ES2321326T3 - Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1, vih-2 y vis, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnostico invitro de las infecciones debidas a estos virus. - Google Patents

Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1, vih-2 y vis, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnostico invitro de las infecciones debidas a estos virus. Download PDF

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ES2321326T3 ES06013029T ES06013029T ES2321326T3 ES 2321326 T3 ES2321326 T3 ES 2321326T3 ES 06013029 T ES06013029 T ES 06013029T ES 06013029 T ES06013029 T ES 06013029T ES 2321326 T3 ES2321326 T3 ES 2321326T3
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Abstract

Oligonucleótido, de 15 a 30 nucleótidos, caracterizado porque su secuencia consiste en: i) una secuencia específica del gel pol , y susceptible de hibridarse a una temperatura de 60ºC ñ 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac; o ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i).

Description

Secuencias nucleotídicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, y sus aplicaciones especialmente para la amplificación de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnóstico in vitro de las infecciones debidas a estos virus.
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La presente invención se refiere a secuencias oligonucleotídicas utilizables para la puesta en práctica de técnicas de amplificación de secuencias nucleicas específicas de retrovirus de inmunodeficiencia humana del tipo VIH o de retrovirus de inmunodeficiencia del mono del tipo SIV.
La invención se refiere en particular a la aplicación de estas secuencias a procedimientos de diagnóstico in vitro en el ser humano de la infección de un individuo por un retrovirus del tipo VIH (actualmente VIH-1 y/o VIH-2).
El aislamiento y la caracterización de retrovirus agrupados bajo la designación VIH-1 y VIH-2 se han descrito en las solicitudes de patente europea EP 201540 Y EP239425. Estos retrovirus se han aislado en diversos enfermos con síntomas de una linfadenopatía o de un Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).
Los retrovirus del tipo VIG-2 como los retrovirus del tipo VIH-1, se caracterizan por un tropismo para los linfocitos T4 humanos y por un efecto citopatógeno respecto de estos linfocitos cuando se multiplican, para entonces causar entre otros poliadenopatías generalizadas y persistentes o un SIDA.
Otro retrovirus, denominado SIV-1, sustituyendo esta denominación la denominación anteriormente conocida de STLV-III, se ha aislado en el mono macaco rhesus (M.D. DANIEL et al., Science, 228, 1201 (1985); N.L. LETWIN et al., Science, 230, 71 (1985) bajo la denominación "STLV-IIImac").
Otro retrovirus, designado "STLV-III_{AGM}", o (SIV_{AGM}) se ha aislado en monos verdes salvajes. Pero contrariamente a los virus presentes en el mono macaco rhesus, la presencia de STLV-III_{AGM} no parece inducir una enfermedad del tipo SIDA en el mono verde africano.
Por motivos de comodidad verbal, estos virus no se designaran a continuación más que con la expresión SIV (la expresión SIV es la abreviación inglesa de "Simian Immunodeficiency Virus" (Virus de inmunodeficiencia del mono) eventualmente seguida de una abreviación que designa la especie de mono del cual proceden por ejemplo "MAC" para el macaco o "AGM" para el mono verde africano (Abreviación de "African Green Monkey").
Una cepa del retrovirus SIV-1mac se ha depositado en la C.N.C.M el 7 de febrero de 1986 con el número I-521.
El seguimiento del estudio de los retrovirus VIH-1 y VIH-2 condujo también a la obtención de secuencias de ADN complementarias (ADNc) de los ARN de su genoma. La secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-2 (VIH-2 ROD) se depositó el 21-02-1986 en la C.N.CM con el número I-522, con el nombre de referencia LAV-2-ROD.
Igualmente, la secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-1 se describe en WAIN HONSON; SONIGO, COLE, DANOS y ALIZON en CEII (enero 1985).
Igualmente por razones de comodidad verbal, los virus del tipo VIH-1 y VIH 2 se designará a veces en este documento por la expresión VIH.
Los procedimientos de diagnóstico in vitro de las infecciones por virus del tipo VIH-1 o VIH-2 que existen actualmente, recurren a la detección de anticuerpos NATI-VIH-1 O ANTI-VIH-2 eventualmente presentes en una muestra biológica (biopsia) o en un fluido biológico, por ejemplo en un suero obtenido, a partir del paciente en estudio, por puesta en contacto de este fluido biológico con extractos o antígenos de VIH-1 o VIH-2, en condiciones que permiten la producción de una eventual reacción inmunológica de estos extractos o antígeno con estos anticuerpos.
Tales procedimientos de diagnóstico corren el riesgo de ser falsamente negativos, en particular en el caso de una infección reciente de un individuo por virus del tipo VIH.
Las técnicas de amplificación génica son una contribución considerable para la puesta a punto de procedimientos de diagnóstico in vitro particularmente sensibles de enfermedades virales. Entre estas técnicas de amplificación génica, se pueden mencionar la técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) tal como se describe en las solicitudes de patente europea EP200362 y EP229701, o también la técnica denominada "Q\betareplicasa" descrita en Biotyechnology, vol 6 página 1197 (octubre 1988) y la que procede con la ayuda de una ARM polimerasa (T7RNA polimerasa) descrita en la solicitud de patente internacional número WO89/01050. Estas técnicas permiten mejorar la sensibilidad de detección de los ácidos nucleicos de los virus y necesitan la utilización de cebadores específicos de síntesis.
Con el fin de amplificar con la ayuda de una técnica de amplificación génica, los genes que codifican la transcriptasa inversa de los hepadnavirus HBV, WHV, GSHV y DHBV, Mack et al., (1985; PNAS, 85: 6977-6981) propone mezclas constituidas por un gran número de isómeros oligonucleotídicos cuyas secuencias se han llevado a cabo para no solamente cubrir las diferencias de nucleótidos que existen entre estos diferentes hepadnavirus, sino también para tener en cuenta la degeneración del código genético.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para la búsqueda de los virus del tipo VIH, la elección de los cebadores es problemática. En efecto, debido a la gran variabilidad de las secuencias de nucleótidos del genoma viral, un cebador conforme a la secuencia conocida de un aislado dado de un virus del tipo VIH puede fallar en la amplificación de algunas variantes virales del tipo VIH. Por otra parte, incluso si se elige un cebador en una región conservada del genoma de un virus VIH a otro, no se garantiza por este hecho su "buen funcionamiento" y puede dar lugar a malos rendimientos de amplificación.
