DE602004003842T2

DE602004003842T2 - Verfahren und automatisiertes Microfluidsystem zum Nachweis von Proteinen in biologischen Proben

Info

Publication number: DE602004003842T2
Application number: DE602004003842T
Authority: DE
Inventors: Mountain View CA Deshmukh A Jay
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2024-01-21
Also published as: DE602004003842D1; EP1441229B1; KR100537504B1; KR20040066564A; EP1441229A1; JP3989446B2; JP2004226403A; US20040152200A1; US6989130B2; CN1517712A; CN1254686C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine biomolekulare Nachweisvorrichtung und insbesondere ein automatisiertes Fluidsystem zum Nachweis von Proteinen in einer biologischen Probe.
2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Die meisten diagnostischen Verfahren involvieren einen Hauptschritt des Nachweises, ob ein bestimmtes Protein in einer biologischen Probe existiert. Verschiedene diagnostische Verfahren wie ein Enzym-gebundener Immunosorbentassay(ELISA), Radioimmunassay(RIA), Fluorimetrie, nuklearmagnetische Resonanzspektroskopie und colorimetrische Assays wurden weit verbreitet verwendet, wobei das ELISA-Verfahren das üblichste ist.
Es gibt drei Technologien, die in den Nachweis eines bestimmten Proteins durch ELISA involviert sind: Eine chemische Antigen-Antikörper- Reaktionstechnologie, bei der ein Antikörper, der auf einem Substrat immobilisiert werden kann oder mit einem Enzym markiert werden kann, mit einem Protein von Interesse umgesetzt wird; eine optische Nachweistechnik, bei der eine Farbvariation in dem Substrat, die durch die Umsetzung mit dem Enzym ausgelöst wird, optisch gemessen wird; und eine Fluidhandhabungstechnologie, bei der verschiedene Flüssigkeiten zu einer Mehrfach-Wellplatte in einer vorbestimmten Reihenfolge geliefert werden und die Mehrfach-Wellplatte wird zwischen den Schritten der Bestückung mit den verschiedenen Flüssigkeiten gewaschen.
Die Fluidhandhabungstechnologie setzt aufwändige Manipulationen für jeden Schritt durch einen Fachmann als Betreiber voraus, zum Beispiel das Pipettieren von Flüssigkeit in eine Mehrfach-Wellplatte und das Spülen der Flüssigkeit und nimmt viel Zeit in Anspruch. Daher ist ein automatisiertes Fluidhandhabungsverfahren zur Ermöglichung eines leichteren Proteinnachweises und zur Verringerung der für den Nachweis benötigten Zeit notwendig.
Um dieser Voraussetzung zu entsprechen, wurden verschiedene automatisierte Systeme für das Manipulieren und die Untersuchung von Komponenten in jedem Tank entwickelt, wenn man ein Protein unter Verwendung einer Mehrfach-Wellplatte nachweist.
Die offengelegte koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2003-43554 offenbart ein Mikrofluidsteuerungssystem, das eine Reihe von Kanälen umfasst, die es einem sehr kleinen Anteil von Flüssigkeit ermöglicht, durchgeführt zu werden.
Die offengelegte koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2002-71853 offenbart ein System und ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung verschiedener molekularer Vorgänge in einer Testprobe. Das System umfasst Speichertanks für Flüssigkeiten, eine Signaleinspeisungseinheit, die ein eingehendes Testsignal überträgt, eine Nachweissonde und eine Signalnachweiseinheit.
Das U.S. Patent Nr. 6,033,911 offenbart eine automatisierte Assayvorrichtung, die eine Vielzahl von einstellbaren Lumen umfasst, die so angeordnet sind, um Cluster zu bilden, die getrennt gemäß dem Probenzufluss und -abfluss gesteuert werden. Diese automatisierte Assayvorrichtung umfasst ein einzigartiges Waschsystem, das in der Lage ist, das gesamte Assaysystem zu spülen.
