DE60132429T2

DE60132429T2 - Pluripotente aus von fettgewebe stammenden stromazellen erzeugte stammzellen und deren verwendung

Info

Publication number: DE60132429T2
Application number: DE60132429T
Authority: DE
Inventors: William O. Bahama Wilkison; Jeffrey Chapel Hill GIMBLE
Original assignee: Artecel Sciences Inc
Current assignee: Artecel Sciences Inc
Priority date: 2000-02-26
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: DK1261694T3; CA2400485C; EP1261694A2; PT1261694E; IL151228A; WO2001062901A2; JP2003523767A; SG134168A1; CA2400485A1; WO2001062901A3; ATE384124T1; EP1261694B1; AU3869501A; DE60132429D1; US7078230B2; AU2001238695B2; ES2300320T3; US20060228341A1; US20010033834A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft den Bereich der Verfahren zum Induzieren von isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazellen zur Differenzierung in Zellen mit einer nicht-mesenchymalen Linie. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum Induzieren einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle zur Exprimierung von mindestens einer phänotypischen Eigenschaft einer Neuronalzelle bzw. neuronalen Zelle.
Hintergrund der Erfindung
Eine Stammzelle muss die folgenden Kriterien erfüllen: (1) Ein Vermögen einer klonalen Stammzellenpopulation zur Selbsterneuerung, (2) ein Vermögen einer klonalen Stammzellenpopulation zur Erzeugung eines neuen, enddifferenzierten Zelltyps in vitro, (3) ein Vermögen einer klonalen Stammzellenpopulation zum Ersetzen einer fehlenden enddifferenzierten Zellpopulation, wenn sie in ein Tier transplantiert wird, das einen Mangel an eigenen natürlichen Zellen aufweist.
Die neonatale Periode in der menschlichen Entwicklung ist durch die Gegenwart von „Stamm"-Zellen mit dem Potenzial zur Entwicklung entlang vielfacher Differenzierungswege gekennzeichnet. Die Enddifferenzierung dieser Zellen wird durch Cytokin und hormonelle Signale festgelegt, welche die Organogenese und die Gewebearchitektur koordinieren. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) von der Maus wurden isoliert und in vitro und in vivo umfangreich untersucht. Unter Verwendung von exogenen Reizen in vitro haben Forscher die ES-Zelldifferenzierung entlang vielfacher Linienwege induziert. Diese Wege umfassen Neuro-nal-, B-Linie-Lymphoid- und Fettzellen (Dani et al. (1997), J. Cell Sci. 110, 1279; Remoncourt et al. (1998), Mech. Dev. 79, 185; S. O'Shea (1999), Anat. Rec. 257, 32, 1999). Die ES-Zellen wurden in vivo durch homologe Rekombinationstechniken manipuliert, um genspezifische Null- oder „Knock-out"-Mäuse zu erzeugen (R. S. Johnson (1989), Science 245, 1234). Sobald ES-Zellklone, denen ein spezifisches Gen fehlt, isoliert worden sind, werden sie in eine befruchtete Mauszygote transplantiert. Die Nachkommenschaft dieser isolierten ES-Zelle kann sich in einer koordinierten Weise zu jedwedem Mausgewebe entwickeln.
Multipotente Stammzellen liegen in Geweben des erwachsenen Organismus vor. Das am besten charakterisierte Beispiel für eine „Stammzelle" ist der hämatopoietische Vorläufer, der aus dem Knochenmark und peripherem Blut isoliert wird. In bahnbrechenden Studien von Trentin und Kollegen (Trentin (1965), Cardiovasc. Res. Cent. Bull. 4, 38; Till & McCulloch (1961), Rad. Res. 14, 213) wurden letal bestrahlte Mäuse untersucht. Ohne Behandlung starben diese Tiere, da sie ihre zirkulierenden Blutzellen nicht ersetzen konnten; die Transplantation von Knochenmarkzellen von Gen-identischen Spendertieren rettete das Wirtstier jedoch. Die Spenderzellen waren für die Repopulation aller zirkulierenden Blutzellen verantwortlich. Eine Fülle von eleganten Studien wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass das Spenden einer endlichen Anzahl von undifferenzierten hämatopoietischen Stammzellen jede der acht oder mehr verschiedenen Blutzellenlinien in einem Wirtstier regenerieren kann. Diese Arbeit hat die Grundlage für eine Knochenmarktransplantation gelegt, wobei es sich um ein weithin akzeptiertes therapeutisches Verfahren für Krebs und angeborene Stoffwechseldefekte handelt. Folglich verbleiben hämatopoietische Stammzellen während des ganzen Lebens in normalem menschlichen Knochenmark; sie sind nicht auf die neonatale Periode beschränkt.
Es gibt hochinteressante neue Anzeichen dafür, dass hämatopoietische Vorläufer gegebenenfalls nicht auf die Mikroumgebung des Knochenmarks beschränkt sind. Forscher an der Universität von Calgary haben neuronale Stammzellen untersucht, die sich routinemäßig entlang neuronaler Zelllinienwege differenzieren. Wenn diese Zellen in letal bestrahlte Wirte transplantiert wurden, haben die Forscher die Gegenwart von Spenderzellenmarkern in neu erzeugten Myeloid- und Lymphoidzellen nachgewiesen (Bjornson (1999), Science 283, 534). Forscher am Baylor College of Medicine haben ähnliche Studien unter Verwendung von Satellitenzellen durchgeführt, die vom Skelettmuskel von Mäusen isoliert worden sind (Jackson et al. (1999), PNAS 96, 14482). Wenn diese von Muskeln stammenden Zellen in letal bestrahlte Wirte transplantiert wurden, haben die Forscher die Gegenwart von Muskelgenmarkern in allen Blutzellenlinien nachgewiesen. Zusammen zeigen diese Studien, dass neuronales Gewebe und Muskelgewebe Stammzellen enthalten, die zur hämatopoietischen Differenzierung fähig sind. Dies legt nahe, dass Stellen, die von dem Knochenmark verschieden sind, eine erneuerbare Quelle von hämatopoietischen Vorläufern mit einer potenziellen Anwendung auf die Therapie von Erkrankungen des Menschen bereitstellen können (Quesenberry et al. (1999), J. Neurotrauma 16, 661; Scheffler et al. (1999), Trends Neurosci. 22, 348; Svendson & Smith (1999), Trends Neurosci. 22, 357).
So wie Neuronal- und Muskelzellen das bestrahlte Knochengewebe regenerieren können, sind von Knochenmark stammende Zellen fähig, bei anderen Organstellen eine Repopulation zu bewirken. Wenn von Knochenmark stammende hämatopoietische Zellen und Stromazellen in ein Tier mit einer verletzten Leber transplantiert werden, können sie Leberovalzellen in dem Wirtstier regenerieren (Peterse et al. (1999), Science 284, 1168). Wenn markierte Knochenmarkstromazellen in den lateralen Ventrikel einer neonatalen Maus implantiert wurden, waren sie entsprechend zur Differenzierung in reife Astrocyten fähig (Kopen et al. (1999) PNAS 96, 10711). Wenn Knochenmarkstromazellen intraperitoneal in Mäuse transplantiert werden, werden sie in den Organen des Wirtstiers nachgewiesen, einschließlich der Milz, der Lunge, dem Knochenmark, den Knochen, in Knorpel und der Haut (Pereira et al. (1998), PNAS 95, Seite 1142, 1998). Diese Studien legen nahe, dass sich eine Knochenmarkstromazelle in Linien differenzieren kann, die von deren ursprünglicher mesodermaler Herkunft verschieden sind (Kopen et al. (1999), PNAS 96, 10711).
Die neuere Entwicklung gesamter Organismen aus einer einzelnen Spenderzelle ist mit dieser Hypothese konsistent. Beispielsweise zeigte das „Dolly"-Experiment, dass sich Zellen, die von einer Brustdrüse vom Schaf isoliert worden sind, zu einem erwachsenen Schaf entwickeln können. In entsprechenden Studien mit Mäusen konnten sich Zellen, die vom Corpus luteum des Eierstocks stammten, zu einer erwachsenen Maus entwickeln. Diese Studien legen nahe, dass Stammzellen mit dem Vermögen zur Differenzierung zu jedwedem Zelltyp im erwachsenen Organismus weiterhin vorliegen. Folglich können „embyronale Stammzellen" während des ganzen Lebens eines Lebewesens bewahrt werden.
