JP2011517959A - チクングニヤウイルスを検出するための方法 - Google Patents
チクングニヤウイルスを検出するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011517959A JP2011517959A JP2011506292A JP2011506292A JP2011517959A JP 2011517959 A JP2011517959 A JP 2011517959A JP 2011506292 A JP2011506292 A JP 2011506292A JP 2011506292 A JP2011506292 A JP 2011506292A JP 2011517959 A JP2011517959 A JP 2011517959A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- seq
- sequence
- complementary
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
この出願は、2008年4月21日に出願された米国仮出願第61/046,734号の利益を主張する。この関連出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、チクングニヤウイルスの核酸を検出するための診断アッセイに関する。
ウイルスは、感染した雌のカの咬創によって、ヒトからヒトに媒介される。最も一般的なベクターは、Aedes aegyptiおよびAedes albopictusであり、これら2つのベクターは、デング熱を含む、カによって媒介される他のウイルスも媒介する。アジアのタイガーモスキート(Aedes albopictus)も、チクングニヤ熱の媒介のための有効なベクターであることが示されている。この後者の種は、ヒトの間で。それにもかかわらず、2005年および2006年のLa Reunion島での大発生時に、785,000人の人口のほぼ40%が感染したことが明示するように、昆虫に基づく伝播様式は非常に効率的である。(WHO Fact sheet 327号(2008年3月)、非特許文献1および「Information on Aedes albopictus」CDC、Division of Vector−Borne Infectious Diseasesを参照)
チクングニヤウイルスは、Togaviridae科Alphavirus属に分類される。一般的に、アルファウイルスは、約12kbの一本鎖、正のセンスRNA分子からなるゲノムを含む、外被付き粒子である。5’末端は7−メチルグアノシンでキャップされ、3’末端はポリアデニル化される。非構造タンパク質は、ゲノムRNAの5’末端の2/3から直接翻訳される。ゲノムRNAの3’末端の1/3に同じである26S RNAと呼ばれるサブゲノムのプラス鎖のRNAは、マイナス鎖のRNA中間体から転写される。この後者のRNAは、ウイルスの構造タンパク質の合成のためのmRNAの役目を果たす。(非特許文献2)
本明細書で明示的に否定されていなければ、以下の用語は、本開示において以下の意味を有する。
本発明は、生体試料中のCHIKV核酸を検出するために特に有用である組成物(核酸捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ)、方法およびキットを含む。そのような用途に適当なオリゴヌクレオチド配列を設計するために、公知のCHIKV核酸配列を先ず比較して、診断アッセイで試薬の役目を果たすことができるウイルスゲノムの候補領域を同定した。これらの比較の結果、図1に図式的に示す捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用いる検出のための標的として、CHIKVゲノムの異なる領域を選択した。比較した配列の間の比較的少数の変異体を含む配列の部分を、増幅された配列の捕捉、増幅および検出で使用するために適する合成オリゴヌクレオチドの設計の出発点として選択した。
本発明に関連して有用な増幅方法には、以下のものが含まれる。転写媒介増幅(TMA)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、および自己複製型のポリヌクレオチド分子および複製酵素、例えばMDV−1 RNAおよびQ−β酵素を用いる増幅方法。これらの様々な増幅技術をそれぞれ実施する方法は、米国特許第5,399,491号、欧州特許出願公開第0 525 882号、米国特許第4,965,188号、米国特許第5,455,166号、米国特許第5,472,840号およびLizardiら、BioTechnology 6巻:1197頁(1988年)で見ることができる。核酸増幅反応を実施する方法を記載するこれらの文書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
上で示すように、「プライマー」は、核酸増幅反応に関与することができる任意選択で改変されたオリゴヌクレオチドを指す。好ましいプライマーは、鋳型核酸とハイブリダイズすることができ、DNAポリメラーゼ活性で延長することができる3’末端を有する。プライマーの5’領域は、標的核酸に非相補的であってもよい。5’非相補的領域がプロモーター配列を含む場合、それは「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。当分野の技術者は、プライマーとして機能することができる任意のオリゴヌクレオチド(すなわち、標的配列と特異的にハイブリダイズし、DNAポリメラーゼ活性によって伸長が可能な3’末端を有するオリゴヌクレオチド)を改変して、5’プロモーター配列を含むようにすることができ、したがってプロモーター−プライマーとして機能することができるであろうことを理解する。同様に、任意のプロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去、またはそれなしの合成によって改変し、しかもプライマーとして機能することができる。
特異的核酸ハイブリダイゼーションを監視するために用いることができる本質的にいかなる標識系および検出系も、本発明と組み合わせて用いることができる。一群の有用な標識には、放射性標識、酵素、ハプテン、連結オリゴヌクレオチド、化学発光分子、蛍光部分(単独でまたは「消光剤」部分との併用で)、および電子的検出方法に適合する酸化還元活性部分が含まれる。好ましい化学発光分子には、均一保護アッセイと一緒に用いられる、米国特許第5,283,174号でArnoldらが開示する種のアクリジニウムエステル、および単一反応で複数の標的を定量化するアッセイと一緒に用いられる、米国特許第5,656,207号でWoodheadらが開示する種のものが含まれる。これらの特許文書に含まれる開示は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい電子的標識および検出手法は、米国特許第5,591,578号および第5,770,369号ならびに国際特許出願公開第98/57158号に開示され、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明での標識として有用な酸化還元活性部分には、Cd、Mg、Cu、Co、Pd、Zn、FeおよびRuなどの遷移金属が含まれる。
本発明に従うプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含み、任意選択で、それに共有結合される検出可能な標識を含むことができる。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、窒素性複素環塩基または塩基類似体を含み、そこにおいてヌクレオシドは、例えばリン酸ジエステル(phospohdiester)結合によって連結されてポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは従来のリボ核酸(RNA)および/またはデオキシリボ核酸(DNA)を含むことができるが、これらの分子の化学類似体を含むこともできる。プローブの「骨格」は、1つまたは複数の糖−リン酸ジエステル結合、ペプチド−核酸結合(Hyldig−Nielsenら、PCT国際公開第95/32305号によって記載されるように「ペプチド核酸」と呼ばれることもある)、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合またはそれらの組合せを含む、当技術分野で公知である様々な結合で作製することができる。プローブの糖部分はリボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換、例えば2’−O−メチルリボースおよび2’ハライド置換(例えば、2’−F)を有する類似した化合物であってもよい。窒素性塩基は、従来の塩基(A、G、C、T、U)、それらの公知の類似体(例えば、イノシンまたは「I」;The Biochemistry of the Nucleic Acids 5〜36頁、Adamsら編、第11版、1992年を参照)、プリンまたはピリミジンの公知の類似体(例えば、N4−メチルデオキシガウノシン、デアザ−もしくはアザ−プリンおよびデアザ−もしくはアザ−ピリミジン、5または6の位置に置換基を有するピリミジン塩基、2、6または8の位置に改変または交替された置換基を有するプリン塩基、2−アミノ−6−メチルアミノプリン、O6−メチルグアニン、4−チオ−ピリミジン、4−アミノ−ピリミジン、4−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびO4−アルキル−ピリミジン(Cook、PCT国際公開第93/13121号を参照)、ならびに、骨格が、ポリマーの1つまたは複数の残基のための窒素性塩基を含まない「無塩基」残基(Arnoldら、米国特許第5,585,481号を参照)であってもよい。プローブは、RNAおよびDNAでは見られる従来の糖、塩基および結合だけを含むことができるか、または従来の成分および置換(例えば、メトキシ骨格を通して連結される従来の塩基または従来の塩基および1つまたは複数の塩基類似体を含む核酸)の両方を含むことができる。
