DE69926639T2

DE69926639T2 - Knochenmarkszellen als quelle von neuronen zur wiederherstellung von gehirn und knochenmark

Info

Publication number: DE69926639T2
Application number: DE69926639T
Authority: DE
Inventors: Juan Sanchez-Ramos; Shijie Song; R. Paul SANBERG; William Jansen; Thomas Freeman
Original assignee: University of South Florida
Current assignee: University of South Florida
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2019-05-08
Also published as: EP1096941A1; EP1096941B1; US6528245B2; AU3888699A; ES2246085T3; EP1096941A4; WO1999056759A1; US20060194316A1; US20020146821A1; JP2002513545A; DE69926639D1

Description

Anwendungsgebiet
Diese Anmeldung betrifft Verfahren für die Züchtung von Knochenmarkszellen, so daß sie den neuronalen Phänotyp exprimieren, für die Verwendung bei der Transplantation.
Hintergrundinformation
Neurobiologen gehen seit langem davon aus, daß Neuronen im erwachsenen Gehirn wie ein wertvolles Nestei sind: ein Vermächtnis, das mit der Zeit und bei Krankheiten schrumpft und bei dem der Wiederaufbau schwierig, wenn nicht unmöglich ist. Die Parkinson- und Alzheimer-Krankheit sind Beispiele von neurodegenerativen Krankheiten, auf deren Heilung die Wissenschaftler durch Überwindung der Schwierigkeit des Wiederaufbaus von Neuronen im erwachsenen menschlichen Gehirn warten. Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine Erkrankung in der mittleren oder späten Lebensphase mit sehr sanftem Fortschreiten und hinausgezögertem Verlauf. HARRISONS'PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, Bd. 2, 23te Ausg., Hrsg. Isselbacher, Braunwald, Wilson, Martin, Fauci und Kasper, McGraw-Hill Inc., New York City, 1994, S. 2275. Die am regelmäßigsten beobachteten Veränderungen waren bei den Aggregaten von Melanin enthaltenden Nervenzellen im Hirnstamm (Substantia nigra, Locus coeruleus), wo es variierende Ausmaße von Nervenzellverlust mit reaktiver Gliosis (am ausgeprägtesten in der Substantia nigra) gibt, zusammen mit kennzeichnenden eosinophilen intracytoplasmatischen Einschlüssen. (Id. bei 2276).
In ihrer voll entwickelten Form ist PD leicht zu erkennen. Die gebeugte Haltung, die Steife und Langsamkeit der Bewegung, die Unbeweglichkeit des Gesichtsausdrucks, das rhythmische Zittern der Glieder, welches aktiv gewollte Bewegung oder vollständige Entspannung begleitet, sind jedem Kliniker bekannt. Im Allgemeinen begleitet der trippelnde Gang die anderen Charakteristika der voll entwickelten Krankheit, wodurch der Patient, der durch die Abnormalität des Haltungstonus an der Ausführung der erforderlichen Reflexanpassungen gehindert wird, die für ein effektives Gehen erforderlich sind, mit schnellen, schlürfenden Schritten mit erhöhter Geschwindigkeit voranschreitet, als ob er mit dem Schwerkraftzentrum des Körpers mithalten wolle (Id. bei 2276).
Obwohl die moderne Behandlung von PD erfolgreicher ist als jede andere, die vor der Einführung von Levodopa verfügbar war, einschließlich der stereotaktischen Chirurgie, gibt es noch immer viele Probleme (Id. bei 2277). Der unbezweifelte Grund für diese Schwierigkeit liegt viel in der Tatsache, daß keine der therapeutischen Maßnahmen eine Wirkung auf den zugrunde liegenden Krankheitsverlauf hat, der aus neuronaler Degeneration besteht. Letztendlich scheint ein Punkt erreicht zu werden, an dem die Pharmakologie nicht mehr den Verlust an Dopamin der Basalganglien ausgleicht. (Id.)
Die Alzheimer-Krankheit (AD) hat ihren Grund in einem degenerativen Verlauf, der durch den fortschreitenden Verlust von Zellen aus dem basalen Vorhirn, dem cerebralen Cortex und anderen Bereichen des Gehirns charakterisiert ist. Insbesondere betroffen sind Acetylcholin übertragende Neuronen und ihre Zielnerven. Alzheimer-Plaques und neurofibrilläre Verflechtungen sind anwesend. Die Pick's-Krankheit hat ein ähnliches klinisches Erscheinungsbild wie die Alzheimer-Krankheit, aber einen etwas langsameren klinischen Verlauf und begrenzte Atrophie und betrifft vor allem die frontalen und temporalen Lappen. Ein Tiermodell für die Alzheimer-Krankheit und andere Demenzen zeigt eine vererbliche Tendenz in Richtung der Bildung solcher Plaques. Man denkt, daß wenn ein Wirkstoff eine Wirkung in dem Modell hat, es auch bei mindestens einigen Formen der Alzheimer-Krankheit und der Pick's-Krankheit von Nutzen sein könnte. Gegenwärtig gibt es palliative Behandlungen, aber keine Mittel zur Wiederherstellung der Funktion.
Eine Gruppe von degenerativen Erkrankungen ist durch fortschreitende Ataxie wegen der Degeneration des Cerebellum, des Hirnstamms, des Rückenmarks, der peripheren Nerven und gelegentlich der Basalganglien charakterisiert. Viele dieser Syndrome sind erblich; andere treten sporadisch auf. Die spinocerebellaren Degenerationen werden logischerweise in drei Gruppen aufgeteilt: vorherrschend spinale Ataxien, cerebellare Ataxien und Degenerationen in mehreren Systemen. Bis heute gibt es keine Behandlungen. Die Friedrich's Ataxie ist die prototypische spinale Ataxie, deren Vererbung autosomal rezessiv ist. Das verantwortliche Gen wurde auf Chromosom 9 gefunden. Die Symptome beginnen zwischen einem Alter von 5 bis 15 mit unstetem Gang, gefolgt von Ataxien der oberen Extremitäten und Dysarthrie. Den Patienten fehlen die Reflexe und sie verlieren die sensorischen Anwendungen der großen Faser (Schwingungs- und Lagesinn). Zwei andere Erkrankungen haben ähnliche Symptome: Bassen-Kornzweig-Syndrom (A beta-lipoproteinämie und Vitamin E-Mangel) und Refsom's Krankheit (Phytansäure-Speicherkrankheit). Cerebellare corticale Degenerationen treten im Allgemeinen im Alter zwischen 30 und 50 auf. Es können nur klinische Zeichen von cerebellarer Dysfunktion nachgewiesen werden, wobei die pathologischen Veränderungen auf das Cerebellum und gelegentlich auf die tiefer gelegenen Oliven beschränkt sind. Es wurde über vererbte und sporadische Fälle berichtet. Eine ähnliche Degeneration kann auch mit chronischem Alkoholismus einhergehen.
Bei Degenerationen in mehreren Systemen tritt die Ataxie in der Jugend bis zum mittleren Erwachsenenleben in variierenden Kombinationen mit spastischen Zuständen und extrapyramidaler, sensorischer Dysfunktion der unteren Motorneuronen und autonomer Dysfunktion auf. Bei einigen Familien können auch eine optische Atrophie, Retinitis pigmentosa, Opthalmoplegia und Demenz auftreten.
Eine andere Form der cerebellaren Degeneration ist die paraneoplastische cerebellare Degeneration, die bei gewissen Krebsformen auftritt, wie dem Haferzell-Lungenkrebs, dem Brustkrebs und Eierstockkrebs. In einigen Fällen kann die Ataxie der Entdeckung des Krebses um Wochen bis Jahre vorausgehen. Es werden ständig Purkinje-Zellen verloren, was in Ataxie resultiert. Selbst wenn der Patient dauerhaft von Krebs geheilt ist, kann ihre Funktionsfähigkeit durch den Verlust der Purkinje-Zellen weitgehend behindert sein. Es gibt keine spezifische Behandlung.
Auch Schlaganfälle können in einer neuronalen Degeneration und einem Verlust von funktionellen Synapsen resultieren. Gegenwärtig gibt es keine Wiederherstellung und es werden nur palliative und Rehabilitationsmaßnahmen unternommnen.
Die Neurotransplantation wurde verwendet, um die Entwicklung des zentralen Nervensystems zu erforschen, und zur Reparatur von krankem Gewebe bei Zuständen wie der Parkinson-Krankheit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Der experimentelle Ersatz von Neuronen durch direkte Transplantation von fötalem Gewebe in das Gehirn wurde bei einer kleinen Anzahl von Patienten in mehreren Forschungsuniversitäten (einschließlich der University of South Florida) vorgenommen; aber bisher war die experimentelle Transplantation von menschlichen fötalen Neuronen wegen des Mangels an geeigneten Gewebequellen, logistischen Problemen, legalen und ethischen Bedenken und dem schlechten Überleben der transplantierten Neuronen in dem menschlichen Empfängergehirn beschränkt.
Ein Verfahren ersetzt Neuronen unter Verwendung von Markstromazellen als Stammzellen für nicht-hämatopoietische Gewebe. Markstromazellen können von anderen Zellen im Mark durch ihre Tendenz zur Adhärenz an Gewebekulturplastik isoliert werden. Die Zellen haben viele der Charakteristika von Stammzellen für Gewebe, die grob als mesenchymal definiert werden können, weil sie in Kultur in Osteoblasten, Chondrocyten, Adipocyten und sogar Myoblasten differenziert werden können. Deshalb stellen Markstromazellen ein überzeugendes Modell für die Untersuchung der Differenzierung von Stammzellen dar. Sie haben auch mehrere Charakteristika, die sie potentiell von Nutzen bei der Zell- und Gentherapie machen. Prockop, D. J. Science: 26: 71–74 (1997). Diese Population an Knochenmarkszellen (BMSC) wurde auch verwendet, um dendritische Zellen herzustellen (K. Inaba, et al., J. Experimental Med. 176: 1693–1702 (1992)), die, wie der Name nahelegt, eine Morphologie haben, die mit der von Neuronen verwechselt werden könnte. Dendritische Zellen umfassen ein System von Antigen präsentierenden Zellen, die bei der Initiation der T-Zell-Antworten eine Rolle spielen. Von dem spezifischen Wachstumfaktor, der die Produktion von dendritischen Zellen stimuliert, wurde als Granulocyten/Macrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) berichtet. K. Inaba, et al., J. Experimental Med. 176: 1693–1702 (1992).
Die Anwesenheit von Stammzellen für nicht-hämatopoietische Zellen im Knochenmark wurde zuerst durch Beobachtungen des deutschen Pathologen Cohnheim vor 130 Jahren nahe gelegt. J. Cohnheim, Arch. Path. Anat. Physiol. Klin. Med. 40: 1 (1867). Cohnheim untersuchte die Wundreparatur durch Injektion eines unlöslichen Anilinfarbstoffs in die Venen eines Tieres und dann Beobachtung des Auftauchens von Farbstoff enthaltenden Zellen in Wunden, die er an einer distalen Stelle erzeugte. Er schloß, daß die meisten, wenn nicht alle, Zellen, die in den Wunden erschienen, aus dem Blutstrom kamen und implizit aus dem Knochenmark. Die gefärbten Zellen umfaßten nicht nur Entzündungszellen, sondern auch Zellen, die eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie hatten und mit dünnen Fibrillen einhergingen. Daher ergab sich aus Cohnheim's Arbeiten die Möglichkeit, daß das Knochenmark die Quelle von Fibroblasten sein könnte, die als Teil des normalen Prozesses der Wundreparatur Kollagenfasern ablagern. Die Quelle von Fibroblasten bei der Wundreparatur wurde seit Cohnheim's Bericht von 1867 in mehr als 40 Publikationen untersucht. Vgl. zum Beispiel R. Ross, N. B. Everett, R. Tyler, J. Cell. Biol. 44: 645 (1970); J. K. Moen. J. Exp. Med. 61: 247 (1935); N. L. Petrakis, M. Davis, S. P. Lusia, Blood 17: 109 (1961); S. R. S. Rangan, Exp. Cell Res. 46: 477 (1967); J. M. Davidson, in INFLAMMATION: BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL CORRELATES, J. I. Gallin, I. M. Goldstein, R. Snyderman, Hrsg. (Rauen, New York City, Ausg. 2, 1992, S. 809–19; R. Bucala, L. A. Spiegel, J. Chesney, N. Hogan, A. Cerami, Mol. Med. 1: 71 (1994). Die meisten dieser Ergebnisse legen nahe, daß die Fibroblasten lokalen Ursprungs sind, die Frage ist aber noch nicht geklärt und wird noch untersucht. Prockop, D. J. Science: 26: 71–74 (1997).