Die adulte Knochenmark-Mikroumgebung ist die potenzielle Quelle für diese hypothetischen Stammzellen. Zellen, die von adultem Knochenmark isoliert werden, werden verschiedenartig bezeichnet, einschließlich als Stromazellen, Stromastammzellen, mesenchymale Stammzellen (MSC's), mesenchymale Fibroblasten, retikuläre Endothelzellen und Westen-Bainton-Zellen (Gimble et al. (1996), Bone 19, 421, 1996). In vitro-Studien haben gezeigt, dass sich diese Zellen entlang mehrerer mesenchymaler oder mesodermaler Linien differenzieren können, die unter anderem Adipocyten (Fettzellen) (Gimble et al. (1990), Eur. J. Immunol. 20, 379), Chondrocyten (Bruder et al. (1994), J. Cell Biochem. 56, 283), hämatopoietische Trägerzellen (Pietrangeli et al. (1988), Eur. J. Immunol. 18, 863), Skelettmuskelmyocyten (Prockop (1998), J. Cell Biochem. Suppl. 30–31, 284–5), Myocyten der glatten Muskulatur (Charbord) und Osteoblasten (Beresford et al. (1992), J. Cell Sci. 99, 131; Dorheim et al. (1993), J. Cell Physiol. 154, 317) umfassen. Darüber hinaus zeigen Stromazellen des Knochenmarks das Vermögen zur Differenzierung zu Astrocyten (Kopen et al. (1999), PNAS 96, 10711) und Leberovaizellen (Petersen et al. (1999), Science 284, 1168). Auf der Basis dieser Erkenntnisse wurde das Knochenmark als eine Quelle von Stromastammzellen zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Muskeln, Fettgewebe, Leber-, Neuronal- und anderen Geweben vorgeschlagen. Die Extraktion von Knochenmark-Stromazellen bedeutet für den Patienten jedoch ein hohes Risiko und ein hohes Maß an Unannehmlichkeiten.
Im Gegensatz dazu stellen Stromazellen, die von adultem menschlichen extramedullären Fettgewebe stammen, eine Stromastammzellenquelle dar, die mit einem minimalen Risiko oder minimalen Unannehmlichkeiten für den Patienten gewonnen werden kann. Pathologische Beweise legen nahe, dass Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, zur Differenzierung entlang mehrerer Linienwege fähig sind. Die häufigsten Weichgewebetumore, Liposarkome, entwickeln sich aus Adipocyten-artigen Zellen. Weichgewebetumore gemischter Herkunft sind relativ häufig. Diese Tumore können Elemente von Fettgewebe, Muskeln (glatt oder Skelett), Knorpel und/oder Knochen umfassen. In Patienten mit einem seltenen Zustand, der als progressive Knochenheteroplasie bekannt ist, bilden subkutane Adipocyten aus unbekannten Gründen Knochen.
Neuere Studien haben das spezifische Vermögen von Stromazellen, die von Knochenmark stammen, gezeigt, in vitro einer neuronalen Differenzierung zu unterliegen (Woodbury et al. (2000), J. Neuroscience Research 61, 364; Sanchez-Ramos et al. (2000), Exp. Neurology 164, 247). In diesen Untersuchungen induzierte eine Behandlung von Knochenmark-Stromazellen mit Antioxidationsmitteln, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) oder von Gehirn stammendem neurotrophen Faktor (BDNF) Zellen dahingehend, morphologischen Veränderungen zu unterliegen, die mit einer neuronalen Differenzierung konsistent sind, d. h. der Verlängerung von langen Zellfortsätzen, die mit dem Wachstum von Kegeln und Filopoden enden (Woodbury et al. (2000), J. Neuroscience Research 61, 364; Sanchez-Ramos et al. (2000), Exp. Neurology 164, 247). Darüber hinaus induzierten diese Mittel die Expression von neuronal-spezifischem Protein, einschließlich Nestin, Neuron-spezifischer Enolase (NSE), Neurofilament M (NF-M), NeuN, und des Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors trkA (Woodbury et al. (2000), J. Neuroscience Research 61, 364; Sanchez-Ramos et al. (2000), Exp. Neurology 164, 247).
Das US-Patent Nr. 5,486,359 (Osiris) betrifft eine isolierte, homogene Population von menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die sich zu Zellen von mehr als einem Bindegewebstyp differenzieren können. Das Patent beschreibt ein Verfahren zum Isolieren, Reinigen und starkem Replizieren dieser Zellen in einer Kultur, d. h. in vitro.
Das US-Patent Nr. 5,942,225 (Case Western und Osiris) beschreibt eine Zusammensetzung zum Induzieren einer Linien-gerichteten Differenzierung von isolierten menschlichen mesenchymalen Stammzellen zu einer einzelnen speziellen mesenchymalen Linie, die menschliche mesenchymale Stammzellen und einen oder mehrere bioaktive Faktor(en) zum Induzieren der Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen zu einer einzelnen speziellen Linie umfasst.
Das US-Patent Nr. 5,736,396 (Case Western) beschreibt ein Verfahren zum Induzieren einer ex vivo-Linien-gerichteten Differenzierung von isolierten menschlichen mesenchymalen Stammzellen, welches das Inkontaktbringen der mesenchymalen Stammzellen mit einem bioaktiven Faktor umfasst, so dass dadurch deren ex vivo-Differenzierung zu einer einzelnen speziellen mesenchymalen Linie induziert wird. Das Patent beschreibt auch ein Verfahren zum Behandeln eines Lebewesens, das mesenchymaler Zellen einer speziellen mesenchymalen Linie bedarf, welches das Verabreichen an ein Lebewesen, das deren bedarf, einer Zusammensetzung umfasst, die isolierte menschliche mesenchymale Stammzellen umfasst, die induziert worden sind, sich ex vivo durch einen Kontakt mit einem bioaktiven Faktor zu differenzieren, so dass dadurch eine ex vivo-Differenzierung von solchen Zellen zu einer einzelnen speziellen mesenchymalen Linie induziert wird.
Das US-Patent Nr. 5,908,784 (Case Western) beschreibt eine Zusammensetzung für die in vitro-Chondrogenese von menschlichen mesenchymalen Vorläuferzellen und die in vitro-Bildung von menschlichen Chondrocyten davon, wobei die Zusammensetzung isolierte menschliche mesenchymale Stammzellen, die als eng aneinander dichtgepacktes Zellpellet vorliegen, und mindestens ein chondroinduktives Mittel in Kontakt damit umfasst. Das Patent beschreibt auch ein Verfahren zum Induzieren einer Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen durch Inkontaktbringen von mesenchymalen Stammzellen mit einem chondroinduktiven Mittel in vitro, wobei die Stammzellen als eng aneinander dichtgepacktes Zellpellet vorliegen.
Das US-Patent Nr. 5,902,741 (Advanced Tissue Sciences, Inc.) beschreibt ein lebendes Knorpelgewebe, das in vitro hergestellt worden ist, das Knorpel-erzeugende Stromazellen und Bindegewebsproteine umfasst, die in natürlicher Weise durch die Stromazellen sekretiert werden, die an ein dreidimensionales Netzwerk gebunden sind und dieses im Wesentlichen einhüllen, wobei das dreidimensionale Netzwerk aus biologisch verträglichem, nicht-lebenden Material zusammengesetzt ist, das zu einer dreidimensionalen Struktur ausgebildet ist, die Zwischenräume aufweist, die durch die Stromazellen überbrückt werden. Das Patent beschreibt auch eine Zusammensetzung zum Wachsenlassen von neuem Knorpel, die mesenchymale Stammzellen in einem polymeren Träger umfasst, der für eine Proliferation und Differenzierung der Zellen zu Knorpel geeignet ist.
Das US-Patent Nr. 5,863,531 (Advanced Tissue Sciences, Inc.) beschreibt ein in vitro hergestelltes schlauchförmiges Stromagewebe, das Stromazellen und Bindegewebsproteine umfasst, die in natürlicher Weise durch die Stromazellen sekretiert werden, die an ein dreidimensionales Netzwerk gebunden sind und dieses im Wesentlichen einhüllen, wobei das dreidimensionale Netzwerk aus biologisch verträglichem, nicht-lebenden Material zusammengesetzt ist, das Zwischenräume aufweist, die durch die Stromazellen überbrückt werden.