所望の特性を有する増幅プライマーおよびプローブを設計するための有用なガイドラインが、本明細書で記載される。CHIKV核酸の増幅およびプロービングのための最適部位は、長さがそれぞれ約15個を超える塩基、好ましくは約200個以内の塩基の連続した配列である、2つ、好ましくは3つの保存されている領域を含む。1セットのプライマーまたはプロモーター−プライマーで観察される増幅の程度は、それらの相補的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力、および酵素的に伸長されるそれらの能力を含むいくつかの因子によって決まる。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性はいくつかの因子の影響を受けるので、それらの因子の操作は、その標的に完全に相補的であろうがなかろうが特定のオリゴヌクレオチドの正確な感受性および特異性を決定する。異なるアッセイ条件の影響は当分野の技術者に公知であり、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,840,488号でHoganらによって記載されている。
表1に示すゲノム配列は、CHIKV核酸を増幅および検出するための、本明細書で開示される様々な増幅および検出系の標的ドメインを表す。より具体的には、表1の記載事項は、CHIKV核酸を増幅および検出することができる配列を表す。これは、例えば、第一のプライマーの標的相補的3’末端配列(すなわち、DNAポリメラーゼによる伸長のための基質)が、表の配列の少なくとも15個の連続した塩基に相補的な配列からなる、2つのプライマーの対向セットを用いて達成することができる。当然、当業者は、異なる長さの範囲も実行可能であることを理解する。例えば、好ましい長さ範囲には、表の配列の15〜48個の連続した塩基、より好ましくは15〜40個の連続した塩基、より好ましくは17〜40個の連続した塩基、より好ましくは28〜40個の連続した塩基、または18〜31個の塩基が含まれる。鋳型として表の配列の1つを用いる第一のプライマーの伸長生成物は、第二のプライマーの標的を定義する。したがって、第二のプライマーの標的相補的配列は、鋳型として表の配列を用いる場合、第一のプライマーの伸長生成物に相補的な配列からなることができる。第二のプライマーのための好ましい長さ範囲は、第一のプライマーで用いるものに一般に類似している。同じく、第二のプライマーは、その標的鎖と少なくとも15個の連続した塩基の相補性を一般に有する。27〜34個の連続した塩基の範囲の第二のプライマー、および17〜24個の連続した塩基の相補性を用いて良好な結果が得られたので、それらも好ましい。同じく、すべてのプライマーの標的相補的3’末端配列(すなわち、DNAポリメラーゼによる伸長のための基質)は、少なくとも15個の連続した塩基の配列をそれらの標的配列に一致させることが一般に好ましい。標的配列は、本明細書で開示される配列によって、またはそれらの相補体(示すように)によって定義することができる。当然、いずれのプライマーも、その5’末端にCHIKV標的配列に相補的でない追加の塩基(例えば、ファージプロモーター配列)を含むことができる。特定の適用において、表の配列は、下に記載の方法によって合成されるアンプリコンの配列に対応する。好ましい実施形態では、2つの対立するプライマーのためのプライマー結合部位は、CHIKV標的核酸またはその相補体に沿っていかなる位置も共有しない。換言すると、増幅がプライマーの伸長によって達成される(すなわち、リガーゼ媒介反応と区別される)実施形態では、CHIKV標的核酸の配列に沿った塩基位置(またはその相補体)のいずれも、対向する両プライマーによって共通されない。
増幅反応を行うために有用なプライマーは、標的結合に関与せず、増幅または検出手順に実質的に影響を及ぼすことができない無関係な配列の存在を受け入れるために、異なる長さを有することができる。例えば、本発明に従って増幅反応を実施するために有用なプロモーター−プライマーは、CHIKV標的核酸とハイブリダイズする最小限の配列、およびその最小限の配列の上流に置かれたプロモーター配列を少なくとも有する。しかし、標的結合性配列とプロモーター配列との間への配列の挿入は、増幅反応でその有用性を損なうことなく、プライマーの長さを変えることができるであろう。さらに、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が所望の相補的配列をハイブリダイズさせるための最小限の必須要件に適合する限り、選択の問題である。
本発明の別の態様は、CHIKV核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる、オリゴヌクレオチドに関する。CHIKVの核酸に存在する標的核酸配列を増幅する方法は、アンプリコンを検出するための任意選択のさらなる工程を含むことができる。この方法は、標的核酸配列またはその相補体と優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと試験試料とをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出のために安定しているプローブ:標的二重鎖を形成する工程を好ましくは含む。次に、試験試料中のCHIKV核酸の有無の指標として試験試料中にハイブリッドが存在するかどうかについて判定する工程がある。これは、プローブ:標的二重鎖を検出することを含むことができ、好ましくは均一アッセイ系を含むことができる。
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上での固定化のための標的の役目を果たす第二の配列(すなわち、「テール」配列)に共有結合されるCHIKV配列(すなわち、「CHIKV標的配列」)に相補的である第一の配列を含む。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結する任意の骨格を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのメトキシ結合を骨格に含む。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの3’末端にあるテール配列は、相補的塩基配列とハイブリダイズして、生体試料中の他の成分に優先してハイブリダイズされた標的CHIKV核酸を捕捉するための手段を提供するために用いられる。
本発明の好ましい方法は、下に示す実施例によって記載および例示する。図1は、CHIKVゲノム(水平の太い実線によって示す)の標的領域を検出するために用いることができる1つの系を模式的に図示する。この系は、4つのオリゴヌクレオチド(より短い実線によって示す)を含む:標的領域中のCHIKV配列と特異的にハイブリダイズする配列、および生体試料に存在する標的領域を捕捉する、固体支持体上に固定される相補的配列とハイブリダイズするテール(「T」)を含む1つの捕捉オリゴヌクレオチド;標的領域中のCHIKV配列と特異的にハイブリダイズする配列、および、二本鎖の場合T7 RNAポリメラーゼのための機能的プロモーターの役目を果たすT7プロモーター配列(「P」)を含む1つのT7プロモーター−プライマー;T7プロモーター−プライマーを用いて標的領域配列から作製される第一鎖のcDNAと特異的にハイブリダイズする配列を含む1つの非T7プライマー;ならびに、2つのプライマーを用いて増幅される標的領域の部分と特異的にハイブリダイズする配列を含む1つの標識プローブ。
本発明は、ウイルス核酸鋳型を用いてポリヌクレオチド増幅反応を実施するためのキットも包含する。特定の好ましいキットは、塩基の標的相補的配列、および任意選択で、検出される標的を増幅するためのプライマーまたは他の補助的オリゴヌクレオチドを含む、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む。他の好ましいキットは、インビトロの増幅反応で標的核酸を増幅するために用いることができる、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。例示的なキットは、増幅されるCHIKV核酸配列の反対鎖に相補的である第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む。キットは、1つまたは複数のオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含むことができる。本発明に従うさらに他のキットは、増幅の前に他の種からCHIKV鋳型核酸を分離精製するための、捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
