CN118139993A - 用于乙型流感病毒的扩增和检测的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
提供了用于检测测试样品中乙型流感病毒的方法、组合物和试剂盒。使用对乙型流感病毒毒株具有极好的灵敏度、特异性和包容性的引物和/或探针,通过基于核酸的测定来确定样品中乙型流感病毒的存在或不存在。
Description
相关申请的交叉引用
无
发明领域
本公开内容涉及分子生物学和核酸化学领域。更具体地说,本公开内容涉及通过分子测定法检测病原体,诸如乙型流感病毒,并且因此也涉及医学诊断和预后领域。
发明背景
乙型流感病毒是几种能导致疾病的流感病毒之一。在人类中,流感病毒可能导致传染性急性呼吸道疾病,并且流感病毒感染可导致广泛的临床表现,从无症状感染到急性自限性流感综合征,到严重并且有时甚至致命的并发症。非常希望能够检测人类受试者(包括无症状或轻度症状受试者)中的乙型流感病毒感染,并将其与疾病的其他病毒或细菌原因区分开来。
流感病毒具有单链负义RNA的基因组,并且属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族。乙型流感病毒基因组包含八个RNA区段和大约14.5千碱基。区段1、3、4和5每个区段编码一种蛋白质:PB2、PA、HA和NP蛋白。所有流感病毒都在区段2上编码聚合酶亚基PB1。乙型流感病毒的区段6既编码NA蛋白,并且在-1交替阅读框中编码NB基质蛋白。乙型流感病毒的区段7编码M1基质蛋白。最后,区段8表达干扰素拮抗物NS1蛋白。由于缺乏RNA聚合酶的校对机制,乙型流感病毒易于频繁突变。基因组中的这些微小变化在一个叫做抗原漂移的过程中积累。
自20世纪70年代以来,乙型流感病毒被鉴定为两个可区分的谱系,命名为维多利亚(Victoria)谱系和山形(Yamagata)谱系。乙型流感病毒仅限于人类感染,并且这两种谱系都导致了每年的流行病。新的乙型流感病毒毒株和变体产生于相对频繁的抗原漂移。抗原漂移的频率使得很难提供包含人群中传播的多种毒株的乙型流感病毒检测测定。
仍然需要一种稳健的包容性乙型流感病毒检测测定,即使乙型流感病毒基因组经历遗传漂变,该测定仍将保持准确、特异和包容性。还迫切需要开发一种用于乙型流感病毒感染的快速、负担得起、样品-输入答案-输出的护理点(POC)诊断平台。
概述
本公开内容提供了用于检测测试样品中的乙型流感病毒的组合物、方法和试剂盒。样品中乙型流感病毒的存在或不存在通过基于核酸的测定使用对乙型流感病毒毒株具有极好的灵敏度、特异性和包容性的引物和/或探针来确定。
本发明技术包括包含多核苷酸组的组合物,多核苷酸组选自由Set-1至Set-47组成的组。可选择地,组合物包含多核苷酸组,多核苷酸组选自由Set-1至Set-36组成的组或选自由Set-1至Set-20组成的组。在一些实施方案中,组合物还包含探针。在一些实施方案中,探针包含标记。在一些实施方案中,探针是经标记的多核苷酸。在一些实施方案中,经标记的多核苷酸包含一个或更多个锁核酸。例如,标记物可以是荧光团,其可以共价地附接至多核苷酸的末端。在一些实施方案中,探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一些实施方案中,荧光团是FAM,并且猝灭剂是BHQ1。在替代的实施方式中,荧光团是ATTO 565或Alexa 594,并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
在一些实施方案中,组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ IDNO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ IDNO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ IDNO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ IDNO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ IDNO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。在另外的实施方式中,经标记的多核苷酸可以包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。在某些实施方式中,经标记的多核苷酸的序列选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-3至Set-11、Set-19、Set-20、Set-23至Set-30和Set-38至Set-42,并且组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25以及SEQ ID NO:69的核苷酸8-26。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸是选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。在一种实施方式中,经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且多核苷酸组是Set-11。在优选的实施方式中,经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且多核苷酸组是Set-20。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-14、Set-32和Set-44,并且组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31和SEQ ID NO:72的核苷酸8-25。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组的序列。在其它实施方案中,经标记的多核苷酸的序列选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-12、Set-13、Set-16至Set-18、Set-31、Set-34至Set-36、Set-46和Set-47,并且组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ IDNO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35以及SEQ IDNO:77的核苷酸4-29。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组的序列。在其它实施方案中,经标记的多核苷酸的序列选自由SEQID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组。
本发明的另一方面提供了一种包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标,其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35以及SEQ IDNO:77的核苷酸4-29。在一些实施方式中,分子信标包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。在其它实施方案中,多核苷酸由选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列组成。在一些实施方式中,荧光团是FAM,并且猝灭剂是BHQ1。在一些实施方式中,荧光团是ATTO 565或Alexa 594,并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
本发明的又另一方面提供了检测测试样品中乙型流感病毒的方法,方法包括(a)从测试样品提取核酸;(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列,其中序列特异性引物组选自由Set-1至Set-47组成的组;和(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在;其中扩增产物的存在指示测试样品中乙型流感病毒的存在。在一种实施方案中,步骤(b)中靶序列的扩增在约60℃和约67℃之间进行,持续少于30分钟。优选地,扩增步骤进行少于十五分钟、少于十二分钟或少于九分钟。在一些实施方式中,反应混合物还包含逆转录酶。在其他实施方式中,链置换DNA聚合酶和逆转录酶活性由单一酶提供。
