladung wird bei + 4⁰C für 12 h ausgeführt.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

3. Blockieren unspezifischer Bindungsstellen durch In-Kubation mit 2 % neonatalem Kälberserum für 15 min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

5. Herstellung einer Verdünnungsreihe eines Serums oder einer reinen Präparation von kappa-Ketten mit bekannter Konzentration an kappa-Ketten (kappa-Kettenstandard). Ebenso wird von der Testflüssigkeit eine Verdünnungsreihe hergestellt. Die Verdünnungen erfolgen zweckmäßigerweise in 1 % neonatalem Kälberserum. Jeweils 100/ül der einzelnen Konzentrationen von Standard und Testprobe werden in die beschichtete Mikrotiterplatte eingefüllt und für 12-24 h bei + 4⁰C inkubiert.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

12S

7. Jeweils 100/Ul ^J-markierter Anti-Human L-Ketten-

Äntikörper (z.B. BL-Ig-L/1) werden zugesetzt. Inkubation für 4-12 h bei + 4°C.

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/P3S.

9. Messung der in den einzelnen Vertiefungen gebundenen Radioaktivität in einer Gammastrahlungsmeßkette.

1o. Aufstellung einer Eichkurve an Hand der Zählraten der Verdünnungsreihe des kappa-Kettenstandards

Bestimmung der Konzentration der kappa-Ketten in der Meßprobe mittels der Eichkurve.

Beispiel 11

Bestimmung der Konzentration von kappa-Ketten in Körperflüssigkeiten durch den Antikörper BL-Ig-.</1 mittels Enzymimmuntest.

1. Mikrotiterplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvinylchlorid) werden mit Anti-Human-L-Ketten-Antikö'rpern (z.B. BL-Ig-L/1) beladen. Der Antikörper ist in PBS gelöst (1 - 50/Ug/ml). Die Beschichtung erfolgt durch Inkubation bei + 4⁰C für 12 h.

2. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20 PBS.

3. Blockieren unspezifischer Bindungsstellen durch Inkubation mit 2 % neonatalem Kälberserum für 15 min.

4. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

5. Gleiches Verfahren wie in Punkt 5 des Beispiels 10.

6. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

7. Zum Nachweis der gebundenen kappa-Ketten wird BL-Ig-tf/1, an den kovalent Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörpßr (z.B. BL-POD/11) angekoppelt sind, verwendet. Dazu

werden jeweils 100/ul dieses Antikörperkonjugates pro Vertiefung eingesetzt. Inkubation bei + 4⁰C für 4 bis 12 h.

8. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

9. Inkubation mit jeweils 100/Ul Meerrettichperoxidase- -lösung für 1 h bei + 4⁰C.

10. Dreimaliges Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS.

Tt. Zugabe von jeweils 100/Ul Substratgemisch, bestehend aus H₂O₂ und ortho-Phenylendiamin. Entwicklung 5-60 min.

12. Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 100/Ul 4U H und anschließende photometrische Auswertung.

13. Aufstellung einer Eichkurve an Hand der Extinktionswerte der Verdünnungsstufen des kappa-Kettenstandards. Bestimmung der Konzentration öer kappa-Ketten in der Me3probe mittels dieser Eichkurve.

Claims (8)

1. Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Bestimmung von kappa-Ketten, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikatorreagenz der monoklonale Antikörper BL-Ig-/</1 eingesetzt wird, wobei direkte und indirekte liachweisreaktionen zur Anwendung kommen.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper mit einem Marker gekoppelt ist.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Methode der direkten Immunfluoreszenz gearbeitet wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Methode der indirekten Immunfluoreszenz gearbeitet wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß enzymimtnunologisch gearbeitet wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper BL-lg-K/1 mit kolloidalem Gold markiert wird.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper BL-Ig-κΓ/1 mit einem goldmarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Reagenz sichtbar gemacht wird.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß . der Antikörper BL-Ig-/</1 in einem Festphasenimmunassay eingesetzt wird.