JP3452366B2 - 新規人工組織、その製法およびその使用 - Google Patents
新規人工組織、その製法およびその使用Info
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- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
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- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規人工組織、その製法およびその使用、な
らびに生きている移植片の製造および疾病モデルの樹立
を目的として人工組織を誘導するための細胞相互作用系
に関する。in vitroの臓器および組織モデル用のかかる
細胞相互作用培養系は、三次元支持構造物（細胞外マト
リックス（ECM）の形成を可能にするが、もともとはECM
を有しない）を用いて三次元細胞組織を調製するのに適
している。人工組織の密な相互作用は、外的影響（例え
ば、薬剤の投与）による細胞およびマトリックスの変化
を境界域で試験することができる疾病モデルの構築を可
能とする。
らびに生きている移植片の製造および疾病モデルの樹立
を目的として人工組織を誘導するための細胞相互作用系
に関する。in vitroの臓器および組織モデル用のかかる
細胞相互作用培養系は、三次元支持構造物（細胞外マト
リックス（ECM）の形成を可能にするが、もともとはECM
を有しない）を用いて三次元細胞組織を調製するのに適
している。人工組織の密な相互作用は、外的影響（例え
ば、薬剤の投与）による細胞およびマトリックスの変化
を境界域で試験することができる疾病モデルの構築を可
能とする。
多数の細胞培養系が知られており、そこには細胞外マ
トリックス（ECM）が記載されている。こうして、特許
明細書DE 3,410,631には、ゲルの形態をしているか、ま
たは天然もしくは人工の骨材料中に埋め込まれているか
のいずれかである、欠陥のある軟骨または骨を修復する
ための移植材料が示されている。このゲルには、胚性の
種特異的な軟骨細胞または間葉細胞が含まれ、また、好
適には軟骨細胞の細胞外マトリックスおよび成長ホルモ
ンも含まれる。米国特許第4,801,299号には、コラーゲ
ンをベースとする細胞外マトリックスの形態の体内イン
プラントが提案されている。
トリックス（ECM）が記載されている。こうして、特許
明細書DE 3,410,631には、ゲルの形態をしているか、ま
たは天然もしくは人工の骨材料中に埋め込まれているか
のいずれかである、欠陥のある軟骨または骨を修復する
ための移植材料が示されている。このゲルには、胚性の
種特異的な軟骨細胞または間葉細胞が含まれ、また、好
適には軟骨細胞の細胞外マトリックスおよび成長ホルモ
ンも含まれる。米国特許第4,801,299号には、コラーゲ
ンをベースとする細胞外マトリックスの形態の体内イン
プラントが提案されている。
米国特許第4,935,000号には、細胞外マトリックス誘
導を用いた組織の再生方法が記載されている。細胞外マ
トリックスは、さらにヒトの皮膚の再生、化粧用組成物
（米国特許第5,055,298号）に関連して、また、コラー
ゲンやフィブロネクチン基底上にＴ細胞を付着させるた
めに（米国特許第5,188,959号および同第5,354,686号）
も使用されている。双極−付着細胞培養肝細胞の静止期
のための基礎マトリックスとして、コラーゲン（タイプ
１）がDE 4,336,399に記載されている。
導を用いた組織の再生方法が記載されている。細胞外マ
トリックスは、さらにヒトの皮膚の再生、化粧用組成物
（米国特許第5,055,298号）に関連して、また、コラー
ゲンやフィブロネクチン基底上にＴ細胞を付着させるた
めに（米国特許第5,188,959号および同第5,354,686号）
も使用されている。双極−付着細胞培養肝細胞の静止期
のための基礎マトリックスとして、コラーゲン（タイプ
１）がDE 4,336,399に記載されている。
固体の生体適合性担体材料上に酵素、タンパク質およ
び全細胞を、該固体の表面被覆と固定化すべき吸着物と
の間の静電相互作用によって、機能的に固定化すること
はDE 4,323,487に記載されている。WO 92/20780（DE 4,
116,727）には、種々の哺乳類細胞の同時培養、種々の
哺乳類細胞の産物の別々の産生、ならびに体液レベルで
