JP2005527223A - サイトカインフリーでの前駆細胞の増殖および維持 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、広く造血細胞に関し、より具体的には造血前駆細胞(hematopoietic progenitor cell)のインビトロ培養のための方法に関する。
赤血球、白血球、血小板およびリンパ球などの循環する血液細胞は、認識できる前駆体(precursor)の最終的な分化の産物である。胎児においては、造血は網状内皮系を介して起こる。通常の成人においては、認識できる前駆体の最終的な分化は、もっぱら軸骨格の髄腔において起こり、近接した大腿骨ならびに上腕骨および脊椎へいくらか拡張する。これら前駆体の細胞は、同様に、前駆細胞(progenitor)と呼ばれる極めて未熟な細胞に由来し、メチルセルロースなどの半固体培地で1〜3週間で成熟した血液細胞の連続したコロニーへの発達によりアッセイされる。
ヒト骨髄細胞の培養物は、当初、限られた造血能を有しており、減少した数の造血前駆細胞および成熟血液細胞を産生し、6〜8週間までに細胞の産生が中断することが見出された。元の系を後に改変してもわずかしか改善されなかった。これは、造血前駆細胞が、インビボで発見された必須の成長因子(造血成長因子(hematopoietic growth factor)およびサイトカイン)などの環境の影響に依存することに大きく起因する(例えば米国特許5,599,703、5,728,851および6,372,210参照)。
別のアプローチは、造血前駆細胞の培養および支持のために放射線照射された骨髄間質を用い、長期培養初期細胞(long-term culture initiating cell(LTCIC))(これらは未熟な細胞である) としてこれらの前駆細胞を維持すること、ならびに、造血前駆細胞およびLTCICのレロトウイルスベクターによる形質導入が増加することが示された。しかし、非自己骨髄の移植に対する感染および免疫反応のリスクについて、疑問が生じてきた。細胞間質成分であるフィブロネクチンは、レトロウイルスの形質導入を増強しつつ、感染および免疫を介した反応のこのリスクを減少させる。しかし、フィブロネクチン単独では、インビトロで原始的な造血前駆細胞を維持するのに充分ではないおそれがある。
造血前駆細胞の増殖を提供するアプローチにより、大量の骨髄の供与への必要性が減少するであろうし、少量の骨髄提供を得て、その後受容者への導入の前にインビトロで前駆細胞の数を増やすことが可能になるであろう。また、少数の造血前駆細胞が血流中で循環していることが知られている。これらの細胞を選択して増やすことができれば、末梢血から移植のための必要数の造血前駆細胞を得、そして骨髄提供への必要をなくすことが可能になるであろう。
造血前駆細胞の増殖を提供する成功するアプローチは、多数の非分化前駆体細胞およびさらに特定の系統の分化前駆体細胞の産生を大きく促進し、同様に、輸血を含む広い種々の適用に多数の分化した造血細胞を提供するであろう。
多数の分化した造血細胞を提供する必要性も存在している。
本発明の目的は、造血前駆細胞の自己再生特性および多分化能特性を維持しつつ、造血幹細胞の増殖(expansion and proliferation)のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、多数の特定の系統の前駆細胞およびそれらのさらに分化した造血細胞の制御された産生のための方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下においてより詳細に記載される。
本発明は、1つの重要な部分では、造血前駆細胞の培養のための改善された方法に関し、この方法は、例えば造血前駆細胞の多分化能および自己再生能を維持できるものである。したがって、本発明の一面は、造血前駆細胞の培養物の改善された維持である。他の面は、造血前駆細胞の試料から得られる子孫(progeny)の数の改善である。本発明のさらなる他の面は、造血前駆細胞の試料から得られる分化した子孫血液細胞の数の改善である。
造血前駆細胞は、骨髄(非分画骨髄を含む)、末梢血(動員(mobilized)末梢血を含む)、臍帯血、胎盤血、胎児肝臓、胚細胞(胚幹細胞を含む)、大動脈−性腺−中腎由来細胞(aortal-gonadal-mesonephros derived cell)およびリンパ軟組織などの組織由来であってもよい。リンパ軟組織は、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃腺およびパイエル板(Peyer's patch)を含む。
本発明によれば、今では、培養の間における前駆細胞の分化および/または損失の誘導なしに造血前駆細胞を培養することができ、そして、造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する造血成長因子を含むおよび/またはそれらを対象に導入する培養条件に、引き続き暴露するその時間間隔の間に細胞をハーベストすることができる。この期間にわたる培養およびハーベストは、本発明の独自の側面である。
他の態様においては、第一の培養ステップの環境は、栄養培地への血清の添加の結果として存在する成長因子以外に、いかなる造血成長因子をも含まない。本発明のこの面においては、本方法は、さらに、複数の第二の培養ステップであって、それぞれが第二の量の造血前駆細胞の一部のみを培養することを含む、第二の培養ステップを包含してもよい。