在某些实施方案中,检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物与包含附接至标记物的多核苷酸的探针杂交。在一些实施方案中,经标记的多核苷酸包含一个或更多个锁核酸。在优选的实施方式中,标记是荧光团,其优选地附接至多核苷酸的末端。在特别优选的实施方案中,探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中,荧光团是FAM,并且猝灭剂是BHQ1。在替代的实施方式中,荧光团是ATTO 565或Alexa 594,并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。该方法可以使用引物组和经标记的多核苷酸的任何组合来实施,例如本文描述的分子信标。在一些实施方式中,扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应,其中序列特异性引物组选自由以下组成的组:Set-1至Set-47,可选择地选自由Set-1至Set-36组成的组,可选择地选自由Set-1至Set-20组成的组。在这样的实施方式中,检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物与分子信标杂交,分子信标包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。在一些实施方式中,多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-3至Set-11、Set-19、Set-20、Set-23至Set-30和Set-38至Set-42,并且经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25和SEQ ID NO:69的核苷酸8-26。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。在一种实施方式中,经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且多核苷酸组是Set-11。在优选的实施方式中,经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且多核苷酸组是Set-20。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-14、Set-32和Set-44,并且经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQID NO:71的核苷酸8-31和SEQ ID NO:72的核苷酸8-25。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组的序列。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-12、Set-13、Set-16至Set-18、Set-31、Set-34至Set-36、Set-46和Set-47,并且经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。在一些实施方式中,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
本发明的又另一方面提供了试剂盒,该试剂盒包含含有选自由Set-1至Set-47组成的组的多核苷酸组的组合物。在一些实施方案中,试剂盒还包含链置换聚合酶,和任选地逆转录酶。在某些实施方案中,试剂盒包含分子信标,分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸,其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ IDNO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ IDNO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ IDNO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ IDNO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ IDNO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ IDNO:77的核苷酸4-29。分子信标的多核苷酸序列可以包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ IDNO:77组成的组的序列。在一些实施方案中,分子信标的多核苷酸序列由选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列组成。在一种实施方案中,分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO:65组成,并且多核苷酸组是Set-11。在优选的实施方式中,经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且多核苷酸组是Set-20。
本发明的另一方面提供了检测测试样品中乙型流感病毒的方法,方法包括(a)从测试样品提取核酸;(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性LAMP引物组的反应混合物反应少于15分钟来扩增靶序列;和(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在;其中扩增产物的存在指示测试样品中乙型流感病毒的存在。在一些实施方式中,扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应,其中所述序列特异性引物组选自由Set-1至Set-47组成的组。在这样的实施方式中,检测步骤(b)中的扩增产物的存在或不存在包括使扩增产物与包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的多核苷酸序列的分子信标杂交。在另外的实施方式中,检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物与包含由SEQ ID NO:65组成的多核苷酸序列的分子信标杂交。
在一些实施方案中,本发明的组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至77组成的组的序列,可选择地由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列,可选择地SEQ ID NO:65的序列。在另外的实施方案中,经标记的多核苷酸可以包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列和荧光团诸如FAM以及猝灭剂诸如BHQ1。
在一些实施方案中,多核苷酸组选自由Set-1至Set-47组成的组(即,选自由以下组成的组:Set-1、Set-2、Set-3、Set-4、Set-5、Set-6、Set-7、Set-8、Set-9、Set-10、Set-11、Set-12、Set-13、Set-14、Set-15、Set-16、Set-17、Set-18、Set-19、Set-20、Set-21、Set-22、Set-23、Set-24、Set-25、Set-26、Set-27、Set-28、Set-29、Set-30、Set-31、Set-32、Set-33、Set-34、Set-35、Set-36、Set-37、Set-38、Set-39、Set-40、Set-41、Set-42、Set-43、Set-44、Set-45、Set-46和Set-47),可选择地由Set-1至Set-36组成的组,可选择地由Set-1至Set-20组成的组,并且组合物包含经标记的多核苷酸,经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:61至77组成的组的序列。在一些实施方案中,经标记的多核苷酸的序列选自SEQ ID NO:62、64、65或66,并且多核苷酸组选自由Set-11组成的组。在其它实施方案中,多核苷酸组是Set-5、Set-11、Set-14或Set-16。在一些实施方案中,本发明的方法、组合物和试剂盒包含以下的的组合:引物Set-5和分子信标MB1、MB2或MB3中的一个或更多个;引物Set-11或Set-20和分子信标MB2、MB4、MB5或MB6中的一个或更多个;引物组Set-4和分子信标MB7、MB8或MB9中的一个或更多个;引物Set-14和分子信标MB10、MB11或MB12中的一个或更多个;引物Set-16和分子信标MB13、MB14、MB15、MB16或MB17中的一个或更多个。
