DE60117517T2

DE60117517T2 - Indolderivate als mcp-1 rezeptor antagonisten

Info

Publication number: DE60117517T2
Application number: DE60117517T
Authority: DE
Inventors: Wellington Alan Macclesfield FAULL; Grant Jason Macclesfield KETTLE
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2021-01-10
Also published as: AU779502B2; KR20020064374A; NZ519311A; NO20023381L; MXPA02006612A; EP1268423B1; IL150276A0; ATE318800T1; CA2393597A1; AU2387401A; BR0107405A; NO20023381D0; JP2003519684A; DE60117517D1; GB0000625D0; EP1268423A1; US6984657B1; ZA200204351B; CN1395564A; WO2001051467A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft entzündungshemmende Verbindungen, die über die Antagonisierung des CCR2-Rezeptors (der auch als MCP-1-Rezeptor bekannt ist) wirken, was u.a. zur Hemmung von MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) führt. Diese Verbindungen enthalten eine Indolgruppierung. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung, bei ihrer Herstellung verwendbare Zwischenprodukte und ihre Verwendung als Therapeutika.
MCP-1 ist ein Mitglied der Chemokinfamilie entzündungsfördernder Protekine, die die Chemotaxis und Aktivierung von Leukozyten vermitteln. MCP-1 ist ein C-C-Chemokin, bei dem es sich um eines der wirkungsvollsten und selektivsten bekannten chemoattraktiven und aktivierenden Mittel für T-Zellen und Monozyten handelt. MCP-1 ist mit der Pathophysiologie einer großen Zahl entzündlicher Krankheiten, einschließlich rheumatoider Arthritis, Glomerulonephritis, Lungenfibrose, Restenose (internationale Patentanmeldung WO 94/09128), Alveolitis (Jones et al., 1992, J. Immunol., 149, 2147) und Asthma in Verbindung gebracht worden. Weitere Krankheitsbereiche, bei deren Pathologie MCP-1 vermutlich eine Rolle spielt, sind Atherosklerose (z.B. Koch et al., 1992, J. Clin. Invest., 90, 772–779), Psoriasis (Deleuran et al., 1996, J. Dermatological Science, 13, 228–236), Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut vom Spät-Typ, entzündliche Darmerkrankung (Grimm et al., 1996, J. Leukocyte Biol., 59, 804–812), multiple Sklerose und Hirntrauma (Berman et al., 1996, J. Immunol., 156, 3017–3023). Ein MCP-1-Inhibitor kann auch zur Behandlung von Schlaganfall, Reperfusionstrauma, Ischämie, Myokardinfarkt und Transplantatabstoßung geeignet sein.
MCP-1 wirkt über den CCR2-Rezeptor. Auch MCP-2 und MCP-3 können zumindest teilweise über diesen Rezeptor wirken. In der vorliegenden Beschreibung schließt daher „Hemmung oder Antagonismus von MCP-1" oder „durch MCP-1 vermittelte Wirkungen" die Hemmung oder den Antagonismus von durch MCP-2 und/oder MCP-3 vermittelten Wirkungen ein, wenn MCP-2 und/oder MCP-3 über den CCR2-Rezeptor wirken.
Bei eigenen Arbeiten wurde eine Klasse von Verbindungen mit einer Indolgruppierung mit brauchbarer Hemmwirkung gegenüber MCP-1 entdeckt. In der internationalen Patentanmeldung WO 99/07351 wird eine Klasse von Indolen mit MCP-1-Hemmwirkung beschrieben. Diese Anmeldung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß bestimmte substituierte 5-Hydroxyindole MCP-1-Inhibitoren sind, die unerwartete und vorteilhafte Eigenschaften bezüglich Wirksamkeit und/oder Blutspiegeln und/oder Bioverfügbarkeit und/oder Löslichkeit besitzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß eine Verbindung der Formel (I):
worin:
R¹ für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht;
R² für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht;
R³ für eine Halogengruppe, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Alkoxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin n 0, 1 oder 2 bedeutet und R⁷ eine Alkylgruppe bedeutet, steht;
R⁴ für Halogen, Trifluormethyl, Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy oder C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl steht;
R⁵ für Wasserstoff, Halogen, Cyano, C₁_₆-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl oder COR⁸, worin R⁸ C_1-6-Alkyl bedeutet, steht;
R⁶ für Wasserstoff, Halogen, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl oder COR⁹, worin R⁹ C_1-6-Alkyl bedeutet, steht;
mit der Maßgabe, daß dann, wenn R¹ für Wasserstoff, Halogen oder Methoxy steht, R² für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht, R⁵ und R⁶ beide für Wasserstoff stehen und eine der Gruppen R³ oder R⁴ für Chlor, Fluor oder Trifluormethyl steht, die andere nicht für Halogen oder Trifluormethyl steht;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein in vivo spaltbarer Ester davon.