本方法はまた、第一の培養ステップおよび第二の培養ステップの間に、ハーベストするステップを含んでもよく、前記ハーベストするステップは、第二の培養ステップにおいて第二の量の少なくとも一部を培養する前に、第二の量の少なくとも一部をハーベストすることを含む。また、前記のハーベストするステップは、時間間隔を隔てた複数のハーベストするステップであってもよく、この場合には、第二の培養ステップは、それぞれが各ハーベストするステップのための培養ステップである、複数の第二の培養ステップであってもよい。造血前駆細胞の好ましい源および培養条件は、上記のとおりである。
造血細胞の維持、増殖および/または分化に関わる全ての上述の態様において、用いられる造血成長因子は、インターロイキン3、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン11、インターロイキン12、幹細胞刺激因子、FLK-2リガンド/FLT-3リガンド、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、オンコスタチンMおよびMCSFからなる群から選択される。
図1〜4は本発明の実施可能性には要求されないことが理解される。
本発明は、一面においては、血清以外に、接種された間質細胞、間質細胞で調整された培地、ならびに、造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する外因的に添加された造血成長因子が全くない環境で、造血前駆細胞を培養することを含む。
本発明の方法により培養される細胞は、造血前駆細胞である。ここで用いられる「造血前駆細胞」とは、自己再生する能力、ならびに、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、巨核球産生血小板、血小板)、リンパ球(例えば、B細胞、T細胞、NK細胞)、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞)および単球(例えば、循環単球、組織マクロファージ、ミクログリア)を含む、さらに成熟した血液細胞に分化する能力を有する未熟な血液細胞をいう。このような細胞は、CD34+細胞を含んでも含まなくてもよいことは当該技術分野において知られている。
本発明による培養方法の全てにおいて用いられる培地は、細胞を培養するために慣用されているもの、例えばRPMI、DMEM、ISCOVESなどであって、有効量の脂肪酸、有効量のコレステロール、有効量のトランスフェリン(もしくは有効量の鉄塩)、および0.25〜2.5 U/ml の量のインスリン(もしくは有効量のインスリン様成長因子)が補充されているものである。このような補充成分を含む培地は、市販されているか(例えば、Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD)および/またはBrownの米国特許6,372,210 B2において記載されている。本発明において、好ましい補充培地は、QBSF (Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD)である。
その標的細胞における各サイトカインの作用は、細胞表面の受容体への結合を介する。サイトカインは、ホルモンの多くの特性を共有しているが、古典的なホルモンが一般的に組織内で近隣の細胞に局所的に作用する点において、古典的なホルモンとは明確に区別される。
ここで用いられる「間質細胞」は、他の細胞および要素を有するかまたは有さない線維芽細胞および間葉細胞を含み、引き続く造血前駆細胞の接着および増殖を助ける条件を確立するのに用いられ得る。線維芽細胞は、あらゆる組織または臓器から生検により得ることができ、胎児線維芽細胞を含んでもよい。これらの線維芽細胞および間葉細胞に、例えば、上記の造血成長因子のうちの1つをコードする外来性DNAをトランスフェクトしてもよい。
したがって、細胞は、上述の剤を全く有さずに培養される場合には、ここでは、血清、通常の栄養培地、あるいは、造血前駆細胞を含む、単離され、非分画または分画された血液産物の中に存在し得るものを除き、かかる剤の添加なしに培養されることを意味する。
ここで用いられるように、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。ヒト造血前駆細胞およびヒト対象は、特に重要な態様である。本発明によれば、細胞の一定量が、インビトロで細胞培養チャンバーに導入され、そして、血清以外に、接種された間質細胞、間質細胞で調整された培地、ならびに造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する外因的に添加された造血成長因子がない環境で、培養される。
本発明は、以下の例を参照することにより、さらに充分に理解されるであろう。しかしながら、これらの例は、単に本発明の態様を詳述することを意図しているだけであり、本発明の範囲を限定するために構成されるものと解されるべきではない。
細胞の分離および培養:
CD34+細胞造血前駆細胞は、フィコール(Ficoll)分離およびマグネチック抗ヒトCD34+ビーズ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)により、ヒト動員末梢血(mPB)から単離された単核細胞由来であった。
CD34+造血前駆細胞はまた、ヒト骨髄または臍帯血由来であってもよい。これらの源はPoietics, Gaithersburg, MDから市販されている。いくつかの場合においては、マグネチックビーズ分離ステップの後に、抗イディオタイプ(idiotype)抗体(例えばDetachabead, Dynal)を用いているビーズからの分離を行ってもよい。