Das US-Patent Nr. 5,811,094 (Osiris) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Bindegewebes, welches das Erzeugen von Bindegewebe in einem Lebewesen, dass dessen Bedarf, durch Verabreichen an das Lebewesen eines Zellpräparats umfasst, das menschliche mesenchymale Stammzellen enthält, welches aus menschlichem Knochenmark gewonnen worden ist und im Wesentlichen frei von Blutzellen ist.
Das US-Patent Nr. 6,030,836 beschreibt ein Verfahren zum Aufrechterhalten von menschlichen hämatopoietischen Stammzellen in vitro, umfassend das gemeinsame Kultivieren von menschlichen mesenchymalen Stammzellen mit den hämatopoietischen Stammzellen derart, dass mindestens einige der hämatopoietischen Stammzellen deren Stammzellenphänotyp aufrechterhalten.
Das US-Patent Nr. 6,103,522 beschreibt eine bestrahlte immortalisierte menschliche Stromazelllinie in einer kombinierten in vitro-Kultur mit menschlichen hämatopoietischen Vorläuferzellen.
WO 96/02662 A1 und das US-Patent Nr. 5,879,940 beschreiben menschliche Knochenmark-Stromazelllinien, welche die Hämatopoiese aufrechterhalten.
Das US-Patent Nr. 5,827,735 (Morphogen) beschreibt gereinigte pluripotente mesenchymale Stammzellen, die im Wesentlichen frei von mehrkernigen, myogenen Linien-festgelegten Zellen sind, und die vorwiegend sternförmig sind, wobei die mesenchymalen Stammzellen vorwiegend fibroblastische Zellen bilden, wenn sie mit Muskel-morphogenem Protein in einem Gewebekulturmedium, das 10% fetales Kälberserum enthält, in Kontakt gebracht werden, und vorwiegend verzweigte mehrkernige Strukturen bilden, die kontrahieren, wenn sie mit Muskel-morphogenem Protein und Narben-inhibierendem Faktor in einer Gewebekultur mit einem Medium, das 10% fetales Kälberserum enthält, in Kontakt gebracht werden.
WO 99/94328 beschreibt die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen zur Behandlung des Zentralnervensystems und ein Verfahren des Ausrichtens der Differenzierung von Knochenmark-Stromazellen.
WO 98/20731 (Osiris) beschreibt eine mesenchymale Megakaryocyten-Vorläuferzusammensetzung und ein Verfahren zum Isolieren von MSC's, die mit isolierten Megakayrocyten bei der Isolierung von Megakaryocyten einhergehen.
WO 99/61587 (Osiris) beschreibt menschliche(s) CD45 und/oder Fibroblasten und mesenchymale Stammzellen.
WO 00/53795 (University of Pittsburgh und The Regents of the University of California) beschreibt von Fettgewebe stammende Stammzellen und Netzwerke, die im Wesentlichen frei von Adipocyten und roten Blutzellen und klonalen Populationen von Bindegewebsstammzellen sind. Die Zellen können allein oder innerhalb biologisch verträglicher Zusammensetzungen eingesetzt werden, um differenzierte Gewebe und Strukturen sowohl in vivo als auch in vitro zu erzeugen. Zusätzlich können die Zellen vermehrt und kultiviert werden, um Hormone zu erzeugen und konditionierte Kulturmedien zur Unterstützung des Wachstums und der Vermehrung anderer Zellpopulationen bereitzustellen. In einem anderen Aspekt betrifft WO 00/53795 ein von Fettgewebe stammendes Netzwerk, das im Wesentlichen frei von Zellen ist, welches extrazelluläres Matrixmaterial von Fettgewebe umfasst. Das Netzwerk kann als Substrat zum Erleichtern des Wachstums und der Differenzierung von Zellen in vivo und in vitro zu reifem Gewebe oder reifen Strukturen verwendet werden. WO 00/53795 beschreibt keine von Fettgewebe stammende Stromazellen, die induziert worden sind, mindestens eine phänotypische Eigenschaft einer Neuronal-, Astroglia-, hämatopoietischen Vorläufer- oder Leberzelle in dessen Prioritätsdokument, noch beschreibt sie eine isolierte, von Fettgewebe stammende Stromazelle, die dedifferenziert worden ist, so dass Adipocytenphänotypenmarker fehlen.
WO 99/28444 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zum Differenzieren von Stromazellen von Fettgewebe zu Zellen mit osteoblastischen Eigenschaften sowie Verfahren zur Verbesserung der Knochenstruktur eines Lebewesens.
WO 00/44882 beschreibt ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Induzieren von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, zu Adipocyten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur zellulären Herstellung von gewünschten Materialien bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Differenzieren einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle in eine Zelle mit den Eigenschaften einer neuronalen Zelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Stromazelle mit einem Antioxidationsmittel umfasst, um dadurch die Differenzierung der Stromazelle in eine Neuronalzelle in vitro zu induzieren.
Folglich wird die isolierte, von Fettgewebe stammende Stromazelle induziert, mindestens eine Eigenschaft einer Neuronalzelle zu exprimieren. Diese Zellen können therapeutisch, um autolog oder allogen einen Wirt zu behandeln, der einer solchen Behandlung bedarf, oder für diagnostische Zwecke verwendet werden. Die Zellen können z. B. in jedwedem pharmazeutisch verträglichen Träger, einschließlich Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, an den Zielbereich verabreicht werden. Alternativ können die Zellen in einer Matrix, einem Netzwerk oder anderen Materialien, die zu zwei- oder dreidimensionalen Strukturen zur Bildung eines strukturierten Depots führen, z. B. einem Implantat oder Transplantat, verabreicht werden. Das dreidimensionale System kann biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar sein. Beispiele für biologisch abbaubare Materialien zur Verwendung bei der Verabreichung dieser Zellen umfassen Alginat, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polylactid-Coglycolid, Proteine, wie z. B. Proteoglykane, Glykoproteine, Hyaluronine, Fibronektine und Kollagene. Die Zellen können gegebenenfalls in einer Kombination mit einem anderen Mittel verabreicht werden, wie z. B. einem Cytokin, Wachstumsfaktor, chemischen Induktionsmittel, biologischen Mittel, Chemotherapeutikum, Hormon oder einer anderen Zelle, einem Protein, Kohlenhydrat, Peptid oder einer Nukleinsäure.
Die induzierten, von Fettgewebe stammenden Zellen können therapeutisch (z. B. bei der Gewebereparatur, -regeneration, -rekonstruktion oder -verstärkung, diagnostisch), als Bioreaktoren zum Erzeugen gewünschter Substanzen und in der Gentechnik und bei der Gewebeerzeugung verwendet werden.
Die Erfindung stellt Verfahren zur Differenzierung von adulten menschlichen extramedullären, von Fettgewebe stammenden Stromastammzellen entlang der nicht-mesenchymalen Neuronalzelllinie bereit. Die adulten menschlichen extramedullären, von Fettgewebe stam menden Stromastammzellen können als pluripotente Stammzellen für die Behandlung einer Anzahl von menschlichen und tierischen Zuständen und Krankheiten verwendet werden.
Es wird ein Verfahren zum Induzieren von Stromastammzellen, die von Fettgewebe stammen, zum Exprimieren von mindestens einer Eigenschaft einer nicht von Fettgewebe stammenden Zelle bereitgestellt, wobei es sich um eine Neuronalzelle handelt, umfassend: Kultivieren von isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazellen in einem chemisch definierten Kulturmedium, das ein Antioxidationsmittel umfasst. Das Kulturmedium kann gegebenenfalls Serum und geeignete Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Serumfaktoren, embryonale Extrakte, vorzugsweise einen nicht-menschlichen embryonalen Extrakt, und/oder chemische Verbindungen zum Induzieren einer spezifischen Liniendifferenzierung enthalten.
Die Verfahren der Erfindung können zum Erhalten von Zellen für eine autologe und allogene Transplantation für die Behandlung menschlicher Zustände verwendet werden, einschließlich unter anderem Blutdyskrasie, Krebs, Erkrankungen des Zentralnervensystems und Trauma, Erkrankungen der peripheren Nerven und Trauma, Lebererkrankungen und Trauma.