In der vorliegenden Beschreibung schließt der Begriff „Alkyl" sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige Alkylgruppen ein. Bei Bezugnahme auf einzelne Alkylgruppen wie „Propyl" ist jedoch ausschließlich die geradkettige Variante gemeint. Ganz analog bezieht sich der Begriff „Alkenyl" und „Alkinyl" auf geradkettige oder verzweigtkettige ungesättigte Gruppierungen. Sofern nicht anders vermerkt, enthalten Alkylgruppen geeigneterweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome und ganz besonders bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Alkenyl- und Alkinylgruppen enthalten geeigneterweise 2 bis 10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome und ganz besonders bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome. Der Präfix „Nieder" gibt an, daß die Gruppe bis zu 6 und vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatome aufweist. Der Begriff „Halogen" bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Vorzugsweise steht R¹ für Wasserstoff oder Halogen, wie Chlor oder Fluor, und ganz besonders bevorzugt für Wasserstoff.
Vorzugsweise steht R² für Wasserstoff oder Halogen, wie Chlor oder Fluor, und ganz besonders bevorzugt für Wasserstoff.
Geeignete Beispiele für R³ sind Halogen, wie Chlor, Nitro oder Alkoxy, wie Methoxy.
Nach einer Ausführungsform steht R³ für Trifluormethyl und R⁴ für Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy, Alkyl, insbesondere Methyl, oder Alkinyl, insbesondere Ethinyl.
Spezielle Beispiele für R⁴ sind Halogen, wie Chlor, Alkyl, wie Methyl, Alkoxy, wie Methoxy, oder Trifluormethoxy.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform steht R' für Halogen, wie Chlor, oder Trifluormethyl und R³ für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin R⁷ und n die oben angegebene Bedeutung besitzen, und R⁷ steht insbesondere für Methyl oder Ethyl.
Vorzugsweise steht R⁵ für Wasserstoff.
Vorzugsweise steht R⁶ für Wasserstoff.
Gegenstand der Erfindung ist gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung eine Verbindung der Formel (IA):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder davon, worin:
R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung besitzen;
R^3' für Chlor, C_1-6-Alkyl, C₂_₆-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Alkoxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin R⁷ und n die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, steht;
R^4' für eine Halogengruppe, Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy oder Methyl steht;
mit der Maßgabe, daß dann, wenn R^3' für Chlor oder Trifluormethyl steht, R^4' nicht für Halogen steht.
Vorzugsweise stehen R¹ und R² für Wasserstoff.
Vorzugsweise ist R^3' unter Methoxy, Chlor oder Nitro ausgewählt.
Vorzugsweise ist R^4' unter Chlor, Methyl, Methoxy oder Trifluormethoxy ausgewählt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind u.a. alle Verbindungen gemäß den Beispielen, die in Tabelle 1 illustriert sind.
Tabelle 1
Die Erfindung betrifft ferner alle tautomeren Formen der Verbindungen der Formel (I).
Es versteht sich auch, daß bestimmte Verbindungen der Formel (I) in solvatisierten sowie unsolvatisierten Formen, wie beispielsweise hydratisierten Formen, vorliegen können. Es versteht sich, daß die Erfindung alle derartigen solvatisierten Formen umfaßt.
Die Verbindungen der Formel (I) sind Inhibitoren von MCP-1. Darüber hinaus scheinen sie die RANTES-induzierte Chemotaxis zu hemmen. Bei RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-Cell Expressed and Secreted) handelt es sich um ein anderes Chemokin aus der gleichen Familie wie MCP-1, das ein ähnliches biologisches Profil aufweist, aber über den CCR1-Rezeptor wirkt. Infolgedessen können diese Verbindungen zur Behandlung von durch diese Mittel vermittelten Krankheiten, insbesondere entzündlichen Krankheiten, verwendet werden.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze von Verbindungen der Formel (I) sind Basensalze, wie ein Alkalimetallsalz, beispielsweise Natrium, ein Erdalkalisalz, beispielsweise Calcium oder Magnesium, ein Salz eines organischen Amins, beispielsweise Triethylamin, Morpholin, N-Methylpiperidin, N-Ethylpiperidin, Procain, Dibenzylamin, N,N-Dibenzylethylamin oder Aminosäuren, wie Lysin. Gemäß einer anderen Ausgestaltung sind geeignete Salze dann, wenn die Verbindung basisch genug ist, u.a. Säureadditionssalze, wie Methansulfonat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Citrat, Maleat und mit Phosphorsäure und Schwefelsäure gebildete Salze. Je nach der Zahl geladener Funktionen und der Wertigkeit der Kationen oder Anionen kann mehr als ein Kation oder Anion vorliegen. Ein bevorzugtes pharmazeutisch annehmbares Salz ist ein Natriumsalz.
Verschiedene Formen von Prodrugs sind im Stand der Technik bekannt. Für Beispiele derartiger Prodrug-Derivate siehe:

a) Design of Prodrugs, Herausgeber H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), und Methods in Enzymology, Band 42, S. 309–396, Herausgeber K. Widder et al. (Academic Press, 1985);
b) A Textbook of Drug Design and Development, Herausgeber Krogsgaard-Larsen und H. Bundgaard, Kapitel 5 „Design and Application of Prodrugs", von H. Bundgaard, S. 113–191 (1991);
c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1–38 (1992);
d) H. Bundgaard et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); und
e) N. Kakeya et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984).

Beispiele für derartige Prodrugs sind in vivo spaltbare Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung. Bei einem in vivo spaltbaren Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Carboxygruppe handelt es sich beispielsweise um einen pharmazeutisch annehmbaren Ester, der im menschlichen oder tierischen Körper unter Bildung der zugrundeliegenden Säure gespalten wird. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Ester für Carboxy sind u.a. C_1-6-Alkylester, beispielsweise Methyl- oder Ethylester; C_1-6-Alkoxymethylester, beispielsweise Methoxymethylester; C₁_₆-Alkanoyloxymethylester, beispielsweise Pivaloyloxymethylester; Phthalidylester; C_3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C_1-6-alkylester, beispielsweise 1-Cyclohexylcarbonyloxyethylester; 1,3-Dioxolan-2-ylmethylester, beispielsweise 5-Methyl-1,3-dioxolan-2-ylmethylester; C_1-6-Alkoxycarbonyloxyethylester, beispielsweise 1-Methoxycarbonyloxyethylester; Aminocarbonylmethylester und Mono- oder Di-N-(C_1-6-alkyl)-Varianten davon, beispielsweise N,N-Dimethylaminocarbonylmethylester und N-Ethylaminocarbonylmethylester; diese können an einer beliebigen Carboxygruppe in den erfindungsgemäßen Verbindungen gebildet werden. Bei einem in vivo spaltbaren Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Hydroxylgruppe handelt es sich beispielsweise um einen pharmazeutisch annehmbaren Ester, der im menschlichen oder tierischen Körper unter Bildung der zugrundeliegenden Hydroxylgruppe gespalten wird. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Ester für Hydroxy sind u.a. C_1-6-Alkanoylester, beispielsweise Acetylester; und Benzoylester, in denen die Phenylgruppe durch Aminomethyl oder N-substituiertes Mono- oder Di-C_1-6-alkylaminomethyl substituiert sein kann, beispielsweise 4-Aminomethylbenzoylester und 4-N,N-Dimethylaminomethylbenzoylester.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines in vivo spaltbaren Esters davon, bei dem man:

a) eine Verbindung der Formel (II):
worin R¹, R², R⁵ und R⁶ die unter Formel (I) angegebene Bedeutung besitzen, R^a für Carboxy oder eine geschützte Form davon steht, und R^b für Wasserstoff oder eine geeignete Hydroxyschutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel (III):
worin R³ und R⁴ die unter Formel (I) angegebene Bedeutung besitzen und L für eine austauschbare Gruppe steht, umsetzt; und gegebenenfalls danach: i) eine Verbindung der Formel (I) in eine andere Verbindung der Formel (I) umwandelt; ii) Schutzgruppen abspaltet oder iii) ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Prodrug davon bildet.