Obwohl Cohnheim's These noch nicht belegt wurde gab es seit der Pionierarbeit von Friedenstein, beginnend in der Mitte der 70er, definitive Beweise, daß Knochenmark Zellen enthält, die in Fibroblasten ebenso wie andere mesenchymale Zellen differenzieren können. A. J. Friedenstein, U. Gorskaja, N. N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976). Friedenstein plazierte Proben von gesamtem Knochenmark in Plastikkulturgefäßen und goß die Zellen ab, die nicht adhärent waren. Die auffälligste Eigenschaft der adhärenten Zellen war, daß sie die Fähigkeit besaßen, in Kolonien zu differenzieren, die kleinen Ablagerungen von Knochen oder Knorpel ähnelten. Friedenstein's ursprüngliche Beobachtungen wurden während der 80er durch eine Reihe von Forschern erweitert, insbesondere von Piersma und Mitarbeitern (A. H. Piersma, R. E. Ploemacher, K. G. M. Brockbank, Br. J. Haematol. 54: 285 (1983); A. H. Piersma et al. Exp. Hematol. 13: 237 (1985)) und Owen und Mitarbeiter. C. R. Howlett et al. Clin. Orthop. Relat. Res. 213: 251 (1986); H. J. Mardon, J. Bee, K. von der Mark, M. E. Owen, Cell Tissue Res. 250: 157 (1987); J. N. Beresford, J. H. Benett, C. Devlin, P. S. Leboy, M. E. Owen J. Cell Sci. 102: 341 (1992). Diese und andere Untersuchungen (M. E. Owen und A. J. Friedenstein, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, UK, 1988, S. 42–60; S. L. Cheng et al., Endocrinology 134: 277 (1994); A. I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D. J. Richard et al., Dev. Biol. 161: 218 (1994). S. Wakitani, T. Saito und A. J. Caplan (Muscle Nerve 18: 1412 (1995)) zeigten, daß die MSCs nach der Behandlung mit 5-Azacytidin und Amphotericin B (Fungasome, Gibco) in Myoblasten und Myotuben differenzierten. D. Phinney (Prockop, D. J. Science 26: 71–74 (1997)) beobachtete kürzlich, daß die Zellen nach der Behandlung mit Amphotericin B (1 μg/ml) allein in Myoblasten und Myotuben differenzierten; A. J. Friedenstein, R. K. Chailakahyan, U. V. Gerasimov, Cell Tissue Kinet. 20: 263 (1987); A. Keating, W. Horsfall, R. G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B. R. Clark und A. Keating, Ann. N. Y. Acad. Sci 770: 70 (1995) stellten fest, daß die Markstromazellen (MSCs), die mittels des relativ rohen Verfahrens von Friedenstein isoliert worden waren, multipotent waren und leicht in Osteoblasten, Chondroblasten, Adipocyten und sogar Myoblasten differenzierten.
Obwohl die multipotentialen Eigenschaften von MSCs seit mehreren Jahrzehnten bekannt sind, gibt es überraschend große Lücken bei unserer Information über die Zellen selbst. Die Zellen, die durch ihre Adhärenz an Plastik isoliert wurden, wie von Friedenstein beschrieben (A. J. Friedenstein, U. Gorskaja, N. N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976)), sind anfänglich heterogen und schwierig zu clonieren. Der Anteil der hämatopoietischen Zellen ist bei anfänglichen Kulturen von Mäusemark relativ hoch, ist aber bei menschlichem Mark weniger als 30% (M. E. Owen und A. J. Friedenstein, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, UK, 1988, S. 42–60; S. L. Cheng et al., Endocrinology 134: 277 (1994); A. I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D. J. Richard et al., Dev. Biol. 161: 218 (1994); A. Keating, W. Horsfall, R. G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B. R. Clark und A. Keating, Ann. N. Y. Acad. Sci 770: 70 (1995)). Die meisten der leicht identifizierbaren hämatopoietischen Zellen gehen verloren, wenn die Zellen für 2 oder 3 Wochen als Primärkulturen gehalten werden. Die kultivierten MSCs synthetisieren eine extrazelluläre Matrix, die interstitielles Typ I-Kollagen, Fibronectin und das Typ IV-Kollagen und Laminin von Basalmembranen enthält (M. E. Owen und A. J. Friedenstein, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, UK, 1988, S. 42–60; S. L. Cheng et al., Endocrinology 134: 277 (1994); A. I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D. J. Richard et al., Dev. Biol. 161: 218 (1994); A. Keating, W. Horsfall, R. G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B. R. Clark und A. Keating, Ann. N. Y. Acad. Sci. 770: 70 (1995)). Ein kleiner Anteil der kultivierten Zellen synthetisiert mit dem Faktor VII assoziiertes Antigen und ist daher wahrscheinlich endothelial. Die Zellen sezernieren Cytokine, von denen die wichtigsten Interleukin-7 (IL-7), IL-8, IL-11 und Stammzellfaktor (c-kit-Ligand) zu sein scheinen. Die Bedingungen für die Differenzierung der Zellen sind etwas von der Art abhängig und werden von unvollständig definierten Variablen beeinflußt, wie der Charge an verwendetem fötalem Kälberserum. MSCs von der Maus, der Ratte, dem Kaninchen und dem Menschen differenzieren als Reaktion auf Dexamethason, 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ oder Cytokine wie BMP-2 (A. J. Friedenstein, U. Gorskaja, N. N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976); 5–11) bereitwillig in Kolonien von Osteoblasten (mit der Ablagerung von Mineral in der Form von Hydroxyapatit), Chondrocyten (die Knorpelmatrix synthetisieren) und Adipocyten. Als Reaktion auf 5-Azacytidin mit Amphotericin B (Fungasome, Gibco) oder Amphotericin B allein zeigten S. Wakitani, T. Saito und A. J. Caplan (Muscle Nerve 18: 1412 (1995)), daß MSCs durch Behandlung mit 5-Azacytidin und Amphotericin B in Myoblasten und Myotuben differenzierten. D. Phinney (unveröffentlichte Ergebnisse) beobachtete kürzlich, daß die Zellen nach der Behandlung mit Amphotericin B allein (1 μg/ml) in Myoblasten und Myotuben differenzierten, und sie differenzierten in Myoblasten, die zu rhythmisch schlagenden Myotuben fusionierten.
Die meisten Experimente zur Differenzierung von MSCs wurden mit Kulturen von MSCs durchgeführt, wie sie von Friedenstein beschrieben wurden (A. J. Friedenstein, U. Gorskaja, N. N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976). Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4,714,680, erteilt am 22. Dezember 1987, ein Verfahren zur Gewinnung von Mark von Spendern. Es werden monoclonale Antikörper bereitgestellt, die ein Stadium-spezifisches Antigen oder unreife menschliche Markzellen erkennen. Diese Antikörper sind von Nutzen bei Verfahren zur Isolierung einer Zellsuspension aus menschlichem Blut und von Mark, das bei Knochenmarkstransplantation verwendet werden kann. Es werden auch Zellsuspensionen bereitgestellt, die menschliche pluripotente lympho-hämatopoietische Stammzellen enthalten, ebenso wie therapeutische Verfahren, die die Zellsuspensionen verwenden.
Mehrere Gruppen von Forschern haben seit 1990 versucht, homogenere Populationen herzustellen. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 5,087,570, erteilt am 11. Februar 1992, wie man homogene Zusammensetzungen an hämatopoietischen Stammzellen des Säugers isolieren kann. Konzentrierte Zusammensetzungen an hämatopoietischen Stammzellen waren im Wesentlichen frei von differenzierten oder festgelegten hämatopoietischen Zellen. Die gewünschten Zellen werden durch Abziehen von anderen Zellen gewonnen, die spezielle Marker haben. Die resultierende Zusammensetzung kann verwendet werden, um individuelle oder Gruppen an hämatopoietischen Linien bereitzustellen, um die Stammzellen des Empfängers wiederherzustellen und um einen Test für einen weiten Bereich von hämatopoietischen Wachstumsfaktoren zu identifizieren.
Das US-Patent Nr. 5,633,426, erteilt am 27. Mai 1997, ist ein anderes Beispiel der Differenzierung und Produktion von hämatopoietischen Zellen. Chimären abwehrgeschwächten Mäusen wird vom Zeitpunkt der Implantation an mindestens 4 Wochen lang menschliches Knochenmark gegeben. Das Knochenmark nahm mit Ausnahme der Erythrocyten die normale Population von Knochenmark an. Diese Mäuse mit menschlichem Knochenmark können zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Mittel auf die Proliferation und Differenzierung von menschlichen hämatopoietischen Zellen verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,665,557, erteilt am 9. September 1997, betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von konzentrierten hämatopoietischen Stammzellen durch Abtrennung einer angereicherten Fraktion von Zellen, die den Marker CDw109 exprimieren. Es werden auch Verfahren zur Gewinnung von Zusammensetzungen bereitgestellt, die angereichert sind an hämatopoietischen Megakaryocyten-Vorläuferzellen. Durch die Erfindung werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, die angereichert sind an Stammzellen und Populationen von Zellen, die davon erhalten werden. Verfahren für die Verwendung der Zellen sind auch eingeschlossen.
Das US-Patent Nr. 5,753,505, erteilt am 5. Juni 1995, ist noch ein anderes Verfahren für die Differenzierung. Primordiales Gewebe wird in immundefiziente Wirte eingebracht, wo sich das primordiale Gewebe entwickelt und differenziert. Der chimäre Wirt erlaubt die Untersuchung der Prozesse und der Entwicklung von xenogenem Gewebe, die Untersuchung der Wirkung verschiedener Mittel auf das Wachstum und die Differenzierung des Gewebes, ebenso wie die Identifizierung von Mitteln, die in das Wachstum und die Differenzierung involviert sind.
Das US-Patent Nr. 5,753,505, erteilt am 19. Mai 1998, stellt eine isolierte zelluläre Zusammensetzung bereit, die mehr als etwa 90% nicht von einem Tumor abgeleitete, neuronale Vorläuferzellen des Säugers umfaßt, die einen Neuronenspezifischen Marken exprimieren und die Nachkommen ergeben, die in neuronale Zellen differenzieren können. Es werden auch Verfahren zur Behandlung von neuronalen Störungen bereitgestellt, die diese zelluläre Zusammensetzung verwenden.
Das US-Patent Nr. 5,759,793, erteilt am 6. August 1996, stellt ein Verfahren für die positive und negative Selektion von mindestens einer Säugerzellpopulation aus Gemischen von Zellpopulation unter Verwendung eines magnetisch stabilisierten fluidisierten Bettes bereit. Eine Anwendung dieses Verfahrens ist die Abtrennung und Reinigung von hämatopoietischen Zellen. Zielzellpopulationen umfassen menschliche Stammzellen.
Das US-Patent Nr. 5,789,148, erteilt am 4. August 1998, offenbart einen Kit, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Zelltrennung. Der Kit umfaßt ein zentrifugierbares Behältnis und eine Zelltrennungssuspension auf der Basis von organosilanisierten Silicapartikeln, die geeignet ist für Dichtegradiententrennung, die ein Polylactam enthält und durch Behandlung mit ionisierender Strahlung sterilisiert wird. Die Zusammensetzung umfaßt eine Suspension auf der Basis von silanisierten Silicapartikeln für die Zelltrennung, die mindestens 0,05% Polylactam enthält und bevorzugt mit ionisierender Strahlung behandelt wurde. Es wird auch ein Verfahren für die Isolierung von seltenen Blutzellen aus einem Gemisch an Blutzellen offenbart.
Innerhalb der letzten paar Jahre wurden die MSCs als Vehikel für die Zelltherapie und Gentherapie untersucht. Die Zellen sind aus kleinen Absaugungen von Knochenmark relativ leicht zu isolieren, das unter lokaler Betäubung gewonnen werden kann; sie können auch relativ leicht in Kultur vermehrt und mit exogenen Genen transfiziert werden. Prockop, D. J. Science: 26: 71–74 (1997). Daher scheinen MSCs für die Verwendung bei der Gentherapie mehrere Vorteile gegenüber hämatopoietischen Stammzellen (HMCs) zu haben. Die Isolierung angemessener Zahlen an HSCs erfordert große Volumina an Mark (1 Liter oder mehr) und die Zellen sind in Kultur schwer zu vermehren. (Prockop, D. J. (ibid.)).
Es gibt mehrere Quellen für Knochenmarksgewebe, einschließlich des eigenen Knochenmarks des Patienten, das von Blutsverwandten oder anderen mit passendem MHC, Knochenmarksbanken und Banken mit umbilicalen Nabelschnurblut. Es gibt mehrere Patente, die diese Quelle einschließen. Das US-Patent Nr. 5,476,997, erteilt am 17. Mai 1994, offenbart ein Verfahren für die Produktion eines Äquivalents zu menschlichem Knochenmark. In einem abwehrgeschwächten Säugerwirt wird ein menschliches hämatopoietisches System bereitgestellt, wobei das hämatopoietische System für längere Zeiträume funktional ist. Insbesondere werden menschliches fötales Lebergewebe und menschlicher fötaler Thymus in junge, abwehrgeschwächte Mäuse an einer Stelle eingebracht, die mit einem Gefäßsystem versehen ist, wobei das fötale Gewebe in der Bildung von funktionalem menschlichem Knochenmarksgewebe resultiert.
Eine Quelle für implantierbare Neuronen, die ethisch höchst kontrovers ist, ist die von menschlichem fötalem Gewebe. Das US-Patent Nr. 5,690,927, erteilt am 25. November 1997, verwendet auch menschliches fötales Gewebe. Menschliche fötale, von Neuronen abgeleitete Zelllinien werden in Wirtsgewebe implantiert. Dieses Verfahren erlaubt die Behandlung einer Vielzahl von neurologischen Störungen und anderen Krankheiten. Eine bevorzugte Zelllinie ist SVG.