の臓器相互作用のモデリングが記載されている。
び全細胞を、該固体の表面被覆と固定化すべき吸着物と
の間の静電相互作用によって、機能的に固定化すること
はDE 4,323,487に記載されている。WO 92/20780（DE 4,
116,727）には、種々の哺乳類細胞の同時培養、種々の
哺乳類細胞の産物の別々の産生、ならびに体液レベルで
の臓器相互作用のモデリングが記載されている。
インプラントの製造においては、吸収性材料製のポリ
マー繊維束から出発し、その上に単離して増殖させた細
胞を置き、そしてこの束を移植する方法が知られるよう
になった。WO 90/12603では、置き換えるべき臓器の形
態に形成された、所望の細胞を加えられた三次元支持構
造物が報告されている。しかしながら、この三次元支持
構造物では、インプラントの内部の細胞に栄養分を充分
に供給するという課題が存在する。
マー繊維束から出発し、その上に単離して増殖させた細
胞を置き、そしてこの束を移植する方法が知られるよう
になった。WO 90/12603では、置き換えるべき臓器の形
態に形成された、所望の細胞を加えられた三次元支持構
造物が報告されている。しかしながら、この三次元支持
構造物では、インプラントの内部の細胞に栄養分を充分
に供給するという課題が存在する。
DE 4,306,661では、細胞培養物からのインプラントの
製造がクレームされている。それによれば、軟骨細胞
を、予備成形した吸収性の三次元支持構造物（所望のイ
ンプラント構造に相当する）上に置き、この構造物を、
栄養液をその構造物全体に拡散させる物質で覆ってい
る。この方法で、細胞の相互結合により細胞間マトリッ
クスが形成されうる。この人工的に作られた軟骨組織
は、移植中および移植後に、その組織の長期安定性を危
うくする多くの負の影響にさらされる（Buja J.ら、An
n.Rheum.Dis.,1994 Apr.53（４）:229−34）。これは、
例えば、関節症またはリウマチ様関節炎に罹っている患
者では特に重要である。そこでは、移植された組織は、
病理学的変性および炎症過程に対する局所効果を有して
いなければならない。
製造がクレームされている。それによれば、軟骨細胞
を、予備成形した吸収性の三次元支持構造物（所望のイ
ンプラント構造に相当する）上に置き、この構造物を、
栄養液をその構造物全体に拡散させる物質で覆ってい
る。この方法で、細胞の相互結合により細胞間マトリッ
クスが形成されうる。この人工的に作られた軟骨組織
は、移植中および移植後に、その組織の長期安定性を危
うくする多くの負の影響にさらされる（Buja J.ら、An
n.Rheum.Dis.,1994 Apr.53（４）:229−34）。これは、
例えば、関節症またはリウマチ様関節炎に罹っている患
者では特に重要である。そこでは、移植された組織は、
病理学的変性および炎症過程に対する局所効果を有して
いなければならない。
移植可能な軟骨置換組織の製造法は、いくつか知られ
ている（Vacanti C.A.ら、Plastic and Reconstructive
Surgery,8:753−759,1991;Sittinger M.ら、Biomateri
als 1994,15:451−456）。
ている（Vacanti C.A.ら、Plastic and Reconstructive
Surgery,8:753−759,1991;Sittinger M.ら、Biomateri
als 1994,15:451−456）。
さらに、ex vivoで主に抗炎症性遺伝子を有する滑膜
の細胞を提供し、次にそれらを再移植する方法も記載さ
れている（Evans,C.H.and P.D.Robbins,1994;Gene Ther
apy for Arthritis,in Gene Therapeutics:Methods and
Applications of Direct Gene Transfer;J.A.Wolff
編、Birkhauser,Boston,312−343）。
の細胞を提供し、次にそれらを再移植する方法も記載さ
れている（Evans,C.H.and P.D.Robbins,1994;Gene Ther
apy for Arthritis,in Gene Therapeutics:Methods and
Applications of Direct Gene Transfer;J.A.Wolff
編、Birkhauser,Boston,312−343）。
本発明は、新しい人工組織を提供し、その製造方法を