La presente invención proporciona precisamente cebadores oligonucleotídicos que permiten, entre otros, la amplificación, en particular con fines de diagnóstico, del genoma de cualquier virus del tipo VIH y SIV, con rendimientos considerados como máximos en el estado actual de la técnica y evitando sobre todo la presencia de numerosas bandas anespecíficas.
Los cebadores de la presente invención son a la vez específicos de los virus del grupo VIH-1 y de los virus de los grupos VIH-2 y SIV, y son sensibles a las variaciones del genoma de estos virus.
La presente invención tiene por objeto cebadores oligonucleotídicos, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, utilizables para la amplificación genómica de los virus del tipo VIH-1 y/o del tipo VIH-2 y SIV.
La solicitud describe cualquier secuencia nucleotídica caracterizada porque su secuencia:
-
bien se elige entre las que están contenidas en una de las secuencias nucleotídicas comprendidas en los genes gen, vpr y pol de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV MAC, o en los genes nef2, vif1 y vpx de los virus VIH-2 ROD y SIV MAC, o en los gnes env. nef1, vif1 y vpr de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli, y más particularmente entre las que están contenidas en los encadenamientos nucleotídicos definidos a continuación,
-
bien (especialmente para las secuencias más largas) contiene una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas procedentes de VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV MAC, o contiene una secuencia nucleotídica complementaria de una de estas últimas secuencias, entendiéndose que los eventuales nucleótidos suplementarios que "sobresalen" de la secuencia nucleotídica del tipo en cuestión, del lado de los extremos 3' o 5', coinciden preferiblemente con los que se encuentran colocados más del lado de los extremos 5' o 3' correspondientes en el seno mismo de la secuencia completa de los virus del tipo VIH-1, VIH-2 o SIV MAC anteriormente mencionados,
-
bien, si esta secuencia nucleotídica no es idéntica a una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas, o no es complementaria de una de estas secuencias, es, sin embargo, susceptible de hibridarse con una secuencia nucleotídica procedente de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, y/o con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-2 ROD y SIV MAC, anteriormente mencionada. La hibridación se puede efectuar a una temperatura de 60ºC+/-1ºC (preferiblemente 60ºC+/-0,5ºC), preconizada para un rendimiento óptimo.
La numeración de los nucleótidos anteriormente mencionados corresponde a la utilizada en el manual de referencia "Human Retrovirus and AIDS-1989" editado por el "Los Alamos National Laboratory -Nuevo México- EE.UU".
(Las secuencias de los virus VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, se han descrito por MONTAGNIER, SONIGO, WAIN-HOBSON y ALIZON en la solicitud de patente europea nº 86.401.380 del 23-06-1986.).
Las secuencias de la invención se sintetizaron en un sintetizador comercializado por Applied Biosystems (procedimiento fósforo-amiditas, o en cualquier otro aparato que utilice un procedimiento similar.
La solicitud se refiere más particularmente a las secuencias oligonucleotídicas caracterizadas por los siguientes encadenamientos nucleotídicos (representados en el sentido 5'\rightarrow3'; las iniciales "S" y "AS" indican si el oligonucleótido es con sentido o antisentido, es decir, si el oligonucleótido está orientado respectivamente en el sentido 5'o\rightarrow3' o en el sentido 3'o\rightarrow5'):
1.-) secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1, VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV):
\bullet
secuencias específicas del gen gag del genoma de los virus anteriormente mencionados (gen que codifica un grupo de antígenos específicos del nucleótido de estos virus).
Se pueden aportar algunas variantes en algunas posiciones de las secuencias nucleotídicas indicadas anteriormente, sin que las propiedades de hibridación de estas secuencias nucleotídicas con los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV se vean afectadas. Las secuencias nucleotídicas que comprenden estas variantes se representan debajo de las secuencias nucleotídicas iniciales de las que se derivan por sustitución de una o más bases. Las bases modificadas respecto de las de las secuencias nucleotídicas iniciales se indican con todas sus letras mientras que las bases de las secuencias iniciales que no se han sustituido en las secuencias que comprenden estas variantes se indican con la ayuda de líneas de puntos.
\bullet
La síntesis de los cebadores se hace utilizando todas las variantes simultáneamente. Es la mezcla de todas las variantes para una secuencia dada que se utiliza en los ensayos.
1
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet
Secuencias específicas del gen vpr
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet
Secuencia específica del gen pol;
5
6 
\newpage
2.-) Secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-2 ROD y SIV-MAC).
\bullet secuencias específicas de gen nef (que codifica un factor negativo de 27 kD)
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet secuencias específicas de gen vif2 (que codifica un factor de infecciosidad de 23 kD)
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet secuencias específicas del gen vpx (que codifica una proteína de 12 kD)
9 
\newpage
3.-) Secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, y VIH-1 Eli (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-1 Bru, VIH-1 MAl y VIH-1 Eli).
\bullet secuencias específicas del gen env (que codifica las proteínas de envoltura)
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\bullet secuencias específicas del gen nef1
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12 
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet secuencias específicas del gen vif 1
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet secuencias específicas del gen vpu
14 
\vskip1.000000\baselineskip
De este modo, la invención se refiere a un oligonucleótifo, de 15 a 30 nucleótidos, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia específica del gen pol , y susceptible de hibridarse a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac; la invención tiene también por objeto las secuencias (o cebadores) que poseen una estructura nucleotídica complementaria de las de la invención.
En particular, el oligonucleótido específico del gen pol se elige entre
-
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3',
-
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3',
-
5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3',
-
5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3',
-
5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3',
-
5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3',
-
5'-TGG AAA GGT GAAGGA GCA GAT-3',
-
3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5',
-
3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5',
-
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5',
-
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5',
-
3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5',
-
3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5',
-
3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5', y
-
3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere igualmente a las secuencias nucleotídicas que presentan algunas mutaciones respecto de la definidas anteriormente sin que se modifiquen las propiedades de hibridación, tal como se han definido anteriormente, de estas secuencias. El porcentaje de nucleótidos diferentes de los que constituyen las secuencias descritas anteriormente, sin afectar por ello las propiedades de hibridación de las secuencias de la invención, puede alcanzar el 40%.