CHIKV核酸の増幅
高力価ウイルス溶解物は、反対セットのプライマーを用いた増幅反応で、CHIKV鋳型配列の原料の役目を果たした。ウイルス陰性緩衝液を用いて、0〜10PFU/mlに等しい核酸に対応する希釈溶液系を調製した。上に示した配列を有するCHIKV標的捕捉オリゴヌクレオチドを用いて鋳型を捕捉したことを除き、国際特許出願公開第PCT/US2000/18685号に開示されている手順に基本的に従う増幅の前に、核酸を試料処理および標的捕捉にかけた。特に、捕捉オリゴヌクレオチドは、アッセイの増幅または検出工程に関与しない。磁気ビーズ上のオリゴヌクレオチドを捕捉するために、核酸放出およびハイブリダイゼーションを促進するために、0.5mlの量のウイルス含有試料を標的−捕捉試薬と合わせた。TMA反応は、米国特許第5,399,491号にKacianらによって記載されるように基本的に実施し、この米国特許の開示は参照により上で本明細書に組み込まれている。100μlの反応緩衝液中の約10ピコモルの各プライマーを用いて、様々なプライマー組合せについて増幅反応を実施した。単離した標的核酸を標準の核酸増幅緩衝液中でプライマーと合わせ、60℃に10分間加熱し、次に42℃に冷却してプライマーアニーリングを促進した。次に、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素(5,600単位/反応)およびT7 RNAポリメラーゼ(3,500単位/反応)を混合液に加えた。当分野の技術者がよく知るように、KCl、デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、リボヌクレオシド5’−三リン酸、N−アセチル−L−システインおよび5%(w/v)グリセロールを含むトリス緩衝液(pH8.2〜8.5)で増幅反応を実施した。
CHIKV核酸の増幅および検出のための好ましいドメイン内の代替アッセイ設計
前の実施例は、異なるレベルの感受性のCHIKV核酸を増幅および検出するために用いることができる多数の異なる系を証明した。以下の実施例は、例示目的のために系14によって増幅した標的領域を用いた個々のアッセイの設計の柔軟性を例示する。
アッセイ設計の柔軟性
以下の方法は、上に示す配列番号14によって例示される標的領域に含まれるCHIKV核酸配列を増幅および検出するための代替戦略を証明した。すべての例で、陰性対照反応の平均RLU読取値に加えて3つの標準偏差を用いてカットオフを確立することによって、反応割合を判定した。2の値の下の読取値は、陰性と評価した。表に示すデータは、このカットオフに基づく。表のシグナル値は、化学発光シグナル読取値を示す。
異なる増幅系の感度の定量化
配列番号128、配列番号129および配列番号148を増幅オリゴヌクレオチドとして用い、配列番号164をハイブリダイゼーション検出プローブ(すなわち、元の系14アッセイからのオリゴヌクレオチド)として用いて実施したアッセイからの結果を用いて、ウイルス溶解物の核酸標的濃度を確立することができた。簡潔には、溶解物試料(すなわち、PFU/mlで測定)およびインビトロ転写産物(すなわち、コピー数/mlで測定)の確率95%の検出を相関させることによってこれは達成された。特に、この方法で用いたインビトロ転写産物は、用いたウイルス溶解物を原料鋳型として用いて合成された。したがって、溶解物中の標的の配列は、インビトロ転写産物の配列と一致した。この手法によって、1PFUがCHIKV核酸標的の約7,000コピー数に対応すると推定することが可能であった。
Claims (81)
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、
前記セットの第一のメンバーは、長さが100個までの塩基であり、配列番号14に含まれる少なくとも15個の連続した塩基に相補的であり、
配列番号14からなるポリヌクレオチドが鋳型依存性プライマー伸長反応の鋳型である場合、前記セットの第二のメンバーは長さが100個までの塩基であり、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの第一のメンバーの伸長生成物の少なくとも15個の連続した塩基に相補的である、工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかを検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す、工程と
を含む方法。 - 工程(c)で検出される前記増幅生成物が、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの1メンバーの17個の連続した塩基、および増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの他のメンバーの17個の連続した塩基の相補体を含む一本鎖核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の増幅オリゴヌクレオチドが、長さが55個までの塩基であり、前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号68の19個の連続した塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の増幅オリゴヌクレオチドの3’末端配列が配列番号108である、請求項3に記載の方法。
- 前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号148、配列番号170、配列番号172および配列番号173からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記検出工程が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号164、配列番号184および配列番号185からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 工程(c)が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記CHIKV核酸配列の濃度が26コピー数/ml〜約3,400コピー数/mlの範囲である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は少なくとも95%である、請求項3に記載の方法。
- 工程(c)が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記CHIKV核酸配列の濃度が26コピー数/ml〜約200コピー数/mlの範囲である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は少なくとも95%である、請求項3に記載の方法。
- 工程(c)が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記CHIKV核酸配列の濃度が約100コピー数/mlと約3,400コピー数/mlとの間である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は、少なくともほんの95%である、請求項3に記載の方法。
- 第一の増幅オリゴヌクレオチドの3’末端塩基配列が配列番号108であり、工程(c)が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記CHIKV核酸配列の濃度が26コピー数/ml〜約200コピー数/mlの範囲である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は少なくとも95%である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の増幅プライマーが、配列番号108の上流に位置するファージT7プロモーター配列を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号68の19個の連続した塩基または配列番号84の17個の連続した塩基を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号148、配列番号174および配列番号176からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号164である、請求項11に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号183である、請求項11に記載の方法。