開発し、そしてその医療上の使用を可能にするという目
的に基づくものである。
開発し、そしてその医療上の使用を可能にするという目
的に基づくものである。
この目的は、架橋可能な構造物中における新しい三次
元細胞外マトリックス（ECM）、人工的な三次元組織を
誘導するための細胞相互作用系、および免疫抑制因子ま
たは細胞分化因子を放出する遺伝子操作された細胞から
なる、新規な人工的相互作用組織を提供することにより
解決された。
元細胞外マトリックス（ECM）、人工的な三次元組織を
誘導するための細胞相互作用系、および免疫抑制因子ま
たは細胞分化因子を放出する遺伝子操作された細胞から
なる、新規な人工的相互作用組織を提供することにより
解決された。
本発明によれば、人工的な三次元組織を誘導するため
の細胞相互作用系は、細胞外マトリックスを保有するか
または生成する培養物を、膜を介して相互に結合させる
か、または互いに直接接触させるか、または相互に混合
するやり方で、用いられる。従って、例えば軟骨組織ま
たは骨組織を得るための人工的な細胞組織の誘導は、骨
膜細胞もしくは軟骨膜細胞のトランスフェクションされ
た細胞培養物または三次元培養物によって行なわれる。
移植片の安定化を達成するという目的は、細胞の遺伝子
操作により、特に特定の遺伝子、例えば、骨形態形成タ
ンパク質、インターロイキン−１レセプターアンタゴニ
ストまたはTGF−βを有するヒト細胞を供給し、次に新
たな軟骨組織となるまでそれらを培養することにより、
解決された。
の細胞相互作用系は、細胞外マトリックスを保有するか
または生成する培養物を、膜を介して相互に結合させる
か、または互いに直接接触させるか、または相互に混合
するやり方で、用いられる。従って、例えば軟骨組織ま
たは骨組織を得るための人工的な細胞組織の誘導は、骨
膜細胞もしくは軟骨膜細胞のトランスフェクションされ
た細胞培養物または三次元培養物によって行なわれる。
移植片の安定化を達成するという目的は、細胞の遺伝子
操作により、特に特定の遺伝子、例えば、骨形態形成タ
ンパク質、インターロイキン−１レセプターアンタゴニ
ストまたはTGF−βを有するヒト細胞を供給し、次に新
たな軟骨組織となるまでそれらを培養することにより、
解決された。
本発明は、新規で改善された性質を有する産物を生成
するように共同作用する新規な要素と公知の要素との組
み合わせからなる。本発明による細胞相互作用系（図
１）は、栄養溶液／冷却容器１、液滴形成室２、混合室
３、灌流室４（加熱プレート装備）、測量ユニット５
（光学制御）、試料採取ユニット６、媒体流出室７およ
びインターフェース/PC8からなる。本発明によれば、三
次元支持構造物、例えば、吸収性ポリマーフリースを用
いて、三次元細胞組織が製造される。軟骨組織の製造に
は、例えば、分化しない（成長した）軟骨細胞または未
分化の間葉前駆細胞が使用される。一般的には、患者由
来の分化した軟骨細胞は、わずかな量でしか入手できな
い（手術が必要）。
するように共同作用する新規な要素と公知の要素との組
み合わせからなる。本発明による細胞相互作用系（図
１）は、栄養溶液／冷却容器１、液滴形成室２、混合室
３、灌流室４（加熱プレート装備）、測量ユニット５
（光学制御）、試料採取ユニット６、媒体流出室７およ
びインターフェース/PC8からなる。本発明によれば、三
次元支持構造物、例えば、吸収性ポリマーフリースを用
いて、三次元細胞組織が製造される。軟骨組織の製造に
は、例えば、分化しない（成長した）軟骨細胞または未
分化の間葉前駆細胞が使用される。一般的には、患者由
来の分化した軟骨細胞は、わずかな量でしか入手できな
い（手術が必要）。
分化性ミクロ培地を作り出すためには、ａ）未分化細
胞懸濁液を、規定された（分化した）表現型の内因性細
胞または細胞集合体と混合する、ｂ）規定された（例え
ば分化した）または遺伝子操作された外因性細胞をゲル
またはフリース中に懸濁させ、分化させるべき組織の回
りにまたは分化させるべき組織に直接付着させる。
胞懸濁液を、規定された（分化した）表現型の内因性細
胞または細胞集合体と混合する、ｂ）規定された（例え
ば分化した）または遺伝子操作された外因性細胞をゲル
またはフリース中に懸濁させ、分化させるべき組織の回
りにまたは分化させるべき組織に直接付着させる。
この方法の設計では、２つの人工的な三次元細胞組織
の間に規定された接触ゾーンがつくられる。この接触ゾ
ーンは疾病の試験系として機能する。境界域では、例え
ば薬剤の投与時の、細胞およびマトリックスの変化を検