De una manera general, en el caso de un cebador (primer) con sentido (S), se tolera un mayor número de mutaciones del lado 5' que del lado 3' del cebador, debiéndose el lado 3' hibridar perfectamente con una cadena determinada de una secuencia nucleica para permitir la amplificación de esta secuencia. en el caso de un cebador antisentido (AS), la tolerancia se permite del lado 3'.
La invención tiene también por objeto los cebadores de la invención tales como los definidos anteriormente y que comprenden una conservación de al menos 5 bases de cada lado, comprendiendo la parte mediana modificaciones, sin que las propiedades de hibridación anteriores se vean afectadas.
Una de las características de los cebadores oligonucleotídicos de la invención es proporcionar una banda de amplificación neta, desprovista generalmente de bandas anespecíficas cuando se aplican las indicaciones técnicas de utilización descritas en la presente invención. Este hecho se debe a la longitud de los cebadores que pueden alcanzar 27 bases, lo que aumenta la especificidad de hibridación, así como a las drásticas condiciones de utilización que permiten eliminar las asociaciones parásitas. La especificidad para cada tipo de virus lo es en función, además del porcentaje de homología con la matriz de referencia, de la longitud de los cebadores, que pueden alcanzar, para un rendimiento aceptable, hasta 40 bases.
La invención se extiende también a los cebadores de la invención tales como los descritos anteriormente ligados al nivel de su extremo 5' a un promotor para la aplicación de un procedimiento de amplificación genómica por síntesis de múltiples copias de ADN o de ARN tal como se describe en la solicitud de patente europea EP 310229.
La invención tiene especialmente por objeto la utilización de los cebadores de la invención descritos anteriormente para la aplicación de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas de virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, y/o SIV, pudiéndose aplicar este procedimiento al diagnóstico in vitro de la potencial infección de un individuo por un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV).
Este procedimiento de diagnóstico in vitro se realiza a partir de una muestra biológica (por ejemplo un fluido biológico tal como suero, linfocitos de la sangre en circulación) obtenida a partir de un paciente en estudio, y comprende principalmente las siguientes etapas:
-
una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, llegado el caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN, para obtener un ácido nucleico bicatenario (estando también esta última etapa designada más adelante como etapa de retrotranscripción del ARN viral)
-
un ciclo que comprende las siguientes etapas:
\bullet
desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario,
\bullet
hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador según la invención, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de los cebadores según la invención en las condiciones de hibridación anteriormente definidas,
\bullet
formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de un agente de polimerización (ADN polimerasa) y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que se van a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número determinado de veces para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección,
-
una etapa de detección de la presencia eventual del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de hibridación anteriormente descrita se realiza ventajosamente a 60ºC durante 1 minuto y 30 segundos en el tampón "10 X buffer" cuya composición (en concentración final de utilización) se indica mas adelante.
El procedimiento de diagnóstico in vitro se puede realizar bien a partir del ARN viral, bien a partir del ADN complementario, episomial o integrado.
En efecto, los genomas de los virus VIH y SIV se presentan en forma de ARN o de ADN en función de la localización del virus en el organismo.
Cuando el virus se sitúa en el interior de las células del organismo, especialmente en el interior de las células sanguíneas, su ARN se vuelve a copiar en ADN por una transcriptasa inversa. Por el contrario, el genoma de los virus del tipo VIH en medio extracelular, especialmente en la sangre, permanece en forma de ARN.
La etapa de extracción según la invención del ADN viral contenido en las células de la muestra biológica preconizada por los inventores -además del procedimiento clásico con fenol cloroformo- presenta las siguientes etapas:
\bullet
suspensión del residuo celular en 0,5 ml de agua pirolizada en un Potter fe pistón grande,
\bullet
trituración de las células denominado de "ida y vuelta",
\bullet
adición Triton X100 para 1 concentración final del 0,1%
\bullet
desnaturalización con calor durante 15 a 25 minutos a 100ºC,
\bullet
centrifugación corta para no eliminar más que los restos celulares,
\bullet
precipitación del ADN durante la noche a -20ºC por adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto y del 10% del volumen final de acetato de sodio 3 molares. El ADN a continuación se recupera y se vuelve a suspender en el agua pirolizada después de haberse lavado 2 veces con etanol a 70ºC. Hay que subrayar que este procedimiento permite la precipitación conjunta de los ADN y de los ARN, lo cual permite la detección del mensaje genómico de los virus de tipo VIH o SIV mediante la utilización del procedimiento denominado "PCR directo ADN" o por el denominado "PCR-ARN".
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de extracción del AAARN viral se efectúa generalmente de la manera clásica conocida por el experto en la técnica.
Después de la extracción del ARN, es necesaria efectuar una etapa suplementaria de transformación del ARN, monocatenario en ADN bicatenario cuando el diagnóstico in vitro se realiza a partir de muestras biológicas que contienen los virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV cuyos genomas están en forma de ARN.
Esta transformación del ARN en ADN se realiza por tratamiento del ARN obtenido después de la extracción de la muestra biológica, especialmente suero, en un medio apropiado con la ayuda de una transcriptasa inversa.