- 前記第一の増幅オリゴヌクレオチドが、長さが55個までの塩基であり、前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号84の17個の連続した塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号174、配列番号175および配列番号176からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第二のメンバーが、配列番号186の配列に含まれる17〜20個の連続した塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第二のメンバーが、配列番号148、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175および配列番号176からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 塩濃度が0.6〜0.9Mの範囲にある場合、42℃のストリンジェントな条件下で、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第一のメンバーが、配列番号14からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第二のメンバーが、同じストリンジェントな条件下で前記伸長生成物とハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 前記カットオフ値が、(i)前記CHIKV核酸配列の既知の濃度を用いて実施される複数の増幅反応、および(ii)前記CHIKV核酸配列の不在下で実施される複数の陰性対照増幅反応で得られる結果の統計分析によって決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記カットオフ値が、前記CHIKV核酸配列を含まない陰性対照反応の平均ハイブリダイゼーションシグナル読取値、加えて前記CHIKV核酸配列を含まない陰性対照反応の3つの標準偏差を用いる統計分析によって決定される、請求項1に記載の方法。
- チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号48の15〜48個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号48の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号186の15〜47個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号186の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、
(i)長さが15〜47塩基数であって、配列番号187の配列中に完全に含まれるか、
(ii)長さが15〜39塩基数であって、配列番号68の配列中に完全に含まれるか、または
(iii)長さが15〜40塩基数であって、配列番号84の配列中に完全に含まれるかのいずれかである、請求項24に記載のキット。 - 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが40塩基数までであって、配列番号84の15〜40個の連続した塩基を含む、請求項24に記載のキット。
- 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号108である、請求項24に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号187の配列中に完全に含まれる、請求項27に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが40塩基数までであって、配列番号84の15〜40個の連続した塩基を含む、請求項28に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号68の配列中に完全に含まれる、請求項28に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号148、配列番号170、配列番号171、配列番号172および配列番号173からなる群から選択される、請求項28に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号164からなる、請求項31に記載のキット。
- 前記第一のプライマーが前記任意選択の第一プライマー5’配列を含み、前記第一プライマー5’配列がファージT7プロモーター配列を含む、請求項27に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号84の配列中に完全に含まれる、請求項27に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号174、配列番号175および配列番号176からなる群から選択される、請求項34に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号184および配列番号185からなる群から選択される、請求項35に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号68に完全に含まれる、請求項24に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号84に完全に含まれる、請求項24に記載のキット。
- 長さが100塩基数までであって、配列番号186の15〜47個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含み、前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号186の配列に完全に含まれ、前記第三のプライマーが、CHIKV核酸に相補的でない第三プライマー5’配列を任意選択で含み、前記第三のプライマーが前記第二のプライマーと異なる、請求項24に記載のキット。
- 互いに異なる前記第二および第三の各プライマーが、配列番号187の15〜47個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む、請求項39に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号148である、請求項40に記載のキット。
- 前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173からなる群から選択される、請求項41に記載のキット。
- 互いに異なる前記第二および第三の各プライマーが、配列番号84の15〜40個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む、請求項39に記載のキット。
- チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号31の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号31の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号51の15〜40個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号51の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)長さが100塩基数までで、配列番号52の15〜38個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号52の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第三プライマー5’配列を任意選択で含む第三のプライマーと、
(d)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ組成物と
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号91である、請求項44に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号131である、請求項44に記載のキット。
- 前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号132である、請求項44に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブ組成物が、長さが39塩基数までで配列番号70の15〜39個の連続した塩基を含む第一のハイブリダイゼーションプローブ、および長さが39塩基数までで配列番号71の15〜39個の連続した塩基を含む第二のハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項44に記載のキット。