査することができる。
の間に規定された接触ゾーンがつくられる。この接触ゾ
ーンは疾病の試験系として機能する。境界域では、例え
ば薬剤の投与時の、細胞およびマトリックスの変化を検
査することができる。
本発明による相互作用細胞培養系は、in vitro臓器お
よび組織モデルとしての使用に好適である。
よび組織モデルとしての使用に好適である。
驚くべきことに、例えば、軟骨組織または骨組織を得
るために、細胞外マトリックスを生成するかまたはそれ
を保有する骨膜細胞または軟骨膜細胞のトランスフェク
ションした細胞培養物または三次元培養物により人工的
な細胞組織を誘導することは、特に細胞外マトリックス
が重要な役割を果たしている場合の、疾病モデルの構築
を可能にすることが判明した。これらの新規な相互作用
性人工組織は、病原および感染過程のin vitroシミュレ
ーション、疾病モデルの樹立、および活性物質の試験に
適する生きている移植片の調製に使用される。
るために、細胞外マトリックスを生成するかまたはそれ
を保有する骨膜細胞または軟骨膜細胞のトランスフェク
ションした細胞培養物または三次元培養物により人工的
な細胞組織を誘導することは、特に細胞外マトリックス
が重要な役割を果たしている場合の、疾病モデルの構築
を可能にすることが判明した。これらの新規な相互作用
性人工組織は、病原および感染過程のin vitroシミュレ
ーション、疾病モデルの樹立、および活性物質の試験に
適する生きている移植片の調製に使用される。
図２は、細胞および組織配置を示す：
連続培養：組織からの因子（左）が右の組織に作用す
る。右の組織からのこの因子は左の組織には作用しな
い。
る。右の組織からのこの因子は左の組織には作用しな
い。
サンドイッチ培養:2つまたはそれ以上の人工組織が重
なっているかまたは近接している（接触ゾーン）。
なっているかまたは近接している（接触ゾーン）。
組み込み培養：これは組織分化を目的とした異なる細
胞の混合物である。
胞の混合物である。
灌流細胞：混合物中の懸濁された細胞（例えば、リン
パ球または微生物）が人工組織（例えば内皮）に沿って
流れ、それら細胞が適切なレセプターを発現する場合は
そこに付着する。
パ球または微生物）が人工組織（例えば内皮）に沿って
流れ、それら細胞が適切なレセプターを発現する場合は
そこに付着する。
図3:
上図：細胞を混合する目的は、少数の分化したまたは
分化している細胞を用いて、できるだけ多くの未分化細
胞を分化させることにある。未分化間葉細胞の80％およ
び分化した軟骨細胞の20％が１つの組織中に一緒に存在
する（組織１）。外因性のまたは遺伝子操作された細胞
は、それらが分化因子を産生する場合は、組織１の回り
に配置される。
分化している細胞を用いて、できるだけ多くの未分化細
胞を分化させることにある。未分化間葉細胞の80％およ
び分化した軟骨細胞の20％が１つの組織中に一緒に存在
する（組織１）。外因性のまたは遺伝子操作された細胞
は、それらが分化因子を産生する場合は、組織１の回り
に配置される。
下図（接触ゾーン）：リウマチ様関節炎においては、
滑膜細胞が患者の関節中の関節軟骨を、その表面および
細胞外マトリックスを破壊することによって破壊し、結
局滑膜細胞が軟骨中に浸潤する。
滑膜細胞が患者の関節中の関節軟骨を、その表面および
細胞外マトリックスを破壊することによって破壊し、結
局滑膜細胞が軟骨中に浸潤する。
本発明により安定化された移植可能な軟骨組織は、三
次元構造物中の新しい細胞外マトリックス（ECM）、成
長した軟骨細胞、架橋可能／重合可能なポリペプチドま
たはポリサッカライド、および遺伝子操作によりマトリ
ックス分子、免疫抑制因子または細胞分化因子を放出す
る細胞、から構成される。それらの構造物は、三次元繊
維構造物、三次元組織、フィブリン、および人工軟骨系
を取りまく半透膜から構成される。
次元構造物中の新しい細胞外マトリックス（ECM）、成
長した軟骨細胞、架橋可能／重合可能なポリペプチドま
たはポリサッカライド、および遺伝子操作によりマトリ
ックス分子、免疫抑制因子または細胞分化因子を放出す
る細胞、から構成される。それらの構造物は、三次元繊
維構造物、三次元組織、フィブリン、および人工軟骨系
を取りまく半透膜から構成される。
望ましい形態は、例えば、シリコーンを含まない、羊
毛繊維、またはα−ヒドロキシ酸のような吸収性ポリマ
ー製の繊維の構造物から構成され、そして半透膜はポリ
リジンやヒアルロン酸のようなポリ電解質複合体から構