Jedoch können eine Reihe von Assayverfahren einschließlich der Probeninjektion, des Kanalspülens, der Farbstoffinjektion, des Kanalspülens und des Probennachweises nicht vollständig mit den oben beschriebenen konventionellen automatisierten Assayvorrichtungen werden. Zusätzlich setzen die konventionellen automatisierten Assaysysteme bedingt durch deren strukturelle Komplexizität eine getrennte Stromquelle sowie einen Fachbetreuer zur Wartung und Reparatur sowie zum Betreiben voraus. Zudem sind die konventionellen automatisierten Assaysysteme teuer und unökonomisch.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein automatisiertes Fluidsystem zur Verfügung, das ein bestimmtes Protein in einer biologischen Probe durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbentassay (ELISA) nachweist, bei dem eine Reihe von Assayverfahren, beginnend mit der Probeninjektion und am Ende abschließend mit dem Nachweis, mit einer einfachen Struktur automatisiert werden, was den bequemen und schnellen Nachweis eines bestimmten Proteins in einer biologischen Probe ermöglicht, ohne fachlich versierte, ausgiebige Manipulationen durch einen Betreiber notwendig zu machen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein automatisiertes Mikrofluidsystem bereit gestellt, das ein Protein in einer biologischen Probe nachweist, wobei das System das Folgende umfasst: Ein Kartuschentankbauteil, umfassend einen Probentank, einen Farbstofftank und eine Vielzahl von Kontrolltanks, die Kontrolllösungen mit verschiedenen Konzentrationen des Proteins von Interesse enthalten, wobei jeweils der Probentank, der Farbstofftank und die Kontrolltanks eine hydrophobe obere Absperrung, die mit einem Drucklufteinlass verbunden ist, sowie eine hydrophobe untere Absperrung, die mit einem Flüssigkeitsauslass verbunden ist, aufweisen;
ein Kartusche mit einem Mikrofluidkanal, die ein Probennachweisbauteil, eine Vielzahl von Kontrollnachweisbauteilen und ein Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil aufweist, wobei jeweils das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile Einlässe, die jeweils mit den Flüssigkeitsauslässen des Probentanks und der Kontrolltanks verbunden sind, einen Auslass, und Antikörper aufweisen, die auf einer inneren Oberfläche immobilisiert sind, und wobei das Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil einen Farbstoffeinlass, der mit einem Flüssigkeitsauslass des Farbstofftanks verbunden ist, und einen Puffereinlassanschluss aufweist;
einen Speichertank für Druckluft, der mit den Einlässen für Druckluft des Probentanks, der Farbstofftanks und der Kontrolltanks durch Ventile verbunden ist; einen Speichertank für Puffer, der mit den Puffereinlassanschlüssen durch Ventile verbunden ist; und
ein Lesegerät, das den Umfang der Antigen-Antikörperreaktionen in den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen basierend auf den Variationen in der Farbstofffarbe misst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis eines Proteins in einer biologischen Probe unter Verwendung des oben genannten automatisierten Mikrofluidsystems zur Verfügung, wobei das Verfahren das Folgende umfasst:
das Einspeisen von Druckluft durch die Einlässe für Druckluft zur jeweiligen Überführung einer Probe in dem Probentank und von Kontrollen in den Kontrolltanks in das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile zum Induzieren von Antigen-Antikörperreaktionen darin;
das Waschen des Probennachweisbauteils und der Kontrollnachweisbauteile durch das Einspeisen eines Puffers durch den Puffereinlassanschluss;
das Einspeisen von Druckluft durch die Einlässe für Druckluft, um einen Farbstoff in dem Farbstofftank durch das Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil in das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile zu führen;
das Waschen des Probennachweisbauteils und der Kontrollnachweisbauteile durch das Einspeisen eines Puffers durch den Puffereinlassanschluss; und
das Nachweisen, ob das Protein in der biologischen Probe existiert, und das Quantifizieren des Proteins basierend auf den Daten der Farbvariation, die von den Antigen-Antikörperreaktionen in dem Probennachweisbauteil und den Kontrollnachweisbauteilen erhalten werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben genannten und anderen Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden sich durch die detaillierte Beschreibung exemplarischer Ausführungsformen davon unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen ergeben, in denen:
1 eine Darstellung eines Mikrofluidkanals gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine Darstellung eines Mikrofluidkanals ist, der Einlässe für eine Probe, eine Kontrolle, einen Farbstoff und eine Pufferlösung aufzeigt, sowie Antikörper, die an eine innere Oberfläche des Mikrofluidkanals gebunden sind;
3 eine Darstellung einer Kartusche gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
4 eine Darstellung eines automatisierten Fluidsystems gemäß der vorliegenden Erfindung ist, das die Kartusche von 3, einen Speichertank für Druckluft, einen Speichertank für Puffer und eine Nachweiseinheit umfasst; und
5 eine dreidimensionale Darstellung der Kartusche gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Computergrafiken ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein automatisiertes Fluidsystem gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine wegwerfbare Kartusche, einen Speichertank für Druckluft, einen Speichertank für Puffer und eine Nachweiseinheit.