作为本发明技术的另一方面,提供了用于检测测试样品中的乙型流感病毒的方法,其中该方法包括(a)从测试样品中提取核酸;(b)通过将步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应少于十五分钟来扩增靶序列;以及(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在;其中扩增产物的存在指示测试样品中乙型流感病毒的存在。
在一些实施方案中,靶序列在步骤(b)中的扩增在约60℃和约67℃之间进行少于30分钟。优选地,扩增步骤进行少于15分钟、少于10分钟或少于6分钟。
在一些实施方案中,乙型流感病毒以≤5000拷贝、或≤500拷贝、或≤440拷贝、或≤400拷贝、或≤150拷贝、或≤100拷贝、或≤50拷贝或≤20拷贝的量存在于测试样品中。
在一些实施方案中,本发明的方法、组合物和试剂盒包容多于一种乙型流感病毒谱系和/或多种乙型流感病毒毒株。例如,本发明的方法、组合物和试剂盒能够扩增来自乙型流感病毒维多利亚谱系和乙型流感病毒山形谱系二者的多核苷酸并且检测二者。在一些实施方案中,还检测一种或更多种前山形/维多利亚谱系。在一些实施方案中,本发明的方法、组合物和试剂盒能够扩增来自以下乙型流感病毒毒株的至少10种、可选择地以下乙型流感病毒毒株的至少15种、可选择地所有以下乙型流感病毒毒株的多核苷酸并检测这些病毒毒株:
在本发明方法的一些实施方案中,检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物与包含附接至标记物的多核苷酸的探针杂交。在一些实施方案中,标记物是荧光团,其优选地共价地附接至多核苷酸的末端。在一些实施方案中,探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中,荧光团是FAM,并且猝灭剂是BHQ1。在替代的实施方式中,荧光团是ATTO 565或Alexa 594,并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。该方法可以使用引物组和经标记的多核苷酸(例如本文描述的分子信标)的任何组合来实施。
作为本发明技术的又另一个方面,提供了包含多核苷酸组的试剂盒,多核苷酸组选自由Set-1至Set-47组成的组,可选择地由Set-1至Set-36组成的组,可选择地由Set-1至Set-20组成的组。在一些实施方案中,试剂盒还包含链置换聚合酶,和任选地逆转录酶。在一些实施方案中,试剂盒还包含探针。在一些实施方案中,试剂盒包含分子信标,分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸,其中多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至77组成的组,可选择地由SEQ ID NO:61至69组成的组,可选择地SEQ ID NO:65的序列。
在本文描述方法的一些实施方案中,除了乙型流感病毒之外,测试样品还包含一种或更多种其他微生物,并且其中来自乙型流感病毒的靶序列比来自一种或更多种其他微生物的多核苷酸序列被优先扩增。在一些实施方案中,步骤(b)的扩增产物基本上不含来自其他微生物的序列。在一些实施方案中,序列特异性引物组基本上不扩增来自以下一种或更多种微生物或来自以下所有微生物的多核苷酸:冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、MERS-冠状病毒、腺病毒、人类偏肺病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、白念珠菌(Candidaalbicans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)。
在一些实施方案中,本发明技术提供了与SEQ ID NO:1-60中的任何一种至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%相同的核酸序列以及使用这些核酸序列检测测试样品中的乙型流感病毒的方法。在一些实施方案中,本发明的组合物、方法或试剂盒包含与由以下组成的组中的任何一种至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%相同的核酸序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。本公开内容还提供了使用这些核酸序列检测测试样品中的乙型流感病毒的方法。
在一些实施方案中,检测来自受试者的样品中乙型流感病毒的存在或不存在的本发明方法包括检测样品中选自基质蛋白基因(M)、非结构基因(NS)和聚合酶酸性基因(PA)的至少一种乙型流感病毒基因的存在或不存在。在一些实施方案中,方法包括检测来自受试者的样品中选自基质蛋白(M)基因、非结构(NS)基因和聚合酶酸性(PA)基因的至少一种乙型流感病毒基因的存在或不存在。在一些实施方案中,本发明的方法包括检测M基因的存在或不存在。在一些实施方案中,方法包括检测NS或PA基因的存在或不存在。在一些实施方案中,方法包括检测M基因和NS基因,或者M基因和PA基因的存在或不存在。在一些实施方案中,该方法还包括检测至少一种乙型流感病毒非结构(NS)基因的存在或不存在。在一些实施方案中,该方法还包括检测至少一种流感血凝素(HA)基因的存在或不存在。在一些实施方案中,该方法包括检测乙型流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的存在或不存在。
详述
通过分子分析检测乙型流感病毒是一个挑战,因为目前在人类中共同传播的乙型流感病毒有两种抗原性不同的谱系。本发明的技术涉及各种各样的乙型流感病毒毒株的选择性和包容性检测。特别地,基于利用核酸扩增的检测策略,特别是RT-LAMP和分子信标检测,可以使用本文描述的方法和组合物来诊断乙型流感病毒感染。此外,本文描述的分子信标检测试剂提供了另外的特异性。本文还描述了本发明技术的许多其他特征。
在描述各种实施方案之前,应当理解,本公开内容的教导不限于所描述的特定实施方案。除非另有定义,否则本文使用的技术和科学术语具有在本公开内容的相关领域工作的人员通常理解的含义。本文提及的所有专利和出版物都通过引用以其整体明确并入。
如本文使用的,“核酸”包括DNA和RNA两者,包括包含非标准核苷酸的DNA和RNA。“核酸”包含至少一个多核苷酸(“核酸链”)。“核酸”可以是单链或双链的。术语“核酸”是指核苷酸和核苷,它们构成例如脱氧核糖核酸(DNA)大分子和核糖核酸(RNA)大分子。最常见的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。应当进一步理解,本文的引物和探针可以包含一种或更多种人工核苷酸,诸如肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)等。在一些实施方案中,人工核苷酸是锁核酸分子,包含[α]-L-LNA。LNA包含核糖核酸类似物,其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥“锁定”。本文的引物和探针可以包含含有至少一种LNA单体的寡核苷酸,即一种2’-O,4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸,可选择地至少2、3、4或更多种LNA单体。LNA碱基形成标准的Watson-Crick碱基对,但锁定配置增加了碱基配对反应的速率和稳定性(Jepsen等人,Oligonucleotides,14,130-146(2004))。