成される。
毛繊維、またはα−ヒドロキシ酸のような吸収性ポリマ
ー製の繊維の構造物から構成され、そして半透膜はポリ
リジンやヒアルロン酸のようなポリ電解質複合体から構
成される。
移植可能な軟骨組織の製法は、重合性溶液を含有する
軟骨細胞懸濁液および遺伝子治療的に改変した細胞を三
次元構造物中に充填する工程と、トロンビンまたは重合
誘発因子を用いてそれらを凝固させる工程と、この三次
元構造物中の細胞が新しい細胞外マトリックス（ECM）
をつくる工程と、そして軟骨系を半透膜で包囲する工程
とを備える。
軟骨細胞懸濁液および遺伝子治療的に改変した細胞を三
次元構造物中に充填する工程と、トロンビンまたは重合
誘発因子を用いてそれらを凝固させる工程と、この三次
元構造物中の細胞が新しい細胞外マトリックス（ECM）
をつくる工程と、そして軟骨系を半透膜で包囲する工程
とを備える。
重合性溶液は架橋可能／重合可能なポリペプチドまた
はポリサッカライドからなり、改変細胞は遺伝子操作に
よりマトリックス分子、免疫抑制因子または細胞分化因
子を放出するものからなる。
はポリサッカライドからなり、改変細胞は遺伝子操作に
よりマトリックス分子、免疫抑制因子または細胞分化因
子を放出するものからなる。
ポリペプチドとしては、フィブリノーゲンが用いら
れ、この場合には、フィブリノーゲン含有細胞懸濁液を
三次元繊維構造物から作られた構造物または三次元組織
中に充填し、トロンビンを用いてそれらを凝固させる。
れ、この場合には、フィブリノーゲン含有細胞懸濁液を
三次元繊維構造物から作られた構造物または三次元組織
中に充填し、トロンビンを用いてそれらを凝固させる。
フィブリノーゲンは、その細胞が由来する患者からお
よび／またはその三次元軟骨組織を移植すべき患者から
回収する。
よび／またはその三次元軟骨組織を移植すべき患者から
回収する。
本発明によれば、細胞の全部または一部を以下の遺伝
子の１種以上を用いて遺伝子治療的に改変する。このよ
うな遺伝子としては、TGF−β、骨形態形成タンパク
質、モルフォゲン、モルフォゲンのレセプター、抗炎症
性サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、例えば
IL−１アンタゴニスト、IL−１レセプターアンタゴニス
ト、TNFアンタゴニスト、またはプロテアーゼインヒビ
ター（TIMP,PAI）がある。
子の１種以上を用いて遺伝子治療的に改変する。このよ
うな遺伝子としては、TGF−β、骨形態形成タンパク
質、モルフォゲン、モルフォゲンのレセプター、抗炎症
性サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、例えば
IL−１アンタゴニスト、IL−１レセプターアンタゴニス
ト、TNFアンタゴニスト、またはプロテアーゼインヒビ
ター（TIMP,PAI）がある。
その場合、ただ１つの遺伝子操作を行なった個々の細
胞または異なる遺伝子操作を行なった多種の細胞を、未
改変の細胞と組み合わせることができる。組み込まれた
遺伝子は、一過性にまたは永久に発現される。驚くべき
ことに、造形および遺伝子操作を利用して、遺伝子操作
された細胞と未改変の細胞の不均等な分布に基づく分極
を達成することができる。
胞または異なる遺伝子操作を行なった多種の細胞を、未
改変の細胞と組み合わせることができる。組み込まれた
遺伝子は、一過性にまたは永久に発現される。驚くべき
ことに、造形および遺伝子操作を利用して、遺伝子操作
された細胞と未改変の細胞の不均等な分布に基づく分極
を達成することができる。
本発明のもう一つの特徴は、遺伝子操作された細胞お
よび未改変の細胞を別々の人工組織中に組み入れ、造形
し、それらを組み合わせて一つの組織を完成させるこ
と、または造形された組織を遺伝子操作された細胞およ
び未改変の細胞と層状にもしくは包み込むことによって
組み合わせるか、または異なる遺伝子操作をされた２種
またはそれ以上の組織を層状にもしくは包み込むことに
より組み合わせることにある。
よび未改変の細胞を別々の人工組織中に組み入れ、造形
し、それらを組み合わせて一つの組織を完成させるこ
と、または造形された組織を遺伝子操作された細胞およ
び未改変の細胞と層状にもしくは包み込むことによって
組み合わせるか、または異なる遺伝子操作をされた２種
またはそれ以上の組織を層状にもしくは包み込むことに
より組み合わせることにある。
遺伝子操作された細胞を含有する組織は、遺伝子的に
未改変の細胞を含有する組織と組み合わせることができ