Geeignete Werte für L sind beispielsweise eine Halogen- oder Sulfonyloxygruppe, beispielsweise eine Chlor-, Brom-, Methansulfonyloxy- oder Toluol-4-sulfonyloxygruppe.
Verbindungen der Formel (II) oder (III) werden geeigneterweise in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan oder Acetonitril, in Gegenwart einer Base, wie Natriumhydroxid, Natriumhydrid oder Kaliumcarbonat, miteinander umgesetzt. Die Umsetzung wird geeigneterweise in Gegenwart eines Phasentransferkatalysators, wie Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, durchgeführt. Die Reaktionszeiten können im Bereich von 1–6 Stunden und vorzugsweise 1–3 Stunden liegen. Man arbeitet bei moderaten Temperaturen von beispielsweise 15–30°C und vorzugsweise 20–25°C.
Verbindungen der Formel (II) sind im Handel erhältlich oder durch Modifizierung von im Handel erhältlichen Verbindungen der Formel (II) nach bekannten Verfahren zugänglich. Insbesondere können sie durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IV):
worin R¹, R⁵, R⁶ und R^b die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit einer Verbindung der Formel (V)
worin R^c und R^c' unabhängig voneinander unter C_1-4-Alkyl ausgewählt sind, hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (IV) und (V) werden geeigneterweise unter den Bedingungen der Reissert-Reaktion miteinander umgesetzt, z.B. in einem inerten Lösungsmittel (wie Tetrahydrofuran) in Gegenwart einer Base (wie Kaliumethoxid) in einem Temperaturbereich von 15–30°C, vorzugsweise 20–25°C, über einen Zeitraum von 10–20 Stunden, vorzugsweise 15–17 Stunden. Die erhaltene Verbindung wird isoliert und in einem Alkohol, wie Ethanol, und einer organischen Säure (wie Essigsäure) und einem Übergangsmetallkatalysator (wie 10% Pd/C) gelöst und mit Cyclohexen versetzt. Die Mischung kann dann 15–25 Stunden, vorzugsweise 16–20 Stunden, auf eine Temperatur von 60–120°C und vorzugsweise 70–90°C erhitzt werden, was eine Verbindung der Formel (II) ergibt, in der R^a für -CO₂-C_1-4-Alkyl steht.
Alternativ dazu können Verbindungen der Formel (II) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (VI):
worin R¹, R⁵, R⁶ und R^b die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit einer Verbindung der Formel (VII)
worin R^d für C_1-4-Alkyl steht, hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (VI) und (VII) werden geeigneterweise unter Fischer-Bedingungen miteinander umgesetzt, z.B. mit einer organischen Säure (wie Essigsäure) in einem Alkohol (wie Ethanol) bei einer Temperatur von 60–90°C, vorzugsweise 75–85°C, über einen Zeitraum von 1–5 Stunden, vorzugsweise 1–3 Stunden. Die erhaltene Verbindung wird mit einer starken Säure (wie Polyphosphorsäure) vermischt und 0,5–4 Stunden, vorzugsweise 0,5–2 Stunden, auf eine Temperatur von 90–150°C und vorzugsweise 100–120°C erhitzt, was eine Verbindung der Formel (II) ergibt, in der R² für Wasserstoff steht. Falls gewünscht, kann R² danach gegebenenfalls nach literaturbekannten Methoden in einen anderen Wert für R² gemäß der Definition in Formel (I) umgewandelt werden.
Bei einer bevorzugten Alternative werden Verbindungen der Formel (II) durch Cyclisierung einer Verbindung der Formel (VIII)
worin R¹, R^a, R^b und R² die oben angegebene Bedeutung besitzen, erhalten.
Die Cyclisierung kann durch Erhitzen der Verbindung am Rückfluß in einem organischen Lösungsmittel, wie Xylol, erfolgen. Verbindungen der Formel (VIII) werden geeigneterweise durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IX)
worin R¹, R² und R^b die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit einer Verbindung der Formel (X)
worin R^a die oben angegebene Bedeutung besitzt, hergestellt. Die Umsetzung wird geeigneterweise in einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, insbesondere Methanol, in Gegenwart einer Base, wie eines Alkalimetallalkoxids, insbesondere Natriummethoxid, durchgeführt. Man arbeitet geeigneterweise bei moderaten Temperaturen von –30 bis 20°C.
Verbindungen der Formel (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) und (X) sind bekannt oder im Handel erhältlich oder werden durch standardmäßige Manipulation von im Handel erhältlichen oder bekannten Substanzen nach an sich bekannten Verfahren hergestellt.
R^c und R^d stehen für C_1-4-Alkyl. Vorzugsweise stehen R^c und R^d für Methyl oder Ethyl.
Es versteht sich weiterhin, daß es bei einigen der hier erwähnten Umsetzungen erforderlich/wünschenswert sein kann, empfindliche Gruppen in den Verbindungen zu schützen. Die Fälle, in denen eine Schützung erforderlich bzw. wünschenswert ist, und hierfür geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Enthalten die Reaktanten also Gruppen wie Carboxy oder Hydroxy, so kann es wünschenswert sein, die Gruppe bei einigen der hier erwähnten Umsetzungen zu schützen.