Die Kartusche des automatisierten Fluidsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Probentank, Kontrolltanks und einen Farbstofftank. Hiernach werden der Probentank, die Kontrolltanks und der Farbstofftank kollektiv als ein Kartuschentankbauteil 9 bezeichnet.
Der Probentank enthält eine biologische Probe, die ein Zielprotein von Interesse enthält. Es kann eine biologische Probe, zum Beispiel Blut, Urin, zerebrospinale Flüssigkeit, Speichel, Gewebeflüssigkeit, die ein Zielprotein enthält, das durch einen Enzymgebundenen Immunosorbentassay (ELISA) nachgewiesen werden kann, verwendet werden.
Die Kontrolltanks enthalten eine Kontrolllösung einer bekannten Konzentration des nachzuweisenden Zielproteins. Die Konzentration des Zielproteins in der biologischen Probe kann unter Verwendung einer Kalibrierungskurve der Kontrolllösung berechnet werden.
Der Farbstofftank enthält einen Farbstoff, der spezifisch an das Zielprotein binden kann und einen Antikörper 13 markieren kann (siehe 2), der an die innere Oberfläche eines Mikrofluidkanals gebunden ist, der später beschrieben werden wird. Jeglicher Farbstoff, der ein optisch nachweisbares Signal als Reaktion auf die Umsetzung des Antigens (Zielproteins) mit dem Antikörper 13, der an die innere Oberfläche des Mikrofluidkanals 10 gebunden ist, produzieren kann, kann ohne Einschränkungen verwendet werden. Beispiele von solch einem Farbstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfassen einen fluoreszierenden Farbstoff, einen Chemilumineszenzfarbstoff, einen Phosphoreszenzfarbstoff und Ähnliche.
Die Kartusche, die das Kartuschentankbauteil 9 umfasst, kann aus einem Acrylharz, einem Polyethylenharz, einem Polypropylenharz, etc., hergestellt werden. Die Kartusche kann eine Breite von 5–10 cm, eine Länge von 2–5 cm und eine Höhe von 2–5 cm aufweisen. Der Probentank, die Kontrolltanks und der Farbstofftank können jeweils eine Kapazität von 100–500 μl Flüssigkeit aufweisen.
Das Kartuschentankbauteil 9 umfasst einen Probentank, ein oder zwei Farbstofftanks und zwei oder drei Kontrolltanks.
Jeder der Tanks in dem Kartuschentankbauteil 9 hat eine hydrophobe obere Absperrung 7, die mit einem Einlass für Druckluft 6 verbunden ist, und eine hydrophobe untere Absperrung 9, die mit einem Flüssigkeitsauslass verbunden ist. Diese hydrophoben Absperrungen 7 und 9, die porös sind, können so hergestellt werden, dass es bei Atmosphärendruck nur Luft, nicht aber Flüssigkeit, möglich ist hindurch zu gelangen. Die untere hydrophobe Absperrung 8 kann eine größere durchschnittliche Porengröße als die obere hydrophobe Absperrung 7 aufweisen.