る。
未改変の細胞を含有する組織と組み合わせることができ
る。
本発明により製造された軟骨組織は、特に、免疫抑制
特性を有する。
特性を有する。
驚くべきことに、本発明による方法はin vitroで製造
された軟骨のin vivo保護およびin vivo維持に適するこ
と、および本発明による軟骨組織がリウマチ様関節炎患
者の治療に使用できることが見出された。さらに、本発
明により使用された半透膜（製造された軟骨組織は、移
植の前、移植中および移植後しばらくして、この膜によ
って包囲される）は免疫学的反応性および非分化反応性
に対する保護を提供することも驚くべきことである。
された軟骨のin vivo保護およびin vivo維持に適するこ
と、および本発明による軟骨組織がリウマチ様関節炎患
者の治療に使用できることが見出された。さらに、本発
明により使用された半透膜（製造された軟骨組織は、移
植の前、移植中および移植後しばらくして、この膜によ
って包囲される）は免疫学的反応性および非分化反応性
に対する保護を提供することも驚くべきことである。
本発明を以下の実施形態により詳細に説明する。
実施形態
実施例1:三次元細胞組織
三次元細胞組織を、三次元支持構造物（吸収性ポリマ
ーフリース）を用いて製造する。軟骨組織を製造するに
は、（ａ）分化しない（成長した）軟骨細胞または
（ｂ）未分化の間葉前駆細胞を使用する。最初に、フリ
ース構造物中に分布させるべき細胞をフィブリノーゲン
溶液中に懸濁する。この細胞懸濁液をフリース支持体中
に充填し、トロンビンの添加により凝固させる。
ーフリース）を用いて製造する。軟骨組織を製造するに
は、（ａ）分化しない（成長した）軟骨細胞または
（ｂ）未分化の間葉前駆細胞を使用する。最初に、フリ
ース構造物中に分布させるべき細胞をフィブリノーゲン
溶液中に懸濁する。この細胞懸濁液をフリース支持体中
に充填し、トロンビンの添加により凝固させる。
実施例2:分化性ミクロ培地
分化性ミクロ培地を調製するために、（Ａ）未分化細
胞懸濁液を、分化した表現型の内因性の細胞または細胞
集合体と5:1で混合する、（Ｂ）外因性であるが、分化
した細胞をゲルまたはポリマーフリース中に懸濁させ、
そして分化させるべき組織の回りにまたは分化させるべ
き組織に直接付着させる。
胞懸濁液を、分化した表現型の内因性の細胞または細胞
集合体と5:1で混合する、（Ｂ）外因性であるが、分化
した細胞をゲルまたはポリマーフリース中に懸濁させ、
そして分化させるべき組織の回りにまたは分化させるべ
き組織に直接付着させる。
分化性ミクロ培地は、
1.分化した軟骨細胞、
2.BMP（骨形態形成タンパク質）でトランスフェクショ
ンされた細胞、 3.パラクリン様式で軟骨分化因子を産生または放出する
すべての細胞（骨膜および軟骨膜細胞）、組織（骨膜、
滑膜）または組織構成分（マトリックス）、を用いて調
製することができる。
ンされた細胞、 3.パラクリン様式で軟骨分化因子を産生または放出する
すべての細胞（骨膜および軟骨膜細胞）、組織（骨膜、
滑膜）または組織構成分（マトリックス）、を用いて調
製することができる。
目下のところ知られている因子は、例えば、骨形態形
成タンパク質、軟骨由来形態形成タンパク質、トランス
フォーミング増殖因子βである（Luyten,F.P.ら、Acta
Orthop.Belg.,58 Suppl.1（1992）263−267;Exp.Cell R
es.1994,210:224−9;Chang,S.C.ら、J.Biol.Chem.1994,
269:28227−28234）。
成タンパク質、軟骨由来形態形成タンパク質、トランス
フォーミング増殖因子βである（Luyten,F.P.ら、Acta
Orthop.Belg.,58 Suppl.1（1992）263−267;Exp.Cell R
es.1994,210:224−9;Chang,S.C.ら、J.Biol.Chem.1994,
269:28227−28234）。
これら方法の配置により、２つの人工的な三次元細胞
組織の間に規定された接触ゾーンが作り出される。
組織の間に規定された接触ゾーンが作り出される。
実施例3:リウマチ様関節炎モデル
リウマチ様関節炎患者の滑液から得られた攻撃的な細
胞（3D組織１）は軟骨細胞組織（3D組織２）にin vitro
で侵襲する。
胞（3D組織１）は軟骨細胞組織（3D組織２）にin vitro
で侵襲する。
実施例4:軟骨組織
成長した軟骨細胞または成熟度および分化度がさまざ