- 前記第一のハイブリダイゼーションプローブが配列番号150を含み、前記第二のハイブリダイゼーションプローブが配列番号151を含む、請求項48に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号31の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号31の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号51の15〜40個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号51の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(iii)長さが100塩基数までで、配列番号52の15〜38個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号52の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第三プライマー5’配列を任意選択で含む第三のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。 - チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号32の15〜46個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号32の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号53の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号53の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号92である、請求項51に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号133である、請求項51に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが42塩基数までであって、配列番号72の15〜42個の連続した塩基を含む、請求項51に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号152を含む、請求項54に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号32の15〜46個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号32の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号53の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号53の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す、工程と
を含む、方法。 - チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号36の15〜51個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号36の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号57の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号57の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号96である、請求項57に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号137である、請求項57に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが37塩基数までであって、配列番号75の15〜37個の連続した塩基を含む、請求項57に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号155を含む、請求項60に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号36の15〜51個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号36の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号57の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号57の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。 - チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号37の15〜37個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号37の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号58の15〜38個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号58の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号97である、請求項63に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号138である、請求項63に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが44塩基数までであって、配列番号76の15〜44個の連続した塩基を含む、請求項63に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号156を含む、請求項66に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号37の15〜37個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号37の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号58の15〜38個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号58の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。 - チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号46の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号46の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号65の15〜40個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号65の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)長さが100塩基数までで、配列番号66の15〜43個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号66の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第三プライマー5’配列を任意選択で含む第三のプライマーと、
(d)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号106である、請求項69に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号145である、請求項69に記載のキット。
- 前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号146である、請求項69に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが39塩基数までであって、配列番号82の15〜39個の連続した塩基を含む、請求項69に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号162を含む、請求項73に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号46の15〜44個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号46の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号65の15〜40個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号65の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(iii)長さが100塩基数までで、配列番号66の15〜43個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号66の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第三プライマー5’配列を任意選択で含む第三のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。 - チクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
(a)長さが100塩基数までで、配列番号50の15〜47個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号50の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(b)長さが100塩基数までで、配列番号69の15〜39個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号69の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