如本文使用的,“多核苷酸”是指包含两个或更多个核苷酸的聚合链,其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物,诸如包含修饰的主链(例如锁核酸(LNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。“多核苷酸”包括引物、寡核苷酸、核酸链等。多核苷酸可以包含标准、非标准或人工核苷酸。因此,该术语包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、探针、引物等。通常,多核苷酸在链的一个末端(“5’末端”)包含5’磷酸,并在链的另一末端(“3’末端”)包含3’羟基基团。多核苷酸的最5’侧的核苷酸在本文中可称为多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’侧的核苷酸在本文中可称为多核苷酸的“3’末端核苷酸”。当本公开内容的核酸采用RNA的形式时,它可以具有或不具有5’帽。
本文中的核苷酸序列采用国际纯化学与应用化学联合会(International Unionof Pure and Applied Chemistry,IUPAC)为核碱基定义的单字母缩写。更具体地,以下缩写用于标识含有所标识的核碱基的特定核苷酸和其中可能存在多于一种核苷酸的简并核苷酸:
A=腺嘌呤 | Y=C或T | K=G或T | H=A或C或T |
C=胞嘧啶 | R=A或G | M=A或C | V=A或C或G |
G=鸟嘌呤 | W=A或T | B=C或G或T | N=A或C或G或T |
T=胸腺嘧啶 | S=G或C | D=A或G或T | |
U=尿嘧啶 |
本文使用缩写I来标识肌苷。“简并”核苷酸序列意味着在具有该序列的给定分子中的某个位置处可能存在多于一种核碱基。在一些实施方案中,简并核苷酸序列引物可以包含选自R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N(如IUPAC编码所定义的)的一种或更多种(例如,至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或5至30种或更多种)核苷酸。在一些实施方式中,可选的核碱基在多核苷酸群体中等量存在。作为实例,在给定位置处包含R的多核苷酸群体中,约50%的多核苷酸在该位置处具有A,并且约50%的多核苷酸在该位置处具有G。在其他实施方式中,可选的核碱基在多核苷酸群体中以不等量存在。例如,在给定位置处包含R的多核苷酸群体中,约X%的多核苷酸可以在该位置处具有A,并且约(100-X)%的多核苷酸可以在该位置处具有G,其中X可以是0和100之间的任何值,诸如5、10、20、25、33、67、75、80、90或95。
LAMP(环介导等温扩增)是一种核酸扩增方法,它依赖于由Bst DNA聚合酶或其他链置换聚合酶进行的自动循环链置换DNA合成。扩增产物为具有靶的若干重复的序列的茎环结构,并具有多个环。LAMP的优点是不需要DNA模板的变性,并且因此LAMP反应可以在等温条件下进行(例如,范围从60℃到67℃)。LAMP通常仅使用一种酶和四种类型的引物来识别靶序列中的六个不同杂交位点,尽管在一些实施方式中,使用了两种类型的引物。通过添加两种另外的引物(总共六个引物)可以加速反应。该方法产生大量的扩增产物,导致更容易的检测,诸如通过视觉判断反应混合物的浊度或荧光来检测。
LAMP反应由一对“成环”引物(分别为正向内部引物FIP和反向内部引物BIP)的退火和延伸起始,然后是一对侧翼引物(F3和B3)的退火和延伸。可选择地,通过引物F3和B3的退火和延伸起始LAMP反应,随后是引物FIP和BIP的退火和延伸。这些引物的延伸导致成环元件的链置换,这些元件折叠形成末端发夹环结构。在这些关键结构出现后,扩增过程就会自我维持,并在恒温以连续和指数的方式(而不是像PCR那样的循环方式)继续进行,直到反应混合物中的所有核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)都掺入到扩增的DNA中。任选地,可以包括另外的引物对以加速反应。这些引物称为环引物,与内部引物哑铃形产物的非内部引物结合的末端环杂交。
如本文使用的术语“引物”是指这样的寡核苷酸,当将其放置在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件下,即在存在核苷酸和聚合剂诸如DNA聚合酶的情况下,并在合适的温度和pH时,其能够充当合成的起始点。“简并引物”是指具有一种或更多种简并核苷酸的引物,使得该引物将包含在简并核苷酸位置处具有各种碱基的各个分子。举例来说,包含序列AAAGTTCTTCCGTGACCAR(SEQ ID NO:19)的简并引物包含具有序列AAAGTTCTTCCGTGACCAA(SEQ ID NO:78)和AAAGTTCTTCCGTGACCAG(SEQ ID NO:57)的各个引物分子。
LAMP允许以比PCR更高的灵敏度扩增靶DNA序列,通常反应时间低于30分钟,这相当于最快的实时PCR测试。被扩增的靶序列通常长度为200-300个碱基对(bp),并且反应依赖于在扩增过程期间由几个引物同时识别该序列的120bp和160bp之间。这种高水平的严格性使得扩增具有高的特异性,使得只有当整个靶序列最初存在时,反应中扩增的DNA的出现才会发生。
LAMP的应用还已经扩展到包括通过逆转录酶(RT)的添加来检测RNA分子。通过包括RNA检测,LAMP可应用的靶的类型也被扩展,并增加了另外的靶向基于RNA的病毒、重要的调节性非编码RNA(sRNA、miRNA)、以及已经与特定疾病或生理状态相关联的RNA分子的能力。检测RNA的能力还具有提高测定灵敏度的潜力,例如在选择高表达、稳定和/或丰富的信使RNA(mRNA)或核糖体RNA(rRNA)靶方面。这个扩增的初步阶段包括RNA分子向互补DNA(cDNA)的逆转录。cDNA然后用作链置换DNA聚合酶的模板。使用热稳定RT酶(即NEB RTx)使反应能够在单一温度和在一步、单一混合物反应中完成。在一些实施方式中,用于LAMP反应的链置换DNA聚合酶可以具有固有的逆转录酶活性,并且因此可以使用具有双重功能的单一酶来扩增和检测RNA分子。例如,Bst 2.0(New England Biolabs)具有DNA聚合酶和逆转录酶能力二者。
如本文使用的“靶序列”意指使用一种或更多种本文提供的多核苷酸进行扩增、检测,或扩增和检测两者的乙型流感病毒的核酸序列或其互补物。此外,虽然术语靶序列有时指双链核酸序列,但本领域技术人员将认识到靶序列也可以是单链的,例如RNA。可以选择对特定生物体或多或少具有特异性的靶序列。例如,靶序列可以是对整个属、多于一个属、物种或亚种、血清群、营养型、血清型、株系(strain)、分离株或其他生物体亚组特异性的。
如本文所用,术语“大约”和“约”是指在本领域普通技术人员可接受的限度或量内。术语“约”通常指所示数字的正负15%。例如,“约10”可以指示8.5到11.5的范围。例如,“大约相同”意味着本领域普通技术人员认为被比较的项目是相同的。在本公开内容中,数字范围包括定义该范围的数字。还公开了规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。在规定的范围包括限值的情况下,排除这些包括的限值中的一个或两个的范围也被包括在本公开内容中。
如本文使用的,术语“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括单数和复数指代物两者,除非上下文另有明确规定。因此,例如,“流体”包括一种流体和多于一种流体。除非另有指示,否则术语“第一”、“第二”、“第三”和其他序号在本文用于区分本发明***和方法的不同要素,并且不意图提供数字限制。提及第一和第二引物不应解释为意指组合物只有两种引物。除非另有指示,否则具有第一和第二要素的组合物、方法或试剂盒也可以包括第三、第四、第五等要素。
应理解,本文所使用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的,而不意图是限制性的。所定义的术语是对在本教导的技术领域中通常理解和接受的所定义术语的技术和科学含义的补充。
作为本公开内容的一个方面,提供了用于扩增乙型流感病毒基因组的一个或更多个部分的引物。用于在本发明组合物、方法和试剂盒中使用的示例性引物包括:
表1:引物序列
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本文公开的引物为检测乙型流感病毒提供了极好的速度、特异性和灵敏度,特别是(但不限于)当它们与本文描述的用于乙型流感病毒多核苷酸序列的探针一起使用时。使用引物检测扩增产物可以经由多种方法实现。在一些实施方案中,扩增产物(扩增子)的检测通过向引物混合物中添加荧光标记的探针来进行。在一些实施方案中,荧光标记的探针是分子信标。