Das US-Patent Nr. 5,753,491, erteilt am 19. Mai 1998, offenbart ein Verfahren für die Behandlung eines Wirts durch Implantation von genetisch nicht verwandten Zellen in den Wirt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung menschliche fötale, von Neuronen abgeleitete Zelllinien bereit und Verfahren zur Behandlung eines Wirts durch Implantation dieser immortalisierten menschlichen fötalen, von Neuronen abgeleiteten Zelllinien in den Wirt. Eine Quelle ist die Maus, was in dem US-Patent Nr. 5,580,777, erteilt am 3. Dezember 1996, eingeschlossen ist. Dieses Patent stellt ein Verfahren für die in vitro-Produktion von Linien von immortalisierten neuralen Vorläuferzellen bereit, einschließlich von Zelllinien, die die Charakteristika von neuronalen und/oder Gliazellen haben, und umfaßt den Schritt der Infektion von Neuroepithel oder neuralen Kammzellen mit einem retroviralen Vektor, der ein Mitglied der myc-Familie von Oncogenen trägt.
Das US-Patent Nr. 5,753,506, erteilt am 19. Mai 1998, offenbart ein in vitro-Verfahren, mit dem eine homogene Population von multipotenten Vorläuferzellen von embryonalem Säuger-Neuroepithel (ZNS-Stammzellen) in Kultur bis zu 10⁹-fach vermehrt wurde, während sie ihre multipotente Fähigkeit der Differenzierung in Neuronen, Oligodendrocyten und Astrocyten behielt. Es werden chemische Bedingungen für die Vermehrung einer großen Zahl von Neuronen aus Stammzellen offenbart. Außerdem wurden vier Faktoren identifiziert -PDGF, CNTF, LIF und T3-, die einzeln signifikant höhere Anteile an Neuronen, Astrocyten oder Oligodendrocyten erzeugen. Diese Verfahren haben das Ziel, in großem Maßstab die Gewinnung der ZNS-Stammzellen, Neuronen, Astrocyten und Oligodendrocyten von Säugern zu erlauben. Diese Zellen werden als ein wichtiges Werkzeug bei vielen Therapien für neurologische Störungen auf der Basis von Zellen und Genen vorgeschlagen.
Eine andere Quelle für Stammzellen ist die der embryonalen Stammzellen von Primaten. Das US-Patent Nr. 5,843,780, erteilt am 1. Dezember 1998, verwendet diese Stammzellen. Eine gereinigte Herstellung von Stammzellen wird offenbart. Diese Herstellung wird durch die folgenden Zelloberflächenmarker charakterisiert: SSEA-1 (–); SSEA-3 (+); TRA-1-60 (+); TRA-1-81 (+); und alkalische Phosphatase (+). Bei einer Ausführungsform haben die Zellen der Herstellung normale Karyotypen und fahren mit der Proliferation in einem undifferenzierten Zustand nach kontinuierlicher Kultur elf Monate lang fort. Die embryonalen Stammzelllinien werden auch so beschrieben, daß sie Fähigkeit zur Bildung von Trophoblasten und zur Differenzierung in Gewebe beibehalten, das von allen drei embryonalen Keimschichten (Endoderm, Mesoderm und Ectoderm) abgeleitet ist. Ein Verfahren für die Isolierung einer Embryo-Stammzelllinie des Primaten wird ebenfalls in diesem Patent offenbart.
Zusammenfassend bestehen bei Tiermodellen und menschlichen Patienten überzeugende Hinweise, daß die neurale Transplantation ein wissenschaftlich möglicher und klinisch vielversprechender Weg für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Schlaganfall ist, ebenso wie für die Reparatur von traumatischen Verletzungen des Gehirns und des Rückenmarks. Dennoch werden alternative Zellquellen und neue Strategien für die Differenzierung benötigt, um die zahlreichen ethischen und technischen Beschränkungen zu umgehen, die jetzt die breitgestreute Verwendung der neuralen Transplantation beschränken.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
Diese Erfindung stellt eine Quelle an neuralem Gewebe bereit, das für die Transplantation in das eigene Gehirn oder Rückenmark des Patienten verwendet werden kann (Autotransplantation). Diese Erfindung umgeht somit das schwierige Problem der Verwendung von vereintem fötalem Gewebe und umgeht ebenfalls die Notwendigkeit der Immunsuppression. Diese Erfindung wird auch verwendet für die Allotransplantation (die Transplantation von vom Knochenmark abgeleiteten neuronalen Zellen von einem Individuum zu einem anderen) und die Xenotransplantation (die Transplantation von vom Knochenmark abgeleiteten neuronalen Zellen von einer Art zu einer anderen). Einfach ausgedrückt können Knochenmarkszellen in vitro und in vivo zur Bildung von Neuronen induziert werden. Weder das Konzept noch die Technik wurden vorher berichtet oder ausgeführt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Produktion von Zellen eines neuronalen Phänotyps aus Knochenmarkszellen bereitgestellt, wobei das besagte Verfahren die folgenden Schritte umfaßt

a) Bereitstellung von Knochenmarkszellen;
b) Auswahl einer Vielzahl von Knochenmarkstromazellen aus dem Knochenmark;
c) Inkubieren der Stromazellen in einem Wachstumsmedium mit einem Mitogen, ausgewählt aus EGF, PDGF oder einer Kombination daraus; und
d) Inkubieren der Zellen von Schritt (c) in einem neuronalen Wachstumsmedium, welches wenigstens eine Retinolsäure und wenigstens einen differenzierenden Wirkstoff, ausgewählt aus BDNF, GDNF oder NGF, einschließt, wobei Zellen mit einem neuronalen Phänotyp erzeugt werden.

Bei einer Ausführungsform werden nicht fötale, nicht tumorerzeugende, von Knochenmark abgeleitete Zellen offenbart, die für die Transplantation in das Gehirn oder Rückenmark eines Säugers geeignet sind.
Somit wird ein Verfahren zur Gewinnung von Neuronen-ähnlichen Zellen aus Knochenmark offenbart, wobei das besagte Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Gewinnung von Knochenmarkszellen; b) Selektion auf Knochenmarkstromazellen; und c) Inkubation der Stromazellen mit einem Differenzierungsmittel für einen Zeitraum, der ausreicht, um den Zellphänotyp zu einem neuronal Phänotyp zu verändern. Das Verfahren kann einen zusätzlichen Schritt der Abtrennung von hämatopoietischen Stammzellen umfassen. Das Verfahren der Selektion von Knochenmarkstromazellen kann die Platzierung der Knochenmarkszellen und von geeignetem Kulturmedium in einem Plastikkulturmediumbehälter, die Anheftung der Knochenmarkstromazellen an das Plastik, und die Entfernung der anderen Zellen durch den Ersatz des Mediums umfassen. Das Verfahren stellt ebenfalls die Verwendung von Retinsäure, Wachstumsfaktoren, fötalen neuronalen Zellen oder einer Kombination davon als dem differenzierenden Mittel bereit. Die Wachstumsfaktoren umfassen BDNF, GDNF und NGF. Retinsäure ist 9-cis-Retinsäure, all-trans-Retinsäure oder eine Kombination davon.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Neuronen für die Autotransplantation aus dem eigenen Knochenmark eines Individuums umfaßt die Schritte von a) Gewinnung des Knochenmarks; b) Selektion auf Knochenmarkstromazellen; c) Inkubation der Knochenmarkstromazellen in einem Medium, das ein Mitogen enthält, bis es genügend Zellen für die Transplantation gibt; d) Inkubation der Stromazellen von Schritt c) mit einem Differenzierungsmittel für einen Zeitraum, der ausreicht, um den Zellphänotyp zu neuronal und/oder glial zu verändern. Das Mitogen ist EGF, PDGF oder eine Kombination davon. Das Verfahren kann einen zusätzlichen Schritt der Abtrennung von hämatopoietischen Stammzellen umfassen. Das Verfahren der Selektion von Knochenmarkstromazellen kann die Platzierung der Knochenmarkszellen und von geeignetem Kulturmedium in einem Plastikkulturmediumbehälter, die Anheftung der Knochenmarkstromazellen an das Plastik, und die Entfernung der anderen Zellen durch den Ersatz des Mediums umfassen.
Das Differenzierungsmittel ist ausgewählt aus Retinsäure Wachstumsfaktoren, fötalen neuronalen Zellen oder eine Kombination davon. Die Wachstumsfaktoren sind BDNF, GDNF und NGF, oder eine Kombination davon. Retinsäure ist 9-cis-Retinsäure, all-trans-Retinsäure oder eine Kombination davon.
Ebenfalls offenbart wird eine Zelllinie von Knochenmarkstromazellen, die durch eines der vorstehenden Verfahren entwickelt wurde, so daß die Zellen die Fähigkeit haben, zu wandern und an spezifischen neuroanatomischen Regionen zu siedeln, wo sie den zu neuronalen Zellen differenzieren, die typisch sind für die Region, und in charakteristischen architektonischen Mustern integrieren.
Ebenfalls offenbart wird ein Kit für die neuronale Zelltransplantation mit einer Spritze, die geeignet ist zur Gewinnung von Knochenmark, einem Plastikkolben mit dehydatisiertem Kulturmedium; und Knochenmarkstammzellen.
Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung einer neurodegenerativen Störung, welches die Verabreichung einer ausreichenden Menge von Zellen, die nach einem der vorstehenden Verfahren produziert wurden, an ein Individuum mit der besagten neurodegenerativen Störung einschließt. Spezifische neurodegenerative Störungen umfassen die Parkinson-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit, die Ischämie, Verletzungen des Rückenmarks, Ataxia und Alkoholismus.
Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren für die Durchmusterung auf die Wirkungen von Substanzen auf menschliche neuronale Zellen. Das Verfahren verlangt die Bereitstellung von implantierten menschlichen neuronalen Zellen für einen Säuger, wobei die besagten Zellen zu mindestens einer spezifischen Stelle in dem Gehirn des Säugers gewandert sind; die Verabreichung der Substanz an den Säuger; und die Beobachtung des Säugers auf eine Wirkung der Substanz.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist ein Balkendiagramm. BMSC, die an einem Kulturgefäß adhärierten, wurden 7 Tage mit EGF (10 ng/ml), RA (0,5 μM) oder RA plus BDNF (10 ng/ml) behandelt. Jeder Balken stellt die mittlere Zahl (± SEM) von Fibronectinimmunreaktiven Zellen pro Beobachtungsfeld (20× Objektiv) dar, die in 20 Feldern pro Gefäß in 4 Kulturgefäßen bestimmt wurden. * = p < 0,05, zweiseitiger t-Test.
Die 2A bis 2F zeigen BMSC von lacZ-Mäusen, die 2 Wochen in N5-Medium, das mit cis-9-Retinsäure (0,5 μM) und BDNF (10 ng/ml) ergänzt war, mit Zellen des fötalen Mittelhirns der Maus co-kultiviert worden waren.
Die 3A bis 3F zeigen die Wanderung und Integration von BMSC in das Mittelhirn der Ratte. 3A (Maßstab des Balkens = 500 μm) zeigt eine symmetrische Verteilung trotz unilateraler Transplantation in das Striatum. 3B ist eine Region des paraventrikulären Nucleus (Maßstab des Balkens = 100 μm). Keine der β-Gal+-Zellen werden mit TH-ir markiert. Die 3A (Maßstab des Balkens = 500 μm), 3B (Maßstab des Balkens = 100 μm) und 3C (Maßstab des Balkens = 50 μm) zeigen Zellen mit β-Gal und TH-ir. Die 3D (Maßstab des Balkens = 50 μm) und 3E (Maßstab des Balkens = 25 μm) zeigen Schnitte vom roten Nucleus, die sich doppelt für β-Gal und NeuN-ir färbten. Die 3F (Maßstab des Balkens = 25 μm) zeigt β-Gal+-Zellen von dem roten Nucleus, die ebenfalls doppelt für MAP2-ir färbten.
Die 4A bis 4F zeigen die Verteilung von β-Gal+-Zellen, im cerebellaren Läppchen der Ratte und laminar, in einer Anordnung von Purkinje-Zellen. In den 4A, 4B und 4C wurden β-Gal-Zellen co-markiert mit der Calbindin-Immunreaktivität. (Maßstab des Balkens = 100 μm bei 4A, 50 μm bei 4B und 25 μm bei 4C). Die 4D zeigt β-Gal+ Purkinje-Zellen, co-markiert mit GAD-ir (Maßstab des Balkens = 50 μm). Die 4E zeigt dichte MAP2-ir-Fasern, die β-Gal+-Purkinje-Zellen umhüllen (Maßstab des Balkens = 25 μm). Die 4F zeigt β-Gal+-Zellen, die im tiefen cerebellaren Nucleus mit NeuN-ir co-markiert sind (Maßstab des Balkens = 25 μm).
Die 5A bis 5D zeigen die Marken für Fibronectin (5A) und differenzierte BMSC mit Nervenzellmarkern (5B, 5C und 5D).
Die 6 ist ein Western-Blot von Lysaten von BMSC, konditioniert mit vier verschiedenen Behandlungen und markiert mit GFAP-ir, Nestin und NeuN. BDNF + RA + N5 induzierten die stärkste Expression von Nervenzellmarkern, während Gliazellmarker am stärksten nach N5 allein exprimiert wurden.