Die oberen und unteren hydrophoben Absperrungen 7 und 8 werden aus Polytetrafluorethylenmembranen hergestellt. Die obere hydrophobe Absperrung 7 hat Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 0,2 μm bis 1 μm. Die untere hydrophobe Absperrung 8 hat Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 2 μm bis 20 μm. Die obere hydrophobe Absperrung 7 ermöglicht es einer vorbestimmten Menge an Flüssigkeit nur dann duchgelassen zu werden, wenn ein Druck aufgetragen wird, der höher ist als der auf die untere hydrophobe Absperrung 8. Zum Beispiel kann, wenn die obere hydrophobe Absperrung 7 einen Porendurchmesser von 0,45 μm aufweist und die untere hydrophobe Absperrung 8 einen Porendurchmesser von 10 μm aufweist, die Erstgenannte Wasser bei einem Druck von 2 Atm durchlassen, wohingegen die Letztere Wasser bei einem Druck von 0,1 Atm durchlassen kann. Die Fugen zwischen den oberen und unteren hydrophobe Absperrungen und jedem der Tanks in dem Kartuschentankbauteil 9 können zum Beispiel unter Verwendung von O-Ringen abgedichtet werden.
Die oberen und unteren Enden von jedem der Tanks in dem Kartuschentankbauteil 9 werden durch die oberen und unteren hydrophoben Absperrungen 7 und 8 abgegrenzt, die unterschiedliche Porengrößen aufweisen, so dass Flüssigkeit in jedem der Tanks nur durch die untere hydrophobe Absperrung 8 austreten kann, nicht aber durch die obere hydrophobe Absperrung 7, wenn ein vorbestimmter Druck über einen korrespondierenden Einlass für Druckluft 6 aufgetragen wird.
Die durch die untere hydrophobe Absperrung 8 entladene Flüssigkeit fließt zum Mikrofluidkanal 10. Der Mikrofluidkanal 10 hat eine Struktur, wie sie in 1 dargestellt wird, welche eine Aufsicht des Mikrofluidkanals 10 ist.
In einem automatisierten Mikrofluidsystem, das in 2 gezeigt wird, das einen Probentank, zwei Farbstofftanks und drei Kontrolltanks umfasst, umfasst der Mikrofluidkanal 10 ein Probennachweisbauteil, drei Kontrollnachweisbauteile und zwei Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteile. Jedes von den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen hat einen Probeneinlass 1 oder einen Kontrolleinlass 2, die jeweils mit den Flüssigkeitsauslässen der Proben- und Kontrolltanks verbunden sind, und einen Auslass 5, und umfassen Antikörper 13, die auf einer inneren Oberfläche immobilisiert sind. Die Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteile haben zwei Farbstoffeinlässe 3, die mit Flüssigkeitsauslässen des Farbstofftanks verbunden sind, und einen Puffereinlassanschluss 4.
Die Antikörper 13, die spezifisch an ein Zielprotein binden, sind an die vier Nachweisbauteile in dem Mikrofluidkanal 10 gebunden. Die vier Auslässe 5 sind mit dem Mikrofluidkanal 10 verbunden, um nach aussen Luft und Flüssigkeit auszustoßen, die in den vier Nachweisbauteilen verwendet wurde.
Die Proben- und Kontrollnachweisbauteile können so hergestellt werden, dass sie das gleiche Volumen aufweisen, so dass jeweils gleiche Volumen einer Probe und einer Kontrolle in die Proben- und Kontrollnachweisbauteile eingespeist werden können, wenn ein gleicher Druck auf sowohl den Proben- wie auch die Kontrolltanks aufgetragen wird. Zusätzlich kann die Länge eines Teils des Mikrofluidkanals zwischen dem Farbstoffeinlass 3 des Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteil und dem Auslass 5 des Probennachweisbauteils zu der Länge eines Teils des Mikrofluidkanals zwischen dem Farbstoffeinlass 3 des Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass 5 von einem der Kontrollnachweisbauteile gleich sein, so dass gleiche Volumen eines Farbstoffes und eines Puffer zu der Probe und der Kontrolle mit der gleichen Geschwindigkeit fließen können, wenn ein gleicher Druck aus dem Einlass für Druckluft 6 aufgetragen wird. Die Länge eines Teils des Mikrofluidkanals zwischen dem Puffereinlassanschluss des Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass des Probennachweisbauteils kann zu der Länge eines Teils des Mikrofluidkanals zwischen dem Farbstoffeinlass des Farbstoff-/Puffer- Einlassbauteil und dem Auslass von einem der Kontrollnachweisbauteile gleich sein.