(c)前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。 - 前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号110である、請求項76に記載のキット。
- 前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号149である、請求項76に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが40塩基数までであって、配列番号85の15〜40個の連続した塩基を含む、請求項76に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号165を含む、請求項79に記載のキット。
- 核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス(CHIKV)核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
(a)前記試験試料の核酸を、
(i)長さが100塩基数までで、配列番号50の15〜47個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号50の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第一プライマー5’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
(ii)長さが100塩基数までで、配列番号69の15〜39個の連続した塩基からなる標的相補的3’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的3’末端配列が配列番号69の配列に完全に含まれ、CHIKV核酸に相補的でない第二プライマー5’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む1セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
(b)増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記CHIKV核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
(c)前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記CHIKV核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4673408P | 2008-04-21 | 2008-04-21 | |
US61/046,734 | 2008-04-21 | ||
PCT/US2009/002504 WO2009131683A2 (en) | 2008-04-21 | 2009-04-21 | Method for detecting chikungunya virus |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011517959A true JP2011517959A (ja) | 2011-06-23 |
JP5646455B2 JP5646455B2 (ja) | 2014-12-24 |
Family
ID=40942798
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011506292A Expired - Fee Related JP5646455B2 (ja) | 2008-04-21 | 2009-04-21 | チクングニヤウイルスを検出するための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9273365B2 (ja) |
EP (5) | EP3392351A1 (ja) |
JP (1) | JP5646455B2 (ja) |
AU (1) | AU2009238586A1 (ja) |
CA (2) | CA3128538C (ja) |
WO (1) | WO2009131683A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021078464A (ja) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | 国立大学法人 大分大学 | プライマーセット |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3392351A1 (en) | 2008-04-21 | 2018-10-24 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting chikungunya virus |
CN102140530B (zh) * | 2010-12-24 | 2013-01-16 | 中国检验检疫科学研究院 | 基孔肯雅病毒荧光定量pcr检测新方法及基孔肯雅病毒检测pcr体系 |
US11591660B2 (en) * | 2016-01-14 | 2023-02-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and reagents for detection of chikungunya virus or chikungunya virus and dengue virus |
WO2018169550A1 (en) * | 2017-03-17 | 2018-09-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Real-time rt-pcr assay for detection of dengue, chikungunya, and zika viruses |
SG10201905639PA (en) * | 2019-06-19 | 2021-01-28 | Delta Electronics Int’L Singapore Pte Ltd | Primer pair, kit and method for detecting chikungunya virus |
KR20230111359A (ko) * | 2022-01-18 | 2023-07-25 | 한국표준과학연구원 | 전장유전체 증폭을 위한 치쿤군야 바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007105111A2 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Institut Pasteur | Novel isolated and purified strains of chikungunya virus and polynucleotides and polypeptides sequences, diagnostic and immunogenical uses thereof |
WO2007130519A2 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Viral nucleic acid microarray and method of use |
WO2008026225A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Bharat Biotech International Limited | A vaccine for chikungunya virus infection |
WO2009044085A2 (fr) * | 2007-09-14 | 2009-04-09 | bioMérieux | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diganostiquer la presence du gene e1 du virus de chikungunya |
Family Cites Families (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2422956A1 (fr) | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4868105A (en) | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
DE3785658T2 (de) | 1986-08-11 | 1993-08-12 | Siska Diagnostics Inc | Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden. |
US5541308A (en) | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
JP2774121B2 (ja) | 1987-07-31 | 1998-07-09 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5283174A (en) | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