まな間葉前駆細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁し、
この細胞懸濁液を吸収性ポリマーフリース中に分布さ
せ、成長および分化過程を促進する適当な細胞外マトリ
ックスの成分または因子を加え、トロンビン添加により
凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝す。
まな間葉前駆細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁し、
この細胞懸濁液を吸収性ポリマーフリース中に分布さ
せ、成長および分化過程を促進する適当な細胞外マトリ
ックスの成分または因子を加え、トロンビン添加により
凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝す。
実施例5:骨組織
成熟度および分化度がさまざまな骨形成原起源の細胞
または間葉前駆細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁さ
せ、この細胞懸濁液を吸収性ポリマー構造物中に分布さ
せ、成長および分化過程を促進する適切な細胞外マトリ
ックスの成分または因子を加え、トロンビン添加により
凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝す。
または間葉前駆細胞をフィブリノーゲン溶液中に懸濁さ
せ、この細胞懸濁液を吸収性ポリマー構造物中に分布さ
せ、成長および分化過程を促進する適切な細胞外マトリ
ックスの成分または因子を加え、トロンビン添加により
凝固させ、そして分化性ミクロ培地に曝す。
実施例6:「リウマチ様関節炎/in vitroパンヌス組織」
モデル リウマチ様関節炎患者の滑膜細胞（3D組織１）を、実
施例３におけるように軟骨細胞組織（3D組織２）とin v
itroで相互作用させる。
モデル リウマチ様関節炎患者の滑膜細胞（3D組織１）を、実
施例３におけるように軟骨細胞組織（3D組織２）とin v
itroで相互作用させる。
実施例7:リウマチ様関節炎患者の軟骨損傷を治療するた
めに人工的に製造された軟骨組織の移植 患者の組織試料由来の間葉細胞をin vitroで充分に単
層培養で成長させ、その一部をBMP（骨形態形成タンパ
ク質）遺伝子によりトランスフェクションする。この細
胞をフィブリノーゲン含有溶液中に懸濁させ、次に支持
構造物（例えば、ポリラクチドおよびポリグリコリド製
の吸収性ポリマーフリース）中に配置する。その後この
懸濁液を、トロンビンの添加により構造物中で凝固させ
る。この組織は直ちにまたはin vitro成熟後に患者の関
節に移植することができる。
めに人工的に製造された軟骨組織の移植 患者の組織試料由来の間葉細胞をin vitroで充分に単
層培養で成長させ、その一部をBMP（骨形態形成タンパ
ク質）遺伝子によりトランスフェクションする。この細
胞をフィブリノーゲン含有溶液中に懸濁させ、次に支持
構造物（例えば、ポリラクチドおよびポリグリコリド製
の吸収性ポリマーフリース）中に配置する。その後この
懸濁液を、トロンビンの添加により構造物中で凝固させ
る。この組織は直ちにまたはin vitro成熟後に患者の関
節に移植することができる。
実施例8:他の人工組織−骨、肝臓、腎臓、脈管、皮膚
実施例１と同様に、細胞の一部を所望の遺伝子で操作
し、この遺伝子治療的に改変した集団を、支持構造物お
よびフィブリンを使用して、所定の造形に形成する。同
様に、造形構造物を使用して、遺伝子的に改変していな
い細胞をこの構造物に付着させ、それにより、遺伝的に
組み込まれた活性物質の拡散勾配および活性勾配が、未
処理の細胞に作用するようにする。これはin vitroで製
造された組織構造物を分極させるように働き、天然の関
節軟骨における分極に匹敵する。
し、この遺伝子治療的に改変した集団を、支持構造物お
よびフィブリンを使用して、所定の造形に形成する。同
様に、造形構造物を使用して、遺伝子的に改変していな
い細胞をこの構造物に付着させ、それにより、遺伝的に
組み込まれた活性物質の拡散勾配および活性勾配が、未
処理の細胞に作用するようにする。これはin vitroで製
造された組織構造物を分極させるように働き、天然の関
節軟骨における分極に匹敵する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02
15/09 37/24
(72)発明者 バーメスター，ゲルト アール.