Der Mikrofluidkanal 10 kann aus einem Substrat aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem Glassubstrat, einem Silikonsubstrat, etc. geformt werden. Der Mikrofluidkanal 10 kann eine Breite von 50–500 μm und eine Tiefe von 10–200 μm aufweisen. Ein Substrat mit dem Mikrofluidkanal 10 wird zum Beispiel mit einem Glaschip kombiniert, der in eine Kartusche platziert wird und unter Verwendung von zum Beispiel O-Ringen abgedichtet wird.
Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Kartuschentankbauteil 9 und der Kartusche, die den Mikrofluidkanal 10 aufnimmt, umfasst das Mikrofluidsystem gemäß der vorliegenden Erfindung einen Speichertank für Druckluft, der mit den Einlässen für Druckluft 6 durch Ventile 11c verbunden ist, einen Speichertank für Puffer, der mit den Puffereinlassanschlüssen 4 durch Ventile 11b verbunden ist, und ein Lesegerät, das den Umfang der Antigen-Antikörperreaktionen in den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen basierend auf den Variationen in der Farbe des Farbstoffes misst.
Druckluft und ein Puffer werden jeweils in dem Speichertank für Druckluft und dem Speichertank für Puffer gelagert. Die Druckluft und der Puffer werden durch eine Pumpe 12 dazu gebracht, in die Kartusche zu fließen, die üblicher Weise mit dem Speichertank für Druckluft und dem Speichertank für Puffer verbunden ist.
Das in dem Mikrofluidsystem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Lesegerät umfasst einen Fotodetektor, der die Daten der Farbvariation für die Probe und die Kontrolle misst, die in dem Mikrofluidkanal 10 umgesetzt werden. Jeglicher üblicher Fotodetektor, der auf dem Gebiet weit verbreitet ist, kann unter der Voraussetzung verwendet werden, dass er ein Fluoreszenzsignal, ein Chemilumineszenzsignal oder ein Phosphoreszenzsignal, etc. nachweisen kann.
Das Mikrofluidsystem gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Flüssigkeitsanschlüsse als Flüssigkeitsaustauschwege zwischen der Kartusche und jeweils dem Speichertank für Druckluft, dem Speichertank für Puffer und anderen externen Vorrichtungen. Die Flüssigkeitsanschlüsse umfassen die Einlassanschlüsse für Druckluft 6, die jeweils oben an den Tanks des Kartuschentankbauteils 9 lokalisiert sind, und ermöglichen es der Druckuft, die aus dem Speichertank für Druckluft geblasen wird, durchgelassen zu werden, den Puffereinlassanschluss 4, der mit dem Mikrofluidkanal 10 verbunden ist, und durch den ein Puffer eingespeist wird, und die Auslässe 5, die mit dem Mikrofluidkanal 10 verbunden sind, und durch die verbrauchtes Gas und Flüssigkeit aus dem Mikrofluidkanal 10 nach aussen ausgestoßen werden.
Die Flüsse an Flüssigkeit durch die Einlassanschlüsse für Druckluft 6, den Einlassanschluss für Puffer 4 und die Auslässe 5 werden durch die Ventile 11a, 11b und 11c gesteuert, die durch ein automatisiertes Steuerungssystem wie einen Computer betrieben werden. Die Ventile 11a, 11b und 11c können mittels eines Computerprogramms wie LabView^® gesteuert werden. Jeder der Flüssigkeitsanschlüsse wird mit einem der Ventile 11a, 11b und 11c gemäß deren Funktion verbunden.
Ventile, die mit den Einlassanschlüssen für Druckluft 6 verbunden sind, sind Dreiwegeventile, die geschlossen werden, um es Aussenluft zu ermöglichen, in die Einlassanschlüsse für Druckluft 6 zu fließen, und werden zu einer Pumpe 12 hin geöffnet, so dass Druckluft in die Einlassanschlüsse für Druckluft 6 eingeht.