US5639604A (en) | 1987-09-21 | 1997-06-17 | Gen-Probe Incorporated | Homogeneous protection assay |
US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
JP3276955B2 (ja) | 1988-09-30 | 2002-04-22 | ジーン−トラック・システムス | Rnaの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法 |
US5656207A (en) | 1989-06-24 | 1997-08-12 | Gen Probe Incorporated | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques |
CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
WO1993013121A1 (en) | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
ES2214472T3 (es) | 1991-08-02 | 2004-09-16 | Biomerieux B.V. | Cuantificacion de acidos nucleicos. |
KR100249110B1 (ko) | 1992-05-06 | 2000-04-01 | 다니엘 엘. 캐시앙 | 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트 |
WO1994003472A1 (en) | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification |
KR100189229B1 (ko) | 1993-07-23 | 1999-06-01 | 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 | 핵산 증폭을 강화하는 방법 |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US5591578A (en) | 1993-12-10 | 1997-01-07 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
US5824473A (en) | 1993-12-10 | 1998-10-20 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
EP0760008A1 (en) | 1994-05-19 | 1997-03-05 | Dako A/S | Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis |
ATE340866T1 (de) | 1994-10-28 | 2006-10-15 | Gen Probe Inc | Zusammensetzungen und verfahren für die gleichzeitige detektion und quantifizierung von einer mehrheit spezifischer nuklein säure sequenzen |
US5731148A (en) | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
ATE340868T1 (de) | 1997-05-02 | 2006-10-15 | Gen Probe Inc | Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid |
US6013459A (en) | 1997-06-12 | 2000-01-11 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Detection of analytes using reorganization energy |
US5952202A (en) * | 1998-03-26 | 1999-09-14 | The Perkin Elmer Corporation | Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification |
US6361945B1 (en) | 1998-07-02 | 2002-03-26 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
CA2501946C (en) * | 2002-10-16 | 2014-12-23 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting west nile virus |
US8485120B2 (en) | 2007-04-16 | 2013-07-16 | Lam Research Corporation | Method and apparatus for wafer electroless plating |
KR20070048784A (ko) * | 2004-08-19 | 2007-05-09 | 토소가부시키가이샤 | α 1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소 (α4GnT)mRNA의 측정 방법 |
JP4819064B2 (ja) * | 2005-02-18 | 2011-11-16 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | アルカリショックを取り入れたサンプル調製法 |
EP3392351A1 (en) | 2008-04-21 | 2018-10-24 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting chikungunya virus |
CN101270394B (zh) * | 2008-05-05 | 2011-08-03 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种用于基孔肯雅病毒检测的引物 |
-
2009
- 2009-04-21 EP EP18174077.0A patent/EP3392351A1/en not_active Withdrawn
- 2009-04-21 CA CA3128538A patent/CA3128538C/en active Active
- 2009-04-21 EP EP14175658.5A patent/EP2808405B1/en not_active Not-in-force
- 2009-04-21 US US12/386,832 patent/US9273365B2/en active Active
- 2009-04-21 WO PCT/US2009/002504 patent/WO2009131683A2/en active Application Filing
- 2009-04-21 EP EP21180135.2A patent/EP3957754A1/en active Pending
- 2009-04-21 AU AU2009238586A patent/AU2009238586A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-21 EP EP14175653.6A patent/EP2811037B1/en active Active
- 2009-04-21 CA CA2721536A patent/CA2721536A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-21 JP JP2011506292A patent/JP5646455B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-04-21 EP EP20090735119 patent/EP2281070B1/en not_active Not-in-force
-
2016
- 2016-02-26 US US15/054,313 patent/US10344341B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-03 US US16/430,007 patent/US20190367998A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-06-23 US US17/356,402 patent/US20210324487A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007105111A2 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Institut Pasteur | Novel isolated and purified strains of chikungunya virus and polynucleotides and polypeptides sequences, diagnostic and immunogenical uses thereof |