Darüber hinaus können die Zellen, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, genetisch so modifiziert werden, dass sie ein therapeutisches Genprodukt exprimieren. Die von Fettgewebe stammenden Zellen können genetisch modifiziert werden, so dass sie z. B. exogene Gene exprimieren oder die Expression von endogenen Genen hemmen. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Zelle einem Gentransfervektor ausgesetzt, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein Transgen umfasst, so dass die Nukleinsäure in die Zelle unter Bedingungen eingeführt wird, die für die Exprimierung des Transgens innerhalb der Zelle geeignet sind. Das Transgen ist üblicherweise eine Expressionskassette, die ein kodierendes Polynukleotid umfasst, das funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist. Das kodierende Polynukleotid kann ein Protein kodieren oder es kann eine biologisch aktive RNA, wie z. B. Antisense-RNA, oder ein Ribozym, kodieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Differenzierung einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle in eine Zelle bereit, die mindestens eine Eigenschaft einer Neuronalzelle exprimiert. Die mit den Verfahren der Erfindung erzeugten Zellen können eine Quelle von partiell oder vollständig differenzierten funktionellen Zellen mit Eigenschaften von mehreren Gewebelinien für die Forschung, zur Transplantation und zur Entwicklung von Gewebe erzeugungsprodukten zur Behandlung einer tierischen Erkrankung, vorzugsweise einer menschlichen Erkrankung, und zur Gewebereparatur oder -verbesserung bereitstellen.
Fettgewebe bietet eine potenzielle Alternative zu Knochenmark als eine Quelle für multipotente Stromastammzellen. Fettgewebe ist in vielen Lebewesen leicht zugänglich und liegt reichlich vor. Fettsucht ist ein Zustand mit epidemischen Ausmaßen in den Vereinigten Staaten, wo über 50% der Erwachsenen den empfohlenen „Body-mass-index" (BMI) auf der Basis ihrer Größe und ihres Gewichts überschreiten. Adipocyten können durch Fettabsaugen auf einer ambulanten Basis gewonnen werden. Das Fettabsaugen ist ein relativ nicht-invasives Verfahren mit kosmetischen Effekten, die für den größten Teil der Patienten akzeptabel sind. Es ist gut dokumentiert, dass es sich bei Adipocyten um eine erneuerbare Zellpopulation handelt. Selbst nach einer chirurgischen Entfernung durch Fettabsaugen oder andere Verfahren ist es üblich, dass in einem Lebewesen im Zeitverlauf an der gleichen Stelle ein Wiederauftreten von Adipocyten festgestellt wird. Dies legt nahe, dass Fettgewebe Zellen enthält, die neue Fettzellen erzeugen können.
Das Verfahren wird verwendet, um eine von Fettgewebe stammende Stromazelle zu induzieren, mindestens eine phänotypische Eigenschaft einer Neuronalzelle zu exprimieren. Phänotypische Marker der gewünschten Zellen sind dem Fachmann bekannt und reichlich in der Literatur veröffentlicht. Zusätzliche phänotypische Marker werden laufend beschrieben oder können ohne übermäßiges Experimentieren identifiziert werden. Jedweder dieser Marker kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Fettzelle zu einem differenzierten Zustand induziert worden ist. Linien-spezifische phänotypische Eigenschaften können Zelloberflächenproteine, Cytoskelettproteine, die Zellmorphologie und sekretorische Produkte umfassen. Neuronale Eigenschaften umfassen die Expression von neuronalen Markern, wie z. B. NeuN, NF-M, NSE, Nestin und trkA. Blutspezifische Marker können die Gegenwart von CD4, CD8, CD7, CD19, CD45, CD33, CD34, TCR, usw., umfassen. Dem Fachmann ist klar, dass bekannte kalorimetrische Verfahren, Fluoreszenzverfahren, immunchemische Verfahren, eine Polymerasekettenreaktion, chemische oder radiochemische Verfahren die Gegenwart oder Abwesenheit eines Linien-spezifischen Markers leicht ermitteln können.
In einer anderen Ausführungsform wird die Zelle in der Abwesenheit von Serum, jedoch in der Gegenwart eines chemischen Mittels, wie z. B. eines Oxidationsmittels, wie z. B. 2-Mercaptoethanol, differenziert.
Differenzierte Zellen, die gemäß den Verfahren der Erfindung erzeugt werden, sind bei autologen und allogenen Transplantationen geeignet.
Beispielsweise ist die Stelle das Zentralnervensystemgewebe und die gewünschte Eigenschaft oder der Phänotyp ist neuronal. Vorzugsweise ist das Lebewesen ein Säuger, mehr bevorzugt ist das Lebewesen ein Mensch.
Die Zellen, die gemäß einem Verfahren der Erfindung erhalten werden, können in einem Verfahren zur Verbesserung der Hämatopoiese in einem Patienten verwendet werden, umfassend die Transplantation der Zellen der Erfindung in den Patienten. Vorzugsweise findet die Transplantation mittels intravenöser Infusion statt. In einer Ausführungsform wird die Zelle vorübergehend oder stabil mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz transfiziert. Ein virales Vehikel oder ein anderes Vehikel, das mindestens eine gewünschte Nukleinsäuresequenz umfasst, die in die Zelle eingeführt werden soll, kann die Transfektion vermitteln.
Die von Fettgewebe stammenden Stromazellen, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Beispielsweise sind solche Verfahren im US-Patent Nr. 6,153,432 beschrieben. In einem bevorzugten Verfahren wird Fettgewebe von einem Säugerlebewesen, vorzugsweise einem Menschen, isoliert. Eine bevorzugte Quelle für Fettgewebe ist Bauchfett. Beim Menschen wird das Fett typischerweise durch Fettabsaugen isoliert. Wenn die durch ein Verfahren der Erfindung erhaltenen Zellen in einen Menschen transplantiert werden sollen, ist es bevorzugt, dass das Fettgewebe von dem gleichen Menschen isoliert wird, um ein autologes Transplantat bereitzustellen. Alternativ kann das verabreichte Gewebe allogen sein.
In einem Verfahren der Isolierung von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, wird das Fettgewebe mit Kollagenase bei Konzentrationen zwischen 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise 0,04 bis 0,2%, insbesondere etwa 0,1%, Trypsin bei Konzentrationen zwischen 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise 0,04%, insbesondere etwa 0,2%, und/oder Dispase bei Konzentrationen von 0,5 ng/ml bis 10 ng/ml und/oder effektiven Konzentrationen von Hyaluronidase oder Dnase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei Konzentrationen von etwa 0,01 bis 2,0 mM, vorzugsweise bei etwa 0,1 bis etwa 1,0 mM, insbesondere bei 0,53 mM bei Temperaturen zwischen 25 bis 50°C, vorzugsweise zwischen 33°C bis 40°C, insbesondere bei 37°C, für Zeiträume zwischen 10 min und 3 Stunden, vorzugsweise zwischen 30 mm bis 1 Stunde, insbesondere für 45 mm behandelt. Die Zeilen werden durch einen Nylonnetz- oder Seihtuchnetzfilter zwischen 20 Mikrometer bis 800 Mikrometer, mehr bevorzugt zwischen 40 bis 400 Mikrometer, insbesondere mit 70 Mikrometer geschickt. Die Zellen werden dann direkt in Medien oder über einen Ficoll- oder Percoll-Gradienten oder einen anderen speziellen Gradienten einer Differenzialzentrifugation unterzogen. Zellen werden mit Geschwindigkeiten zwischen 100 bis 3000 × g, mehr bevorzugt von 200 bis 1500 × g, insbesondere von 500 × g für Zeiträume zwischen 1 min bis 1 Stunde, mehr bevorzugt von 2 bis 15 min, insbesondere von 5 min, bei Temperaturen zwischen 4 bis 50°C, vorzugsweise zwischen 20 bis 40°C, insbesondere bei etwa 25°C zentrifugiert.
Die Erfindung umfasst die Behandlung der von Fettgewebe stammenden Stromazellen, um diese zur Bildung von Neuronallinien von Zellen zu induzieren. Während die Erfindung nicht an eine Theorie bezüglich der Funktion gebunden ist, wird davon ausgegangen, dass die Behandlung der Präadipocyten mit einem Medium, das ein Antioxidationsmittel und gegebenenfalls eine Kombination von Serum, embryonalen Extrakten, vorzugsweise eines nicht-menschlichen embryonalen Extrakts, gereinigten oder rekombinanten Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Hormonen und/oder chemischen Mitteln enthält, in einer 2-dimensionalen oder 3-dimensionalen Mikroumgebung eine Differenzierung induzieren wird.
Nicht-beschränkende Beispiele für Basismedien, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem Minimum Essential Medium Eagle, ADC-1, LPM (Rinderserum, albuminfrei), F10 (HAM) F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ Medium (mit und ohne Fitton-Jackson-Modifizierung), Basal Medium Eagle (BME – mit der Zugabe von Earle's Salzbasis), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM – ohne Serum), Yamane, IMEM-20, Glasgow Modification Eagle Medium (GMEM), Leibovitz L-15 Medium, McCoy's 5A Medium, Medium M199 (M199E – mit Earle's Salzbasis), Medium M199 (M199H – mit Hank's Salzbasis), Minimum Essential Medium Eagle (MEM-E – mit Earle's Salzbasis), Minimum Essential Medium Eagle (MEM-H – mit Hank's Salzbasis) und Minimum Essential Medium Eagle (MEM-NAA – mit nicht-essentiellen Aminosäuren), einschließlich Medium 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MCDB 153. Ein bevorzugtes Medium zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist DMEM. Diese und andere geeignete Medien sind unter anderem von GIBCO, Grand Island, N. Y., USA, und Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, erhältlich. Eine Anzahl dieser Medien ist in Methods of Enzymology, Band LVIII, „Cell Culture", Seiten 62–72, herausgegeben von William B. Jakoby und Ira H. Pastan, veröffentlicht von Academic Press, Inc., zusammengefasst.
Zusätzliche, nicht-beschränkende Beispiele für Medien, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können fetales Serum vom Rind oder anderen Arten in einer Konzentration von mindestens 1% bis etwa 30%, vorzugsweise von mindestens etwa 5% bis 15%, insbesondere von etwa 10% enthalten. Ein embryonaler Extrakt von Hühnern oder anderen Spe zies kann bei einer Konzentration von etwa 1% bis 30%, vorzugsweise von mindestens etwa 5% bis 15%, insbesondere von etwa 10% vorliegen.
Mit „Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Hormonen" sind die folgenden spezifischen Faktoren gemeint, einschließlich unter anderem Wachstumshormon, Erythropoietin, Thrombopoietin, Interleukin 3, Interleukin 6, Interleukin 7, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, c-kit Ligand/Stammzellenfaktor, Osteoprotegerinligand, insulin, Insulin-artige Wachstumsfaktoren, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, ziliärneurotropher Faktor, von Plättchen stammender Wachstumsfaktor und morphogenetisches Knochenprotein, und zwar bei Konzentrationen im Bereich zwischen Picogramm/ml bis Milligramm/ml. Bei solchen Konzentrationen können die Wachstumsfaktoren, Cytokine und Hormone, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, bis zu 100% der Bildung von Blutzellen (lymphoide, erythroide, myeloide oder Plättchen-Linien) aus Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, in Tests bezüglich einer Kolonie-bildenden Einheit (CFU) induzieren. (Moore et al. (1973), J. Natl. Cancer Inst. 50, 603–623; Lee et al. (1989), J. Immunol. 142, 3875–3883; Medina et al. (2993), J. Exp. Med. 178, 1507–1515).
Es sollte ferner beachtet werden, dass dem Kulturmedium zusätzliche Komponenten zugesetzt werden können. Solche Komponenten können Antibiotika, Antimykotika, Albumin, Aminosäuren und andere Komponenten sein, die in dem Fachgebiet für die Kultivierung von Zellen bekannt sind. Zusätzlich können Komponenten zur Verstärkung des Differenzierungsvorgangs zugesetzt werden.
Mit „chemischen Mitteln" sollen unter anderem Antioxidationsverbindungen, wie z. B. butyliertes Hydroxyanisol (BHA) oder 2-Mercaptoethanol, Steroide, Retinoide und andere chemische Verbindungen oder Mittel gemeint sein, welche die Differenzierung von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, induzieren.
Mit „Charakterisierung" der resultierenden differenzierten Zellen ist die Identifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen, Genen und/oder anderen Markern gemeint, welche die Linienfestlegung der Stromazellen auf einen bestimmten enddifferenzierten Zustand anzeigen. Diese Verfahren umfassen unter anderem (a) den Nachweis von Zelloberflächenproteinen durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung von Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die unter Verwendung eines sekundären Fluoreszenzmarkers verknüpft sind, einschließlich die Verwendung von durchflusscytometrischen Verfahren, (b) den Nachweis von intrazellulären Proteinen durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung von Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die unter Verwendung eines sekundären Fluoreszenzmarkers verknüpft sind, einschließlich die Verwendung von durchflusscytometrischen Verfahren, (c) den Nachweis von Zellgenen durch eine Polymerasekettenreaktion, eine in situ-Hybridisierung und/oder eine Northern Blot-Analyse.
Partiell differenzierte oder enddifferenzierte Zellen können durch die Identifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen, Genen und/oder anderen Markern, welche die Linienfestlegung der Stromazellen auf einen bestimmten enddifferenzierten Zustand anzeigen, charakterisiert werden. Diese Verfahren umfassen unter anderem (a) den Nachweis von Zelloberflächenproteinen durch Immunfluoreszenztests, wie z. B. einer Durchflusscytometrie oder einer in situ-Immunfärbung von Oberflächenproteinen von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, wie z. B. alkalischer Phosphatase, CD44, CD146, Integrin beta 1 oder Osteopontin (Gronthos et al. (1994), Blood 84, 4164–4173), (b) den Nachweis von intrazellulären Proteinen durch Immunfluoreszenzverfahren, wie z. B. einer Durchflusscytometrie oder einer in situ-Immunfärbung von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper, die gegen Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren, Retinoid X-Rezeptoren, Vitamin D-Rezeptoren oder Cbfa1 gerichtet sind, (c) den Nachweis der Expression von Linien-selektiven mRNA's, wie z. B. Osteocalcin, PPAR gamma, Leptin, Cbfa1, Interleukin 7, Osteoprotegerinligand und/oder Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor, Leukocytenmarker und Wachstumsfaktor durch eine Polymerasekettenreaktion, eine in situ-Hybridisierung und/oder eine andere Blot-Analyse (vgl. Gimble et al. (1989), Blood 74, 303–311).
Die Zellen können einem Wirt auf vielen verschiedenen Wegen verabreicht werden. Bevorzugte Verabreichungsarten sind eine parenterale, intraperitoneale, intravenöse, intradermale, epidurale, intraspinale, intrasternale, intraartikuläre, intrasynoviale, intrathecale, intraarterielle, intrakardiale, intramuskuläre, intranasale, subkutane, intraorbitale, intrakapsuläre, lokale Verabreichung, eine Verabreichung mittels Transdermalpflaster, eine rektale, vaginale oder urethrale Verabreichung, einschließlich mittels Zäpfchen, perkutan, mittels Nasenspray, chirurgische Implantierung, internes chirurgisches Aufbringen, Infusionspumpe oder mittels eines Katheters. Das Mittel und der Träger können z. B. in einer Formulierung mit langsamer Freisetzung, wie z. B. einer direkten Gewebeinjektion oder mittels eines Bolus, einem Implantat, einem Mikroteilchen, einem Mikrokügelchen, einem Nanoteilchen oder einem Nanokügelchen verabreicht werden.
Die Gegenwart der differenzierten Zellen, die durch ein Verfahren der Erfindung erhalten worden sind, kann in einem Lebewesen mit verschiedenen Techniken nachgewiesen werden, einschließlich unter anderem mittels Durchflusscytometrie, immunhistochemisch, in situ- Hybridisierung und/oder einer anderen histologischen oder zellbiologischen Technik. Vgl. z. B. Kopen et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 10711–10716.
Krankheiten oder pathologische Zustände umfassen neurodegenerative Erkrankungen, hepatodegenerative Erkrankungen, nephrodegenerative Erkrankungen, Rückenmarksverletzungen, Kopftrauma oder -chirurgie, virale Infektionen, die zu einer Gewebe-, Organ- oder Drüsendegeneration führen, und dergleichen. Solche neurodegenerativen Erkrankungen umfassen unter anderem AIDS-Demenz-Komplex, Entmarkungskrankheiten, wie z. B. multiple Sklerose und akute Transferasemyelitis, extrapyramidale und zerebelläre Störungen, wie z. B. Läsionen des Kortikospinalsystems, Störungen der basalen Ganglien oder Kleinhirnstörungen, hyperkinetische Bewegungsstörungen, wie z. B. Chores Huntington und senile Chores, Arzneistoff-induzierte Bewegungsstörungen, wie z. B. solche, die durch Arzneistoffe induziert werden, welche die CNS-Dopaminrezeptoren blockieren, hypokinetische Bewegungsstörungen, wie z. B. Parkinson-Krankheit, progressive Supranukleoplasie, strukturelle Läsionen des Kleinhirns, spinozerebelläre Degenerationen, wie z. B. spinale Ataxie, Friedreich-Ataxie, zerebelläre kortikale Degenerationen, multiple Systemdegenerationen (Mencel, Dejerine Thomas, Shi-Drager und Machado-Joseph), systemische Störungen, wie z. B. Refsum-Krankheit, Abetalipoproteinämie, Ataxie, Teleangiektasie sowie mitochondrielle Mehrfachsystemstörungen, Entmarkungsstörungen, wie z. B. multiple Sklerose, akute Querschnittsmyelitis, und jedwede Störungen der motorischen Einheit, wie z. B. neurogene muskuläre Atrophien (Zelldegeneration des Vorderhorns des Seitenventrikels, wie z. B. amyotrophe Lateralsklerose, infantile Rückenmuskelatrophie und juvenile Rückenmuskelatrophie), Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom im mittleren Alter, diffuse Lewykörper-Krankheit, senile Demenz des Lewykörpertyps, Wernicke-Korsakoff-Syndrom, chronischer Alkoholismus, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, subakute sklerosierende Panenzephalitis-Hallervorden-Spatz-Krankheit, und Boxerenzephalopathie. Vgl. z. B. Berkow et al. (Hrsg.) (1987), The Merck Manual (15.) (Hrsg.) Merck and Co., Rahway, NJ.
In einer anderen Ausführungsform können die von Fettgewebe stammenden Zellen, die durch ein Verfahren der Erfindung erhalten worden sind, genetisch modifiziert werden, z. B. um exogene Gene zu exprimieren oder um die Exprimierung von endogenen Genen zu unterdrücken. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Zelle einem Gentransfervektor ausgesetzt, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein Transgen umfasst, so dass die Nukleinsäure in die Zelle unter Bedingungen eingeführt wird, die für eine Exprimierung des Transgens innerhalb der Zelle geeignet sind. Das Transgen ist im Allgemeinen eine Expressionskassette, die ein kodierendes Polynukleotid umfasst, das funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist. Das kodierende Polynukleotid kann ein Protein kodieren oder es kann biologisch aktive RNA, wie z. B. Antisense-RNA, oder ein Ribozym kodieren. Folglich kann das kodierende Polynukleotid ein Gen, das z. B. eine Beständigkeit gegen ein Toxin verleiht, ein Hormon (wie z. B. Peptidwachstumshormone, Hormonfreisetzungsfaktor, Sexualhormone, adrenokortikotrophe Hormone, Cytokine, wie z. B. Interferone, Interleukine und Lymphokine), einen an die Zelloberfläche gebundenen intrazellulären Signalgebungsrest, wie z. B. Zelladhäsionsmoleküle und Hormonrezeptoren, und Faktoren, die eine gegebene Differenzierungslinie fördern, oder jedwedes andere Transgen mit einer bekannten Sequenz kodieren.
Die Expressionskassette, die das Transgen enthält, sollte in den genetischen Vektor einbezogen werden, der zur Abgabe des Transgens an die Zelle geeignet ist. Abhängig von der gewünschten Endanwendung kann jedweder derartige Vektor so eingesetzt werden, dass er die Zellen genetisch modifiziert (z. B. Plasmide, nackte DNA, Viren, wie z. B. Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Lentivirus, Papillomavirus, Retroviren, usw.). Jedwedes Verfahren zur Konstruktion der gewünschten Expressionskassette innerhalb solcher Vektoren kann eingesetzt werden, wobei viele davon bekannt sind, wie z. B. durch direktes Klonieren, homologe Rekombination, usw. Der gewünschte Vektor wird größtenteils das Verfahren bestimmen, das zum Einführen des Vektors in die Zellen verwendet wird, welches allgemein bekannt ist. Geeignete Techniken umfassen Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Genkanone, Elektroporation und Infektion mit viralen Vektoren.
Die Zellen, die durch ein Verfahren der Erfindung erhalten worden sind, können in einer Kombination mit jedweder bekannten Technik der Gewebeerzeugung verwendet werden, einschließlich unter anderem solchen Technologien, die in Patenten und Veröffentlichungen beschrieben sind, die in „Hintergrund der Erfindung" zitiert sind (einschließlich die US-Patente Nr. 5,902,741 und 5,863,531 (Advanced Tissue Sciences, Inc.)), sowie unter anderem: US-Patent Nr. 6,139,574 , Vacanti et al. (31.10.2000), „Vascularized Tissue Regeneration Matrices Formed By Solid Free Form Fabrication Techniques"; US-Patent Nr. 5,759,830 , Vacanti et al. (2.6.98) „Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cells For Producing Vascularized Tissue In Vivo"; US-Patent Nr. 5,741,685 , Vacanti (21.4.98), „Parenchymal Cells Packaged In Immunoprotective Tissue For Implantation"; US-Patent Nr. 5,736,372 , Vacanti et al. (7.4.98), „Biodegradable Synthetic Polymeric Fibrous Matrix Containing Chondrocyte For In Vivo Production Of A Cartilaginous Structure"; US-Patent Nr. 5,804,178 , Vacanti et al. (8.9.98), „Implantation Of Cell-Matrix Structure Adjacent Mesentery, Omentum Or Peritoneum Tissue"; US-Patent Nr. 5,770,417 , Vacanti et al. (23.6.98), „Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cells For Producing Vascularized Tissue In Vivo"; US-Patent Nr. 5,770,193 , Vacanti et al. (23.6.98), „Preparation of Three-Dimensional Fibrous Scaffold For Attaching Cells To Produce Vascularized Tissue In Vivo"; US-Patent Nr. 5,709,854 , Griffith-Cima et al. (20.1.98), „Tissue Formation By Injecting A Cell-Polymeric Solution That Gels In Vivo"; US-Patent Nr. 5,516,532 , Atala et al. (14.5.98), „Injectable Non-Immunogenic Cartilage And Bone Preparation", US-Patent Nr. 5,855,610 , Vacanti et al. (5.1.99), „Engineering Of Strong, Pliable Tissues"; US-Patent Nr. 5,041,138 , Vacanti et al. (20.8.91), „Neomorphogenesis Of Cartilage In Vivo From Cell Culture"; US-Patent Nr. 6,027,744 , Vacanti et al. (22.2.00), „Guided Development and Support Of Hydrogel-Cell Compositions"; US-Patent Nr. 6,123,727 , Vacanti et al. (26.9.00), „Tissue Engineered Tendons And Ligament"; US-Patent Nr. 5,536,656 , Kemp et al. (16.7.96), „Preparation Of Tissue Equivalents By Contraction Of A Collagen Gel Layered On A Collagen Gel"; US-Patent Nr. 5,144,016 , Skjak-Braek et al. (1.9.92), „Alginate Gels"; US-Patent Nr. 5,944,754 , Vacanti (31.8.99), „Tissue Re-Surfacing With Hydrogel-Cell Compositions"; US-Patent Nr. 5,723,331 , Tubo et al. (3.3.98), „Methods And Compositions For The Repair Of Articular Cartilage Defects In Mammals"; US-Patent Nr. 6,143,501 , Sittinger et al. (7.1.00), „Artificial Tissues, Methods For The Production And The Use Thereof'.
Beispiele
Die Beispiele 1, 2 und 4 fallen nicht in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung und sind lediglich für Veranschaulichungszwecke einbezogen.
Beispiel 1 – Hämatopoietisches Festlegen durch von Fettgewebe stammende Stromazellen
A. Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren, die in der US-Patentanmeldung 09/240,029, eingereicht am 29. Januar 1999, beschrieben sind, sowie unter Verwendung der Modifizierungen des Wachstumsmediums, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, isoliert. Insbesondere wurden menschliche Präadipozyten aus Fettgewebe isoliert, das durch eine Fettabsaugungschirurgie gemäß den Verfahren entfernt worden ist, die bereits von Rodbell und Hauner beschrieben worden sind (Rodbell (1967) und (1974); Hauner, vorstehend). Präadipozyten aus der Stroms-vaskulären Fraktion wurden in DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, resuspendiert und mit 25000 Zellen/Well in jeden der Wells einer 96 Well-Platte (150 μl/Well) plattiert. Die Zellen wurden dann in einen 37%C 5% CO₂-Inkubator eingebracht und über Nacht ansiedeln gelassen. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Menschliche, von Fettgewebe stammende Stromazellen werden bezüglich der hämatopoietischen Differenzierung auf der Basis eines Knochenmarkrepopulationstests getestet. Immunschwache SCID- oder Nackt/Beige-Mäuse werden mit 11 Gy γ-Strahlung in einer aufgeteilten Dosis letal bestrahlt und mit einer Nahrung aus angesäuertem Wasser und autoklaviertem Futter versorgt. Hämatopoietische Zellen aus dem Knochenmark der gleichen Tiere werden in Mengen von etwa 10⁷ Zellen pro Transplantat isoliert. Hämatopoietische Zellen von der Maus (10⁷ von Knochenmark stammende Zellen) oder Stromazellen menschlicher Herkunft (10⁶ von Fettgewebe stammende Zellen) werden in die Mäuse 16 Stunden nach der letalen Bestrahlung durch eine Injektion in die Schwanzvene oder in die Retroorbitalvene eingeführt. Alternativ werden die menschlichen Stromazellen mit den hämatopoietischen Zellen der Mäuse in einem Verhältnis von etwa 1:10 vor der Transplantation in ein subletal bestrahltes Wirtstier gemischt, um einen kompetitiven Repopulationstest festzulegen. Tiere werden unter einer Methoxyfluoran-Anästhesie transfundiert. Sechs bis zwölf Wochen nach der Transplantation wird Blut von den Empfängertieren gesammelt und einer durchflusscytometrischen Analyse mit spezifischen monoklonalen Antikörpern für menschliche hämatopoietische Zellmarker, einschließlich unter anderem Thy 1 (T-Zellen-Marker), B220 (B-Zellen-Marker), Mac 1 (Makrophagenmarker) und HLA (H-2K, menschlicher Marker), unterzogen. Der Prozentsatz der gesamten peripheren hämatopoietischen Zellen menschlicher Herkunft gegen eine Herkunft von der Maus wird bestimmt. In entsprechenden Studien werden Knochenmark und Milz von der Empfängermaus gewonnen und klonogenen in vitro-Tests bezüglich spezifischer hämatopoietischer Linien unterzogen. Diese Studien nutzen Tests auf Methylcellulosekoloniebasis. Zellen werden unter Verwendung vergleichbarer Immunfluoreszenzverfahren bezüglich einer spezifischen Linienfestlegung analysiert.
B. Menschliches Fettgewebe von einem einzelnen menschlichen Patienten wird durch Fettabsaugen isoliert und von Fettgewebe stammende Stromazellen werden gemäß den Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Zellen werden sofort für Patienten mit hämatopoietischen Störungen verwendet, wie z. B. Störungen nach einer hochdosierten Chemotherapie, oder sie werden für eine zukünftige Verwendung in dem Fall eines akuten Medikamentenbedarfs durch diesen Patienten oder einen histokompatiblen Empfänger kryokonserviert. Stromazellen werden in den Empfänger entweder als autologe oder allogene Transplantation nach jedwedem Ereignis, wie z. B. einer Chemotherapie oder einer Bestrahlung, das die Knochenmarksfunktion und die Immunkompetenz stark beeinträchtigt, infundiert. Stromastammzellen werden mit einem Fluoreszenzmarker markiert, um es einem Arzt zu ermöglichen, deren Schicksal nach der Transplantation zu verfolgen. Anzeichen für eine beschleunigte Knochenmarkserholung werden auf der Basis des Nachweises von neu synthetisierten hämatopoietischen Zellen (Lymphoidzellen, Myeloidzellen, Erythroidzellen und Plättchen) in dem peripheren Blutstrom auf der Basis von durchflusscytometrischen Verfahren überwacht.
Beispiel 2 – Astroglia-Festlegen durch von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
A. Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Zellen werden in das Zentralnervensystem von immunschwachen Mäusen oder Ratten transplantiert. Nackt/Beige- oder SCID-Mäuse oder Nacktratten werden in einer verschlossenen Kammer unter Verwendung von 3% Halothan in Sauerstoff anästhesiert; die Anästhesie wird durch eine intramuskuläre Injektion von 6 mg/kg Xylozin und 60 mg/kg Ketamin aufrechterhalten. Die Tiere werden in einem sauberen Bereich in eine Stereotaxievorrichtung überführt. In die Kopfhaut 2 mm lateral zum Vorderkopf wird ein 2 bis 5 mm Einschnitt ausgeführt. Mit einem Zahnbohrer wird in den Knochen 3 mm lateral zum Vorderkopf ein Bohrloch eingebracht. Etwa 10 μl einer Zellsuspension (10000 Zellen pro μl) werden langsam während eines 30 min-Zeitraums in das Striatum in einer Tiefe von 4 bis 5 mm von der Oberfläche des Gehirns injiziert. Die Wunde wird dicht vernäht und die Tiere wurden für einen Zeitraum von bis zu 10 Wochen beobachtet. Tiere werden nach einer tiefen Anästhesie mittels Xylozin und Ketamin durch eine intrakardiale Perfusion unter Verwendung von eiskaltem PBS, 3% gepuffertem Paraformaldehyd und dann 10% Saccharose getötet. Die Gehirne werden mittels Immunhistochemie und einer in situ-Hybridisierung bezüglich der Gegenwart menschlicher Genmarker (Alu-Fragment) und der Exprimierung von Zelllinien-spezifischen Marken untersucht. Durch diesen Ansatz werden Hinweise auf ein Überleben, eine Differenzierung und eine Wanderung von menschlichen Zellen bestimmt. Modifizierungen unter Verwendung einer Zellmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen oder einer gentechnischen Behandlung der Zellen vor dem Implantieren mit viralen Mitteln können in Betracht gezogen werden.
B. Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen Patienten gemäß den Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, für eine autologe oder allogene Transplantation in einen histokompatiblen Empfänger isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Stromazellen werden in das Zentralnervensystem eines Patienten nach einer lebensbedrohlichen und/oder schwächenden Zentralnervensystemstörung oder -erkrankung, wie z. B. einem kraniovaskulären Zwischenfall (Schlaganfall), Parkinson-Krankheit oder Alzheimer-Krankheit, eingeführt. Zellen werden in das Striatum des betroffenen Bereichs des Gehirns unter Verwendung eines neurochirurgischen Ansatzes eingeführt. Wo immer dies möglich ist, werden radiologisch geführte, minimal invasive Verfahren eingesetzt. Die kognitive und metabolische Funktion des Zentralnervensystems wird nach der Chirurgie verfolgt, um Verbesserungen nach der Transplantation zu dokumentieren. Zellen, die gentechnisch mit Genen versehen sind, die Enzyme kodieren, die so gestaltet sind, dass sie die ZNS-Funktion verbessern, wie z. B. Dopamin-metabolische Enzyme in dem Fall einer Parkinson-Krankheit, werden je nach Eignung für bestimmte Störungen verwendet.
Beispiel 3 – Neuronales Festlegen durch von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
Verbesserte Reparatur und funktionelle Wiederherstellung bei einer traumatischen Verletzung des Nervensystems
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen Patienten gemäß den Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, für eine autologe oder allogene Transplantation in einen histokompatiblen Empfänger isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien mit 1 mM Glutamin, jedoch ohne Pyruvat, zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 10% Serum vom neugeborenen Kalb, Nukleosidlösungen, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 1000 Einheiten/ml Leukämieinhibierenden Faktor und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert.
Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet. Zellen werden dann auf ein Gewebekulturkunststoffsubstrat plattiert, das mit einer sterilen 0,1% Gelatinelösung beschichtet ist. Zellen werden während des Stadiums eines schnellen Wachstums durch einen Abbau mit 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA und Zerreiben vor der Differenzierung/Implantierung geerntet. Zellen werden als Suspension in der Form von einzelnen Zellen und Zellklumpen, die zusammen vorliegen, geerntet. Zellen werden als Aliquots in bakteriologische (nicht-Gewebekultur)-Schalen mit einem Durchmesser von 100 mm in einem Volumen von 10 ml Medium, das aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien mit 1 mM Glutamin, jedoch ohne Pyruvat, zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 10% Serum vom neugeborenen Kalb und Nukleosidlösungen (Kontrollmedium) enthielten, eingebracht. Die Zellkulturen werden zwei Tage gehalten, wobei sich während dieser Zeit Zellaggregate bilden; zu diesem Zeitpunkt wird das Medium durch das ursprüngliche Kontrollmedium ersetzt. Nach weiteren zwei Tagen der Kultivierung (Tag 4 nach der Passage) werden die Zellen mit Kontrollmedium versorgt, das mit all-trans-Retinsäure bei Konzentrationen zwischen 10^–9 M bis 10^–6 M, insbesondere bei 5 × 10^–7 M ergänzt ist. Die Zellen werden am Tag 6 in dem mit all-trans-Retinsäure ergänzten Medium gehalten. Am Tag 8 nach der Passage sind die Zellen zur Bewertung und Verwendung bei der Behandlung eines traumatischen Verletzungsmodells des Rückenmarks oder des peripheren Nervensystems bereit.
Die in vitro-Bewertung der Zellen wird durch Überführen der Zellen von der bakteriologischen Kulturschale auf Standardgewebekulturschalen zur Bereitstellung eines Substrats zum Binden durchgeführt. Zellen werden an den Kunststoff anhaften gelassen und auf der Basis ihrer Morphologie im Einklang mit ihrem neuronalen Differenzierungsprofil und ihrer Exprimierung von neuronal assoziierten Proteinen, einschließlich unter anderem Klasse III beta-Tubulin, der M-Untereinheit von Neurofilamenten, Tyrosinhydroxylase, Glutamatrezeptor-Untereinheiten der GluR1–4- und GluR6-Klassen, gliales fibrilläres saures Protein, basisches Myelinprotein und Gehirnfaktor 1 (Rain et al. (1995), Develop. Biol. 168, 342–357), bewertet.
Die in vivo-Bewertung der Zellen wird durch Transplantieren der Zellaggregate in die Fistel durchgeführt, die sich um eine experimentell induzierte thorakale Rückenmarksläsion in Ratten bildet (McDonald et al. (1999), Nature Med. 5(12), 1410–1412). Das thorakale Rückenmarksverletzungsmodell (Brustwirbel 9 und 10) wird in Long-Evans-Ratten unter Verwendung eines 10 g-Stabs mit einem Durchmesser von 2,5 mm, der 25 mm fällt, verursacht. Am neunten Tag nach der Verletzung werden von Fettgewebe stammende Stromazellaggregate (etwa 10⁶ Zellen) durch Injektion unter Verwendung eines Mikrostereotaxie-Injektionssystems in die Fistel der thorakalen Rückenmarksverletzung transplantiert. Scheinkontrollen werden mit einem äquivalenten Volumen an Medien allein (keine Zellen) injiziert. Beginnend mit dem Tag der Transplantation erhalten Ratten täglich Cyclosporin (10 mg/kg), um eine Abstoßung zu verhindern. Die motorische Hinterlauffunktion der Ratten wird auf der Basis der Basso-Beattie-Breesnahan-Locomotor-Bewertungsskala während eines Zeitraums von 6 Wochen nach der Transplantation bewertet, um einen funktionellen Vergleich der Wiederherstellung zwischen transplantierten Stromazellen und Scheinkontrollen zu ermöglichen. Am Ende der Studie (6 Wochen) werden die Tiere getötet und die Gewebe werden histologisch bezüglich Anzeichen von menschlichen Fett-Stromazellen auf der Basis eines in situ-Nachweises der menschlichen Alu-DNA untersucht. Die Zelldifferenzierung wird durch einen Antikörpernachweis von Oligodendrocyten-spezifischen Markern, wie z. B. unter anderem des adenomatösen Polyposis Coli-Genprodukts APC CC-1, von Astrocyten-spezifischen Markern, wie z. B. unter anderem glialem fibrillären sauren Protein, GFAP, und neuronalem, wie z. B. unter anderem Neuron-spezifischem Kernprotein, NeuN, bestimmt. Die Colokalisierung der Alu-DNA mit differenzierungsspezifischen Markern wird als Anzeichen für eine Stromazelldifferenzierung gewertet.
Menschliche, von Fettgewebe stammende Stromazellen werden bezüglich der neuronalen Differenzierung auf der Basis von in vitro-Tests bewertet. Menschliche, von Fettgewebe stammende Stromazellen werden bei Konzentrationen von 8000 Zellen/cm² für 24 Stunden in DMEM, das mit 20% fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt ist, kultiviert. Die Zellen werden dann mit Antioxidationsmitteln, wie z. B. BHA, bei Konzentrationen von 20 μm bis 200 μm in DMEM mit 0% fetalem Rinderserum für Zeiträume von 5 Stunden bis 5 Tagen behandelt. Zellen werden fixiert und bezüglich der Exprimierung einer neuronalen Differenzierung durch (a) morphologische Kriterien, (b) immunhistochemische Kriterien, Immunfluoreszenzkriterien oder Durchflusszytometriekriterien, (c) Immunblotkriterien und/oder eine Polymerasekettenreaktion oder eine Northernblot-Analyse von ausgewählten mRNA's untersucht. Die Zellen werden bezüglich ihrer Exprimierung eines Untersatzes der folgenden neuronalen Marker bewertet: NeuN, NF-M, NSE, Nestin und trkA unter Verwendung von Antikörper- oder Oligonukleotidreagenzien. Morphologische Kriterien der Differenzierung umfassen die Bildung eines zusammengezogenen multipolaren Zellkörpers mit membranartigen, Fortsatzähnlichen Zellverlängerungen, die zum Wachstum von kegelartigen Enden und filopodialen Verlängerungen führen, das Vermögen von solchen Zellen, ein Aktionspotenzial zu erzeugen und aufrechtzuerhalten, das mit einer neuronalen Signalübertragung konsistent ist, und das Vermögen zur Exprimierung von Rezeptoren und von Aufnahmesystemen für bekannte Neurotransmitter, wie z. B. Glutamat.
Beispiel 4 – Hepatocyten-Festlegen durch von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
A. Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren, die in „Methods and Composition for the Differentiation of Human Preadipocytes into Adipocytes", US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/240,029, eingereicht am 29. Januar 1999, beschrieben sind, und unter Verwendung der vorstehend angegebenen Modifizierungen isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Von Fettgewebe stammende Stromazellen werden in immunschwache Nacktmäuse transplantiert, die ein Transgen für das Haupt-Harnprotein-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivatorfusionsgen aufweisen [T. C. Weglarz, J. L. Degen, E. P. Sandgren, „Hepatocyte transplantation into diseased mouse liver: kinetics of parenchymal repopulation and identification of the proliferative capacity of tetraploid and octaploid hepatocytes", Am. J. Pathol. 157, 1963–1974 (2000)]. Diese Tiere zeigen eine progressive Degeneration der Leber. Die Stromazellen werden in das Tiermodell durch eine Transplantation in die Milz, eine intraperitoneale und/oder intravenöse Infusion eingeführt. Repräsentative Tiere von Kontroll- oder Experimentgruppen werden in Intervallen während eines Zeitraums von 4 Monaten getötet. Anzeichen einer Leberregeneration werden auf der Basis von histologischen und molekularbiologischen Analysen des Lebergewebes bewertet. Immunhistochemische und molekularbiologische (Alu-Färbung) Verfahren werden die Gegenwart von menschlichen Zellen in der regenerierten Leber dokumentieren.
B. Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen Patienten für eine autologe oder allogene Transplantation in einen histokompatiblen Empfänger gemäß den Verfahren, die in „Methods and Composition for the Differentiation of Human Preadipocytes into Adipocytes", US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/240,029, eingereicht am 29. Januar 1999, beschrieben sind, und unter Verwendung der vorstehend angegebenen Modifizierungen isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
Stromazellen werden in die Milz, den Kreislauf und/oder das Peritoneum eines Patienten eingeführt, der an degenerativen Lebererkrankungen jedweder Herkunft nach einer viralen Infektion, einer Toxinaufnahme, oder an angeborenen metabolischen Defekten leidet. Wo immer dies möglich ist, werden zur Implantierung der Zellen radiologisch geführte, minimal invasive Verfahren verwendet. Zellen, die gentechnisch mit Genen versehen worden sind, die Enzyme kodieren, die zur Verbesserung der Leberfunktion gestaltet sind, werden je nach Eignung für bestimmte Störungen verwendet.

Claims

In vitro-Verfahren zum Differenzieren einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle in eine Zelle mit den Eigenschaften einer neuronalen Zelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Stromazelle mit einem Antioxidationsmittel umfasst, um dadurch die Differenzierung der Stromazelle in eine Neuronalzelle in vitro zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierte, von Fettgewebe stammende Stromazelle eine menschliche Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antioxidationsmittel aus der Gruppe, bestehend aus 2-Mercaptoethanol und butyliertem Hydroxyanisol, ausgewählt ist.