Ein Ventil, das mit dem Puffereinlassanschluss 4 verbunden ist, ist ein Zweiwegeventil, das geschlossen wird, um einen Puffer in dern Speichertank für Puffer daran zu hindern, in den Mikrofluidkanal 10 zu gelangen, und es wird geöffnet, um es dem Puffer zu ermöglichen, in den Mikrofluidkanal 10 einzudringen.
Ventile, die mit den Auslässen 5 verbunden sind, sind Zweiwegeventile, die geöffnet werden, um nach außen verbrauchtes Gas und Flüssigkeit aus dem Mikrofluidkanal 10 auszustoßen.
Eine Kartusche gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die das Kartuschentankbauteil 9, den Mikrofluidkanal 10, die Einlässe für Druckluft 6, den Puffereinlassanschluss 4 und die Auslässe 5 umfasst, wird schematisch in 3 gezeigt. Ein dreidimensionales Bild der Kartusche, die unter Verwendung von Computergrafiken dargestellt wird, wird in 5 gezeigt. Die Kartusche (Einsatz, Patrone) ist so konstruiert, dass sie aus dem automatisierten Fluidsystem gemäß der vorliegenden Erfindung zur leichten Messung von Daten der Farbvariation für Proben in der Kartusche und für den leichten Austausch, die Reparatur und die Wartung der Kartusche entnommen werden kann.
4 ist eine schematische Ansicht eines automatisierten Mikrofluidsystems gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, das die Kartusche, den Speichertank für Druckluft, den Speichertank für Puffer und das Lesegerät umfasst.
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung kann, wenn ein Zielprotein in einer Probe unter Verwendung des automatisierten Mikrofluidsystems gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird, die Antigen-Antikörperreaktion durch die Einspeisung von Druckluft durch die Einlassanschlüsse für Druckluft induziert werden, um jeweils die Probe in dem Probentank und die Kontrolle in dem Kontrolltank in die Proben- und Kontrollnachweisbauteile zu führen.
Das Einspeisen von Druckluft wird durch das Anschalten eines Schalters an der Pumpe 12 gestartet, die mit dem Speichertank für Druckluft verbunden ist. Die Pumpe 12 trägt einen vorbestimmten Druck auf den Speichertank für Druckluft und den Speichertank für Puffer auf. In diesem Zustand wird, wenn alle der Ventile 11a, 11b und 11c noch nicht geöffnet sind, die Kartusche nicht durch den Druck beeinflusst. Jedoch fliessen, wenn die Ventile 11c, die mit den Proben- und Kontrolltanks verbunden sind, durch ein automatisiertes Ventilsteuerungssystem geöffnet werden, die Probe und die Kontrolle entlang dem Mikrofluidkanal 10 und erreichen jeweils die Proben- und Kontrollnachweisbauteile, so dass Antigen-Antikörperreaktionen zwischen den Antikörpern, die auf der inneren Oberfläche des Mikrofluidkanals gebunden sind, und den Antigenen (Zielprotein) der Probe und der Kontrolle zustande kommen.
Wenn die Probe und die Kontrolle jeweils vollständig aus den Proben- und Kontrolltanks entladen sind, werden die Ventile 11c, die mit den Einlassanschlüssen für Druckluft 6 und den Proben- und Kontrolltanks verbunden sind, durch das Ventilkontrollsystem geschlossen, die Ventile 11a und 11b, die mit dem Puffereinlassanschluss 4 und den Auslässen 5 verbunden sind, werden geöffnet, so dass der Puffer einfließt und den Mikrofluidkanal 10 füllt, der mit dem Puffereinlassanschluss 4 verbunden ist. So bald der Mikrofluidkanal 10 vollständig mit dem Puffer gefüllt wurde, füllt der Puffer das Kartuschentankbauteil 9 bis zur oberen hydrophoben Absperrung 7. So werden die Proben- und Kontrolltanks sowie die Proben- und Kontrollnachweisbauteile gefüllt und mit dem Puffer gespült.