本文使用的“探针”是指包含与靶序列互补或基本互补的一个或更多个部分的核酸分子。
如本文使用的,“分子信标”是指单链发夹状寡核苷酸探针,其设计用于报告溶液中特定核酸的存在。分子信标由四个组分组成:茎、发夹环、末端标记的荧光团和相对末端标记的猝灭剂(Tyagi等人,(1998)Nature Biotechnology 16:49-53)。当发夹样信标未与靶结合时,荧光团和猝灭剂紧密地靠在一起,并且荧光被抑制。在存在互补的靶核苷酸序列的情况下,信标的茎打开以与靶杂交。这将荧光团和猝灭剂分开,允许荧光团发出荧光。可选地,分子信标还包含在末端标记的供体附近发射的荧光团。“波长位移分子信标(Wavelength-shifting Molecular Beacons)”掺入了另外的收集荧光团,使荧光团能够发射得更加强烈。目前对分子信标的综述包括:Wang等人,2009,Angew Chem Int Ed Engl,48(5):856-870;Cissell等人,2009,Anal Bioanal Chem 393(1):125-35;Li等人,2008,Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61;和Cady,2009,Methods Mol Biol 554:367-79。
在一种实施方案中,分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸,其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。在另一种实施方案中,多核苷酸由选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列组成。
分子信标优选地用于还包含序列特异性LAMP引物组的组合物中。在一种实施方式中,分子信标包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。在这样的实施方式中,分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。更优选地,分子信标的多核苷酸序列由选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列组成。在特别优选的实施方式中,分子信标的多核苷酸序列是SEQ ID NO:65。
当被包含在包含选自由Set-3至Set-11、Set-19、Set-20、Set-23至Set-30和Set-38至Set-42组成的组的多核苷酸组的组合物中时,分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25以及SEQ ID NO:69的核苷酸8-26。更具体地,分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。在某些实施方式中,分子信标的序列选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组。
当被包含在含有选自由Set-14、Set-32和Set-44组成的组的多核苷酸组的组合物中时,分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25。更具体地,分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组的序列。在某些实施方式中,分子信标的序列选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组。
当被包含在含有选自由Set-12、Set-13、Set-16至Set-18、Set-31、Set-34至Set-36、Set-46和Set-47组成的组的多核苷酸组的组合物中时,分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。更具体地,分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组的序列。在某些实施方式中,分子信标的序列选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组。
如本文使用的术语“标记物”意指具有能够检测和任选地定量的特性或特征的分子或部分。标记物可以是直接可检测的,如用例如(且不限于)放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒等可检测的;或者标记物可以是间接可检测的,如用例如特异性结合成员可检测的。应当理解,直接可检测的标记物可能需要另外的组分,诸如例如底物、触发试剂、猝灭部分、光等,以实现标记物的检测和/或定量。当使用间接可检测的标记物时,它们通常与“缀合物”联合使用。缀合物通常是已经附接或偶联到直接可检测的标记物的特异性结合成员。用于合成缀合物的偶联化学是本领域熟知的,并且可以包括例如不破坏特异性结合成员的特异性结合特性或标记物的可检测特性的任何化学手段和/或物理手段。如本文使用的,“特异性结合成员”意指结合对的成员,结合对即两个不同的分子,其中一个分子通过例如化学或物理手段与另一个分子特异性结合。除抗原和抗体特异性结合对外,其他特异性结合对包括但不意图限于抗生物素蛋白和生物素;半抗原和半抗原特异性抗体;互补核苷酸序列;酶辅因子或底物和酶;等等。
分子信标可以仅包含核酸诸如DNA或RNA,或者它可以包含肽核酸(PNA)缀合物。荧光团可以是任何荧光实体,诸如有机染料或单个量子点。猝灭部分理想地猝灭荧光团的发光。可以使用任何合适的猝灭荧光团发光的猝灭部分。荧光团可以是本领域已知的任何荧光标志物/染料。合适的荧光标志物的实例包括但不限于Fam、Hex、Tet、Joe、Rox、Tamra、Max、Edans、Cy染料诸如Cy5、荧光素、香豆素、曙红、罗丹明、Bodipy、Alexa、Cascade Blue、Yakima Yellow、Lucifer Yellow、得克萨斯红和ATTO染料家族。猝灭剂可以是本领域中已知的任何猝灭剂。猝灭剂的实例包括但不限于Dabcyl、Dark Quencher、Eclipse DarkQuencher、ElleQuencher、Tamra、BHQ和QSY(都是商标)。技术人员在设计探针时会知道染料/猝灭剂的哪些组合是合适的。在示例性实施方案中,荧光素(FAM)与BlackholeQuencherTM(BHQTM)(Biosearch Technologies,Novato,CA)一起使用。然后,分子信标与扩增产物的结合可以直接可视化地评估。可选地,荧光水平可以通过光谱学来测量,以提高灵敏度。
多种商业供应商生产标准和定制的分子信标,包括Abingdon Health(UK;(www)abingdonhealth.com)、Attostar(US,MN;(www)attostar.com)、Biolegio(NLD;(www)biolegio.com)、Biomers.net(DEU;www.biomers.net)、Biosearch Technologies(US,CA;(www)biosearchtech.com)、Eurogentec(BEL;(www)eurogentec.com)、Gene Link(US,NY;(www)genelink.com)、Integrated DNATechnologies(US,IA;(www)idtdna.com)、IsogenLife Science(NLD;(www)isogen-lifescience.com)、Midland Certified Reagent(US,TX;(www)oligos.com)、Eurofins(DEU;(www)eurofinsgenomics.eu)、Sigma-Aldrich(US,TX;(www)sigmaaldrich.com)、Thermo Scientific(US,MA;(www)thermoscientific.com)、TIB MOLBIOL(DEU;(www)tib-molbiol.de)、TriLink Bio Technologies(US,CA;(www)trilinkbiotech.com)。利用分子信标的多种试剂盒也是商购可得的,诸如来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的SentinelTM Molecular Beacon Allelic Discrimination试剂盒以及来自Eurogentec SA(Belgium,eurogentec.com)和Isogen Bioscience BV(TheNetherlands,isogen.com)的多种试剂盒。
本发明的探针和引物任选地使用本领域已知的基本上任何技术制备。在一些实施方案中,例如,本文描述的本发明的探针和引物使用基本上任何核酸合成方法化学合成,包括例如根据Beaucage和Caruthers(1981),Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862描述的固相亚磷酰胺三酯方法,其通过引用并入,或者本领域已知的另一合成技术,例如,如Needham-VanDevanter等人,(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-6168描述的使用自动合成器,其通过引用并入。用于自动化寡核苷酸合成的各种各样的设备是商购可得的。还任选地利用多-核苷酸(multi-nucleotide)合成方法(例如,三-核苷酸合成等)。此外,本文描述的引物任选地包含各种修饰。为了进一步说明,引物也任选地被修饰以提高扩增反应的特异性,例如如1999年12月14日发布的美国专利第6,001,611号中描述的,该专利通过引用并入。引物和探针也可以合成为带有本文中描述的或其他本领域中已知的各种其他修饰。
此外,基本上任何核酸(和几乎任何标记的核酸,无论是标准的或非标准的)都可以从多种商业来源(诸如Integrated DNA Technologies、the Midland CertifiedReagent Company、Eurofins、Biosearch Technologies、Sigma Aldrich和许多其他来源)中的任何一个定制或标准订购。
测试样品通常来自或分离自怀疑患有乙型流感病毒感染的受试者,通常是哺乳动物受试者,更通常是人类受试者。示例性样品或样本包括为唾液、眼泪、黏液、痰、血液、血浆、血清、尿液、滑液、***、***、***液、***液、宫颈液、子宫液、宫颈刮屑、羊水、***刮屑、组织等中的一种或更多种的样品。任选地使用用于获取这些样品的基本上任何技术,包括例如刮擦、静脉穿刺、擦拭、活检或本领域已知的其他技术。
如本文使用的术语“测试样品”意指取自怀疑包含或可能包含靶序列的生物体或生物流体的样品。测试样品可以取自任何生物来源,诸如例如唾液、眼泪、黏液、痰、组织、血液、汗液、尿液、尿道拭子、宫颈拭子、***拭子、泌尿生殖或***拭子、结膜拭子、眼晶状体液、脑脊液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、发酵液、细胞培养物、化学反应混合物等。测试样品可以(i)按从来源获得的那样直接使用或(ii)在预处理以修改样品的特征后使用。因此,可以通过例如从血液制备血浆或血清、破坏细胞或病毒颗粒、从固体材料制备液体、稀释黏性流体、过滤液体、蒸馏液体、浓缩液体、灭活干扰组分、添加试剂、纯化核酸等在使用前对测试样品进行预处理。
有利地,本发明能够实现可靠地快速检测临床样品(诸如唾液或鼻拭子或咽拭子)中的乙型流感病毒。
为了进一步说明,在分析本文描述的靶核酸之前,可以从典型地包含不同组分的复杂混合物的样品纯化或分离这些核酸。收集的样品中的细胞通常被裂解以释放细胞内容物。例如,特定样品中的细胞可以通过使它们与各种酶、化学物质接触来裂解,和/或通过本领域已知的降解例如细菌细胞壁的其他方法来裂解。在一些实施方案中,直接在细胞裂解物中分析核酸。在其他实施方案中,核酸在检测之前从细胞裂解物进一步纯化或提取。基本上任何核酸提取方法都可以用于纯化本发明方法中使用的样品中的核酸。可用于纯化核酸的示例性技术包括,例如,亲和层析、与固定在固体支持物上的探针杂交、液-液萃取(例如,苯酚-氯仿萃取等)、沉淀(例如,使用乙醇等)、用滤纸提取、用胶束形成试剂(例如,十六烷基-三甲基-溴化铵等)提取、与固定的嵌入染料(例如,溴化乙锭、吖啶等)结合、吸附到硅胶或硅藻土、在离液条件下吸附到磁性玻璃颗粒或有机硅烷颗粒等。样品处理也在例如美国专利第5,155,018号、第6,383,393号和第5,234,809号中描述,其各自通过引用并入。
测试样品可以任选地根据本领域技术人员已知的任何技术处理和/或纯化,以改进扩增效率和/或定性准确性和/或定量准确性。因此,样品可以完全或基本上由核酸组成,无论是通过纯化、分离还是通过化学合成获得。对于希望从测试样品分离或纯化核酸(诸如DNA),例如从鼻刮屑分离或纯化DNA的技术人员,手段是可获得的(例如,QIAamp-DNA微型试剂盒;Qiagen,Hilden,Germany)。
实施例:
实施例1:用于乙型流感病毒基因的组
使用LAMP designer程序设计环介导的扩增引物,用于扩增乙型流感病毒基因的某些部分,包括M基因、NS基因和PA基因。使用BLAST针对人类基因组和NCBI核苷酸数据库进一步分析引物组的特异性。
引物组的实施方案总结在表2中,其至少包括正向内部引物(FIP)和反向内部引物(BIP)。此外,引物组通常还包括至少两种或至少四种另外的选自正向外部引物(F3)、反向外部引物(B3)、正向环引物(LF)和反向环引物(LB)的引物。
表2:LAMP引物组
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实施例2:扩增反应
在本实施例中,评估了表2中的乙型流感病毒引物组扩增来自乙型流感病毒的M基因或NS基因或PA基因的部分的能力。下表3描述了引物组、扩增频率和由染料(To-Pro-3或Cy5)检测并由仪器计算的到阳性的时间(Tp)的值。
用带有不同浓度的ZeptoMetrix乙型流感病毒NATrol(标记为未稀释的、10-1、10-2或10-3)或乙型流感病毒毒株提取物(标记为拷贝/反应(cp/rxn))的RT-LAMP反应混合物评估引物组。每个引物组的灵敏度是观察到100%阳性的最低浓度。
对于本实施例,20μl反应包含1X等温扩增缓冲液(New England Biolabs),其包含4-10mM MgSO4、5-70mM KCl、10-20mM(NH4)2SO4、1.4-2.0mM dNTP、0-2mM TCEP、0-300mM海藻糖(Life Science Advanced Technologies)、10-40mM Tris pH 9.0、0-0.5% Tween 20。如果实验设计允许的话,另外添加Bst 2.0聚合酶(New England Biolabs)和热启动RTx(逆转录酶;New England Biolabs)与400nM TO-Pro-3染料(Life Technologies)。加入引物(0.2μM的F3和B3、2.0μM的FIP和BIP、以及0.8μM的LF和LB)和定量基因组RNA(作为模板)。将反应在64℃孵育,并使用Roche实时Lightcycler96(Roche)监测反应动力学。
表3:到阳性的时间染料检测
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引物Set-1至引物Set-18和引物Set-20除了实现快速扩增动力学之外,还具有使用环介导的扩增方法扩增M基因、NS基因或PA基因的部分的能力。
实施例3:分子信标
在本实施例中,设计了用作探针和分子信标的寡核苷酸,用于检测乙型流感病毒基因的部分的存在,诸如来自本文列出的引物组的扩增子。分子信标或探针是手动和/或使用信标设计程序诸如Premier Biosoft设计的。使用BLAST针对人类基因组和NCBI核苷酸数据库进一步分析信标的寡核苷酸序列的特异性。
下表4描述了与本文描述的引物组一起设计的用于检测来自乙型流感病毒的基因的部分的示例性分子信标。分子信标包含如下所示的荧光团、猝灭剂和寡核苷酸序列。每个分子信标探针设计有5’荧光团和3’猝灭剂修饰。在优选的实施方案中,荧光团是6-羧基荧光素(FAM),并且猝灭剂是Black Hole Quencher 1(BHQ1)。括号“{}”表示LNA核苷酸。
表4:探针序列
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实施例4:扩增反应