Eine geeignete Schutzgruppe für eine Hydroxylgruppe ist beispielsweise eine Acylgruppe, zum Beispiel eine Alkanoylgruppe wie Acetyl, eine Aroylgruppe, zum Beispiel Benzoyl, oder eine Arylmethylgruppe, zum Beispiel Benzyl. Die Entschützungsbedingungen für die oben aufgeführten Schutzgruppen hängen natürlich von der gewählten Schutzgruppe ab. So kann man beispielsweise eine Acylgruppe wie eine Alkanoyl- oder eine Aroylgruppe zum Beispiel durch Hydrolyse mit einer geeigneten Base, wie einem Alkalimetallhydroxid, beispielsweise Lithium- oder Natriumhydroxid, abspalten. Alternativ dazu kann eine Arylmethylgruppe wie z.B. eine Benzylgruppe zum Beispiel durch Hydrierung an einem Katalysator wie Palladium auf Kohle abgespalten werden.
Eine geeignete Schutzgruppe für eine Carboxygruppe ist beispielsweise eine Veresterungsgruppe, beispielsweise eine Methyl- oder eine Ethylgruppe, die zum Beispiel durch Hydrolyse mit einer Base wie Natriumhydroxid abgespalten werden kann, oder beispielsweise eine t-Butylgruppe, die zum Beispiel durch Behandlung mit einer Säure, beispielsweise einer organischen Säure wie Trifluoressigsäure, abgespalten werden kann, oder beispielsweise eine Benzylgruppe, die zum Beispiel durch Hydrierung an einem Katalysator wie Palladium auf Kohle abgespalten werden kann.
Die Schutzgruppen können mit herkömmlichen, an sich gut bekannten Verfahren in einer zweckmäßigen Stufe der Synthese abgespalten werden.
Einige der hier beschriebenen Zwischenprodukte können neu sein, beispielsweise Zwischenprodukte der Formel (II), und werden als solche als weiteres Merkmal der Erfindung bereitgestellt.
Wird ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel (I) benötigt, so kann es beispielsweise durch Umsetzung der Verbindung mit der entsprechenden Säure (die ein physiologisch annehmbares Anion liefert) oder mit der entsprechenden Base (die ein physiologisch annehmbares Kation liefert) oder nach einer beliebigen anderen herkömmlichen Salzbildungsmethode erhalten werden.
Gegenstand der Erfindung ist nach einer weiteren Ausgestaltung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) gemäß obiger Definition oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen in vivo spaltbaren Ester davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- oder Trägerstoff.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer für die orale Verwendung (beispielsweise als Tabletten, Lutschtabletten, Hart- oder Weichkapseln, wäßrige oder ölige Suspensionen, Emulsionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Sirupe oder Elixiere) für die topische Verwendung (beispielsweise als Cremes, Salben, Gele oder wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen), zur inhalativen Verabreichung (beispielsweise als feinteiliges Pulver oder flüssiges Aerosol), zur Verabreichung durch Insufflation (beispielsweise als feinteiliges Pulver) oder zur parenteralen Verabreichung (beispielsweise als sterile wäßrige oder ölige Lösung zur intravenösen, subkutanen, intramuskulären oder intramuskulären Dosierung oder als Suppositorium für die rektale Dosierung) geeigneten Form vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind nach herkömmlichen Methoden unter Verwendung herkömmlicher pharmazeutischer Hilfsstoffe, die an sich gut bekannt sind, erhältlich. So können für die orale Verwendung vorgesehene Zusammensetzungen beispielsweise einen oder mehrere Farbstoffe, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Konservierungsstoffe enthalten.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe für eine Tablettenformulierung sind inerte Verdünnungsmittel, wie Lactose, Natriumcarbonat, Calciumphosphat oder Calciumcarbonat, Granulier- und Sprengmittel, wie Maisstärke oder Algensäure; Bindemittel, wie Stärke; Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk; Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäureethylester oder -propylester, und Antioxidantien, wie Ascorbinsäure. Tablettenformulierungen können gegebenenfalls zur Modifizierung ihres Zerfalls und der anschließenden Resorption des Wirkstoffes im Magen-Darm-Trakt oder zur Verbesserung ihrer Stabilität und/oder ihres Aussehens beschichtet werden, wobei jeweils an sich gut bekannte und übliche Beschichtungsmittel und Verfahrensweisen angewandt werden.
Zusammensetzungen zur oralen Verwendung können in Form von Hartgelatinekapseln vorliegen, in denen der Wirkstoff im Gemisch mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin vorliegt, oder als Weichgelatinekapseln, in denen der Wirkstoff im Gemisch mit Wasser oder einem Öl, wie Erdnußöl, Flüssigparaffin oder Olivenöl, vorliegt.