Nach dem Waschen wird das Ventil 11b, das mit dem Puffereinlassanschluss 4 verbunden ist, geschlossen, und die Ventile 11c, die mit den Einlassanschlüssen für Druckluft 6 und dem Farbstofftank verbunden sind, werden geöffnet, so dass der Farbstoff in dem Speichertank für Farbstoff in den Mikrofluidkanal 10 durch die Farbstoffeinlässe 3 des Farbstoff-/Puffer-Einlassbauteils fließt. Die Abstände zwischen den Farbstoffeinlässen 3 und den Auslässen 5 der Proben- und Kontrollnachweisbauteile sind die selben, so dass gleiche Mengen eines Farbstoffes entlang dem Mikrofluidkanal 10 in die Proben- und Kontrollnachweisbauteile fließen, an denen die Antikörper 13 gebunden sind.
Nachdem die Farbstofflösung vollständig entladen ist, werden die Ventile 11c, die mit dem Farbstofftank und den Einlassanschlüssen für Druckluft 6 verbunden sind, geschlossen, und das Ventil 11b, das mit dem Puffereinlassanschluss 4 verbunden ist, wird geöffnet, um es dem Puffer zu ermöglichen, entlang dem gesamten Mikrofluidkanal 10 zu fließen und den Farbstoff abzuwaschen, der in den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen verblieben ist.
Zuletzt, nach dem Spülen der Kartusche, werden die Daten der Farbvariation für die Probe und die Kontrolle, die jeweils in den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen der Kartusche umgesetzt wurden, durch einen Fotodetektor ausgelesen. Es kann basierend auf den ausgelesenen Daten der Farbvariation festgestellt werden, ob ein bestimmtes Protein in der Probe vorhanden ist. Die Konzentration eines bestimmten Proteins in der Probe kann unter Verwendung einer Kalibrierungskurve der Kontrolle berechnet werden.
So wie es oben beschrieben wird, kann ein automatisiertes Mikrofluidsystem gemäß der vorliegenden Erfindung, das ein bestimmtes Protein in einer biologischen Probe durch ELISA nachweist, eine Reihe von Assayverfahren, angefangen mit der Probeninjektion und endend mit dem Nachweis, mittels einer einfachen Struktur automatisieren, was wiederum einen einfachen und schnellen Nachweis eines bestimmten Proteins in einer biologischen Probe ermöglicht, ohne technisch aufwändige, ausgiebige Manipulationen durch einen Betreiber vorauszusetzen.
Während die vorliegende Erfindung insbesondere unter Bezugnahme auf beispielhafte Ausführungsformen davon gezeigt und beschrieben wurde, werden die Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet verstehen, dass verschiedene Änderungen in der Form und den Details davon ohne Abweichung vom Geist und vom Umfang der vorliegenden Erfindung möglich sind, wie sie durch die folgenden Beispiele definiert werden.

Claims

Ein automatisiertes Mikrofluidsystem, das ein Protein in einer biologischen Probe nachweist, wobei das System das Folgende umfasst: ein Kartuschentankbauteil (9), umfassend einen Probentank, einen Farbstofftank und eine Vielzahl von Kontrolltanks, die Kontrolllösungen mit verschiedenen Konzentrationen des Proteins von Interesse enthalten, wobei jeweils der Probentank, der Farbstofftank und die Kontrolltanks eine hydrophobe obere Absperrung (7), die mit einem Drucklufteinlass (6) verbunden ist, sowie eine hydrophobe untere Absperrung (8), die mit einem Flüssigkeitsauslass verbunden ist, aufweisen; eine Kartusche mit einem Mikrofluidkanal (10), die ein Probennachweisbauteil, eine Vielzahl von Kontrollnachweisbauteilen und ein Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil aufweist, wobei jeweils das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile Einlässe, die jeweils mit den Flüssigkeitsauslässen des Probentanks und der Kontrolltanks verbunden sind, einen Auslass und Antikörper (13) aufweisen, die auf einer inneren Oberfläche immobilisiert sind, und wobei das Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil einen Farbstoffeinlass (3), der mit einem Flüssigkeitsauslass des Farbstofftanks verbunden ist, und einen Puffereinlassanschluss (4) aufweist; einen Speichertank für Druckluft, der mit den Einlässen für Druckluft (6) des Probentanks, der Farbstofftanks und der Kontrolltanks durch Ventile (11c) verbunden ist; einen Speichertank für Puffer, der mit den Puffereinlassanschlüssen (4) durch Ventile (11b) verbunden ist; und ein Lesegerät, das den Umfang der Antigen-Antikörperreaktionen in den Proben- und Kontrollnachweisbauteilen basierend auf den Variationen in der Farbstofffarbe misst.