ドイツ連邦共和国 ディー−12277 ベ
ルリン，トゥラーヴェーク ７
(72)発明者 ホープル，トーマス
ドイツ連邦共和国 ディー−15537 エ
ルクナー，アム シュッツェンヴェルト
ヒェン 59
(56)参考文献 特開 平２−209811（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開358506（ＥＰ，Ａ
１)
国際公開94／020151（ＷＯ，Ａ１)
黒木登志夫ら 編，分子生物学研究の
ための培養細胞実験法，株式会社 羊土
社，1995年 ３月20日，第24〜30頁
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61L 27/00
A61K 35/12
A61K 38/00
A61K 38/22
C12N 5/06
C12N 5/10
C12N 15/09
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】細胞相互作用系を用いて新たな人工の骨ま
たは軟骨組織を製造する方法であって、以下の工程： 分化しない成長した軟骨細胞、骨形成原起源の細胞およ
び未分化の間葉前駆細胞からなる群から選択された細胞
を、重合するように誘発し得る溶液中に懸濁させて懸濁
液を形成し、該細胞の分化および組織形成の過程を促進
する因子または成分に加え、次に重合誘発因子を加えて
凝固させることにより、第１の細胞培養系を調製するこ
と； 第１の細胞培養系の細胞の分化を誘導するための手段で
あって、分化した細胞および遺伝子操作された外因性細
胞からなる群より選択された手段を、重合するように誘
発し得る溶液中に懸濁させて懸濁液を形成し、次に重合
誘発因子を加えて凝固させることにより、少なくとも１
つの第２の細胞培養系を調製すること； 重合誘発因子を加える前に、第１の細胞培養系の懸濁液
および第２の細胞培養系の懸濁液のいずれか一方または
両方をゲルまたはポリマーフリース中に分布させるこ
と；および 第１の細胞培養系を第２の細胞培養系と接触させて、新
たな人工組織を製造すること； を含んでなる上記方法。 - 【請求項２】ポリマーフリース中に分布させる前に、第
１および第２の細胞培養系を均質に混合することによっ
て前記接触工程を行なう、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】凝固工程の前に、第１および第２の細胞培
養系のいずれか一方または両方を型の中に入れる、請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】第１および第２の細胞培養系のいずれか一
方または両方を、個々にまたは一緒に、半透膜で包囲す
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】第１の細胞培養系中の細胞、第２の細胞培
養系中の遺伝子操作細胞、および重合誘発因子として用
いられるフィブリノーゲンからなる群より選択される１
以上が自己由来のものである、請求項１〜４のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項６】第１および第２の細胞培養系のいずれか一
方または両方において、重合するように誘発し得る前記
溶液が架橋可能／重合可能なポリペプチドまたはポリサ
ッカライドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項７】第１および第２の細胞培養系の少なくとも
一方を凝固させた後に接触工程を行ない、その結果、そ
れらの間に形成された境界に沿って接触が生じる、請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】第１の細胞培養系および少なくとも１つの
第２の細胞培養系を層状に接触させるか、または一方の
培養物のまわりを他方の培養物で包囲することにより接
触させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】前もって増殖させた未分化の細胞を、規定
された表現型の内因性の細胞もしくは細胞集合体と接触
させることを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１０】第２の細胞培養系が、 （ａ） 分化した軟骨細胞、 （ｂ） TGF−β、骨形態形成タンパク質、モルフォゲ
ン、モルフォゲンのレセプター、抗炎症性サイトカイ
ン、サイトカインアンタゴニスト、IL−１アンタゴニス
ト、IL−１レセプターアンタゴニスト、TNFアンタゴニ
スト、プロテアーゼインヒビターおよびマトリックス分
子を産生する細胞、および／または、 （ｃ） パラクリン様式で軟骨分化因子を産生または放
出する細胞、組織または組織構成成分、 からなる群より選択される少なくとも１つを用いて形成
される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】第１の細胞培養系を第２の細胞培養系と
接触させることを含み、その際、該方法が栄養溶液／冷
却容器、液滴形成室、混合室、加熱プレートを備えた灌
流室、測量ユニット、試料採取ユニット、媒体流出室、
およびインターフェース／コンピュータを含むユニット
で行なわれる、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１２】病原および感染過程のin vitroシミュレ
ーション用、疾病モデルの樹立用、および活性物質の試
験用の生きている移植片の調製における、請求項１〜11
のいずれか１項に記載の方法に従う細胞相互作用系を用
いた新たな人工の骨または軟骨組織の使用。 - 【請求項１３】「リウマチ様関節炎/in vitroパンヌス
組織」モデルを樹立するため、第１の細胞培養系として
のリウマチ様関節炎患者由来の滑膜細胞を、第２の細胞
培養系としての軟骨細胞組織とin vitroで相互作用させ
ることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19540487A DE19540487A1 (de) | 1995-10-20 | 1995-10-20 | Zellinteraktionssystem zur Induktion künstlicher Gewebe |
| DE19540487.4 | 1996-08-02 | ||
| DE19632404.1 | 1996-08-02 | ||
| DE19632404A DE19632404A1 (de) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | Transplantierbare Knorpelgewebe mit immunsuppressiven Eigenschaften, Verahren zu ihrer Herstellung und Verwendung |
| PCT/DE1996/002025 WO1997015655A2 (de) | 1995-10-20 | 1996-10-18 | Neue künstliche gewebe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10511884A JPH10511884A (ja) | 1998-11-17 |
| JP3452366B2 true JP3452366B2 (ja) | 2003-09-29 |
Family
ID=26019940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51620297A Expired - Fee Related JP3452366B2 (ja) | 1995-10-20 | 1996-10-18 | 新規人工組織、その製法およびその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5932459A (ja) |
| EP (1) | EP0801676A2 (ja) |
| JP (1) | JP3452366B2 (ja) |
| WO (1) | WO1997015655A2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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