Se describe más particularmente un procedimiento de diagnóstico in vitro tal como se define anteriormente, en el cual la etapa de retro-trascripción del ARN viral se realiza de la siguiente manera:
-
10 \mug de ARN extraído resuspendido en agua se pone en presencia del par de cebadores a la concentración de 40 \muM cada uno, en un volumen final de 40 \mul. El conjunto se desnaturaliza a 100ºC durante 10 minutos y a continuación se sumerge en agua helada,
-
se añaden 10 \mul de la siguiente mezcla: 5 \mul del tampón "10 buffer" descrito anteriormente + 1 unidad de transcriptasa inversa de (AMV (Avian Myeloblastosis Virus) o de MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 unidad de Taq polimerasa + 1 \mul de la mezcla de los 4 dNTP a 25 mM cada uno + agua C.S.P. 10 \mul. El volumen final es por lo tanto de 50 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta reacción se efectúa en dos etapas:
-
\;
a)
primera etapa: fabricación del ADNc por acción de la transcriptasa inversa a 42ºC durante 13 minutos,
-
\;
b)
segunda etapa : amplificación génica clásica: se calienta a 95ºC durante 3 minutos para destruir la transcriptasa inversa y permitir la etapa de deshidratación/hibridación, y a continuación se inicia el ciclo descrito anteriormente para la amplificación génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe particularmente un procedimiento de diagnóstico in vitro tal como el que se describe anteriormente, en el cual la etapa de desnaturalización se realiza en presencia del (o de los pares de) cebador(es) o (primers) descritos. En efecto, como se ha precisado anteriormente, una de las características de los oligonucleótidos (o primers), descritos es proporcionar una banda de amplificación neta, generalmente desprovista de bandas anespecíficas, cuando se utilizan en las siguientes condiciones:
-
hibridación: se ponen los cebadores (1 \mul de una solución 40 \muMolar (40 \muM) de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo, para de este modo aumentar la tasa de reasociación de matriz de ADN/cebadores. Los cebadores se deben utilizar a una concentración final en la siguiente etapa de amplificación de 0,8 \muM cada uno;
-
amplificación: se añaden al medio precedente los 4 A dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 \muMolar en solución final (50 \mul), y una unidad de Taq polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul. Ésta etapa se realiza en un tampón de amplificación de la presente invención, generalmente designado con el nombre "10 X buffer" cuya composición (cuando se diluye a 1/10) es la siguiente: Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM; MgCl_{2} : 5 mM; \beta-mercapto-etanol: 10 mM; gelatina: 0,25 mg/ml. Se añaden 5 \mul de este tampón y agua c.s.p. 50 \mul al medio anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ciclos de amplificación se realizan de la siguiente manera: 30 a 40 ciclos compuestos de:
\bullet
94ºC durante 10 segundos (desnaturalización),
\bullet
60ºC durante 1 minuto (hibridación),
\bullet
78ºC durante 1 minuto 30 segundo (elongación)
El todo será seguido por un ciclo único a 78ºC durante 15 minutos.
La precisión de las temperaturas indicadas a +/- 0,3ºC aproximadamente, así como su estabilidad durante los diferentes ciclos, representan condiciones esenciales para la obtención de los rendimientos máximos así como la ausencia de bandas anaespecíficas.
La concentración óptima de ADN es de 100 a 300 ng para ADN genómico extraído de células (de pacientes o en cultivo, de mamíferos u otros).
Es evidente que las condiciones anteriores representan condiciones óptimas para un medio de reacción final de 50 \mul, y que estas condiciones se pueden modificar en función del volumen final del medio de reacción.
La utilización de diversos pares de cebadores diferentes (o cócteles de pares) permite bien la detección cruzada de diversos tipos de virus del tipo VIH y/o SIV, bien la detección simultánea de diversos genes de un mismo virus del tipo VIH y/o SIV.
A título de ejemplo de pares de cebadores preferidos utilizables en el marco de la presente invención, se pueden mencionar los siguientes pares de cebadores :
-
MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy18-MMy19, MMy4bis-MMy28bis, MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy31-MMy32bis, especialmente para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo VIH-1 y/o VIH-2.
-
MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy4-MMy7bis, MMy9-MMy11, MMy10MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis, MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis MMy16MMy17, MMy25-MMy27, MMy26-MMy27, especialmente para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo VIH-1.
-
MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21MMy22, MMy23MMy24, MMy124-MMy14, MMy12-MMy13bis, para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo VIH-2.
El agente de polimerización utilizado en la etapa de elongación del ciclo es una ADN polimerasa termoestable, especialmente Taq polimerasa, amplifiosa de la firma Appligène o cualquier ADN polimerasa termoestable que se pueda comercializar.
De manera general, el ciclo del procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención se repite entre 30 y 40 veces.
El procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención permite igualmente, en función de los pares de cebadores nucleotídicos utilizados, detectar selectivamente los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV presentes en la muestra biológica.
Los pares de cebadores utilizables, a título de ejemplos, para el procedimiento de amplificación génica anteriormente mencionado, son los siguientes:
-
MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis para le gen gag.
-
MMy18-MMy19 para el gen vpr,
-
MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis para el gen env,
-
MMy9-MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy10-MMy11 para el gen nef1,
-
MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis, MMy16-MMy17, para el gen vif1,
-
MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21-MMy22 para el gen vif 2,
-
MMy23-MMy24 para vpx,
-
MMy12-MMy14, MMy12-MMy13bis, MMy13-MMy14 para el gen nef2,
-
MMy25-MMy27, MMY26-MMy27 para el gen vpu,
-
MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy30-MMy31bis, MMy31-MMy32bis para el gen pol.
\vskip1.000000\baselineskip
En el marco de la invención unos pares de cebadores utilizados para la aplicación de una amplificación del gen pol de los virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV consisten en :
i) MMy29-MMy30bis
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3'
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3'
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5'
3'-TTC TGT ATG TCA TTG TACT GTC CA-5'
\vskip1.000000\baselineskip
ii) Mmy30-Mmy31bis
5'-GG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3'
5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3'
3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5'
\vskip1.000000\baselineskip
iii) Mmy31-Mmy32bis:
5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3'
3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, las combinaciones entre cebadores "S" y "AS" descritas anteriormente no son limitativas y se pueden variar según lo desee el usuario.
Las dimensiones de los fragmentos nucleotídicos sintetizados con la ayuda de los pares de cebadores anteriormente mencionados a título de ejemplos, se indican en las siguientes tablas I a XI:
(las cifras indicadas en las siguientes tablas representan el número de nucleótidos de los fragmentos sintetizados, y los "guiones" indican que los pares de cebadores ensayados no permiten caracterizar las cepas virales correspondientes).
TABLA I
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA III
17
TABLA IV
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA V
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA VI
20
TABLA VII
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA VIII
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA IX
23
TABLA X
24 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA XI
25
Hay que subrayar que gracias a su disposición en el genoma, los cebadores que sirven para la amplificación se pueden combinar de tal manera que se pueden utilizar como sonda, bien después del marcado con el ^{32P} por quinación, bien para la utilización en la técnica de las sondas frías para verificar la especificidad de la banda de amplificación observada durante un análisis por Southern transfert''. Además, la combinación clásica de los cebadores para que un tercer oligonucleótido pueda servir de sonda interna específica, hay que subrayar el caso particular de los genes vif1/vpr y vif2/vpx debido a la imbricación de estos genes, lo cual permite una detección cruzada. Además, durante un análisis por secuenciación del ADN amplificado, estos oligonucleótidos se pueden utilizar como cebador específico para la DNA polimerasa que permite una doble secuenciación en cada sentido, por lo tanto una doble lectura de las secuencias haciendo desaparece de este modo las eventuales ambigüedades de interpretación.