Die 7A bis 7F zeigen menschliche BMSC, die mit fötalen striatalen Zellen der Ratte in einer N5-Formulierung mit BDNF + RA co-kultiviert wurden. Diese Figuren zeigen, daß menschliche BMSC (weiß in 7C und 7D und grau in 7E und 7F) zur Expression der neuronalen Marker NeuN (7A und 7E) und GFAP (7B und 7F) induziert werden können.
Die 8 zeigt Rattenhirn, in dem Maus-BMSC, die mit grauem PKH26 markiert sind, auch den neuronalen Marker NeuN-ir exprimieren (weiß). Außerdem ist die Morphologie der doppelt markierten Zellen diejenige von Neuronen.
Die 9 zeigt Rattenhirn mit einer doppelt markierten Gliazelle. Die graue Markierung identifiziert sie als von BMSC abgeleitet, und die weiße Schattierung der Zelle ist auf GFAP-ir zurückzuführen. Man beachte, daß die Morphologie diejenige einer Gliazelle ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die Maxime der alten Chinesischen Medizin „das Gehirn ist ein Meer von Mark" (W. R. Morse, Chinese Medicine, Paul Hoeber, Inc., New York, 1938) ist in Übereinstimmung mit kürzlichen Forschungsergebnissen bezüglich der Möglichkeit einer Population von Knochenmarkszellen, unter experimentellen Bedingungen in Neuronen zu differenzieren.
In der westlichen Medizin wurde die Existenz von nicht-hämatopoietischen Stammzellen in Knochenmark vor über 100 Jahren vermutet, die Isolierung und Differenzierung von Markstromazellen in Osteoblasten, Chondroblasten, Adipocyten und Myoblasten wurde aber erst kürzlich gezeigt. D. J. Prockop, Science 276: 71–74 (1997). In der medizinischen Literatur wurden nicht-hämatopoietische Vorläufer von Knochenmarkstroma als Kolonie-bildende-Einheit-Fibroblasten, mesenchymale Stammzellen oder Knochenmarkstromazellen (BMSC) bezeichnet. Obwohl man von BMSC natürlicherweise erwarten kann, daß sie eine Quelle für umgebendes Gewebe an Knochen, Knorpel und Fett sind, zeigten kürzlich mehrere Berichte, daß diese Zellen unter spezifischen experimentellen Bedingungen wandern und in Muskel- oder Gliazellen differenzieren können. Die systemische Infusion von BMSC in bestrahlte, drei Wochen alte Mäuse resultierte im Erscheinen der Nachkommen der Spenderzellen in einer Vielzahl von nicht-hämatopoietischen Geweben einschließlich dem Gehirn. R. F. Pereira et al., Proc. Natl. Acad. Med. (U.S.A.) 95: 1142–1147 (1998). Es wurde berichtet, daß die Transplantation von genetisch markierten Knochenmarkszellen in immundefiziente Mäuse in der Migration von Markzellen in einen Bereich von chemisch induzierter Muskeldegeneration resultierte. G. Ferrari, et al., Science 279: 1528–1530 (1998). Die von Mark abgeleiteten Zellen erlitten eine myogene Differenzierung und beteiligten sich bei der Regenerierung von beschädigten Muskelfasern. Darüber hinaus resultierte die Infusion von menschlichen BMSC in das Striatum der Ratte im Anwachsen, Migration und Überleben von Zellen. S. A. Azizi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 95: 3908–3913 (1998). Nach dem Anwachsen verloren diese Zellen typische BMSC-Marker wie die Immunreaktivität gegenüber Antikörpern gegen Kollagen und Fibronectin. BMSC entwickelten viele der Charakteristika von Astrocyten und ihr Anwachsen und ihre Migration standen in deutlichem Gegensatz zu Fibroblasten, die weiterhin Kollagen produzieren und nach der Implantation eine Gliose erleiden. Nach der Transplantation von Knochenmark in letal bestrahlte Ratten wurden bei von Knochenmark abgeleiteten Zellen gefunden, daß sie zwischen 60 und 80% der Makrophagen des Wirts in sensorischen und autonomen Ganglien ebenso wie in peripheren Nerven ersetzen. K. Vass, W. F. Hickey, R. E. Schmidt, N. Lassmann, Laboratory Investigation 69: 275–282 (1993). Bei dieser Untersuchung wurde kein Versuch gemacht, um zu bestimmen, ob Markzellen in Gliazellen oder neuronale Zellen differenzierten.
Unser Labor hatte kürzlich Erfolg bei der Differenzierung von BMSC in einen Neuronen-ähnlichen Phänotyp, unter Verwendung einer Kombination von Retinsäure, Wachstumsfaktoren und einer fötalen neuronalen Umgebung. Darüber hinaus transplantierten wir BMSC in denerviertes Striatum der Ratte und fanden, daß BMSC in spezifische neuroanatomische Regionen wandern, wo sie in Zellen differenzieren, die Marken von benachbarten Zellen exprimieren. In diesen Regionen integrieren sich die Zellen in charakteristische architektonische Muster.
Definitionen:
"Neuronale Zellen" sind diejenigen, die mindestens eine Indikation des neuronalen Phänotyps haben, wie die Anfärbung für einen oder mehrere neuronale Marker. Beispiele für neuronale Marker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Neuronen-spezifisches nucleäres Protein, Tyrosinhydroxylase, mit Mikrotubuli assoziiertes Protein und Calbindin.
"Nicht tumorerzeugend" betrifft die Tatsache, daß die Zelle nicht Ursache eines Neoplasma oder Tumors ist.
Wie hier verwendet betrifft "nicht fötal" die Tatsache, daß die Quelle geboren ist. Sie schließt umbilicales Nabelschnurblut nicht aus.
Die Selektion auf Knochenmarkstromazellen kann mittels einer Reihe von Wegen durchgeführt werden. Klassisch werden die Stromazellen aus dem Verband gelöst und in einem Plastikgefäß kultiviert. Die Stromazellen werden durch ihr Überleben in spezifischen Medien und ihre Adhärenz an das Plastik abgetrennt.
Knochenmarkzellen können dazu induziert werden, eine Anzahl von verschiedenen neuronalen Phänotypen anzunehmen, wie nachstehend durch in vitro- und in vivo-Beobachtungen bewiesen wird. Zusätzliche in vitro-Difterenzierungstechniken können durch die Verwendung von verschiedenen Zellwachstumsfaktoren und gemeinsamen Kulturverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, adaptiert werden. Neben der gemeinsamen Kultur mit fötalen mesencephalischen oder striatalen Zellen (wie nachstehend erfolgreich gezeigt) kann eine Vielzahl von anderen Zellen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, akzessorische Zellen, Sertoli-Zellen und Zellen von anderen Teilen des fötalen und reifen zentralen Nervensystems.
Allgemeine Verfahren
Es wird allgemein molekularbiologischen Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind und nicht spezifisch beschrieben werden, gefolgt, wie bei Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992) und Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989). Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird im Allgemeinen ausgeführt wie in PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, California (1990). Die Reaktionen und Handhabungen, die andere Nucleinsäuretechniken betreffen, werden, außer anders festgehalten, durchgeführt, wie allgemein beschrieben in Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, und Methoden, wie dargestellt in den Patenten Nr. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659; und 5,272,057 der Vereinigten Staaten. Die in situ-PCR in Kombination mit der Durchflußcytometrie kann für den Nachweis von Zellen verwendet werden, die spezifische DNA- und mRNA-Sequenzen enthalten (Testoni et al. Blood 87: 3822 (1996)).
Es wird allgemein Standardverfahren der Immunologie, die im Stand der Technik bekannt sind und nicht spezifisch beschrieben werden, gefolgt, wie bei Stites et al. (Hrsg.), BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8te Ausg., Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); und Mishell und Shigi (Hrsg.), SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, W. H. Freeman und Co., New York (1980).
Immuntests
Im Allgemeinen werden Immuntests angewendet, um eine Probe auf zum Beispiel Zelloberflächenmarker oder dergleichen zu beurteilen. Immuncytochemische Tests sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Bei diesen Tests können sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper verwendet werden, Wenn angebracht, können andere Immuntests wie enzymverbundene Immunadsorptionstests (ELISAs) und Radioimmuntests (RIA) verwendet werden, wie sie dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind. Verfügbare Immuntests sind ausführlich beschrieben in der Patentliteratur und wissenschaftlichen Literatur. Vgl. zum Beispiel die Patente 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 und 5,281,521 der Vereinigten Staaten ebenso wie Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor, New York (1989).
Antikörperproduktion
Antikörper können monoclonal, polyclonal oder rekombinant sein. Zweckmäßigerweise können die Antikörper gegen das Immunogen oder einen Teil davon, zum Beispiel ein synthetisches Peptid auf der Basis der Sequenz hergestellt werden, oder rekombinant durch Clonierungstechniken hergestellt werden, oder das natürliche Genprodukt und/oder Teile davon können isoliert und als das Immunogen verwendet werden.
Immunogene können verwendet werden, um mittels Standardantikörperproduktionstechnik, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt ist, Antikörper zu produzieren, wie allgemein beschrieben bei Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988) und Borrebaeck, ANTIBODY ENGINEERING – A PRACTICAL GUIDE, W. H. Freeman and Co. (1992). Antikörperfragmente können ebenfalls mittels Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, von den Antikörpern hergestellt werden und umfassen Fab und F(ab')₂.
Für die Produktion von polyclonalen Antikörpern wird ein Wirt wie ein Kaninchen oder eine Ziege mit dem Immunogen oder dem Immunogenfragment immunisiert, im Allgemeinen mit einem Adjuvans und, falls erforderlich, gekoppelt an einen Träger; die Antikörper gegen das Immunogen werden aus dem Serum gewonnen. Weiterhin kann der polyclonale Antikörper absorbiert werden, so daß er monospezifisch ist. Das heißt, daß das Serum ähnlichen Immunogenen ausgesetzt werden kann, so daß kreuz-reaktive Antikörper aus dem Serum entfernt werden und das Serum monospezifisch wird.
Für die Produktion von monoclonalen Antikörpern wird ein geeigneter Spender mit dem Immunogen hyperimmunisiert, im Allgemeinen eine Maus, und es werden die Antikörper produzierenden Zellen der Milz isoliert. Diese Zellen werden mit immortalen Zellen fusioniert, wie Myelomzellen, um ein fusioniertes Zellhybrid zu ergeben, das immortal ist und den erforderlichen Antikörper sezerniert. Die Zellen werden dann gezüchtet und der monoclonale Antikörper wird aus dem Kulturmedium gewonnen.
Zur Produktion von rekombinanten Antikörpern wird die Boten-RNA von Antikörper produzierenden B-Lymphocyten von Tieren oder Hybridomen revers transkribiert, um komplementäre DNAs (cDNAs) zu erhalten. Antikörper-cDNA, die vollständiger oder partieller Länge sein kann, wird amplifiziert und in einen Phagen oder ein Plasmid cloniert. Die cDNA kann eine cDNA der schweren und leichten Kette partieller Länge sein, getrennt oder durch einen Linker verbunden. Der Antikörper oder das Antikörperfragment wird unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems exprimiert. Antikörper-cDNA kann auch durch Durchmusterung einschlägiger Expressionsbibliotheken erhalten werden.
Der Antikörper kann an ein festes Trägersubstrat gebunden sein oder mit einer nachweisbaren Gruppe konjugiert sein oder sowohl gebunden als auch konjugiert sein, wie im Stand der Technik wohl bekannt ist. (Für eine allgemeine Diskussion der Konjugation von fluoreszierenden oder enzymatischen Gruppen vgl. Johnstone & Thorpe, IMMUNCYTOCHEMISTRY IN PRACTICE, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982). Die Bindung von Antikörpern an ein festes Trägersubstrat ist im Stand der Technik ebenfalls wohl bekannt. (Für eine allgemeine Diskussion vgl. Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York 1988 und Borrebaeck, ANTIBODY ENGINEERING – A PRACTICAL GUIDE, W. H. Freeman and Co., 1992). Die nachweisbaren Gruppen, die bei der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, können fluoreszierende, metallische, enzymatische und radioaktive Marker umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele umfassen Biotin, Gold, Ferritin, alkalische Phosphatasen, ⎕-Galactosidase, Peroxidase, Unease, Fluorescein, Rhodamin, Tritium, ¹⁴C, Iodierung und grün fluoreszierendes Protein.
Gentherapie
Gentherapie, wie sie hier verwendet werden, betrifft die Übertragung von genetischem Material (z.B. DNA oder RNA) von Interesse in einen Wirt, um eine genetische oder erworbene Krankheit oder einen solchen Zustand zu behandeln oder zu verhindern. Das genetische Material von Interesse codiert ein Produkt (z.B. Protein, Polypeptid und Peptid, funktionelle RNA, Antisense), dessen in vivo-Produktion gewünscht ist. Zum Beispiel codiert das genetische Material von Interesse ein Hormon, einen Rezeptor, ein Enzym, Polypeptid oder Peptid von therapeutischem Wert. Alternativ codiert das genetische Material von Interesse ein Selbstmordgen. Für einen Überblick vgl. "Gene Therapy" in ADVANCES IN PHARMACOLOGY 40, Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1997.