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die obere hydrophobe Absperrung (7) und die untere hydrophobe Absperrung (8) bei Atmosphärendruck nur Luft, nicht aber Flüssigkeit durchlassen.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die obere hydrophobe Absperrung (7) und die untere hydrophobe Absperrung (8) porös sind und die untere hydrophobe Absperrung (8) eine größere durchschnittliche Porengröße als die obere hydrophobe Absperrung (7) aufweist.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 3, wobei die obere hydrophobe Absperrung (7) einen durchschnittlichen Porendurchmesser im Bereich von 0,2 μm bis 1 μm aufweist und die untere hydrophobe Absperrung (8) einen durchschnittlichen Porendurchmesser im Bereich von 2 μm bis 20 μm aufweist.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die obere hydrophobe Absperrung (7) und die untere hydrophobe Absperrung (8) aus porösen Polytetrafluorethylenmembranen hergestellt sind.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, das zusätzlich eine Pumpe (12) umfasst, die mit dem Speichertank für Druckluft und dem Speichertank für Puffer verbunden ist.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile das gleiche Volumen aufweisen.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die Länge eines Teils des Mikrofluidkanals (10) zwischen dern Farbstoffeinlass (3) des Farbstoff/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass (5) des Probennachweisbauteils zu der Länge eines Teils des Mikrofluidkanals (10) zwischen dem Farbstoffeinlass (3) des Farbstoff/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass (5) von einem der Kontrollnachweisbauteile gleich ist.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die Länge eines Teils des Mikrofluidkanals (10) zwischen dem Puffereinlassanschluss (4) des Farbstoff/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass (5) des Probennachweisbauteils zu der Länge eines Teils des Mikrofluidkanals (10) zwischen dem Farbstoffeinlass (3) des Farbstoff/Puffer-Einlassbauteils und dem Auslass (5) von einem der Kontrollnachweisbauteile gleich ist.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, wobei die Ventile (11c), die die Einlässe für Druckluft (6) und den Speichertank für Druckluft miteinander verbinden, Dreiwegeventile sind, die geschlossen werden, um es Aussenluft zu ermöglichen, in die Einlassanschlüsse für Druckluft zu fließen, und zum Speichertank für Druckluft hin geöffnet sind.
Das automatisierte Mikrofluidsystem von Anspruch 1, das zusätzlich ein Steuergerät umfasst, das das Öffnen und Schließen der Auslässe (5) des Probennachweisbauteils und der Kontrollnachweisbauteile steuert.
Ein Verfahren zum Nachweis eines Proteins in einer biologischen Probe unter Verwendung des automatisierten Mikrofluidsystems gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren das Folgende umfasst: das Einspeisen von Druckluft durch die Einlässe für Druckluft (6) zur jeweiligen Überführung einer Probe in dem Probentank und von Kontrollen in den Kontrolltanks in das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile zum Induzieren von Antigen-Antikörperreaktionen darin; das Waschen des Probennachweisbauteils und der Kontrollnachweisbauteile durch das Einspeisen eines Puffers durch den Puffereinlassanschluss (4); das Einspeisen von Druckluft durch die Einlässe für Druckluft (6), um einen Farbstoff in dem Farbstofftank durch das Farbstoff/Puffer-Einlassbauteil in das Probennachweisbauteil und die Kontrollnachweisbauteile zu führen; das Waschen des Probennachweisbauteils und der Kontrollnachweisbauteile durch das Einspeisen eines Puffers durch den Puffereinlassanschluss (4); und das Nachweisen, ob das Protein in der biologischen Probe existiert, und das Quantifizieren des Proteins basierend auf den Daten der Farbvariation, die von den Antigen-Antikörperreaktionen in dem Probennachweisbauteil und den Kontrollnachweisbauteilen erhalten werden.