将重悬于VTM基质中的鼻拭子掺入不同浓度(范围为20拷贝/反应至500拷贝/反应)的定量基因组RNA(毒株Wisconsin/1/2010,VR-1885DQ,ATCC)。使用LAMP引物组(根据表2)和一个分子信标(根据表4)扩增样品,以检测扩增产物。在本实施例中,20μl反应包含1X等温扩增缓冲液(New England Biolabs),其包含4-10mM MgSO4、5-70mM KCl、10-20mM(NH4)2SO4、1.4-2.0mM dNTP、0-2mM TCEP、0-300mM海藻糖(Life Science AdvancedTechnologies)、10-40mM Tris pH 9.0和0-0.5% Tween 20。另外添加Bst 2.0聚合酶(NewEngland Biolabs)和热启动RTx(逆转录酶;New England Biolabs)与200nM设计的分子信标(Eurofins)以检测RT-LAMP扩增子。添加引物(0.2μM F3和B3、2.0μM FIP和BIP以及0.8μMLF和LB)以及定量基因组RNA(作为模板)。反应在64℃孵育,并使用Roche实时Lightcycler96(Roche)监测反应动力学。表5示出了引物-探针组合在检测到100%阳性的最低浓度,从反应开始到阳性的时间(Tp)。
表5:到阳性的时间探针检测
本实施例表明,包含本文描述的引物组和分子信标的乙型流感病毒测定能够以优异的灵敏度检测乙型流感病毒,每次反应的量≤500拷贝或低至125拷贝。
实施例5:对乙型流感病毒毒株的包容性
如本文先前描述,乙型流感病毒的两种抗原性不同的谱系正在传播。用分子信标MB5分别测试引物Set-11用于检测多种流感毒株的包容性。用引物Set-11和/或Set-20和MB5在440cp/rxn或低于440cp/rxn测试总共9个维多利亚谱系和13个山形谱系毒株(列于表6中)的扩增。星号表示在15min内被展示扩增超过440cp/rxn的毒株。用提取的病毒基因组RNA测试该测定。
表6:乙型流感病毒毒株的包容性
所有毒株均被乙型流感病毒测定检测到,这表明本测定具有高度的包容性。乙型流感病毒测定的包容性可以通过体外和/或计算机模拟测试针对另外的毒株进行进一步评估。
实施例7:对乙型流感病毒的选择性
本实施例通过示出不存在与来自其他生物体/实体的多核苷酸的交叉反应性,展示了本测定对乙型流感病毒的选择性。共提取了28种生物体/实体,并使用包含引物Set-11和MB5的乙型流感病毒检测测定测试了潜在的交叉反应性。对表7示出的生物体/实体进行扩增测试。单次提取重复三个技术重复。
表7:用于测试测定选择性的毒株/菌株
没有观察到与任何前述生物体/实体的交叉反应性。因此,本乙型流感病毒测定显示出对乙型流感病毒的高选择性。
实施例8:乙型流感病毒测定的特异性
本实施例展示了本乙型流感病毒测定的优异特异性。针对阴性临床样品独立测试包含引物Set-11和MB5的乙型流感病毒测定,以评估该测定的特异性。用该测定共测试了VTM中的20份鼻拭子(NS)和20份鼻咽拭子(NPS)。结果如下:
样品基质 | 乙型流感病毒测定 |
鼻拭子 | 无扩增 |
鼻咽拭子 | 无扩增 |
从拭子没有观察到非特异性扩增。本实施例展示了本测定对乙型流感病毒是特异性的。
尽管为了便于理解,已经对本发明方法、组合物和试剂盒进行了一些详细的描述,但是应该认识到,在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下,可以对其进行各种改变和修改。因此,前面仅仅说明了本发明技术的原理。将理解的是,本领域技术人员将能够设计出各种布置,尽管本文未明确描述或显示,这些布置体现本发明技术的原理并且被包括在本发明技术的精神和范围内。此外,本文列举本发明方法、组合物和试剂盒的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述意图包括其结构和功能等同物。另外,意在这样的等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物,即开发的执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。鉴于本公开内容,设想示例性方法、组合物和试剂盒的替代实施方案可以按照本教导来实现。此外,各种组件、材料、结构和参数仅通过说明和示例的方式被包括,而不具有任何限制性意义。鉴于本公开内容,本教导可以在其他应用中实现,并且可以确定实现这些应用的组件、材料、结构和设备,同时保持在所附权利要求的范围内。
Claims (58)
1.一种组合物,所述组合物包含选自由Set-1至Set-47组成的组的多核苷酸组。
2.根据权利要求1所述的组合物,所述组合物还包含探针。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中所述探针包含标记物。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述探针是经标记的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含一个或更多个锁核酸。
6.根据权利要求4或5所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。
7.根据权利要求4所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物,其中所述标记物是荧光团。
9.根据权利要求8所述的组合物,其中所述荧光团共价地附接至所述多核苷酸的末端。
10.根据权利要求1所述的组合物,还包含经标记的多核苷酸,所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25和SEQ ID NO:69的核苷酸8-26,并且其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-3至Set-11、Set-19、Set-20、Set-23至Set-30和Set-38至Set-42。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且所述多核苷酸组是Set-11。
13.根据权利要求11所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且所述多核苷酸组是Set-20。
14.根据权利要求1所述的组合物,还包含经标记的多核苷酸,所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25,并且其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-14、Set-32和Set-44。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:70至SEQ ID NO:72组成的组的序列。
16.根据权利要求1所述的组合物,还包含经标记的多核苷酸,所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29,并且其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组:Set-12、Set-13、Set-16至Set-18、Set-31、Set-34至Set-36、Set-46和Set-47。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:73至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
18.根据权利要求2所述的组合物,其中所述探针是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。
20.根据权利要求19所述的组合物,其中所述分子信标包含选自由SEQ ID NO:61至SEQID NO:77组成的组的序列。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:65组成。
22.一种分子信标,所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸,其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。
23.根据权利要求22所述的分子信标,其中所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
24.根据权利要求23所述的分子信标,其中所述多核苷酸由选自由SEQ ID NO:61至SEQID NO:77组成的组的序列组成。
25.根据权利要求22所述的分子信标,其中所述荧光团是FAM并且所述猝灭剂是BHQ1。