La invención tiene igualmente por objeto los cebadores de la invención tal como se describen anteriormente, se marcan especialmente de manera radiactiva o enzimática, así como su utilización como sondas nucleotídicas, especialmente en el marco del procedimiento de diagnóstico in vitro tal como se describe anteriormente.
La invención tiene igualmente por objeto tales oligonucleótidos tal como se describen anteriormente y que comprenden azúcares en conformación a. Tales oligonucleótidos presentan la característica de invertir el sentido de la doble hélice formada con la matriz (cadena del genoma del virus), pasando de este modo esta doble hélice del estado "S" al estado "AS".
La invención se refiere igualmente a los oligonucleótidos tales como los de la invención descritos anteriormente, de los cuales algunos se metilan y/o comprenden uno o varios átomos de azufre especialmente en las adeninas. Tales oligonucleótidos presentan la característica de aumentar la estabilidad de la doble hélice, y, por consiguiente, de hibridarse mejor con la cadena de ADN que se va amplificar.
La invención se refiere igualmente a los oligonucleótidos tal como se describen anteriormente y se presentan bajo la forma denominada "de bases modificadas" que comprende nucleótidos sobre los cuales se injertan de manera covalente agentes cromóforos moléculas aromáticas planas tales como la acridina naranja), especialmente según el procedimiento descrito en el artículo de C. Hélène aparecido en "la Vie des Sciences", informes, serie general, tomo 4, nº 1 , p. 17-37. Tales oligonucleótidos presentan la característica de ser fácilmente detectables, especialmente por fluorescencia.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar también para la aplicación de un procedimiento de diagnóstico in vitro de la infección de monos (macacos, mono de mangabeys o mono verde) por el virus del tipo SIV, retomando este procedimiento las principales características del descrito anteriormente.
La invención tiene igualmente por objeto kits de diagnóstico par la aplicación de los procedimientos de diagnóstico in vitro anteriormente mencionados. A título de ejemplo, un kit de diagnóstico la presente invención comprende:
-
al menos un par cebadores oligonucleotídicos según la invención, comprendiendo cada par un cebador que hibrida a una de las cadenas de la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar, y un cebador que hibrida con la cadena complementaria de este último en las condiciones anteriormente definidas,
-
reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y el medio de reacción denominado "10 x buffer" descrito anteriormente,
-
una (o más) sondas, que se puede marcar, especialmente por radiactividad o por la técnica de las sondas frías, capaz de hibridar específicamente con la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos amplificada(s) que se van a detectar.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud describe igualmente la utilización de los cebadores indicados con anterioridad mediante la puesta en marcha de un procedimiento de síntesis de proteínas que han sido codificadas por las secuencias nucleotídicas, amplificadas mediante dichos cebadores.
A título ilustrativo, este procedimiento de síntesis de proteínas comprende la amplificación de secuencias nucleotídicas de los genomas de los virus del tipo VIH o SIV (que codifican una proteína determinada y que han experimentado, en su caso, algunas modificaciones de sus nucleótidos) por puesta en contacto de dichas secuencias con al menos un par de cebadores según la invención en las condiciones anteriormente descritas, seguida de la traducción de estas secuencias así amplificadas en proteínas: esta última etapa se realiza especialmente por transformación de células huéspedes apropiadas con la ayuda de vectores que contienen dichas secuencias amplificadas, y recuperación de las proteínas producidas en estas células huéspedes.
La solicitud describe igualmente los polipéptidos procedentes de la traducción de las secuencias (o cebadores) nucleotídicas desveladas anteriormente.
La solicitud describe también la utilización de los cebadores oligonucleotídicos antisentido como agentes antivirales en general, especialmente en la lucha contra el SIDA, así como composiciones farmacéuticas que contienen estos cebadores antisentido en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La solicitud describe igualmente las composiciones inmunógenas que comprende uno o más productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, y/o uno o más productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas según los procedimientos descritos anteriormente a partir de los cebadores definidos según la invención, asociándose estos productos de traducción a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La solicitud describe los anticuerpos dirigidos contra uno o varios de los productos de traducción descritos anteriormente (o dicho de otro modo, susceptibles de formar una reacción inmunológica con uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, o también uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas a partir de los cebadores definidos según la invención) y su utilización para la puesta en práctica de procedimientos de diagnóstico in vitro de la infección de un individuo por un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV) según los procedimientos conocidos por el experto en la técnica.
A título ilustrativo, tal procedimiento de diagnóstico in vitro comprende la puesta en contacto de una muestra biológica (especialmente suero) procedente de un paciente en estudio, con anticuerpos descritos, y la detección con la ayuda de cualquier procedimiento apropiado (especialmente con la ayuda de antiinmunoglobulinas marcadas) de los complejos inmunológicos formados entre los antígenos de los virus del tipo VIH o SIV eventualmente presentes en la muestra biológica y dichos anticuerpos.
La solicitud describe igualmente kits de diagnóstico in vitro que comprenden anticuerpos descritos, y en su caso, reactivos apropiados para la identificación de la reacción inmunológica formada entre dichos anticuerpos y los antígenos de los virus VIH o SIV.
La solicitud describe igualmente un procedimiento de preparación de los polipéptidos anteriormente mencionados, especialmente los que corresponden según el código genético universal a las secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, caracterizándose este procedimiento porque, partiendo preferiblemente del aminoácido C-terminal, se condensan sucesivamente de dos en dos los aminoácilos sucesivos en el orden requerido, o aminoácilos y fragmentos previamente formados y que ya contienen diversos residuos aminoácilos en el orden apropiado, o también diversos fragmentos previamente preparados de este modo, entendiéndose que se habrá tenido cuidado de proteger previamente todas las funciones reactivas llevadas por estos aminoácilos o fragmento con la excepción de las funciones amina de uno y carboxilo del otro o viceversa, que deben intervenir normalmente en la formación de los enlaces peptídicos, especialmente después de la activación de la función carboxilo, según los procedimientos conocidos en la síntesis de los péptidos y así sucesivamente, progresivamente, hasta el aminoácido N terminal.