Verabreichung von Zellen
Die Zellen der vorliegenden Erfindung werden gemäß guter medizinischer Praxis verabreicht und dosiert, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle und Art der Verabreichung, die Zeitfolge der Verabreichung, das Alter, Geschlecht, Körpergewicht des Patienten und andere Faktoren berücksichtigt werden, die dem medizinischen Praktiker bekannt sind. Die pharmazeutisch "wirksame Menge" für die Zwecke hier wird somit durch solche Überlegungen bestimmt, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Die Menge muß insofern wirksam sein, als sie eine Verbesserung erreicht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, verbesserter Überlebensrate oder schnellere Genesung oder Verbesserung oder Eliminierung von Symptomen und anderen Indikatoren, wie sie vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet als geeignete Mittel ausgewählt werden.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Zellen der vorliegenden Erfindung auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, wie es geeignet wäre, um sie in das zentrale Nervensystem zu implantieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, der parenteralen Verabreichung, der intrathecalen Verabreichung, der intraventrikulären Verabreichung und der intranigralen Verabreichung.
BEISPIELE
Beispiel 1. In Vitro-Differenzierung
Knochenmark wurde entweder von Oberschenkelknochen der Maus oder menschlichen Knochenmarksabsaugungen gewonnen. Menschliches Knochenmark wurde mit Dulbecco's minimalem essentiellem Medium (DMEM) (GIBCO/BRL) und 10%-igem fötalem Rinderserum (FBS) 1:1 verdünnt und 30 Minuten bei 1.000 g durch einen Dichtegradienten (Ficoll-Paque Plus, 1,077 g/ml, Pharmacia) zentrifugiert. Der Überstand und die Zwischenschicht wurden vereinigt, auf etwa 20 ml mit MEM mit 10%-igem fötalem Kälberserum (FCS) verdünnt und in mit Polyethylenimin beschichteten Plastikkolben ausplattiert. Das Mäuseknochenmark wurde in 10 ml PBS und 5% Rinderalbumin gegeben. Die Zellen wurden in diesem Medium gewaschen und 5 Minbei 2000 U/Minzentrifugiert. Die Zellen wurden in Wachstumsmedium resuspendiert, das aus DMEM bestand, das mit 2 mM Glutamin, 0,001% β-Mercaptoethanol, nicht-essentiellen Aminosäuren und 10% Pferdeserum ergänzt war. Die Zellen wurden in den Kolben zwei Tage inkubiert, wonach die nicht adhärenten Zellen durch Ersatz des Mediums entfernt wurden. Nachdem die Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen durch Anwendung von Trypsin (0,25%) und 1 mM EDTA und 3–4 min Inkubation bei 37°C abgelöst. Einige der Zellen wurden für eine spätere Verwendung eingefroren. Um die Zellpopulation zu vermehren, wurden andere Zellen nach 1:2 oder 1:3 Verdünnung unter Zugabe eines Mitogen wie epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) mit einer Konzentration von 10 ng/ml oder von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumfaktor (PDGF) mit einer Konzentration von 5 ng/ml erneut ausplattiert. Diese Prozedur wurde über 3–5 Passagen wiederholt.
Die Differenzierung von BMSC-Zellen in Neuronen-ähnliche Zellen war der nächste Schritt. Zellen, die, wie vorstehend beschrieben, vom Boden der Plastikkolben entfernt worden waren, wurden in Kulturgefäßen von 35 mm in der Anwesenheit von neuronalem Wachstumsmedium (N5) (Kaufmann & Barrett, Science 220: 1394, 1983) erneut ausplattiert, das mit 5% BSA, 1% FBS, Transferrin (100 g/ml), Putrescin (60 μM), Insulin (25 g/ml), Progesteron (0,02 μM), Selen (0,03 μM), 9-cis-Retinsäure oder all-trans-Retinsäure (0,05 μM) und irgendeinen von mehreren neuronalen Wachstumsfaktoren mit einer Konzentration von 1–10 ng/ml ergänzt war. Die getesteten Wachstumsfaktoren waren vom Gehirn abgeleiteter Wachstumsfaktor (BDNF), von Gliazellen abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) und Nervenwachstumsfaktor (NGF). Nach 7–14 Tagen wechselte ein kleiner Teil der BMSC die Morphologie und exprimierte Proteine wie Nestin (ein Marker für Zellen, die dafür bestimmt sind, neurale Zellen zu werden), Neuronen-spezifisches nukleäres Antigen (NeuN), Tyrosinhydroxylase (TH) und fibrilläres saures Protein von Gliazellen (GFAP). 4% der Zellen entwickelten eine Neuronen-ähnliche oder Gliazellenmorphologie, wenn sie immunhistochemisch sichtbar gemacht wurden. Diese Zellen hatten sich nicht in "dendritische Zellen" differenziert, bewiesen durch die fehlende Färbung auf CD40.
Färbungscharakteristika von BMSC-abgeleiteten Zellen
Beispiel 2
Knochenmarkszellen wurden unter Verwendung von Methoden ähnlich denen, die verwendet werden, um die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES) zu fördern, in vitro induziert, um Neuronen-ähnliche Zellen zu werden. J. Dinsmore, et al., Cell Transplantation 5: 131–143 (1996). Knochenmark wurde von ausgewachsenen Mäusen gewonnen und unter Verwendung von magnetischer Zellsortierung in zwei Fraktionen aufgeteilt. Zunächst wurden die Knochenmarkszellen unter Verwendung einer Spritze mit einer Nadel #26 G durch Spülen des Schafts mit Puffer (PBS, ergänzt mit 0,5% BSA, pN-Wert 7,2) aus den Oberschenkelknochen und Schienbeinen von Mäusen gesammelt. Die Zellen wurden durch mehrfaches vorsichtiges Pipettieren aus dem Verband gelöst. Die Zellen wurden durch ein Nylon-Sieb von 30 μM gegeben, um verbliebene Gewebeklumpen zu entfernen. Die Zellen wurden durch Zugabe von Puffer gewaschen, indem sie 10 Min bei 200 × g zentrifugiert wurden und der Überstand entnommen wurde. Das Zellpellet wurde in 800 μl Puffer je 10⁸ Zellen resuspendiert. Mit einem magnetischen Zellsortierungskit (Milteny Biotec, Inc, Auburn, TX) wurden die hämatopoietischen Knochenmarkszellen mit Sca1+-Mikrokügelchen markiert. Die markierten Knochenmarkszellen wurden für die positive Abtrennung von Sca1+-Zellen auf eine MS+-Säule gegeben.
Spezifisch wurden 200 μl Sca1-Multi-sort-Mikrokügelchen pro insgesamt 10⁸ Zellen zugegeben, gemischt und 15 Minbei 6–12°C inkubiert. Eine Fraktion war angereichert an Zellen, die Marken für das Antigen für hämatopoietische Stammzellen der Maus (Sca1) enthielten, und die zweite Fraktion enthielt alle anderen Markzellen (einschließlich der BMSC-Fraktion). Die Zellen wurden durch Zugabe des 5–10-fachen Markierungsvolumens Puffer gewaschen und 10 Minbei 200 × g zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Das Zellpellet wurde in 500 μl Puffer resuspendiert. Die MS+/RS+-Säule wurde mit 500 μl Puffer gewaschen. Die Zellsuspension wurde auf die Säule aufgetragen und die negativen Zellen liefen durch. Die Säule wurde dann dreimal mit 500 μl Puffer gespült. Die Säule wurde von dem Separator (der den Magnet enthält) entfernt und auf ein geeignetes Sammelröhrchen gesetzt. Auf die Säule wurde 1 ml Puffer pipettiert und die positive Fraktion wurde mit dem Kolben herausgespült, der mit der Säule bereitgestellt wird. Die mit Scal markierten Zellen wurden in 10 ml PBS und 5% BSA gegeben. Die Zellen wurden mit diesem Medium gewaschen und zentrifugiert (5 Min., 2000 U/Min.). Die Zellen wurden in Wachstumsmedium resuspendiert, das aus DMEM bestand, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 0,001% β-Mercaptoethanol, nicht-essentiellen Aminosäuren und 10% Pferdeserum. Die Zellen wurden in Polyethylenkolben 2 Tage inkubiert, und die nicht adhärenten Zellen durch Ersatz des Mediums entfernt. Nachdem die Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen durch 3–4 Minuten Inkubation mit Trypsin (0,25%) und 1 mM EDTA bei 37°C gelöst. Sie wurden für eine spätere Verwendung eingefroren oder nach 1:2- oder 1:3-Verdünnung unter Zugabe von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 10 ng/ml, wieder ausplattiert. Die Population an Zellen, die fest am Boden der Kulturkolbens heftete, erschien primär fibroblastisch. Die Mehrheit dieser Zellen färbte sich mit Antikörpern gegen Fibronectin. Diese Zellen wurden wegen ihres mesenchymalen oder fibroblastischen Aussehens entweder als mesenchymale Stammzellen bezeichnet oder als Knochenmarkstromazellen (BMSC), weil sie sich aus der komplexen Anordnung von unterstützenden Strukturen zu erheben scheinen, die in Mark gefunden werden. D. J. Prockop, Science 276: 71–74 (1997).
Vorläufige Ergebnisse aus unserem Labor ergaben keine Hinweise für dendritische Zellen in BMSC, die mit Retinsäure (RA) und Wachstumsfaktor (BDNF, GDNF oder NGF) gezüchtet wurden (Beispiel 1). Darüber hinaus verminderte sich die Zahl von gegenüber Fibronectin immunreaktiven Zellen als Funktion der Behandlung mit RA und Wachstumsfaktor, was zeigt, daß Retinsäure und Wachstumsfaktor die Differenzierung von BMSC weg vom fibroblastischen Phänotyp induzierten (vgl. 1).
Um zu bestimmen, ob die zelluläre Umgebung die Differenzierung dieser Zellen beeinflußt, wurden BMSC mit fötalen mesencephalischen Zellen co-kultiviert. Die BMSC wurden von transgenen lacZ-Mäusen (Jackson Labs.) gewonnen, die β-Galactosidase (β-Gal) in Knochenmarkszellen exprimieren. Die lacZ-BMSC wurden mit gleichen Anteilen mit fötalen mesencephalischen Zellen ausplattiert, die, wie kürzlich beschrieben (J. R. Sanchez-Ramos, P. Michel, W. J. Weiner, F. Hefti, Journal of Neurochemistry 50: 1934–1944 (1988)), von Mäusen eines anderen Stamms (C57 bl6; Jackson Labs) in Kulturmedium gewonnen wurden, das 9-cis-Retinsäure (0,5 μM) und BDNF (10 ng/ml) enthielt. Nach zwei Wochen wurden die Kulturen fixiert und für die β-Gal-Histochemie und Immuncytochemie für neuronale Marker vorbereitet. β-Gal+ von lacZ-BMSC wurden durch ein blaues Reaktionsprodukt klar identifiziert, das mit Hellfeld-Mikrokopie (dunkel markierte Zellen bei den 2A, 2C und 2E) sichtbar gemacht wurde, und Neuronen wurden unter Verwendung eines mit Fluorescein gekoppelten sekundären Antikörpers durch Immunreaktivität mit Neuronen-spezifischem nukleärem Protein (NeuN-ir) identifiziert. Die 2B, 2D und 2F sind die entsprechenden NeuN-ir-Bilder von 2A, 2C bzw. 2E (weiß markierte Zellen). Bei der 2A sind die Zellen mit den Nummern 1, 2 und 3 β-Gal+-Zellen und werden co-markiert von NeuN-ir, wie in 2B gezeigt. Viele spindelförmige Zellen mit Neuronen-ähnlichen Prozessen zeigten β-Gal-Färbung und NeuN-ir, aber die Neuronen von den fötalen mesencephalischen Zellen waren unterscheidbar, weil sie größer waren und nicht β-Gal+. Zum Beispiel zeigt in 2E die Zelle oberhalb der Zahl 1 keine β-Gal-Färbung, zeigt aber Neur-N-ir in der 2F und ist somit ein fötales mesencephalisches Neuron. Im Gegensatz dazu waren in der 2E die Zellen mit den Zahlen 2 bis 6 von β-GaI+-BMSC abgeleitete Zellen, die NeuN-ir zeigen (2F) und somit Neuronen-ähnliche Zellen geworden waren. Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine neuronale Umgebung ebenso wie die geeigneten Differenzierungs-/Wachstumsfaktoren die Transformation der Mehrheit der BMSC in einen neuronalen Phänotyp induzierten.
Beispiel 3. In Vivo-Differenzierung
Um zu bestimmen, ob die Differenzierung von BMSC-Zellen in Neuronen in vivo eintreten würde, wurden BMSC von lacZ-Mäusen in denerviertes oder normales Striatum der Ratte transplantiert. Vor der Transplantation wurden die BMSC 2 Tage mit cis-9-Retinsäure (0,5 μM) und BDNF (10 ng/ml) behandelt. Drei Wochen vor der Transplantation wurde die Transplantationsstelle der Schwanzstelle des Putamens von Ratten mit unilateralen Injektionen in die Substantia nigra von 6-Hydroxydopamin (6-OH DA) behandelt. Eine einzelne Injektionen von 6-OH DA (Sigma; 2,5 μl, 3,6 μg/μl für eine Gesamtdosis von 9 μg in 0,2%-iger Ascorbinsäure) wurde in das rechte aufsteigende mesostriatale dopaminergische Sytem gemacht (4,4 mm hinter dem Scheitel, –1,2 mm seitlich und –7,8 mm ventral zur harten Hirnhaut mit auf –2,4 mm eingestelltem Zahnbalken). Das 6-OH DA wurde mit einer Rate von 1 μl/Minverabreicht. Die Spritzen wurden vor dem langsamen Herausziehen zusätzliche 5 Minan der Stelle gehalten.
Teilmengen einer BMSG-Suspension wurden bei 6 Tieren entlang eines einzelnen Nadelkanals auf derselben Seite wie die nigralen Schädigungen von 6-OH DA im Striatum abgelagert. Die Ratten wurden mit Natriumpentobarbital betäubt und in einen stereotaxischen Rahmen gebracht. Teilmengen der Zellsuspension wurden in zwei separaten Stellen im Striatum entlang eines einzelnen Nadelkanals abgelagert. Die Koordinaten für die Injektionen waren 1,2 mm vor dem Scheitel, +2,7 mm lateral und –5,2 mm und –4,7 ventral zur harten Hirnhaut mit auf Null eingestelltem Zahnbalken. Jede Injektion von 2 μl wurde mit einer Rate von 1 μl/Minverabreicht. Die Zahl an Stammzellen, die in das Striatum injiziert wurde, war 20.000 Zellen/μl für insgesamt 80.000 Zellen. Bei zwei Ratten wurde eine zweite Injektion von Zellen in das Striatum an der Stelle ohne Schädigung vorgenommen, was in insgesamt 160.000 Zellen pro Ratte resultierte.
Ein, zwei und drei Monate nach der Transplantation wurden Paare von Tieren getötet und mit heparinisierter Salzlösung und phosphatgepuffertem Paraformaldehyd perfundiert. Es wurden serielle kryostatische Schnitte von 30 μm Dicke durch die gesamte Länge des Gehirns geschnitten. Die Schnitte wurden zunächst auf β-Gal- Aktivität angefärbt, gefolgt von immunhistochemischer Verarbeitung mit Antikörpern gegen Neuronen-spezifisches nukleäres Protein (NeuN), mehreren Blockierungsmitteln, um die nicht-spezifische Immunmarkierung zu verringern, und einem zweiten Antikörper, der mit Peroxidase und einem rot-braunen Chromagen (Histomouse Kit, Zymed) gekoppelt war. Andere neuronale Marken, die immunhistochemisch bewertet wurden, umfaßten Tyrosinhydroxylase (TH), Glutamatdecarboxylase (GAD), Calbindin und Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP2).
Die Tiere verhielten und bewegten sich bis zur Tötung normal. Da dieses Experiment speziell geplant war, um zu bestimmen, ob Transplantate überlebten und sich differenzierten, wurden die Tiere nicht Apomorphin oder Amphetamin ausgesetzt, um zu bestimmen, ob die Schädigung mit 6-OH DA und die anschließende Transplantation das Rotationsverhalten veränderte. Die Überprüfung der Gehirngewebeschnitte offenbarte von BMSC abgeleitete β-Gal+-Zellen in vielen Gehirnregionen, die entfernt lagen von der Stelle der Implantation im Corpus striatum. Eine erwartungsgemäße Anhäufung von β-Gal+-Zellen wurde in den folgenden spezifischen Gehirnregionen gefunden: mitrale Zellzone des Riechkolbens, paraventrikuläre und supraoptische Nuclei von Hypothalamus, Hippocampus, Habenula, oculomotorischem Nucleus, rotem Nucleus, S. nigra, Abducens, faciale und hyoglossale Schädelnerv-Nuclei, der unteren Olive der Medulla, dem ventralen Horn des Rückenmarks und der cerebellaren Purkinje-Zellschicht. Die Verteilung von β-Gal+-Zellen war bilateral und nahezu symmetrisch in allen Regionen außer der S. nigra, wo die unbeschädigte Stelle eine größere Zahl an β-Gal+-Zellen zeigte (3A, die schwarzen Zellen, und Tabelle 1). Die β-GaI+-BMSC-Zellen waren im Cerebellum in einem laminaren Muster verteilt, identisch dem der Purkinje-Zellen (4A, 4B, 4C). Eine ähnliche, aber doch weniger dichte laminare Verteilung von BMSC wurde in der mitralen Zellschicht des Riechkolbens gesehen. Der cerebrale Cortex und der Corpus striatum akkumulierten selbst an der Transplantationsstelle keine signifikanten Zahlen an β-Gal+-Zellen, obwohl diese Zellen üblicherweise in den kapillaren Kanälen dieser Regionen gesehen wurden.
Die BMSC-β-Gal+-Zellen nahmen mehrere Phänotypen an, einschließlich Epithel-ähnliche cuboidale Zellen im Plexus choroideus, kleine Oligodendrogliaähnliche Zellen im optischen Chiasma und der sub-corticalen Substantia alba, große Neuronen-ähnliche Zellen im roten Nucleus, der S. nigraund Motornuclei des Hirnstamms. Tabelle 1 Zellzahlen in Mittelhirnregionen 1 Monat nach der Transplantation von BMSC (mittlere Zahl von 2 Ratten)
3 Monate nach der Transplantation (mittlere Zahl von 2 Ratten)

** der neuronale Marker in diesen Regionen war Tyrosinhydroxylase (TH). Nur die linke (nicht geschädigte) Seite enthielt BMSC-abgeleitete Zellen

Die stereologischen Zahlen an β-Gal+-Zellen (insgesamt und co-markiert mit neuronalen Markern) in Mittelhirnregionen wurden bei 4 Ratten bestimmt, von denen jede zuvor mit einer Injektion von 6-ON-DA in die rechte S. nigrageschädigt worden war, gefolgt von der Transplantation von BMSC 3 Wochen später in den rechten Corpus striatum. Zwei Ratten wurden 1 Monat und 2 Ratten wurden 3 Monate nach der Transplantation getötet. Die Zahlen von TH-ir-Zellen in der S. nigra und dem ventral-tegmentalen Bereich (VTA) wurden nur bei einem Tier bestimmt.
Cerebellare β-Gal+-Zellen, wie echte Purkinje-Zellen exprimierten Calbindin (echt schwarz in den 4A, 4B und 4C), exprimierten aber nicht den neuronalen Marker NeuN. Interessanterweise exprimierten auch normale (nicht-β-Gal+) Purkinje-Zellen nicht NeuN. Viele β-Gal+-Purkinje-Zellen wurden auch co-markiert mit GAD-ir (echt schwarz 4D). GAD ist ein Marker für y-Aminobuttersäure (GABA), die üblicherweise in Purkinje-Zellen synthetisiert wird und in den tiefen cerebellaren Nuclei freigesetzt wird. GABA ist auch ein Neurotransmitter, der von lokalen Leitungsneuronen im cerebellaren Cortex verwendet wird. Die tiefen cerebellaren Nuclei enthalten auch β-Gal+-Zellen, von denen viele mit NeuN-ir co-markiert wurden (schwarz in 4F). Im Hippocampus wurde eine schwache β-Gal+-Färbung von Zellen bemerkt, aber diese Zellen schienen nicht NeuN-ir zu exprimieren.
Die β-Gal+-Zellen mit neuronalem Phänotyp im roten Nucleus wurden in mit MAP2 immunreaktiven Fasern vernetzt (3F). Es war mit dem Lichtmikroskop nicht möglich zu bestimmen, ob diese Fasern von β-Gal+-Zellen ausgingen oder zu ihnen hinführten. In ähnlicher Weise schienen die β-Gal+-Zellen in der Purkinje-Zellschicht des Cerebellum mit den MAP2-ir-Fasern vernetzt zu sein (4E), was den Eindruck erweckt, daß diese Zellen sich in den Neuronenkreis des Cerebellum integriert hatten. Das Fehlen der immuncytochemischen Färbung auf Fibronectin, einem Marker von Knochenmarkstromazellen innerhalb des Marks, zeigte den Verlust des nativen BMSC-Phänotyps in den Regionen der Stellen-spezifischen Differenzierung einen und drei Monate nach der Transplantation.
Die Gesamtzahl an β-Gal+-Zellen und der Anteil der β-Gal+-Zellen, der den neuronalen Marker NeuN exprimiert, wurde unter Verwendung von stereologischen Techniken bei drei getrennten Nuclei des Mittelhirns (roter Nucleus, oculomotorische Nuclei und die S. nigra) in 4 Tieren geschätzt. (vgl. Tabelle 1). Schätzungen von BMSC-abgeleiteten Neuronen wurden unter Verwendung des Optischen Dissektor-Verfahrens bei kryokonservierten Schnitten von 30 um vorgenommen. BMSC-abgeleitete (β-Gal+) Zellen wurden bei einer kleinen Zahl von Schnitten mit vorbestimmten einheitlichen Intervallen für den gesamten Satz an Schnitten, die den roten Nucleus, die S. nigra und den oculomotorischen Nucleus umfaßten, direkt gezählt. Innerhalb jedes zu zählenden Schnittes wurde das Sehfeld unter Verwendung eines 40× Objektivs oben auf den Schnitt fokussiert. Der Fokus wurde dann durch den Schnitt bewegt und die Zahl an BMSC-abgeleiteten neuronalen Profilen im Fokus oben (Höhe des Dissektors = 9,25 μm) wurde gezählt. Die Gesamtzahl an lacZ-Zellen und die insgesamt doppelt markierten Zellen (NeuN + lacZ) in jeder Region wurde unter Verwendung der Berechnung: N = N_v × V (ref) = ΣQ/(ΣP × v(dis) × V (ref) bestimmt; wobei ΣQ die Gesamtzahl an Neuronen ist, die in allen Dissektoren im Referenzvolumen gezählt wurde, und v(dis) das Volumen des Dissektors ist, das gleich ist dem Bereich des Testrahmens, multipliziert mit der Höhe des Dissektors (9,25 μm), was der Abstand zwischen den fokalen Ebenen ist.
Mit der Ausnahme der S. nigra und der ventral-tegmentalen Fläche (VTA) waren die Zahlen an β-Gal+-Zellen in allen Regionen symmetrisch verteilt, trotz eines unilateralen rechten nigralen Schadens und der gleichseitigen Transplantation in das Striatum. Die Gesamtzahl an β-Gal+-Zellen in der S. nigra und der VTA auf der rechten Seite war niedriger als auf der unbeschädigten linken Seite einen und drei Monate nach der Transplantation. Der Prozentsatz an β-Gal+-Zellen, die NeuN-ir co-exprimierten, reichte von 58,6% im oculomotorischen Nucleus bis 89% im roten Nucleus. Abschätzungen für β-Gal+-Zellen, die mit TH-ir in der S. nigra und der VTA co-markiert waren, wurden in nur einem Tier 3 Monate nach der Transplantation gemacht. Der Prozentsatz an β-Gal+-Zellen, die TH in der S. nigra co-exprimierten, war 12,9% auf der Seite der 6-OH DA-Schädigung und 69,7% auf der unbeschädigten Seite. Ein ähnliches Muster wurde in der VTA gesehen, wo der Prozentsatz an β-Gal+-Zellen, die mit TH co-markiert waren, auf der Seite der Schädigung 19,8% war und 50% auf der unbeschädigten Seite. Abschätzungen der Gesamtzahl an Zellen im Mittelhirn erhöhten sich leicht nach drei Monaten im Vergleich mit den Zellzahlen einen Monat nach der Transplantation. Die Summe aller β-Gal+-Zellen in den Mittelhirnregionen belief sich nach einem Monat auf durchschnittlich 15.067, was 18% der ursprünglich 80.000 in das Striatum transplantierten Zellen darstellt. Nach 3 Monaten belief sich die Summe aller β-Gal+-Zellen in den Mittelhirnregionen auf durchschnittlich 18.635 (23% der insgesamt transplantierten). Die leichte Erhöhung in der Zahl der β-Gal+-Zellen stellt wahrscheinlich nicht eine kontinuierliche Zellteilung dar, weil eine Immunreaktivität gegen das nukleäre Antigen einer proliferierenden Zelle (PCNA-ir) in denjenigen Bereichen nicht nachgewiesen wurde, wo die BMSC eine neuronale Morphologie angenommen hatten. Eine Analyse der beiden Tiere, die bilaterale Transplantationen erhalten hatten, zeigte ähnliche bilaterale Verteilungen und Differenzierungsmuster von BMSC zwei Monate nach der Transplantation. Bei diesen Tieren wurden jedoch keine stereologischen Abschätzungen vorgenommen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß unsere behandelten BMSC pluripotente Zellen enthalten, die in Neuronen differenzieren, wie angezeigt durch mehrere neuronale Marker, morphologische Charakteristika und Integration in spezifische architektonische Schichten oder Regionen. Wir stellten einen Stimulus bereit (Schädigung des nigro-stratialen Systems), mit dem wir versuchten die BMSC-Differenzierung zu induzieren. Die nigralen Schädigungen hatten jedoch einen negativen Einfluß auf das lokale Einwachsen an der Stelle der Implantation. Statt dessen wanderten die β-Gal+-BMSC intensiv und differenzierten in einer stellenabhängigen bilateralen symmetrischen Verteilung in allen Teilen des Gehirns, mit der Ausnahme der S. nigra und der VTA. An der Stelle der nigralen Schädigung von 6-OH DA waren weniger β-GaI+-BMSC und ein kleinerer Anteil von ihnen co-exprimierte TH im Vergleich mit der unbeschädigten Seite. Dies kann vom Alter der Schädigung beeinflußt sein (drei Wochen). Üblicherweise gibt es eine optimale Zeit für die Transplantation von Zellen in Modelle der Neurodegeneration und Hypoxia-Ischämie. Von anderen neuralen "Stamm-ähnlichen" Zellen, die in das Gehirn transplantiert wurden, wurde gezeigt, daß sie vorzugsweise an die Stelle der Ischämie in der geschädigten Hemisphäre eines hypoxischen-ischämischen Rattenmodells wandern, optimale Migration und optimales Einwachsen wurden aber erreicht, wenn die Zellen 3–7 Tage nach der Schädigung transplantiert wurden. E. Y. Snyder et al., ADVANCES IN NEUROLOGY BD. 72: NEURONAL REGENERATION, REORGANIZATION, AND REPAIR. (Hrsg. F. J. Seil) Lippincott Raven, Philadelphia, 1997.
Da es unwahrscheinlich ist, daß die Schädigung die stellenabhängige Differenzierung in Regionen beeinflußt, die entfernt liegen vom nigro-stratialen System, war die wahrscheinlichste Erklärung für den Neurotropismus oder die Affinität von BMSC für spezifische neuronale Populationen die Vorbehandlung von BMSC mit Retinsäure und BDNF vor der Transplantation. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, daß unbehandelte menschliche BMSC, die in normales Striatum der Ratte transplantiert wurden, sich nicht unterschiedlich verteilten oder durch die Stelle differenzierten, ungeachtet ihrer weit verteilten Migration. S. A. Azizi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 95: 3908–3913 (1998).
Wir wollen nicht durch eine Theorie gebunden sein, schlagen aber dennoch vor, daß die Vorbehandlung von BMSC mit Retinsäure und BDNF die Expression von Zelloberflächenproteinen oder Rezeptoren mit einer Affinität für die entsprechenden trophischen Faktoren, Cytokine oder Zelladhäsionsmoleküle induziert, die normalerweise von spezifischen neuronalen Populationen produziert werden. Dies scheint ein nützliches Modell für die Untersuchung des Mechanismus für die Affinität von BMSC für spezifische Hirnregionen zu sein. Diese Affinität von vorbehandelten BMSC für spezifische Hirnregionen wird die zielgerichtete Lenkung von neuronalen Populationen für zelluläre Therapien erlauben, die von Gentherapeutika bis zu neuraler Wiederherstellung bei neurodegenerativen Erkrankungen, Schlaganfall und Trauma reichen.
Um sicherzugehen, daß die β-Gal+-Zellen tatsächlich von BMSC abgeleitet sind, wurden unter Verwendung von BMSC, die mit anderen Markern markiert waren, zwei andere Experimente durchgeführt (Beispiele 7 und 8 nachstehend). Dies war notwendig, weil einige Populationen von normalen, nicht transplantierten Rattenneuronen eine endogene β-Galactosidase-Aktivität exprimieren. Mit der Anwesenheit von mehreren anderen Markern von Maus-BMSC bestimmten wir, daß die β-Gal+-Zellen in der Tat von Mäusen abgeleitet waren und keine endogenen Rattenneuronen waren.
Beispiel 4. Ataxia-Behandlung
"Wobbler"-Mäuse (JAX labs) exprimieren eine Mutation, bei der die Purkinje-Zellen des Cerebellum im Alter von 3 bis 4 Wochen rasch degenerieren. Der Verlust an Purkinje-Zellen scheint die vorherrschende Auswirkung der Mutation zu sein, und es degenerieren keine anderen Neuronen als die mitralen Zellen des Riechkolbens und wenige Thalamus-Neuronen. Der Verlust der Purkinje-Zellen korreliert mit dem Beginn eines ataxischen wackeligen Schritts, der das Leben über anhält, der aber die Gesundheit der Tiere nicht auf andere Weise beeinflußt.
Vorkonditionierte BMSC (wie vorstehend beschrieben) werden in das Gehirn dieser Tiere im Alter von 6 Wochen transplantiert. Für jedes Experiment werden insgesamt 12 mutierte Tiere und 12 normale Tiere untersucht. Die Hälfte der Tiere empfängt vorkonditionierte BMSC von lacZ-Mäusen und die Hälfte erhält eine Scheinoperation. Obwohl das Ziel der Ersatz der cerebellaren Purkinje-Zellen ist, wird das Transplantat im Striatum planiert, da wir zeigten (Beispiel 3), daß das Cerebellum eine bevorzugte Region für die Migration und stellenspezifische Differenzierung in Purkinje-ähnliche Neuronen zu sein scheint. Alternative Transplantationstellen sind die Injektion in den lateralen Ventrikel und direkt in das Cerebellum, sorgfältig, um traumatische Ataxia zu vermeiden.
Um zu bestimmen, ob die Transplantationen in einer funktionellen Verbesserung des neurologischen Defizits resultierten, wird die Grundlinie von spontanen Schritten vor der Operation durch Aufzeichnung der Abdrücke einer mit Tinte versehenen Pfote quantifiziert, die auf einem schmalen, 36 Inch langen Papierstreifen auf dem Boden eines geschlossenen Laufwegs (36'' lang, 3'' breit und 6'' hoch) zurückblieben. Außerdem wurde die Leistung auf einem Balancebalken gemessen (die Fähigkeit und die erforderliche Zeit zur Überquerung eines Stabs, der zwischen zwei Plattformen verläuft). Die Messungen der Fortbewegung und Koordination werden sowohl bei den mutierten Mäusen als auch bei der Kontrollgruppe von normalen Mäusen mit demselben genetischen Hintergrund zu den folgenden Zeitpunkten vorgenommen: 1 Woche vor der Operation und 1 Woche, 1 Monat, 2 Monate und 3 Monate nach der Operation.
Zu einem Zeitpunkt, bei dem es eine signifikante Verbesserung bei Fortbewegung und Koordination gibt, werden die Tiere getötet und die Gehirne werden auf die Verteilung und das Maß an Differenzierung der transplantierten BMSC untersucht. Der BMSC-Ursprung der Zellen wird durch β-Gal+-Färbung bestimmt. Der Marker für die Purkinje-Zellen ist die Calbindin-Immunreaktivität. Der Anteil der β-Gal+-Zellen, die mit Calbindin co-markiert sind, wird unter Verwendung der stereologischen Technik bestimmt.
Beispiel 5. Differenzierung von Menschlichen Knochenmarkzellen (BMSC) In Vitro.
Kurz zusammengefaßt wurden BMSC aus Gesamtknochenmark der Maus, des Kalbs und des Menschen gewonnen. BMSC-Kulturen wurden mit a) epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), b) Retinsäure (RA), c) neuronalem N5-Medium und d) vom Gehirn abgeleitetem neurotrophem Faktor (BDNF) plus RA inkubiert.
BMSC wurden von verbliebenem Knochenmarkmaterial isoliert (Knochenstücke mit anhängendem stromalen Zellen, Fettgewebe und Splittern), das auf dem Nylonmaschenfilter zurückblieb, das routinemäßig bei der Filtration von frisch gewonnenem menschlichem Mark verwendet wird, das für die Knochenmarktransplantation verwendet werden soll. Das Filtrat enthält den größten Teil der hämatopoietischen Elemente des Knochenmarks, der dann für den Ersatz von menschlichem Knochenmark verarbeitet wird. Wir verwenden die Filter, die üblicherweise verworfen werden. Die Filter wurden fünfmal mit PBS gewaschen. Die PBS-Lösung wurde zentrifugiert, um die schwereren Knochenstücke abzulagern. Der Überstand wurde in Zellkulturmedium resuspendiert und in Gewebekulturkolben ausplattiert (wie in Beispiel 1). Die BMSC wurden durch ihre Adhärenz an die Plastikkulturkolben abgetrennt, während die kleineren hämatopoietischen Stammzellen in dem Medium suspendiert blieben und entfernt wurden, wenn das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt wurde. Die menschliche Knochenmarksfraktion zum Ausplattieren wurde mit Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM, GIBCO/BRL) und 10% FBS 1:1 verdünnt und 30 Minbei 1.000 × g über einen Dichtegradienten (Ficoll-Paque Plus, 1,077 g/ml, Pharmacia) zentrifugiert. Der Überstand und die Zwischenschicht wurden vereint, mit MEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) auf etwa 20 ml verdünnt und in mit Polyethylenimin beschichteten Plastikkolben ausplattiert.
Knochenmark der Maus wurde in 10 ml PBS und 5% BSA gebracht. Die Zellen wurden in diesem Medium gewaschen, und zentrifugiert (5 Minbei 2000 U/Min.) Die Zellen wurden in Wachstumsmedium resuspendiert, das aus DMEM bestand, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 0,001% β-Mercaptoethanol, nicht essentiellen Aminosäuren und 10% Pferdeserum. Die Zellen wurden in den Kolben 2 Tage inkubiert und die nicht adhärenten Zellen wurden durch Ersatz des Mediums entfernt. Nachdem die Kulturen Konfluenz erreichten wurden die Zellen durch 3–4 Minuten Inkubation mit Trypsin (0,25%) und 1 mM EDTA bei 37°C abgelöst. Sie wurden für eine spätere Verwendung eingefroren oder nach 1:2- oder 1:3-Verdünnung unter Zugabe von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 10 ng/ml, oder von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF), 5 ng/ml, wieder ausplattiert. Diese Prozedur wurde für 3–5 Passagen wiederholt.
Menschlichen Gesamtknochenmarkzellen wurde erlaubt, 2 Tage an den Kulturkolbenboden zu adhärieren, und nach der Entfernung von den Kolben wurden sie in einem Medium ausplattiert, das das Mitogen epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) enthielt. Dies resultierte in einer Proliferation der Zellen, ohne die Differenzierung signifikant zu induzieren, Die Zellen wurden dann von dem Kolbenboden entfernt und in Kulturgefäßen von 35 mm in der Gegenwart von neuronalem Wachstumsmedium (N5) ausplattiert, das ergänzt war mit fötalem Kälberserum (FCS), 10% Retinsäure (RA) und einem von mehreren Wachstumsfaktoren (BDNF, GDNF oder NGF) (oder eingefroren für eine spätere Verwendung). Die üblichen Markstromazellen waren reich an Fibronectin (weiß in 5A). Nach 7 bis 14 Tagen entwickelte ein kleiner Anteil (< 2%) der menschlichen BMSC einen deutlich Neuronen-ähnlichen Phänotyp und deutlich Neuronen-ähnliche Marker. Die immuncytochemische Analyse der Kulturen offenbarte die Anwesenheit von Nestin-ir-Zellen (5B), NeuN-ir-Zellen (5C) und GFAP-ir-Zellen (5D). BMSC, die mit RA und BDNF inkubiert wurden, resultierten in der Expression des neuronalen Markers NeuN, während die Menge an exprimiertem Fibronectin im Vergleich mit den Kulturen, die mit EGF allein konditioniert waren, abnahm.
Nach 7 Tagen wurde die Expression der neuronalen Marker (Nestin, Neuronen-Spezifisches Nukleäres Protein oder neuN und GFAP) und ein Marker für Knochenmarkstromazellen (Fibronectin) mittels Western Blot-Analyse und immuncytochemie analysiert (6). Für die Western Blot-Analyse wurden die Kulturen dreimal in kaltem PBS gewaschen, in eiskaltes PBS geschabt und in einem eiskalten Lysierungspuffer lysiert, der 20 nM Tris/HCI (pH-Wert = 8,0), 0,2 mM EDTA, 3% Nonidet P-40, 2 mM Orthovanadat, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrophosphat, 100 mM NaCl und jeweils 10 μg Aprotinin und Leupeptin pro ml enthielt. Nach 10 Minlnkubation auf Eis wurden die Proben 15 Minbei 14.000 × g zentrifugiert und die Überstände gewonnen. Ein Teilvolumen wurde für die Gesamtproteinbestimmung (Bio-Rad-Test) entnommen. Ein Teilvolumen, das 30 μg Gesamtprotein von jeder Probe entsprach, wurde mittels SDA/PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und mittels Elektrophorese auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die unspezifischen Bindung von Antikörper wurde durch 2 Std. Inkubation mit 3%-igem BSA blockiert. Das Immunblot-Verfahren wurde mit anti-trk A-Rezeptor des Kaninchens (oder dem entsprechenden Antikörper für den Wachstumsfaktorrezeptor von Interesse) durchgeführt, gefolgt von mit Peroxidase konjugierten sekundären anti-Immunglobulin-Antikörpern, und die Blots wurden mit dem Verfahren der verstärkten Chemielumineszenz (ECL, Amersham) entwickelt. Die Western-Blots der Zellkulturlysate (6) ergaben vorläufige Hinweise, daß BDNF + RA + N5 (Säule 4) bei menschlichen BMSC in der höchsten Expression an Nestin-ir und NeuN-ir resultierten.
Darüber hinaus wurden Zellen, die wie oben von dem Kolbenboden entfernt wurden (BMSC) oder mittels magnetischer Zellsortierung abgetrennt wurden, in der Gegenwart von neuronalem Wachstumsmedium (N5) in Kulturschalen von 35mm erneut ausplattiert, das mit 5% Pferdeserum, 1% FBS, Transferrin (100 μg/ml), Putrescin (60 μM), Insulin (25 μg/ml), Progesteron (0,02 μM), Selen (0,03 μM), 9-cis-Retinsäure oder all-trans-Retinsäure (RA) (0,5 μM) und irgendeinem von mehreren neuronalen Wachstumsfaktoren mit einer Konzentration von 1–10 ng/ml (vom Gehirn abgeleiteter Wachstumsfaktor-BDNF, von Gliazellen abgeleiteter neurotropher Faktor-GDNF und Nervenwachstumsfaktor (NGF) ergänzt war. Nach 7 bis 14 Tagen hatten einige der BMSC die Morphologie geändert und sich zu den Phänotypen von Neuronen, Gliazellen und Fibroblasten entwickelt.
Beispiel 6. Effekte der gemeinsamen Kultur von menschlichen BMSC mit fötalen striatalen Kulturen der Ratte
BMSC der Maus, konditioniert mit RA und BDNF, wurden mit primären neuronalen mesencephalischen Zellen co-kultiviert, die von fötalen E15-Ratten gewonnen wurden. Menschliche BMSC wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren etabliert. Die Zellen wurden mit einer Konzentration von 10 μM fluoreszenzgrünem "Cell Tracker" (5-Chlormethylfluoresceindiacetat, Molecular Probes, Inc.) markiert und auf einem Zellbett von fötalen striatalen Zellen der Ratte ausplattiert, das drei Tage zuvor hergestellt worden war. Die Kulturen wurden mit RA (0,5 μM) + BDNF (10 ng/ml) in N5-Medium gefüttert. Nach 10 Tagen Kultur wurden die Zellen unter Verwendung von primären Antikörpern gegen NeuN, GFAP, Nestin und Fibronectin für die Immuncytofluoreszenz verarbeitet, gefolgt von einem sekundären Antikörper, der mit Texas-Rot fluoreszenzmarkiert war. Dies erlaubte eine zweifache Markierung von Zellen, um zu bestimmen, ob eine Zelle, die spezifische Marker für Neuronen, Gliazellen oder Neuroectoderm zeigte, auch einen Knochenmarkursprung hatte. Vgl. die 7A–7F. Die 7A zeigt Zellen, die für den neuronalen Marker (NeuN) immunreaktiv sind. Die 7B zeigt den Gliazellmarker (GFAP). Die 7C und 7D zeigen die entsprechende Fläche mit weiß markierten Zellen (mit Cell Tracker markierte BMSC). Die 7E und 7F zeigt Zellen, die doppelt markiert waren. Interessanterweise waren zwei dieser NeuN-ir-Zellen von BMSC-Ursprung und eine der GFAP-ir-Zellen war von BMSC-Ursprung. Diese Ergebnisse stellten einen zusätzlichen Beweis bereit, daß BMSC, die von Mensch oder Maus abstammten, in der Lage waren, in Zellen des neuralen Phänotyps zu differenzieren.
LacZ-markierte BMSC, die mit primären mesencephalischen Kulturen der Ratte co-kultiviert wurden, differenzierten in Neuronen-ähnliche Zellen, die mit NeuN-ir und β-Gal co-markiert waren.
Beispiel 7. In Vivo
lacZ-BMSC von Mäusen wurden in denervierten Corpus striatum von Ratten, die zuvor mit 6-OH-Dopamin geschädigt worden waren, und in nicht geschädigte Ratten transplantiert. Einen und drei Monate später wurden die Ratten getötet und die Gehirne wurden für die Histochemie und Immuncytochemie verarbeitet. BMSC-abgeleitete Zellen wurden durch die β-Gal+-Anfärbung oder durch anti-Maus-Antikörper, die gegen das wichtige Histokompatibilitäts-Antigen Typ 1 der Maus gerichtet waren, sichtbar gemacht. Die Expression von neuronalen Markern in BMSC-abgeleiteten Zellen wurde durch ihre Immunreaktivität mit Antikörpern gegen das Neuronen-spezifische nukleäre Antigen (NeuN-ir), Tyrosinhydroxylase (TH), das Mikrotubuli-assoziierte Protein (MAP2), Neurofilament (NF) und Calbindin (CB) bestimmt.
BMSC-abgeleitete Zellen, die in das Striatum transplantiert wurden, blieben nicht im Striatum lokalisiert, wohin sie transplantiert worden waren, sondern wurden im Mittelhirn, Thalamus und selten im Cerebellum gefunden, wenn sie mit dem anti-Maus-Antikörper identifiziert wurden. Einige dieser Maus-BMSC co-exprimierten NeuN-ir oder TH-ir. Transplantierte und Kontrollratten (nicht transplantiert) zeigten β-Gal+-Zellen in ähnlichen und unterschiedlichen Verteilungen. β-Gal+-Zellen wurden im Riechkolben, dem supraoptischen und paraventrikulären Hypothalamus, dem roten Nucleus, dem dritten Nerv-Nucleus, der S. nigra gefunden und waren im Cerebellum in einem Muster ähnlich dem von Purkinje-Zellen in nicht transplantierten Ratten verteilt.
BMSC, konditioniert mit RA und BDNF, exprimierten neuronale Marken und verminderten die Expression von stromalen und fibroblastischen Markern. Wenn konditionierte lacZ-BMSC mit primären mesencephalischen Neuronen co-kultiviert wurden, co-exprimierten viele BMSC-abgeleitete Zellen NeuN-ir und β-Gal. Wenn sie in denerviertes Striatum transplantiert wurden, exprimierten konditionierte BMSC mehrere neuronale Marker und wanderten von der Stelle der Transplantation zu beiden Seiten des Thalamus und in kleinerem Maß zum Hippocampus und zu der nicht beschädigten S. nigra. Die positive Anfärbung für die β-Gal-Aktivität in Ratten ohne Transplantation ergab einen Artefakt, den man leicht fälschlicherweise für β-Gal-BMSC halten könnte. Ein zweiter Marker für BMSC bestätigte jedoch, daß diese Zellen wanderten und zu Neuronen-ähnlichen Zellen differenzierten.
Beispiel 8. In vivo-Ergebnisse, die unter Verwendung eines dritten Markers für BMSC zeigen, daß BMSC in neurale Zellen differenzieren (Neuronen oder Gliazellen)
Die vorstehenden Beispiele verwendeten β-GaI+-BMSC von Mäusen und für Mäuse spezifische Antikörper. Bei diesem Experiment wurden BMSC der Maus mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff PKH26 (Sigma, Inc.) oder Cell Tracker Orange (Molecular Probes, Inc.) vor der Transplantation in denerviertes Striatum, wie vorstehend beschrieben, vormarkiert. Zwei Wochen nach der Transplantation waren die fluoreszierenden BMSC von der Stelle der Transplantation weggewandert (einige zum cerebralen Cortex auf der contralateralen Seite). Nach nur zwei Wochen hatte ein kleiner Anteil der transplantierten Zellen angefangen, neurale Marker wie NeuN-ir und GFAP-ir zu exprimieren (8 und 9). BMSC der Maus, die mit rotem PKH26 markiert waren, exprimieren auch den neuronalen Marker NeuN (weiß in 8). Zusätzlich ist die Morphologie der doppelt markierten Zellen diejenige von Neuronen. Mit einem confocalen Rastermikroskop Zeiss LSM510 wurde ein Bild produziert. In 9 ist eine doppelt markierte Gliazelle mit der roten Fluoreszenzmarkierung (grau), was sie als eine BMSC-abgeleitete Zelle identifiziert, und die grüne Fluoreszenz (weiß) ist auf GFAP-ir zurückzuführen. Man beachte, daß die Morphologie die einer Gliazelle ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Überprüfung von Gehirngewebeschnitten bei den vorstehenden Experimenten offenbarte regenerierende BMSC-abgeleitete β-Gal+-Zellen in mehreren Hirnregionen, die entfernt sind von der Implantationsstelle im Corpus striatum. Die Migration der behandelten BMSCs umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf, die folgenden Hirnregionen: mitrale Zellzone des Riechkolbens, paraventrikuläre und supraoptische Nuclei von Hypothalamus, Hippocampus, Habenula, oculomotorischer Nucleus, roter Nucleus, S. nigra, Abducens, faciale und hyoglossale Schädelnerv-Nuclei, die untere Olive der Medulla, das ventrale Horn des Rückenmarks und die cerebellare Purkinje Zellschicht. Die BMSC-β-Gal+-Zellen nahmen vielerlei Phänotypen an, einschließlich Epithel-ähnliche cuboidale Zellen im choroiden Plexus; kleine Oligodendroglia-ähnliche Zellen im optischen Chiasma und der sub-corticalen Substantia alba; große Neuronen-ähnliche Zellen im roten Nucleus, der S. nigra und den Motor-Nuclei des Hirnstamms. Dieses neue Verfahren für die neurale Transplantation ist ein wissenschaftlich durchführbarer und klinisch vielversprechender Weg für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Schlaganfall ebenso wie für die Reparatur von traumatischen Verletzungen des Gehirns und Rückenmarks.
Es gibt zahlreiche Verwendungen von BMSC in universitären und pharmazeutischen Forschungslabors. Menschliche BMSC, die im Rattenmodell zum Cerebellum wandern und die Charakteristika von Purkinje-Zellen annehmen, können verwendet werden, um die Wirkungen (sowohl therapeutische als auch toxische) von Wirkstoffen auf menschliche cerebellare Zellen zu testen. In ähnlicher Weise können menschliche BMSC, implantiert in andere Bereiche des Gehirns, die die Charakteristika dieser Zellen annehmen, für die Testung der Toxizität von Wirkstoffen und der therapeutischen Wirksamkeit bei einer Vielzahl von Störungen verwendet werden. Vor der Implantation können die Zellen gentechnisch verändert werden, damit sie Gene tragen, die bei verschiedenen Störungen des Gehirns und Nervensystems eine Rolle spielen.
Eine mögliche Anwendung der migratorischen und regenerativen Natur der BMSCs ist die Behandlung der Parkinson-Krankheit. Die vorbehandelten BMSCs können fötale Neuronen ersetzen, die bei dieser Krankheit für die Transplantation verwendet wurden. Von den BMSCs, die mit Retinsäure und BCNF behandelt wurden, wurde gezeigt, daß sie zur Substantia nigra wandern, wo ein Defizit an dopaminergen Neuronen PD verursacht. Die Verabreichung von BMSCs in die Substantia nigra könnte nigrale Neuronen regenerieren und den Fluß an Dopamin zu dieser Region wiederherstellen.
Die Regeneration der cerebellaren Purkinje-Zellschicht kann helfen, um die koordinierte Bewegung des Patienten zu verbessern. Die Wiederherstellung des Cerebellum wäre bei cerebellaren Tumoren von Nutzen, typischerweise einem Medulloblastom, das in der Kindheit auftritt. Bei Erwachsenen kann ein ähnliches Syndrom bei chronischem Alkoholismus beobachtet werden, der eine Degeneration des Kleinhirnwurms verursacht. Der Patient hat einen unsteten, schwankenden ataxischen Gang; er oder sie geht auf einer breiten Basis und schwankt hin und her. Barr, M. L. und Kiernan, J. A. THE HUMAN NERVOUS SYSTEM, AN ANATOMICAL VIEWPOINT, 6te Ausg., J. B. Lippincott Company, Philadelphia (1993).
Eine andere Verwendung für die Migration und Regeneration von BMSCs ist in der mitralen Zone des Riechkolbens. Impulse vom Riechkolben werden übermittelt zu den olfaktorischen Bereichen für die subjektive Wahrnehmung von Gerüchen und Aromen. Barr, M. L. und Kiernan (ibid.). Die Migration und Regeneration von BMSCs zu diesen Hirnregionen könnte den Verlust an Geschmack durch toxische Chemikalien, Alter und Verletzung behandeln.
Die Verabreichung von BMSCs kann bei der Regeneration der Nuclei des facialen und hyoglossalen Schädelnervs und der Wiederherstellung der Beweglichkeit von Gesichtsmuskeln nach einem Schlaganfall oder einer anderen Verletzung verwendet werden.
Die Verabreichung von BMSCs könnte bei der Regeneration des ventralen Horns des Rückenmarks und bei der Wiederherstellung von motorischen Fertigkeiten helfen, die bei einem Trauma des Rückgrats verloren ging.
Die Verabreichung von BMSCs könnte bei der Regeneration einer verletzten hippocampalen Region helfen.

Claims

Verfahren zur Erzeugung von Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus Knochenmarkszellen, umfasend die Schritte (a) Bereitstellen von Knochenmarkszellen; (b) Auswahl einer Vielzahl von Knochenmarkstromazellen aus dem Knochenmark; (c) Inkubieren der Stromazellen in einem Wachstumsmedium mit einem Mitogen, ausgewählt aus EGF, PDGF oder einer Kombination daraus; und (d) Inkubieren der Zellen aus Schritt (c) in einem neuronalen Wachstumsmedium, welches wenigstens eine Retinolsäure und wenigstens einen differenzierenden Wirkstoff, ausgewählt aus BDNF, GDNF oder NGF, einschließt, wodurch Zellen mit einem neuronalen Phänotyp erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) zusätzlich das Aussortieren von hämatopoietischen Stammzellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Schritt (b) zusätzlich die Platzierung der Knochenmarkszellen und eines geeigneten Nährmediums in einer Plastik-Kulturschale umfasst, wobei die Knochenmarkstromazellen an das Plastik binden können, und Entfernen der anderen Zellen durch den Austausch des Mediums.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zusätzlich zu dem differenzierenden Wirkstoff fötale neuronale Zellen zugesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Retinolsäure 9-cis-Retinolsäure, all-trans-Retinolsäure oder eine Kombination daraus ist.