26.根据权利要求22所述的分子信标,其中所述荧光团是ATTO 565或Alexa 594并且所述猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
27.一种检测测试样品中乙型流感病毒的方法,所述方法包括:
(a)从所述测试样品中提取核酸;
(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列,其中所述序列特异性引物组选自由Set-1至Set-47组成的组;和
(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在;其中所述扩增产物的存在指示所述测试样品中乙型流感病毒的存在。
28.根据权利要求27所述的方法,其中步骤(b)中所述靶序列的扩增在约60℃和约67℃之间进行,持续少于30分钟。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中扩增步骤进行少于15分钟。
30.根据权利要求27或28所述的方法,其中扩增步骤进行少于12分钟。
31.根据权利要求27或28所述的方法,其中扩增步骤进行少于9分钟。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法,其中所述反应混合物还包含逆转录酶。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法,其中所述检测步骤(c)中所述扩增产物的存在或不存在包括使所述扩增产物与包含附接至标记物的多核苷酸的探针杂交。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含一个或更多个锁核酸。
35.根据权利要求33所述的方法,其中所述标记物是荧光团。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述荧光团共价地附接至所述多核苷酸的末端。
37.根据权利要求33所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。
38.根据权利要求33-36中任一项所述的方法,其中所述多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:61至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
39.根据权利要求33-36中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ IDNO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ IDNO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25和SEQ IDNO:69的核苷酸8-26,并且另外其中所述序列特异性引物组选自由以下组成的组:Set-3至Set-11、Set-19、Set-20、Set-23至Set-30和Set-38至Set-42。
40.根据权利要求33-36中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:69组成的组的序列。
41.根据权利要求33-37中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且所述序列特异性引物组是Set-11。
42.根据权利要求33-37中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:65,并且所述多核苷酸组是Set-20。
43.根据权利要求33-37中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31和SEQ IDNO:72的核苷酸8-25,并且其中所述序列特异性引物组选自由以下组成的组:Set-14、Set-32和Set-44。
44.根据权利要求33-37中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:72组成的组的序列。
45.根据权利要求33-37中任一项所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ IDNO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29,并且其中所述序列特异性引物组选自由以下组成的组:Set-12、Set-13、Set-16至Set-18、Set-31、Set-34至Set-36、Set-46和Set-47。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:77组成的组的序列。
47.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求1-21中任一项所述的组合物。
48.根据权利要求47所述的试剂盒,所述试剂盒还包含链置换聚合酶。
49.根据权利要求48所述的试剂盒,所述试剂盒还包含逆转录酶。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包含分子信标,所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸,其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列:SEQ ID NO:61的核苷酸5-21、SEQ ID NO:62的核苷酸6-38、SEQ ID NO:63的核苷酸5-26、SEQ ID NO:64的核苷酸8-37、SEQ ID NO:65的核苷酸8-37、SEQ ID NO:66的核苷酸8-37、SEQ ID NO:67的核苷酸8-26、SEQ ID NO:68的核苷酸7-25、SEQ ID NO:69的核苷酸8-26、SEQ ID NO:70的核苷酸3-29、SEQ ID NO:71的核苷酸8-31、SEQ ID NO:72的核苷酸8-25、SEQ ID NO:73的核苷酸6-36、SEQ ID NO:74的核苷酸6-34、SEQ ID NO:75的核苷酸5-35、SEQ ID NO:76的核苷酸5-35和SEQ ID NO:77的核苷酸4-29。
51.根据权利要求50所述的试剂盒,其中所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:61至SEQID NO:77组成的组的序列。
52.根据权利要求51所述的试剂盒,其中所述多核苷酸由选自由SEQ ID NO:61至SEQID NO:77组成的组的序列组成。
53.根据权利要求52所述的试剂盒,其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:65组成,并且所述多核苷酸组是Set-11。
54.根据权利要求52所述的试剂盒,其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:65组成,并且所述多核苷酸组是Set-20。
55.一种检测测试样品中乙型流感病毒的方法,所述方法包括:
(a)从所述测试样品中提取核酸;
(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性LAMP引物组的反应混合物反应少于15分钟来扩增靶序列;和
(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在;其中所述扩增产物的存在指示所述测试样品中乙型流感病毒的存在。
56.根据权利要求55所述的方法,其中扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应,其中所述序列特异性引物组选自由Set-1至Set-47组成的组。
57.根据权利要求55或56所述的方法,其中所述检测步骤(b)中所述扩增产物的存在或不存在包括使所述扩增产物与分子信标杂交,所述分子信标包含选自由SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:77组成的组的多核苷酸序列。
58.根据权利要求55或56所述的方法,其中所述检测所述扩增产物的存在或不存在包括将所述扩增产物与包含由SEQ ID NO:65组成的多核苷酸序列的分子信标杂交。
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