50万個のCD34+細胞を、標準的な48ウェル組織培養プレート(Becton Dickinson/Falcon, Bedford, MA)の各ウェルに播種した。培養物には、5%のプールされていたヒトAB血清が補充された、0.35〜1 mlのQBSF-60液体培地(Quality Biological, Gaithersburg, MD)を用いた。培養物は、37℃、5%CO2インキュベーター中で、7〜14日間インキュベートした。
培養期間の後、全ての非接着細胞を各ウェルからハーベストして、カウントし、表面抗原を染色した。細胞数および生存率は、トリパンブルー(Trypan Blue)の排出およびNuebauer 血球計算板(Haemocytometer)上での計数により決定した。
ハーベスト時の平均細胞数は、136万個の生細胞であった。これは、インプットした細胞数に対して2.6倍の増加である。ハーベスト時の細胞生存率(89.1%)は、インプット時の生存率(92.3%)とほとんど同じであることが見出された。これらの結果を図1および2に示す。
CD34+の集団を調べた場合にも同様の結果がみられた。ハーベスト時のCD34+細胞の平均数は、979,000であった。これは、インプットに対して2.1倍の増加を表している。CD34マーカー陽性細胞の平均パーセントは、インプットおよびアウトプット集団の両方において同様であった(92.0% v. 87.5%)。これらの結果を図3および4に示す。
前駆細胞の分布を評価するために、表面の表現型の決定に用いられる抗体は、抗CD34(Qbend10, Beckman/Coulter, Brea, CA)、抗CD38および抗CD45 (両方ともBD Immunocytometry, San Diego, CA)抗体を含む。細胞のフローサイトメトリー解析は、FACSCalibur機器(Becton Dickinson)を使用し、マルチパラメータ(multi-parameter)FACScanフローサイトメトリー解析を用いて行った。補正を設定するための適切な単色染色とともに、適切な対照は、陽性および陰性クオドラント(quadrant)を設定するための適合したアイソタイプ(isotype)抗体を含んでいた。各サンプルに対して、少なくとも10,000 のリストモード(list mode)が収集された。
(上記の通り7〜14日間培養された)HPCのミエロイド(myeloid)および赤血球系(erythroid)コロニーの産生能は、従来のメチルセルロースアッセイを用いて示すことができる。典型的なメチルセルロースアッセイが以下に記載されているが、当業者は、過度の実験をすることなく、必要に応じて前記のアッセイを改変することができるであろう。
上記の通りに培養物から単離された同数の細胞を、1.33×104細胞/mlの密度で、サイトカイン (IL-3 20ng/ml;GM-CSF 30ng/ml;エリスロポエチン 3IU/ml;幹細胞刺激因子50 ng/ml;全てStem Cell Technologies, Vancouver, CA)に加えて0.5mlのDMEM (2% のFCS, 10IU/mlのペニシリン、10pg/mlのストレプトマイシン、1 mMのL-グルタミン)を含む、3.5mlのメチルセルロース培地に加える。この混合物の1.5mlを泡立てないようにシリンジととがっていない注射針を用いて、決められたペトリディッシュに添加する。各条件について、二反復にてアッセイを行う。その後、2つの二反復によるペトリディッシュを5%CO2で37℃のインキュベーターに10〜21日間置く。10〜21日後、コロニーの数を手作業でカウントすることにより決定する。陽性コロニーは、20個以上の細胞が集積していることを基準として決められる。赤血球系コロニーは、14〜21日後、ヘモグロビンを示す金茶色(gold-brown)の色素に基づいて決定され、一方、ミエロイドコロニーは、その主として透明な外見により同定される。カウントは、二反復にて行う。
培養されたHPC(上記の通り培養された)の増殖能および分化能も、また、当該技術分野において既知の動物モデルを用いてインビボで示すことができる。これらのビボアッセイは、HPCの複数のタイプの血液細胞子孫の産生能(例えば、多分化能)、自己再生能、および/または宿主における移植体の生着(engraft)能を示す。そのようなモデルの1つは、亜致死放射線照射免疫不全非肥満性糖尿病−重症複合型免疫不全症(sublethally-irradiated immunodeficient nonobese diabetic-scid)/scid(NOD/SCID)マウスである(Conneally E, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A, 1997,94 : 9836-41)。簡潔には、本発明の上述の方法により培養されたHPCを、亜致死放射線照射免疫不全NOD/SCIDマウスに静注し、かかる受容対象の骨髄を、移植後6〜8週後に、移植体の生着について調べる(例えば、CD34CD19+(Bリンパ球)およびCD34+(ミエロイド)コロニー形成細胞の子孫の両方を産生する細胞の頻度を測定するために限界希釈法を用いることにより)。
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の態様と均等なものの多くを認識し、また、日常的な実験を超える用いることなく確かめることができるであろう。かかる均等物は下記特許請求の範囲に包含されることが意図される。本明細書で開示された全ての参考文献は、その全体において参照により組み込まれる。
Claims (20)
- 造血前駆細胞のインビトロ培養のための方法であって:
培養チャンバーに一定量の造血前駆細胞を導入すること、ならびに、血清以外に、接種された間質細胞、間質細胞で調整された培地、および造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する外因的に添加された造血成長因子がない環境で、前記細胞を培養することを含む、前記方法。 - 環境が、インターロイキン3、6および11、Tpo、幹細胞刺激因子ならびにFLT/FLKリガンド成長因子を含まない、請求項1に記載の方法。
- 環境が、造血成長因子を含まない、請求項1に記載の方法。
- 導入するステップの前に、血液産物から造血前駆細胞を得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 血液産物が、動員末梢血または動員臍帯血である、請求項4に記載の方法。
- 培養チャンバーに導入された量に対して造血前駆細胞の数が増加するのに充分な条件下および時間で、造血前駆細胞が培養される、請求項1に記載の方法。
- 培養するステップの後に、細胞をハーベストすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する造血成長因子、接種された間質細胞、ならびに間質細胞で調整された培地からなる群から選択される、外因的に添加される剤の少なくとも1種の中で、ハーベストされた造血細胞を培養することをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 1回目のハーベストで得られた造血細胞を、外因的に添加される剤の存在下で培養すること、および
少なくとも1回のさらなるハーベストで得られた造血細胞を、外因的に添加される剤の存在下で培養すること、
をさらにを含む、請求項8に記載の方法であって、
前記外因的に添加される剤は、造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する造血成長因子、接種された間質細胞、ならびに間質細胞で調整された培地からなる群から選択される、前記方法。 - 造血系由来の分化した細胞を産生するための、造血前駆細胞のインビトロ培養のための方法であって:
第一の培養ステップにおいて、第一の量の造血前駆細胞を、血清以外に、接種された間質細胞、間質細胞で調整された培地、および造血細胞の分化を促進する外因的に添加された造血成長因子がない環境で、前記第一の量に対して造血前駆細胞の数またはコロニー形成ユニットが増加する条件下および時間で培養し、それにより第二の量の造血前駆細胞を産生すること、そして、第二の培養ステップにおいて、造血系由来の分化した細胞を産生するために、前記第二の量の造血前駆細胞の少なくとも一部を、造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する造血成長因子、接種された間質細胞、ならびに間質細胞で調整された培地からなる群から選択される剤の少なくとも1種が含有される環境において、培養することを含む、前記方法。 - 第一の培養ステップの環境が、インターロイキン3、6および11、Tpo、幹細胞刺激因子ならびにFLT/FLKリガンド成長因子を含まない、請求項10に記載の方法。
- 環境が、造血成長因子を含まない、請求項10に記載の方法。
- 第二の培養ステップが、複数の第二の培養ステップであって、それぞれが第二の量の造血前駆細胞の一部のみを培養することを含む、請求項10に記載の方法。
- 第一の培養ステップおよび第二の培養ステップの間に、ハーベストするステップをさらに含む、請求項10に記載の方法であって、前記ハーベストするステップが、第二の培養ステップにおいて第二の量の少なくとも一部を培養する前に、第二の量の少なくとも一部をハーベストすることを含む、前記方法。
- ハーベストするステップが、時間間隔を隔てた複数のハーベストするステップを含み、そして、第二の培養ステップが、それぞれが各ハーベストするステップのための培養ステップである、複数の第二の培養ステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 造血前駆細胞が血液産物から得られる、請求項10に記載の方法。
- 血液産物が、動員末梢血または動員臍帯血である、請求項16に記載の方法。
- 造血系由来の分化した細胞を産生するための、造血前駆細胞のインビトロ培養のための方法であって:
第一の培養ステップにおいて、培養造血前駆細胞を産生するために、造血前駆細胞を、血清以外に、接種された間質細胞、間質細胞で調整された培地、および造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する外因的に添加された造血成長因子がない環境で、培養すること、
断続的にハーベストされた培養造血細胞の一部を複数作製するために、断続的に前記培養造血前駆細胞の一部のみをハーベストすること、
複数の第二の培養ステップにおいて、造血系由来の分化した細胞を産生するために、断続的にハーベストされた一部の複数を培養することを含み、ここで、第二の培養ステップは、造血細胞の維持、増殖および/または分化を促進する造血成長因子、接種された間質細胞、ならびに間質細胞で調整された培地からなる群から選択される剤の少なくとも1種を含有する環境において行われる、前記方法。 - 第一の培養ステップの環境が、インターロイキン3、6および11、Tpo、幹細胞刺激因子ならびにFLT/FLKリガンド成長因子を含まない、請求項18に記載の方法。
- 環境が、造血成長因子を含まない、請求項18に記載の方法。
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