Por ejemplo, se recurrirá a la técnica de síntesis peptídica en solución homogénea descrita por Houbenweyl en "Methode der Organischen Chemie" (Método de la química orgánica) editado por E. Wunsch, vol. 15-I y II THIEME, STUTTGART, 1974, o a la de síntesis peptídica en fase sólida descrita por R.D. Merrifield en "Solid Phase Peptide Synthesis" (J.AM. CHEM. SOC., 45,2149-2154).
La solicitud divulga igualmente un procedimiento de preparación de las secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, comprendiendo este procedimiento las siguientes etapas:
-
incubación del ADN genómico, aislado a partir de uno de los virus del tipo VIH o SIV anteriormente mencionados, con ADNasa I, y a continuación adición de EDTA y purificación por extracción a la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25-24-1) y a continuación por éter.
-
tratamiento del ADN así extraído por Eco R1 metilasa en presencia de DTT, y purificación por extracción tal como se describe anteriormente,
-
incubación del ADN así purificado con los 4 trifosfatos de desoxinucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTp en presencia de T4 ADN polimerasa y de ADNligasa de E. coli, y a continuación purificación según el procedimiento descrito anteriormente,
-
clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico buscado con la ayuda de una sonda apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento de preparación particularmente ventajoso de las secuencias nucleotídicas comprende las siguientes etapas:
-
la síntesis de ADN utilizando el procedimiento automatizado de las \beta-cianetil fosforamiditas descrita en Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986),
-
la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico por hibridación con una sonda apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento de preparación de las secuencias nucleotídicas comprende las siguientes etapas:
-
el ensamblado de los oligonucleótidos químicamente sintetizados, provistos en sus extremos de sitios de restricción diferentes, cuyas secuencias son compatibles con el encadenamiento de aminoácidos del polipéptido natural según el principio descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80; 7461-7465, (1983),
-
la clonación de los ácidos nucleicos obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico buscado por hibridación con una sonda apropiada.

Claims (15)

1. Oligonucleótido, de 15 a 30 nucleótidos, caracterizado porque su secuencia consiste en:
i)
una secuencia específica del gel pol , y susceptible de hibridarse a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac; o
ii)
una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i).
2. Oligonucleótido, de 15 a 30 nucleótidos, caracterizado porque su secuencia nuclleotídica se modifica respecto de la secuencia del oligonucleótido según la reivindicación 1 y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac a una temperatura de de 60ºC \pm 1ºC.
3. Oligonucleótido según la reivindicación 2, cuyas 5 bases de cada extremo se conservan respecto de las de un cebador oligonucleotídico tal como se describe en la reivindicación 1, y que comprende en su parte mediana modificaciones respecto de la secuencia de un cebador oligonucleotídico según la reivindicación 1.
4. Oligonucleótido específico del gen pol según la reivindicación 1 elegido entre
-
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3',
-
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3',
-
5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3',
-
5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3',
-
5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3',
-
5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3',
-
5'-TGG AAA GGT GAAGGA GCA GT-3',
-
3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5',
-
3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5',
-
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5',
-
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5',
-
3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5',
-
3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5',
-
3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5', y
-
3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Par de cebadores oligonucleotídicos, para llevar a cabo una amplificación génica del gen pol de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, consistiendo los cebadores cada uno en:
i)
una secuencia específica del gen pol de 15 a 30 nucleótidos, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC\pm1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o
ii)
una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Par de cebadores caracterizado porque la secuencia de al menos un cebador oligonucleotídico de un par de cebadores según la reivindicación 5 se modifica respecto de la secuencia del gen pol de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, y conserva las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac, a una temperatura de 60ºC\pm1ºC.
7. Par de cebadores según la reivindicación 5, para llevar a cabo una amplificación génica del gen pol de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, consistiendo los cebadores en :
i. al menos una mezcla elegida en el grupo de las siguientes mezclas de secuencias sentido:
Mmy29: Mezcla constituida de las secuencias
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3'
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3'
Mmy30: Mezcla constituida de las secuencias
5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3'
5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3'
Mmy31: Mezcla constituida de la secuencia
5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3'
Mmy32: Mezcla constituida de las secuencias
5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3'
5'-TGG AAA GGT GAAGGA GCA GT-3', y
\vskip1.000000\baselineskip
ii) al menos una mezcla elegida en el grupo de las siguiente mezclas de secuencias antisentido:
Mmy29bis: Mezcla constituida de las secuencias
3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5'
3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5'
Mmy30bis: Mezcla constituida de las secuencias
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5'
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5'
Mmy31 bis: Mezcla constituida de la secuencia
3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5'
Mmy32bis: Mezcla constituida de las secuencias
3'ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Par de cebadores según la reivindicación 7, para llevar a cabo una amplificación génica del gen pol de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, que consisten en :
i) Mmy29-Mmy30bis
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3'
5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3'
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5'
3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5'
\newpage
ii) Mmy30-Mmy31 bis
5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3'
5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3'
3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5'
\vskip1.000000\baselineskip
iii) Mmy31-Mmy32bis:
5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3'
3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5'
3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Oligonucleótido o par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, susceptible de hibridar con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac en un tampón 10 x buffer de composición Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM, MgCl_{2}: 5 mM, \beta-mercaptoetanol: 10 mM, gelatina: 0,25 mg/ml.
10. Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen pol de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las siguientes etapas:
a)
una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, en su caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN,
b)
un ciclo que comprende las siguientes etapas:
-
desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario,
-
hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador oligonucleotídico o un par de cebadores oligonucleotídicos según una de las reivindicaciones 1 a 9, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de cebadores oligonucleotídicos anteriormente citados,
-
formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que se van a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente,
repitiéndose este ciclo un número determinado de veces para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección,
c)
una etapa de detección de la eventual presencia del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 y/o VIS en la muestra biológica.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia del (o de los) par(es) de cebadores oligonucleotídicos según una de las reivindicaciones 6 a 9.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se realiza en las siguientes condiciones:
a)
hibridación: se ponen los cebadores oligonucleotídicos (1 \mul de una solución 40 \mumolar de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo. Los cebadores se deben utilizar a una concentración final en la siguiente etapa de amplificación de 0,8 \muM cada uno;
b)
amplificación: se añaden al medio precedente los 4 dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 \mumolar en la solución final (50 \mul), y una unidad de Taq polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul.
13. Aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el diagnóstico in vitro de infección de un individuo por un virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, VIS).
14. Kit para la puesta en práctica de un procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 que comprende:
i)
al menos un cebador oligonucleotídico o un par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
ii)
reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y el tampón 10 x buffer de composición Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM; MgCl_{2}: 5 mM, \beta-mercaptoetanol: 10 mM; gelatina: 0,25 mg/ml. (en concentración final de utilización),
iii)
una (o más) sondas, que puede estar marcada, capaz de hibridar con la(s) secuencia(s) de ácido nucleico amplificada(s) que se van a detectar.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Utilización de al menos un cebador oligonucleotídico o de un par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la amplificación génica de secuencias nucleicas del gen pol de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS.
ES06013029T 1989-06-02 1990-06-05 Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1, vih-2 y vis, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnostico invitro de las infecciones debidas a estos virus. Expired - Lifetime ES2321326T3 (es)

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ES90401520T Expired - Lifetime ES2139567T3 (es) 1989-06-02 1990-06-05 Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de retrovirus del tipo vih-1 y sus aplicaciones para la amplificacion de los genomas de estos retrovirus y para el diagnostico in vitro de las infecciones producidas por estos virus.
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ES05014676T Expired - Lifetime ES2275451T3 (es) 1989-06-02 1990-06-05 Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1,vih-2 y siv, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de los genomas de estos retrovirus y para el diagnostico in vitro de las infecciones debidas a estos virus.

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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2321326T3 (es) * 1989-06-02 2009-06-04 Institut Pasteur Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1, vih-2 y vis, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnostico invitro de las infecciones debidas a estos virus.
US7022814B1 (en) 1992-01-21 2006-04-04 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the diseases due to these viruses
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
JPH04152899A (ja) * 1990-10-17 1992-05-26 Shionogi & Co Ltd ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド
FR2677039B1 (fr) * 1991-05-31 1994-09-09 Cis Bio Int Oligonucleotides, utilisables comme reactifs pour la detection in vitro des infections a retrovirus de type hiv et procede de detection de retrovirus de type hiv.
CA2124797C (en) * 1991-12-23 2004-03-30 Bruce D. Irvine Hiv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
FR2692279B1 (fr) * 1992-06-16 1995-05-19 Centre Nat Rech Scient Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline.
JP4108118B2 (ja) * 1993-03-26 2008-06-25 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒト・免疫不全ウイルス１型の検出
AU7568794A (en) * 1993-08-20 1995-03-21 St. Luke's-Roosevelt Hospital Center Hiv (vif)-related compositions, and prophylactic and therapeutic uses thereof
US5733781A (en) 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
AU731101B2 (en) 1995-12-05 2001-03-22 Donald R. Branch Methods for the early detection of HIV infection
US6265152B1 (en) * 1995-12-22 2001-07-24 Visible Genetics Inc. Method and kit for evaluation of HIV mutations
DE19644248A1 (de) * 1996-10-24 1998-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh Primer und Probes zum Nachweis von HIV
US6830887B2 (en) 1997-03-18 2004-12-14 Bayer Healthcare Llc Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample
US5962665A (en) * 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
US6001558A (en) * 1997-06-25 1999-12-14 Ortho Clinical Diagnostics, Inc. Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2
US6228128B1 (en) 1997-11-10 2001-05-08 Charlotte Johansen Antimicrobial activity of laccases
DE19850186A1 (de) * 1998-10-30 2000-05-25 Roche Diagnostics Gmbh Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV
US6303293B1 (en) * 1999-02-02 2001-10-16 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof
AU3219400A (en) * 1999-02-03 2000-08-25 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and reagents for molecular detection of hiv-1 groups m, n and
DE19908766C2 (de) * 1999-02-19 2001-02-15 Ulrich Schubert Verwendung synthetischer Vpr-Peptide des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) zur Entwicklung von therapeutischen und diagnostischen Reagenzien
AU3438999A (en) * 1999-05-07 2000-11-21 Nationales Zentrum Fur Retroviren Detection system for human immunodeficiency virus based on nucleic acid amplification
FR2798385B1 (fr) * 1999-06-21 2003-09-05 Bio Merieux Procede de recherche d'une resistance aux anti-proteases chez des souches du virus vih-2
EP1422298B1 (en) * 1999-07-09 2010-01-27 Gen-Probe Incorporated Detection of hiv-1 by nucleic acid amplification
US20030228600A1 (en) * 2000-07-14 2003-12-11 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
AU7104200A (en) * 2000-09-01 2002-03-22 Gen Probe Inc Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
US6582920B2 (en) 2000-09-01 2003-06-24 Gen-Probe Incorporated Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
US6870045B2 (en) 2000-10-23 2005-03-22 Gen-Probe Incorporated Kits for detecting HIV-2
US6770752B2 (en) 2001-01-09 2004-08-03 Becton, Dickinson And Company Sequences for detection of HIV-1
DE60233871D1 (de) * 2001-03-05 2009-11-12 Siemens Healthcare Diagnostics Verfahren und primer zur analyse von hiv-1-mutationen
JP4701532B2 (ja) 2001-04-26 2011-06-15 東ソー株式会社 Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法
CN1620309A (zh) * 2001-12-18 2005-05-25 蒙多生物技术实验室 用于结合分子诊断法改进间质性肺疾病的治疗的干扰素γ或甲苯吡啶酮的新型药物组合物
US20030215793A1 (en) * 2002-01-17 2003-11-20 Hahn Beatrice H. Complete genome sequence of a simian immunodeficiency virus from a wild chimpanzee
CN1301263C (zh) * 2002-12-18 2007-02-21 北京昭衍新药研究中心 一组抗hiv感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其应用
US20050222068A1 (en) 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
DE602004028862D1 (de) * 2003-12-19 2010-10-07 Gen Probe Inc Der nukleinsäuren von hiv-1 und hiv-2
TW200613554A (en) * 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
US7993647B2 (en) 2004-07-01 2011-08-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies to HIV-1 and methods of using same
KR101450497B1 (ko) 2004-09-14 2014-10-13 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신
US20090050492A1 (en) * 2005-08-02 2009-02-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Nanoporous silicon-based electrochemical nucleic acid biosensor
EP2121984A2 (en) * 2007-03-16 2009-11-25 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of hiv drug resistant variants
WO2009017743A2 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 Argos Therapeutics, Inc. Improved primers and probes for the amplification and detection of hiv gag, rev and nef polynucleotides
US8405379B1 (en) 2008-09-18 2013-03-26 Luc Montagnier System and method for the analysis of DNA sequences in biological fluids
US10545149B2 (en) * 2008-10-06 2020-01-28 Morehouse School Of Medicine Detection of HIV-related proteins in urine
CA2746508A1 (en) 2008-12-17 2010-07-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
AU2011230619C1 (en) 2010-03-25 2016-06-23 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
RS57397B8 (sr) 2011-06-10 2020-01-31 Univ Oregon Health & Science Cmv glikoproteini i rekombinantni vektori
CN102964898B (zh) 2011-08-05 2016-05-25 罗门哈斯公司 具有改进的亲水污渍排斥性的水性涂料组合物
EP2568289A3 (en) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3587181T2 (de) * 1984-10-18 1993-06-24 Centre Nat Rech Scient F antigene vom menschlichen immunodefizienz-virus und deren verwendungen.