WO2007130519A2 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Viral nucleic acid microarray and method of use |
WO2008026225A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Bharat Biotech International Limited | A vaccine for chikungunya virus infection |
WO2009044085A2 (fr) * | 2007-09-14 | 2009-04-09 | bioMérieux | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diganostiquer la presence du gene e1 du virus de chikungunya |
Non-Patent Citations (13)
Title |
---|
JPN5011008438; SCHUFFENECKER, I, et al.: 'GENOME MICROEVOLUTION OF CHIKUNGUNYA VIRUSES CAUSING THE INDIAN OCEAN OUTBREAK' PLOS MEDICINE 3(7), 200607, p.e263 * |
JPN5011008441; PASTORINO, B., et al.: 'DEVELOPMENT OF A TAQMAN(R) RT-PCR ASSAY WITHOUT RNA EXTRACTION STEP 以下備考' JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 124(1-2), 200503, pp.65-71, ELSEVIER BV * |
JPN5011008443; CARLETTI, F., et al.: 'RAPID DETECTION AND QUANTIFICATION OF CHIKUNGUNYA VIRUS BY A ONE-STEP REVERSE 以下備考' THE AMERICAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE 77(3), 200709, pp.521-524 * |
JPN5011008444; PARIDA, M.M., et al.: 'RAPID AND REAL-TIME DETECTION OF CHIKUNGUNYA VIRUS BY REVERSE TRANSCRIPTION 以下備考' JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 45(2), 200702, pp.351-357 * |
JPN5011008445; PFEFFER, M., et al.: 'SPECIFIC DETECTION OF CHIKUNGUNYA VIRUS USING A RT-PCR/NESTED PCR COMBINATION' JOURNAL OF VETERINARY MEDICINE B. INFECTIOUS DISEASES AND VETERINARY PUBLIC HEALTH 49(1), 2002, pp.49-54 * |
JPN5011008446; LAURENT, P., et al.: 'DEVELOPMENT OF A SENSITIVE REAL-TIME REVERSE TRANSCRIPTASE PCR ASSAY 以下備考' CLINICAL CHEMISTRY 53(8), 2007, pp.1408-1414 * |
JPN5011008449; CHAN, A.B., et al.: 'NASBA AND OTHER TRANSCRIPTION-BASED AMPLIFICATION METHODS FOR RESEARCH AND DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY' REVIEWS IN MEDICAL MICROBIOLOGY 10(4), 1999, pp.185-196 * |
JPN6014000092; PAROLA, P., et al.: Emerging Infectious Diseases 12(10), 200610, pp.1493-1499 * |
JPN6014000094; EDWARDS, C.J., et al.: Journal of Clinical Virology 39, 2007, pp.271-275 * |
JPN6014000096; TSETSARKIN, K., et al.: VECTOR-BORNE AND ZOONOTIC DISEASES 6(4), 2006, pp.325-337 * |
JPN6014000098; SANTHOSH, S.R., et al.: Virus Research 135, 20080401, pp.36-41 * |
JPN6014000100; ARANKALLE, V.A., et al.: Journal of General Virology 88, 2007, pp.1967-1976 * |
JPN6014000103; KHAN, A.H., et al.: Journal of General Virology 83, 2002, pp.3075-3084 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021078464A (ja) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | 国立大学法人 大分大学 | プライマーセット |
JP7417985B2 (ja) | 2019-11-22 | 2024-01-19 | 国立大学法人 大分大学 | プライマーセット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2811037A1 (en) | 2014-12-10 |
EP2811037B1 (en) | 2017-04-19 |
US9273365B2 (en) | 2016-03-01 |
EP3392351A1 (en) | 2018-10-24 |
US20090263806A1 (en) | 2009-10-22 |
CA3128538C (en) | 2023-08-08 |
EP2808405B1 (en) | 2018-06-06 |
EP2808405A1 (en) | 2014-12-03 |
AU2009238586A1 (en) | 2009-10-29 |
US20160168651A1 (en) | 2016-06-16 |
WO2009131683A2 (en) | 2009-10-29 |
CA2721536A1 (en) | 2009-10-29 |
US20210324487A1 (en) | 2021-10-21 |
US10344341B2 (en) | 2019-07-09 |
US20190367998A1 (en) | 2019-12-05 |
WO2009131683A3 (en) | 2010-04-29 |
EP2281070A2 (en) | 2011-02-09 |
JP5646455B2 (ja) | 2014-12-24 |
EP3957754A1 (en) | 2022-02-23 |
EP2281070B1 (en) | 2015-01-21 |
CA3128538A1 (en) | 2009-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5568403B2 (ja) | 西ナイルウィルスを検出するための、組成物および方法 | |
US20210324487A1 (en) | Method for detecting chikungunya virus | |
US20210040570A1 (en) | Detection of west nile virus nucleic acids in the viral 3' non-coding region | |
US8318432B2 (en) | Cross-reactive hybridization probe for detecting HIV-1 and HIV-2 nucleic acids in the P31 gene sequence |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120410 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140407 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141104 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141105 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5646455 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |