DE69232662T2

DE69232662T2 - Verfahren zur wirkungsverstärkung von mitteln der ersten wahl bei der behandlung mehrfachresistenter zellen

Info

Publication number: DE69232662T2
Application number: DE69232662T
Authority: DE
Inventors: Knox Van Dyke
Original assignee: CBA International Inc
Current assignee: CBA International Inc
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-15
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2012-04-16
Also published as: AU673142B2; EP0580790A1; DE69232662D1; EP0580790A4; WO1992018131A1; AU2175292A; EP0580790B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen bei der Herstellung eines Mittels für die Behandlung in vivo von Krebszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe.
Eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe ist ein Phänomen, das bei Krebs und einer Anzahl parasitäter Krankheiten, wie Malaria, Tuberkulose, Befall mit Ruhramöben (Amöbendysentrie), Trypanosoma (Afrikanische Schlafkrankheit), Leishmanie und AIDS-Pneumonie, beobachtet wurde.
Eine Anzahl diverser Arzneistoffe haben sich als wirksam gegen solche Krankheiten erwiesen. Jedoch stellt sich in vielen Fällen nach dem anfänglichen Erfolg der Ärzte bei der Behandlung der Krankheit der vollständige Mißerfolg ein. Arzneistoffe, die anfänglich wirkten, werden nach einer Zeitspanne vollständig unwirksam. Auf eine anfängliche Periode der vorübergehenden Besserung folgt oft eine Periode der Fehlschläge, während der nichts gegen die Krankheit wirksam zu sein scheint. Der Tod wird unausweichlich.
Solch eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bei Krebszellen wird mit einer Zunahme der Gegenwart von Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht von 150.000 bis 170.000 in der Arzneistoff-resistenten Zelle in Verbindung gebracht. Solche P150-170-kD-Glykoproteine wirken als eine Pumpe zum Ausschleusen von Arzneistoffen, um die die Krankheit bekämpfenden Arzneistoffe aus den infizierten oder infizierenden Zellen, die die Arzneistoffe abtöten sollen, herauszupumpen. Dieses Phänomen der Glykoprotein-Pumpe bei Krebszellen wurde in einem Artikel von Kartner und Ling in der Märzausgabe 1989 der Scientific American berichtet. (Es versteht sich, dass diese Veröffentlichung bezüglich des Gegenstands der Erfindung, welcher in den zugrunde liegenden älteren Anmeldungen enthalten ist, nicht zum Stand der Technik gehört.) Die Anwesenheit einer sehr ähnlichen Glykoprotein-Pumpe bei Arzneistoff-resistenten Malariaerregern wurde auch von dem Erfinder fertiggestellt.
Es wurde von Rothenberg und Ling berichtet, dass eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bei Krebs durch Verwendung von hydrophoben Molekülen mit zwei planaren aromatischen Ringen und einem tertiären basischen Stickstoffatom mit einer positiven Ladung bei einem physiologischen pH umgekehrt werden kann. Journal of the National Cancer Institute, Bd. 81, Nr. 12, 21. Juni 1989, auf Seite 907. (Es versteht sich, dass diese Veröffentlichung bezüglich des Gegenstands der Erfindung, welcher in den zugrunde liegenden älteren Anmeldungen enthalten ist, nicht zum Stand der Technik gehört). Eine repräsentative Verbindung dieser Klasse und tatsächlich offensichtlich ein Mitglied dieser Klasse, das tatsächlich Gegenstand intensiver experimenteller Arbeit war, ist der Arzneistoff Verapamil, dessen strukturelle Formel nachfolgend dargestellt ist:
Verapamil ist ein Blocker des Calciumkanals. Andere Forscher haben behauptet, dass Blocker von Calciumkanälen gegen Malaria wirksam sind. Während jedoch solche Ergebnisse in vitro erbringbar sind, erwiesen sie sich als von geringem praktischen Nutzen als klinische Behandlungen in vivo. Während die Blocker der Calciumkanäle bei der Behandlung einer Hypertonie bei moderaten Spiegeln therapeutisch wirksam sind, sind sie bei Spiegeln, die hoch genug sind, um eine Umkehr der Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe (MDR) zu bewirken, toxisch.
Eine andere Technik zur Umkehr einer MDR bei Krebs, welche im Labor von Interesse ist jedoch keine praktische Verwendbarkeit aufweist, beinhaltet die Induktion von Punktmutationen der Energiebezogenen ATP-Bindungsstellen in dem Glykoprotein. Solche Punktmutationen führen gemäß Rothenberg und Ling, a.a.O., zu einem fast vollständigen Verlust der MDR-Aktivität. Gleichwohl solche Arbeiten in vitro wichtig sind, fehlt ihnen die klinische Anwendbarkeit in vivo.
Shiraishi et al. offenbaren eine Arbeit in vitro über die Verwendung von Cepharanthin zur Behandlung einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bei Krebserkrankungen. Von Isotetrandrin, Tetrandrin, Fangchinolin und Berbamin wurde behauptet, dass sie ähnliche Wirkungen bei Krebserkrankungen zeigen. Antitumorwirkungen von Tetrandrin wurden auch erwähnt. Chamber, T. et al., J. Biol. Chem. 265: 7679 (1990) offenbaren, dass Tetrandrin Eigenschaften einer Umkehr einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe aufweist, falls es in vitro an die KB-V1-Zelllinie verabreicht wird.
Bisher wurde das Phänomen der Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bei solchen erkrankten Zellen mit der Anwesenheit von natürlich vorkommenden P150-170-kD-Glykoproteinen in den erkrankten Zellen in Verbindung gebracht. Es wird angenommen, dass, falls die Krankheitskolonie einer Behandlung ausgesetzt wird, die Zellen mit dem Glykoprotein oder mit einem erhöhten Anteil davon die anfängliche Behandlung überleben, wohingegen die Zellen ohne das Glykoprotein oder mit einer niedrigeren Konzentration davon dies nicht tun. Der überlebende Rest reproduziert sich dann und erzeugt unter Umständen eine Kolonie, die gegenüber einer Behandlung mit irgendeinem Arzneistoff im Wesentlichen, wenn nicht sogar vollständig, resistent ist.
Eine kürzlich erschienene Publikation in den Proceedings of the National Academy of Science legt dar, dass eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe auch durch eine virale Infektion erzeugt werden kann. "A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ira Pastan et al., Bd. 85, Seiten 4486-4490, Juni 1988, Medical Sciences. Die Verfasser insertierten eine cDNA voller Länge des menschlichen Gens für eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe (MDR1) in einen retroviralen Vektor. Sie waren imstande, Zellen mit diesem Virus zu infizieren, so dass die Zelle P-Glykoprotein exprimierte und der Zelle eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe verliehen wurde.
Diese experimentelle Arbeit hebt die Erwartungen an die Möglichkeit der durch eine Infektion erworbenen Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe aufgrund einer versehentlichen Freisetzung solcher hergestellten Retroviren. Was vielleicht wichtiger ist, ist, dass sie das mögliche natürliche Vorkommen eines solch eine cDNA tragenden Retroviruses nahelegt.
Die Implikationen dieser Möglichkeiten sind, dass die Krankheiten, welche normalerweise mit Arzneistoffen anfänglich behandelbar sind, einschließlich Krebserkrankungen, aufgrund einer Infektion mit einem Virus, das solch eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe trägt, ab initio unbehandelbar werden könnten. Solche Viren könnten über natürliche oder künstliche Wege Körperzellen infizieren, die später krebsartig werden könnten, oder sie könnten die Zellen von parasitären Krankheiten, wie Malaria, Tuberkulose, AIDS-Pneumonie, der Afrikanischen Schlafkrankheit und anderer solcher Krankheiten, infizieren. Die Anwesenheit von ziemlich großen Kolonien solcher Krankheitszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe würde die Krankheiten und Krebserkrankungen besonders aggressiv, virulent und höchstwahrscheinlich verwirrend für einen nichtsahnenden Arzt machen.
Forscher auf der ganzen Welt suchen weiter mit Hochdruck nach Techniken zur Umkehr einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe. Eine erfolgreiche klinische Technik zur Umkehr der Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe wird einer der wichtigsten Durchbrüche bei der Bekämpfung von Krebs, Malaria, Tuberkulose und anderen Krankheiten, die das Phänomen einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe zeigen, sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Bei der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass Tetrandrin und gewisse seiner Derivate nicht nur eine Umkehr der Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bewirken, sondern auch die Wirksamkeit eines primären Arzneistoffs gegen eine Arzneistoffresistente Zelle potenzieren. Diese Verbindungen scheinen die Glykoprotein-Pumpe einer Zelle mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe umzukehren oder zu inhibieren, so dass eine resistente Zelle tatsächlich eine höhere Konzentration eines Arzneistoffs als eine sogenannte Arzneistoff-resistente Zelle akzeptiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I
wobei R&sub1; und R&sub1;' gleich oder verschieden sind und für H, CH&sub3; oder CO&sub2;CH&sub3; stehen;
R&sub2; für CH&sub3; steht;
R&sub3; für CH&sub3; oder Wasserstoff steht;
die isomere Konfiguration an der Stelle des chiralen Kohlenstoffatoms C-1' "S" ist; und mindestens einer von R&sub2; und R&sub3; CH&sub3; umfasst;
bei der Herstellung eines Mittels für die Behandlung in vivo von Krebszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe, vorgesehen.
Die Familie der Tetrandrinverbindungen als eine Gesamtheit schließt Tetrandrin, Isotetrandrin, Hernandezin, Berbamin, Pycnamin, Phaeanthin, Obamegin und Fangchinolin ein, wobei diese Liste nicht als erschöpfend anzusehen ist. Bei all diesen Beispielen besteht R&sub1; und R&sub1;' aus einer Methylgruppe. Eine Variation innerhalb der Gruppe tritt dergestalt auf, dass R&sub2; und R&sub3; aus entweder einer Methylgruppe oder aus Wasserstoff bestehen können, und die isomere Konfiguration der Verbindungen an der Stelle des chiralen Kohlenstoffs C-1 ist entweder R (rectus) oder S (sinister). Die Regeln für die R- und S-Konfiguration sind in Morrison und Boyd, "Organic Chemistry", 4. Aufl., Copyright 1983 von Allyn und Bacon, auf den Seiten 138-141 zu finden. Zusätzlich enthält Hernandezin eine Methoxygruppe an der C-5-Position, eine Substitution, die nicht signifikant für die Verwendbarkeit der Verbindungen in der vorliegenden Erfindung zu sein scheint. Die spezifische Art und Weise, mit der diese beispielhaften Familienmitglieder variieren, ist nachfolgend in der Tabelle VII aufgelistet, wobei diese Familienmitglieder mit zwei Nicht-Familienmitgliedern auf eine Wirkung gegen Arzneistoff-sensible und Arzneistoff-resistente Stämme von P. falciparum malaria verglichen werden.
Nicht alle Mitglieder der Familie der Tetrandrinverbindungen bewirken eine Steigerung oder Potenzierung der Wirkung eines primären Arzneistoffs gegen eine Zelle mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe. Nur diejenigen Mitglieder der Familie mit der zuvor umrissenen spezifischen Konfiguration sind auf diese Art und Weise einsetzbar. Von den acht repräsentativen Mitgliedern der obigen Familie bewirken nur Tetrandrin, Isotetrandrin, Hernandezin und Berbamin eine Potenzierung des primären Arzneistoffs gegen Zellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe.
Diese Verbindungen bewirken tatsächlich eine Steigerung der Sensibilität für die inhibierende Wirkung eines Arzneistoffs bei einer Arzneistoff-resistenten Zelle im Vergleich zu einer sogenannten Arzneistoff-sensiblen Zelle. Gegenwärtig ist die einzige logische Erklärung dieses Ergebnisses, dass die Verbindungen tatsächlich die Glykoprotein-Pumpen, die in größerer Anzahl bei den Arzneistoff-resistenten Zellen gefunden werden, umkehren. Eine andere Erklärung ist, dass die Zellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe tatsächlich sensibler auf den primären toxischen Arzneistoff als die Arzneistoff-sensiblen Zellen sind, jedoch kann dies nicht bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Pumpe zum Ausschleußen inhibiert ist, beobachtet werden. Somit arbeitet der Glykoprotein-Pumpenmechanismus, welcher ursprünglich der Zelle eine Mehrfachresistenz gegen die Inhibierung durch Arzneistoffe verliehen hatte, tatsächlich gegen die Zelle unter Bewirkung einer größeren Sensibilität der Zelle gegen eine Inhibierung durch Arzneistoffe.
Eine spezifische Dosis in vivo für jede der verschiedenen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen wurde nicht ermittelt. Jedoch können solche Dosen durch routinemäßiges klinisches Austesten bestimmt werden, indem die Konzentrationen, bei denen die verschiedenen Verbindungen eine 50%ige Inhibierung zeigten, referenziert werden, wie es in den Tabellen III bis einschließlich VII hier wiedergegeben ist. Diese Konzentrationen lagen zwischen etwa 0,1 und etwa 3 mikromolar. Solche Konzentrationen können in vivo erreicht werden, indem Dosen von etwa 100 bis etwa 300 mg/Tag verabreicht werden. Es ist bekannt, dass bei diesen Konzentrationen Tetrandrin im Wesentlichen untoxisch ist. Das bevorzugte Verfahren zur Verabreichung des Arzneistoffs ist oral, obgleich andere Verfahren, wie eine Injektion, auch verwendet werden können.
Bei der Behandlung von verschiedenen Krebserkrankungen, deren Zellen eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe aufweisen, wird ein Mitglied der zuvor beschriebenen Familie der Tetrandrinverbindungen oder Mischungen davon in Verbindung mit primären Arzneistoffen, von denen bekannt ist, dass sie gegen die jeweiligen Krebserkrankungen wirksam sind, verabreicht. Es folgen Arzneistoffe gegen Krebs, die durch den Resistenzmechanismus gegen mehrere Arzneistoffe gepumpt werden: Doxorubicin, Vinblastin, Vincristin, Adriamycin, Mythramycin, Actinomycin D, Colchicin, Daunomycin, Mitoxantron, VP-16 (Podophyllotoxin).
Die Erfindung wird weiter in den folgenden nichtbeschränkenden Beispielen beschrieben, die sich auf die begleitenden Zeichnungen beziehen, bei denen:
die Fig. 1 ein Graph ist, der verschiedene Konzentrationen an Doxorubicin vergleicht, wenn es gegen Arzneistoff-resistente DX20 alleine und in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Tetrandrin verwendet wird, und wenn es gegen Arzneistoff-sensible MES- SA-Mutterzellen verwendet wird;
die Fig. 2 ein Graph ist, der verschiedene Konzentrationen an Vincristin vergleicht, wenn es gegen Arzneistoff-resistente DX20 alleine und in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Tetrandrin verwendet wird, und wenn es gegen Arzneistoff-sensible MES-SA- Mutterzellen verwendet wird;
die Fig. 3 ein Graph ist, der verschiedene Konzentrationen an Vinblastin vergleicht, wenn es gegen Arzneistoff-resistente DX20 alleine und in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Tetrandrin verwendet wird, und wenn es gegen Arzneistoff-sensible MES-SA- Mutterzellen verwendet wird;
die Fig. 4 ein Graph ist, der verschiedene Konzentrationen an Doxorubicin vergleicht, wenn es gegen Arzneistoff-resistente A2780AD10 alleine und in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Tetrandrin verwendet wird, und wenn es gegen Arzneistoff-sensible A2780-Mutterzellen verwendet wird;
die Fig. 5 ein Graph ist, der verschiedene Konzentrationen an Doxorubicin vergleicht, wenn es gegen Arzneistoff-resistente DX20 alleine und in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Tetrandrin verwendet wird, und wenn es gegen Arzneistoff-sensible MES- SA-Mutterzellen verwendet wird;
die Fig. 6 ein Graph ist, der die Wirkung von Doxorubicin und Tetrandrin, verwendet als ein einziges Mittel, auf die Tumorgröße, zeigt;
die Fig. 7 ein Isobologramm ist, das die Wirksamkeit von Tetrandrin und Chloroquin bei 50%-Inhibitionskonzentrationen gegen sensible und resistente Malariastämme zeigt; und
die Fig. 8 ein Isobologramm ist, das die Wirksamkeit von Tetrandrin und Qinghaosu bei 50%-Inhibitionskonzentrationen gegen sensible und resistente Malariastämme zeigt.

BEISPIEL 1

Die Wirksamkeit von Tetrandrin bei einer Potenzierung von Antikrebs-Arzneistoffen bei Krebszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe wurde bezüglich drei Arzneistoffkombinationen bestimmt: Tetrandrin und Doxorubicin; Tetrandrin und Vincristin; und Tetrandrin und Vinblastin. Diese Kombinationen wurden bei den folgenden menschlichen Krebszelllinien mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe untersucht: MES-SA/DX20 (die Mutterzelllinien und die Doxorubicin-resistenten Zelllinien eines Uterus- Leiomyosarkoms) und A2780/A2780AD10 (die Mutterzelllinien und die Zelllinien mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe eines Individuums mit einem Eierstockkrebs). Die MES-SA/DX20-Zelllinie wurde gemäß den Entwicklungsverfahren nach Sikic et al., Resistance to Antineoplastic Drugs, Kap. 3, CRC Press, Hrsg. David Kessel, S. 37-47 (1989) etabliert. Die Tests auf eine Arzneistoffsensibilität in vitro bestanden aus zwei Assaymodellen, nämlich dem modifizierten MTT-Assay (Mossmann, J. Immunolog. Methods, Bd. 65, S. 55- 63, 1983) und dem clonogenen Assay. Zusätzlich dazu wurden die Kombinationen in vitro an nackten Mäusen, die die DX20-Zelllinie tragen, untersucht. Der MTT-Assay wurde aufgrund seiner praktischen Vorteile bei einem Durchmustern in großem Maßstab ausgewählt. Der Assay beinhaltete die celluläre Umwandlung eines Tetrazoliumsalzes zu einem gefärbten Formazan, das als Maß der Zell-Überlebensfähigkeit diente.

Modifizierter MTT-Assay

Kulturmedien, 50 Mikroliter, enthaltend 8000-25.000 Zellen in Abhängigkeit von der Wuchergeschwindigkeit der Zelllinie, wurde in jede Vertiefung mehrerer Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die Zellen wurden über Nacht zur Anheftung stehengelassen. 100 Mikroliter einer d-Tetrandrin-(S)-Lösung wurden bei einer Konzentration, die unterhalb derjenigen lag, die als eine unabhängige IC&sub5;&sub0; bestimmt wurde, dann zu jeder Vertiefung der Platten zugegeben. Der cytotoxische Arzneistoff wurde dann auch bei einer Konzentration, die unterhalb derjenigen lag, die zuvor als eine IC&sub5;&sub0; bestimmt wurde, zu mehreren halben Plattenteilen mit um 25% abnehmenden Konzentrationen zugegeben. Die Zellen wurden für 72 Stunden wachsen gelassen. Dann wurden 100 Mikroliter der Medien entfernt und 25 Mikroliter einer phosphatgepufferten Salzlösung mit 5 mg/ml MTT (Sigma, St. Louis, MO) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden in einen Inkubator bei 37ºC und 5% CO&sub2; eingestellt. Nach einer Inkubationszeit von 2-3 Stunden wurde der Extraktionspuffer, enthaltend 20% Gew./Vol. SDS und 50% DMF, zugegeben und die Platten erneut über Nacht inkubiert. Die Platten wurden bei der in dem Test verwendeten Wellenlänge von 570 nm mit einem Spektrophotometer für mehrere Vertiefungen (Modell MR 700, Dynatech Labarotories, Alexandria, VA) ausgelesen. Jede Arzneistoffkombination wurde dreifach getestet. Der Prozentsatz an überlebenden Zellen war definiert als der Prozentsatz der optischen Dichte (OD) der Arzneistoff-behandelten Vertiefungen bezüglich derjenigen der Kontrolle, die durch das Spektrophotometer detektiert wurden.
Die Fig. 1, 4 und 5 zeigen, dass die Resistenz gegen Doxorubicin entweder teilweise oder vollständig durch die Zugabe von Tetrandrin umgekehrt werden kann. Die Fig. 1 zeigt, dass, falls Tetrandrin bei 1,0 · 10&supmin;&sup6; M mit Doxorubicin bei 1,2 · 10&supmin;&sup8; M kombiniert wird, sich eine dramatische Verschiebung nach links ergibt. Diese Verschiebung zeigt, dass die DX20- Zelllinie mit einer Resistenz gegen Doxorubicin gegenüber Doxorubicin sensibler wird als die Mutterzelllinie (MES). Die berechneten IC&sub5;&sub0;-Werte zeigen auch, dass, falls die Tetrandrindosis von 2 · 10&supmin;&sup7; auf 1 · 10&supmin;&sup6; erhöht wird, die Doxorubicindosis von 6,6 · 10&supmin;&sup7; auf 3,4 · 10&supmin;&sup8; erniedrigt werden kann. Die Fig. 2 und 3 zeigen, dass auch eine Resistenz gegen Vincristin und eine Resistenz gegen Vinblastin durch die Zugabe von Tetrandrin entweder teilweise oder vollständig umgekehrt werden können.

Clonogener Assay

Das zweite verwendete Assaymodell, der Koloniebildungsassay, bestand aus 1000-1500 Zellen, wiederum in Abhängigkeit von der Wuchergeschwindigkeit der Zelllinie, die zu jeder Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen in 500 Mikrolitern Kulturmedien zugegeben wurden. Die Zellen wurden zur Anhaftung über Nacht stehengelassen. Wie in dem MTT wurden Kulturmedien zugegeben, die d-Tetrandrin-(S) und auch einen cytotoxischen Arzneistoff bei Konzentrationen enthielten, die unterhalb derjenigen lagen, die zuvor als unabhängige IC&sub5;&sub0;-Werte bestimmt wurden. Die Platten wurden insgesamt für 7 Tage inkubiert, bevor sie in 2,5%igem Glutaraldehyd fixiert wurden und mit Kristallviolett angefärbt wurden. Die mengenmäßigen Ausmaße des Koloniewachstums wurden unter Verwendung einer ultrasensiblen Bildgebungsvorrichtung (LCVS-5, LP. S., Pittsburgh, PA) bewertet. Eine Kolonie ist als jeder Cluster mit mehr als 30 Zellen definiert. Der Prozentsatz der Inhibierung wurde direkt im Vergleich zu Kontrollplatten, die keine Arzneistoffe enthielten, gemessen. Auch die Fig. 5 legt nahe, dass eine Resistenz gegen Doxorubicin entweder teilweise oder vollständig durch die Zugabe von Tetrandrin umgekehrt werden kann.

Nackte Mäuse, die die DX20-Zelllinie tragen

Zusätzlich wurden die Wirkungen von d-Tetrandrin-(S) zusammen mit Doxorubicin in Nu/Nu-athymischen Mäusen, die mit DX20-Sarkomazellen, 76 x resistent im Vergleich zu den MES-SA-Mutterzellen, inokuliert waren, untersucht. Vier Kohorten der den DX20- Tumor tragenden nackten Tiere wurden in Gruppen von jeweils 5 Tieren (Kontrolle, Doxorubicin, Tetrandrin und Doxorubicin + Tetrandrin) behandelt. Anfängliche Daten wurden gesammelt, indem das Tumorwachstum beobachtet wurde, wobei die sichtbare Wachstumshemmung bei den experimentellen Gruppen, die 2 Zyklen mit d-Tetrandrin-(S) und Doxorubicin erhielten, mit denjenigen verglichen wurden, die entweder d-Tetrandrin-(S) oder Doxorubicin alleine in vergleichbaren Mengen erhielten. (Siehe die Fig. 6). Die Tumorgröße wurde unter Verwendung der Formel (4 Pi/3)X·Y·2Z berechnet. Eine zusätzliche Analyse zeigte, dass, falls insgesamt 150 mg/kg in 3 intraperitonealen Injektionen über einen Zeitraum von 120 Stunden verabreicht wurden, 54 Mikrogramm/Gramm Gewebe d-Tetrandrin-(S) in dem Tumor detektiert werden konnten. Eine L.D.&sub5;&sub0; von 260 mg/kg wurde auch berechnet, indem einzelne sich steigernde Injektionen der Verbindung verabreicht wurden. Die Tabellen I & II und die Fig. 6 geben die tatsächlichen Messungen wieder. Tabelle I Tabelle II
Die Studie wurde mit 3 bis 4 Wochen alten männlichen nackten Balb-C-Mäusen durchgeführt. Den Tieren wurden 1 · 10&sup7; DX20-Zellen injiziert. Die Tiere wurden an den Tagen 6, 8 und 10 mit Tetrandrin (1,5 mg, 1 mg und 0,5 mg) behandelt. Den Mäusen wurden 5,5 mg/kg Doxorubicin am Tag 12 verabreicht.

REFERENZBEISPIEL 1

Die Wirksamkeit von Tetrandrin bei der Potenzierung von Antimalaria-Arzneistoffen bei Zellen von parasitären Malariaerregern mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe wurde durch Vergleich der Antimalariawirkung von Tetrandrin und Chlorquin alleine und in Kombination gegen einen P. falciparum-Malariastamm, der sensibel gegenüber Chloroquin ist, und einen anderen, der resistent gegenüber Chlorquin ist, bestimmt. Eine ähnliche Untersuchung wurde unter Verwendung von Tetrandrin und Qinghaosu durchgeführt. Chlorquin und Qinghaosu sind herkömmlich verwendete Antimalaria-Arzneistoffe.
Die Dosis (IC&sub5;&sub0;) jedes Arzneistoffs oder jeder Arzneistoffkombination, die benötigt wird, um eine 50%ige Inhibierung der Malariaaktivität jedes Stammes zu bewirken, wurde bestimmt, indem eine Dosis-Antwortkurve für jeden (jede) bestimmt wurde.
Der sudanesische FCMSU1-Stamm und der clonierte (W-2)-Stamm aus Indochina von P. falciparum wurden verwendet. Der Erstere ist gegenüber Chlorquin sensibel und der Letztere ist gegenüber Chlorquin resistent. Die beiden Stämme des Parasiten wurden gemäß dem Kerzenglasverfahren von Trager und Jensen, Science, Bd. 193, Seiten 673-675 (1976) kultiviert. In einem gegebenen Experiment wurden vier Tage alte Petrischalenkulturen (ungefähr 10%ige Parasitämie) mit einem Medium verdünnt, das eine Menge von nichtinfizierten menschlichen Typ-A-Erythrozyten enthielt, um eine Kultur mit einem endgültigen Hämotocritwert von 1,5% und einer Parasitämie von 0,5-1,0% zu erhalten. Die resultierende Kultur war für die Zugabe auf Mikrotitrationsplatten mit sechsundneunzig flachbauchigen Vertiefungen vorbereitet.
Das verwendete Testverfahren war zu demjenigen, das von Desjardins et al. in "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", Bd. 16, Seiten 710-718 (1979) beschrieben wurde, ähnlich. Kurz beschrieben betrug das endgültige Volumen, das zu jeder der Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen zugegeben wurde, 250 Mikroliter und bestand aus 25 Mikrolitern eines vollständigen Mediums mit oder ohne dem primären Arzneistoff (Chlorquin oder Qinghaosu), aus 175 Mikrolitern entweder der mit Parasiten befallenen Kultur oder einer nicht mit Parasiten befallenen menschlichen Erythrozytenkontrolle und aus 25 Mikrolitern eines vollständigen Mediums mit oder ohne Tetrandrin und aus 25 Mikrolitern radioaktivem (0,5 microCi) [2,8- ³H]-Adenosin. Die Mikrotitrationsplatten wurden in einem Kerzenglas für weitere 18 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Während des Wachstums der Malariaparasiten wird ³H-Adenosin metabolisiert und in die polymere RNA und DNA eingebaut. Die markierten Polymere werden auf Glasfiberfiltern gefangen und nichteingebautes Material wird weggewaschen. In Abwesenheit eines Arzneistoffs erfolgt ein 100%iger Einbau des markierten Materials. Falls die Arzneistoffe eingreifen (entweder direkt oder indirekt), kann eine um 50% inhibierende Dosis (IC&sub5;&sub0;) benötigte Dosis berechnet werden. Die Experimente wurden dreimal wiederholt, außer dort, wo es angemerkt wurde. Eine statistische Analyse wurde unter Verwendung des Studenten-T-Tests auf eine Signifikanz durchgeführt. Van Dyke et al., "Exp. Parasitol", Bd. 64, Seiten 418-423 (1987).
Falls Tetrandrin zu Chloroquin zugegeben ist, unterstützt und potenziert es die Antimalariawirkung. Falls Tetrandrin zu Qinghaosu oder Chlorquin zugegeben ist, stellt es eine langwirkende und synergistische Wirkung für Qinghaosu oder Chloroquin zur Verfügung. Dies ist in den Tabellen III-VI und in den Fig. 7 & 8 ersichtlich. Bemerkenswerterweise kann, falls 3,0 mikromolares Tetrandrin zu 0,1 mikromolarem Chloroquin zugegeben wird, die IC&sub5;&sub0; von Chloroquin um das 43-Fache gesenkt werden. Tabelle III IC&sub5;&sub0; (nM) von TT und CQ für jeden Arzneistoff alleine und in Kombination*
* Die Daten in der obigen Tabelle sind die Durchschnittswerte ± die Standardabweichung (S. D.) (nM) aus drei Experimenten außer dort, wo es vermerkt ist.
* Die Verhältnisse von TT/CQ in den Arzneistoffkombinationen sind 10 : 3, 10 : 1 bzw. 30 : 1.
*** S- und R-Stämme stehen für einen CQ-sensiblen (FCMSU1/Sudan) bzw. einen -resistenten (w2)-Stamm von P. falciparum.
Wenn die inhibierende Wirkung von zwei Arzneistoffen, z. B. A und B, verglichen wird, wird der mittlere Punkt der Dosisantwortkurve für gewöhnlich als die Grundlage für einen Vergleich gewählt. Dieser Punkt ist als die inhibierende Dosis bekannt, die an dem Punkt einer 50%igen Inhibierung der zu messenden Antwort (inhibierende Konzentration bei um 50% inhibierter Antwort = IC&sub5;&sub0;) auftritt. Ein Isobologramm wird entwickelt, indem die IC&sub5;&sub0; eines Arzneistoffs gegen die andere, d. h. Arzneistoff A gegen Arzneistoff B, verglichen wird. Wir beginnen, indem die IC&sub5;&sub0; des Arzneistoffs B am oberen Ende der y-Achse, das mit 1,0 markiert ist, antragen wird. Die IC&sub5;&sub0; des Arzneistoffs A wird an der Position 1,0 der x-Achse angetragen. Die Kombinationen des Arzneistoffs A und des Arzneistoffs B, die unterhalb der IC&sub5;&sub0; von beiden Arzneistoffen liegen, werden gemischt und getestet und die Punkte werden auf dem Graphen eingetragen. Falls die beiden Arzneistoffe additiv sind, ergibt sich eine gerade Linie zwischen Y&sub1;X&sub0; (Arzneistoff B) und Y&sub0;X&sub1; (Arzneistoff A). Falls die Linie oder Kurve unterhalb der geraden Linie gebeugt ist, sind die Arzneistoffe synergistisch oder potenzierend. Falls die Linie oberhalb der geraden Linie gebeugt ist, sind die zwei Arzneistoffe antag Tabelle IV IC&sub5;&sub0; (nM) von TT und QHS für jeden Arzneistoff alleine und in Kombination*
* Die Daten in der obigen Tabelle sind die Durchschnittswerte ± die S. D. (nM) aus drei Experimenten außer dort, wo es vermerkt ist.
* Die Verhältnisse von TT/QHS in den Arzneistoffkombinationen sind 10 : 3, 10 : 1 bzw. 30 : 1.
*** S- und R-Stämme stehen für einen CQ-sensiblen (FCMSU1/Sudan) bzw. einen -resistenten (W2)-Stamm von P. falciparum. Tabelle V Wirkung der Kombination von Tetrandrin und Chloroquin auf P. falciparum
* SFIC steht für die Summe der Kehrwerte der inhibierenden Konzentrationen, wie von Berenbaum (11) beschrieben, SFIC ist gleich eins in Fällen von additiven Wirkungen der Arzneistoffe, größer als eins in Fällen eines Antagonismus und kleiner als eins bei einer synergistischen Wirkung.
** S- und R-Stamm: Chloroquin-sensibeler (FCMSU1/Sudan) und -resistenter (w2) Stamm von P. falciparum. Tabelle VI (Wirkung der Kombination von Tetrandrin und Qinghaosu auf P. falciparum)
* SFIC steht für die Summe der Kehrwerte der inhibierenden Konzentrationen, wie von Berenbaum (11) beschrieben, SFIC ist gleich eins in Fällen von additiven Wirkungen der Arzneistoffe, größer als eins in Fällen eines Antagonismus und kleiner als eins bei einer synergistischen Wirkung.
** S- und R-Stamm: Chloroquin-sensibele (FCMSU1/Sudan) und -resistente (W2)-Stämme von P. falciparum.
In einem Versuch, dieses überraschende Ergebnis zu erklären, wurden Tetrandrin und verschiedene seiner Derivate und mehrere Nicht-Tetrandrin-Derivate auf ihre individuelle Wirksamkeit gegen einen Chlorquin-sensiblen und einen Chlorquin-resistenten Stamm von P. falciparum malaria getestet. Das Testverfahren war im Grundsatz das gleiche wie das zuvor Umrissene. Die Nicht-Familienmitglieder waren Cycleanin, Cepharanthin, Methoxadiantifolin und Thalicarpin, deren Strukturformeln hier nachfolgend aufgezeigt sind: Struktur von Cepharanthin METHOXADIANTIFOLIN THALICARPIN
Diese Vergleichswirkungen sind in der folgenden Tabelle VII wiedergegeben. Chemische Struktur - Antimalariawirkung von Bisphenylisochinolinalkaloiden gegen Plasmodium falciparum in vitro
(a): TT - Tetrandrin; IT - Isotetrandrin; HE - Hernandezin; BB - Berbamin; PY - Pycnamin; PH - Phaeanthin; OB - Obamegin; FA - Fangchinolin; CY - Cycleanin; CE - Cepharanthin; ME - Methoxadiantifolin; TH - Thalicarpin
* Eine IC&sub5;&sub0; eines Arzneistoffs gegen einen sensiblen Stamm von P. falciparum wird durch einen IC&sub5;&sub0; eines resistenten Stammes dividiert.
** S und R stehen für einen Chloroquin-sensiblen und einen -resistenten Stamm von P. falciparum.
Die Ergebnisse der Tabelle VII zeigen, dass Methoxadiantifolin und diejenigen Mitglieder der Familie der Tetrandrinverbindungen mit der "S"-isomeren Konfiguration an dem chiralen C- 1'-Kohlenstoff, die mindestens einen R&sub2;-Substituenten aufweisen, der CH&sub3; umfasst, tatsächlich wesentlich wirksamer gegen Chloroquin-resistente Malariastämme als gegen Chlorquinsensible Malariastämme sind. Dieses extrem überraschende Ergebnis legt nahe, dass diese Verbindungen tatsächlich die Pumpwirkung des Glykoproteins, welches mit solchen Zellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe in Verbindung gebracht wird, umkehrt oder inhibiert. Anstelle des Herauspumpens des toxischen Arzneistoffs aus der Zelle scheint sie tatsächlich eine geringere Konzentration des toxischen Arzneistoffs aus der Zelle herauszupumpen. Gegenwärtig ist dies die einzig vernünftige Erklärung dieser überraschenden Ergebnisse, da der einzige bekannte signifikante Unterschied zwischen Zellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe und den entsprechenden Arzneistoff-sensiblen Zellen der wesentlich höhere Anteil an P-Glykoprotein ist, der mit der Zelle mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe in Verbindung gebracht wird.
Das Vorangegangene zeigt, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen eine Behandlung einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe bei Krebszellen zur Verfügung stellen können. Die Erfindung zielt auf die Verwendung solcher Verbindungen bei der Herstellung eines Mittels für die Behandlung in vivo von Krebszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe ab. Die Verbindungen potenzieren die Wirkung von primären Arzneistoffen, von denen bekannt ist, dass sie wirksam gegen die infizierten erkrankten Zellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe sind.

Claims

1. Die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I

wobei R&sub1; und R&sub1;' gleich oder verschieden sind und für H, CH&sub3; oder CO&sub2;CH&sub3; stehen;

R&sub2; für CH&sub3; steht;

R&sub3; für CH&sub3; oder Wasserstoff steht;

die isomere Konfiguration an der Stelle des chiralen Kohlenstoffatoms C-1' "S" ist; und mindestens einer von R&sub2; und R&sub3; CH&sub3; umfasst;

bei der Herstellung eines Mittels für die Behandlung in vivo von Krebszellen mit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe.

2. Die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Zellen mit mindestens einem grundsätzlichen Arzneistoff, von dem bekannt ist, dass er bei der Behandlung von Krebs wirksam ist, behandelt werden.

3. Die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2, wobei der wesentliche Arzneistoff Doxorubicin, Vinblastin, Vincristin, Adriamycin, Mythramycin, Actinomycin D, Colchicin, Daunomycin, Mitoxantron oder Podopyllotoxin ist.

4. Die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Dosierungshöhe zwischen etwa 100 und 300 mg pro Tag liegt.

5. Die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Verbindung Tetrandrin ist.