US5386022A (en) * 1985-03-28 1995-01-31 Hoffman-La Roche Inc. Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5008182A (en) * 1986-01-10 1991-04-16 Cetus Corporation Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction
ES8706823A1 (es) 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
US5176995A (en) 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US5008185A (en) 1985-11-04 1991-04-16 Cell Analysis Systems, Inc. Methods and apparatus for the quantitation of nuclear proteins
EP0239425B1 (fr) * 1986-01-22 1989-11-02 Institut Pasteur Rétrovirus du type HIV-2 susceptible de provoquer le SIDA, et ses constituants antigéniques et nucléiques
US4839288A (en) * 1986-01-22 1989-06-13 Institut Pasteur Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5824482A (en) * 1986-06-23 1998-10-20 Institut Pasteur Purification, cloning, and characterization of a novel human immunodeficiency virus LAVMAL
US5030714A (en) * 1986-06-23 1991-07-09 Institut Pasteur Variant of LAV viruses
DE3785658T2 (de) * 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
EP0269520A3 (fr) * 1986-11-21 1988-08-24 Institut Pasteur Rétrovirus du type HIV-2 susceptible de provoquer le sida, et ses constituants antigéniques et nucléiques
US5268268A (en) 1986-11-26 1993-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of HTLVI and HTLVII viruses by hybridization
US5079351A (en) 1986-11-26 1992-01-07 Cetus Corporation Oligonucleotides and kits for detection of htlvi and htlvii viruses by hybridization
EP0272098A3 (en) * 1986-12-15 1990-06-06 City Of Hope National Medical Center Method for amplification and detection of rna sequences
AU608294B2 (en) * 1987-01-16 1991-03-28 Institut Pasteur Peptides having immunological properties 2-hiv-2
JP2774121B2 (ja) 1987-07-31 1998-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
US4963532A (en) 1987-11-25 1990-10-16 Hem Research, Inc. dsRNA-based prevention of viral escape
US5389512A (en) 1988-10-07 1995-02-14 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction
FR2647856B1 (fr) * 1989-05-31 1994-03-04 Framatome Dispositif auxiliaire de relachement commande a distance pour un mecanisme a action positive
ES2321326T3 (es) * 1989-06-02 2009-06-04 Institut Pasteur Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1, vih-2 y vis, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de secuencias del pol de estos genomas de estos retrovirus y para el diagnostico invitro de las infecciones debidas a estos virus.

Also Published As

Publication number Publication date
DE69034265D1 (de) 2009-04-09
ATE423856T1 (de) 2009-03-15
EP1715064B1 (fr) 2009-02-25
US20050037340A1 (en) 2005-02-17
DE69034260D1 (de) 2008-09-25
ATE323183T1 (de) 2006-04-15
DE69033311T2 (de) 2000-02-17
US6194142B1 (en) 2001-02-27
DE69033311D1 (de) 1999-11-11
EP2011888B1 (fr) 2010-04-28
ES2275451T1 (es) 2007-06-16
EP2011888A1 (fr) 2009-01-07
DE69034220T2 (de) 2006-12-28
US5786177A (en) 1998-07-28
HK1125136A1 (en) 2009-07-31
DE69034267D1 (de) 2010-06-10
HK1092839A1 (en) 2007-02-16
CA2685262A1 (fr) 1990-12-13
EP1642987A3 (fr) 2006-08-23
EP1642987A2 (fr) 2006-04-05
US7759477B2 (en) 2010-07-20
US5688637A (en) 1997-11-18
CA2062829A1 (fr) 1990-12-03
ATE466111T1 (de) 2010-05-15
JPH04507043A (ja) 1992-12-10
US7777020B2 (en) 2010-08-17
DE05014676T1 (de) 2007-05-10
EP0806484A2 (fr) 1997-11-12
EP0806484B1 (fr) 2006-04-12
EP1715064A8 (fr) 2007-05-16
GR3032261T3 (en) 2000-04-27
CA2062829C (fr) 2007-08-07
DE07025195T1 (de) 2009-05-07
CA2585164C (fr) 2010-02-02
ATE185379T1 (de) 1999-10-15
DK1642987T3 (da) 2008-12-01
EP0403333A3 (fr) 1991-11-21
ES2139567T3 (es) 2000-02-16
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JP2000093187A (ja) 2000-04-04
ES2315215T1 (es) 2009-04-01
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CA2585164A1 (fr) 1990-12-13
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EP0806484A3 (fr) 2000-09-13
EP0403333A2 (fr) 1990-12-19
EP0403333B1 (fr) 1999-10-06
SG47868A1 (en) 1998-04-17
EP1642987B1 (fr) 2008-08-13
JP3428012B2 (ja) 2003-07-22

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