Wäßrige Suspensionen enthalten den Wirkstoff im allgemeinen in feingepulverter Form zusammen mit einem oder mehreren Suspendiermitteln, wie Natriumcarboxy methylzellulose, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragant und Gummiarabicum; Dispergier- oder Netzmitteln, wie Lecithin oder Produkten der Kondensation eines Alkylenoxids mit Fettsäuren (beispielsweise Polyoxyethylenstearat) oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und einem Hexit abgeleiteten Partialestern, wie Polyoxyethylensorbitmonooleat, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und einem Hexit abgeleiteten Partialestern, wie Polyoxyethylensorbitmonooleat, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleiteten Partialestern, beispielsweise Polyethylensorbitanmonooleat. Die wäßrigen Suspensionen können außerdem einen oder mehrere Konservierungsstoffe (wie p-Hydroxybenzoesäureethylester oder -propylester), Antioxidantien (wie Ascorbinsäure), Farbstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Süßstoffe (wie Saccharose, Saccharin oder Aspartam) enthalten.
Zur Formulierung von öligen Suspensionen kann man den Wirkstoff in einem Pflanzenöl (wie Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnußöl) oder in einem Mineralöl (wie Flüssigparaffin) suspendieren. Die öligen Suspensionen können außerdem ein Verdickungsmittel, wie Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol, enthalten. Zur Bereitstellung einer schmackhaften oralen Zubereitung kann man Süßstoffe, wie die oben angeführten, und Geschmacksstoffe zusetzen. Diese Zusammensetzungen können durch Zugabe eines Antioxidans, wie Ascorbinsäure, konserviert werden.
Dispergierbare Pulver und Granulate, die zur Herstellung einer wäßrigen Suspension durch Zugabe von Wasser geeignet sind, enthalten den Wirkstoff im allgemeinen zusammen mit einem Dispergier- oder Netzmittel, Suspendiermittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln. Als Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel eignen sich beispielsweise die oben bereits aufgeführten. Es können auch noch zusätzliche Hilfsstoffe enthalten sein, wie Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Farbstoffe.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen vorliegen. Bei der Ölphase kann es sich um ein Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Erdnußöl, oder ein Mineralöl, wie beispielsweise Flüssigparaffin, oder ein Gemisch von beliebigen dieser Substanzen handeln. Als Emulgatoren eignen sich beispielsweise natürlich vorkommende Gummen, wie Gummiarabicum oder Traganth, natürlich vorkommende Phosphatide, wie Sojabohnenlecithin, von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleitete Ester oder Partialester (beispielsweise Sorbitanmonooleat) und Produkte der Kondensation dieser Partialester mit Ethylenoxid, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsionen können außerdem Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Konservierungsmittel enthalten.
Sirupe und Elixiere können mit Süßstoffen, wie Glycerin, Propylenglykol, Sorbit, Aspartam oder Saccharose, formuliert werden und außerdem ein Demulcens, ein Konservierungsmittel, einen Geschmacksstoff und/oder einen Farbstoff enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in Form einer sterilen injizierbaren wäßrigen oder öligen Suspension vorliegen, die nach bekannten Methoden unter Verwendung eines oder mehrerer der oben aufgeführten geeigneten Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel formuliert werden können. Bei einer sterilen injizierbaren Zubereitung kann es sich auch um eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel handeln, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol.
Zur Herstellung von Suppositorienformulierungen kann man den Wirkstoff mit einem geeigneten nichtreizenden Hilfsstoff, der bei gewöhnlichen Temperaturen fest ist, bei der Rektaltemperatur aber flüssig ist und daher im Rektum unter Freisetzung des Arzneistoffs schmilzt, vermischen. Geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise Kakaobutter und Polyethylenglykole.
Topische Formulierungen, wie Cremes, Salben, Gele und wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen, sind im allgemeinen dadurch erhältlich, daß man einen Wirkstoff nach an sich gut bekannten herkömmlichen Methoden mit einem herkömmlichen topisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel formuliert.
Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Insufflation können in Form eines feinteiligen Pulvers mit Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von beispielsweise 30 μ oder viel weniger vorliegen, wobei das Pulver selbst den Wirkstoff entweder für sich alleine oder mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern, wie Lactose, verdünnt enthält. Das Pulver zur Insufflation wird dann zur Verwendung mit einer Turboinhalationsvorrichtung, wie sie beispielsweise zur Insufflation des bekannten Mittels Natriumcromoglycat verwendet wird, zweckmäßigerweise in eine Kapsel mit beispielsweise 1 bis 50 mg Wirkstoff gefüllt.
Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Inhalation können in Form eines herkömmlichen Druckaerosols zur Abgabe des Wirkstoffs entweder als Aerosol mit feinteiligem Feststoff oder flüssige Tröpfchen vorliegen. Dabei kann man herkömmliche Aerosoltreib mittel verwenden, wie leichtflüchtige Fluorkohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffe, und die Aerosolvorrichtung wird zweckmäßigerweise so arrangiert, daß eine dosierte Wirkstoffmenge abgegeben wird.
Für weitere Informationen über die Formulierung wird der Leser auf Kapitel 25.2 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
Die mit einem oder mehreren Hilfsstoffen zu einer Einzeldosisform vereinigte Wirkstoffmenge variiert notwendigerweise in Abhängigkeit von dem behandelten Wirt und dem jeweiligen Verabreichungsweg. So wird eine für die orale Verabreichung an Menschen vorgesehene Formulierung im allgemeinen beispielsweise 0,5 mg bis 2 g Wirkstoff in Abmischung mit einer geeigneten und zweckmäßigen Menge von Hilfsstoffen, die von etwa 5 bis etwa 98 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, variieren kann, enthalten. Dosiseinheitsformen enthalten im allgemeinen etwa 1 mg bis etwa 500 mg eines Wirkstoffs. Für weitere Informationen über Verabreichungswege und Dosierungsschemas wird der Leser auf Kapitel 25.3 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
Die Größe der Dosis einer Verbindung der Formel I für therapeutische oder prophylaktische Zwecke wird natürlich gemäß an sich gut bekannten medizinischen Prinzipien je nach Art und Schwere der Leiden, dem Alter und Geschlecht des Tiers bzw. Patienten und dem Verabreichungsweg variieren. Wie oben bereits erwähnt, eignen sich Verbindungen der Formel I zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen oder medizinischen Zuständen, die ganz oder teilweise auf die Wirkungen von MCP-1 und/oder RANTES zurückzuführen sind, beispielsweise rheumatoide Arthritis.
Bei der Verwendung einer Verbindung der Formel I für therapeutische oder prophylaktische Zwecke wird die Verbindung im allgemeinen so verabreicht, daß die gegebenenfalls in Teildosen verabreichte Tagesdosis im Bereich von zum Beispiel 0,5 mg bis 75 mg pro kg Körpergewicht liegt. Bei parenteraler Verabreichung werden im allgemeinen niedrigere Dosen gegeben. So wird beispielsweise für die intravenöse Verabreichung im allgemeinen eine Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 30 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Ganz analog wird bei inhalativer Verabreichung eine Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 25 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Bevorzugt ist jedoch die orale Verabreichung.
Gegenstand der Erfindung ist gemäß einer weiteren Ausgestaltung eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Prodrug davon gemäß obiger Definition zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie. Zweckmäßigerweise führt man die Behandlung einer entzündlichen Krankheit so durch, daß man eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen in vivo hydrolysierbaren Ester davon oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß obiger Beschreibung verabreicht.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel (I) und ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon zur Verwendung als Arzneimittel.
Zweckmäßigerweise handelt es sich hierbei um eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon zur Verwendung als Arzneimittel zur Antagonisierung einer durch MCP-1 (und/oder RANTES) vermittelten Wirkung bei einem Warmblüter wie einem Menschen.
Gegenstand der Erfindung ist somit gemäß einer weiteren Ausgestaltung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Prodrug davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Antagonisierung einer durch MCP-1 (und/oder RANTES) vermittelten Wirkung bei einem Warmblüter wie dem Menschen.
Außerdem kann die Antagonisierung einer durch MCP-1 (und/oder RANTES) vermittelten Wirkung bei einem Warmblüter wie dem Menschen, der einer derartigen Behandlung bedarf, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines in vivo hydrolysierbaren Esters davon gemäß obiger Definition erreicht werden.
Biologische Tests
Die folgenden biologischen Testmethoden, Daten und Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Abkürzungen:

ATCC

American Type Culture Collection, Rockville, USA

BCA

Bicinchroninsäure (wird zusammen mit Kupfersulfat für den Proteinassay verwendet)

BSA

Rinderserumalbumin

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

EGTA

Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure

FCS

Fötales Kälberserum

HEPES

(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2- ethansulfonsäure])

HBSS

Hank's Balanced Salt Solution

hMCP-1

Humanes Monocyte Chemoattractant Protein-1

PBS

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PCR

Polymerasekettenreaktion

Als Quelle für thermostabile DNA-Polymerase wird AMPLITAQ^TM von Perkin-Elmer Cetus verwendet.
Bei dem Bindungspuffer handelt es sich um 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% fötales Kälberserum, mit 1M NaOH auf pH 7,2 eingestellt.
Bei den nichtessentiellen Aminosäuren (100fach konzentriert) handelt es sich um: L-Alanin, 890 mg/l; L-Asparagin, 1320 mg/l; L-Asparaginsäure, 1330 mg/l; L-Glutaminsäure, 1470 mg/l; Glycin, 750 mg/l; L-Prolin, 1150 mg/l und L-Serin, 1050 mg/l.
Das Hypoxanthin- und Thymidin-Supplement (50fach konzentriert) besteht aus: Hypoxanthin, 680 mg/l und Thymidin, 194 mg/l.
Penicillin-Streptomycin ist: Penicillin G (Natriumsalz); 5000 Einheiten/ml; Streptomycinsulfat, 5000 μg/ml.
Zellen der humanen Monozyten-Zellinie THP-1 sind erhältlich von der ATCC, Zugangsnummer ATCC TIB-202.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) wurde von Gibco bezogen; siehe Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1949, 71, 196.
Das synthetische Zellkulturmedium RPMI 1640 wurde von Gibco bezogen; es enthält anorganische Salze [Ca(NO₃)₂·4N₂O 100 mg/l; KCl 400 mg/l; MgSO₄·7H₂O 100 mg/l; NaCl 6000 mg/l; NaHCO₃ 2000 mg/l & Na₂HPO₄ (wasserfrei) 800 mg/l], D-Glucose 2000 mg/l, reduziertes Glutathion 1 mg/l, Aminosäuren und Vitamine.
Bei FURA-2/AM handelt es sich um 1-[2-(5-Carboxyoxazol-2-yl)-6-aminobenzofuran-5-oxy]-2-(2'-amino-5'-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäurepentaacetoxy methylester, der von Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA, bezogen wurde.
Blutsedimentationspuffer enthält 8,5 g/l NaCl und 10 g/l Hydroxyethylcellulose.
Lysepuffer besteht aus 0,15 M NH₄Cl^–, 10 mM KHCO₃, 1 mM EDTA.
Bei dem Ganzzellen-Bindungspuffer handelt es sich um 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% BSA, 0,01% NaN₃, mit 1 M NaOH eingestellt auf pH 7,2.
Bei dem Waschpuffer handelt es sich um 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% hitzeinaktiviertes FCS, 0,5 M NaCl, mit 1 M NaOH eingestellt auf pH 7,2.
Es können allgemeine molekularbiologische Verfahrensweisen aus allen der in „Molecular Cloning – A Laboratory Manual" 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Methoden befolgt werden.
i) Klonierung und Expression des hMCP-1-Rezeptors
Die cDNA des MCP-1-Rezeptors B (CCR2B) wurde aus zellulärer THP-1-RNA mittels PCR unter Verwendung geeigneter Oligonucleotidprimer auf Grundlage der veröffentlichten MCP-1-Rezeptorsequenzen (Charo et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752) kloniert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in den Vektor PCR-II^TM (InVitrogen, San Diego, CA.) kloniert. Die fehlerfreie CCR2B-cDNA wurde dann als ein Hind III-Not I-Fragment in den eukaryontischen Expressionsvektor pCDNA3 (InVitrogen) subkloniert, so daß pCDNA3/CC-CKR2A bzw. pCDNA3/CCR2B erhalten wurde.
Linearisierte pCDNA3/CCR2B-DNA wurde in CHO-K1-Zellen mittels Calciumphosphatpräzipitation transfiziert (Wigler et al., 1979, Cell, 16, 777). Die transfizierten Zellen wurden durch Zugabe von Geneticin-Sulfat (G418, Gibco BRL) in einer Konzentration von 1 mg/ml 24 Stunden nach Transfektion der Zellen selektioniert. RNA-Präparation und Northern-Blots wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Needham et al., 1995, Prot. Express. Purific., 6, 134). Der CHO-K1-Klon 7 (CHO-CCR2B) wurde als Klon mit der höchsten MCP-1-Rezeptor-B-Expression identifiziert.
ii) Herstellung von Membranfragmenten
CHO-CCR2B-Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1× nichtessentiellen Aminosäuren, 1× Hypoxanthin- und Thymidin-Supplement und Penicillin-Streptomycin (mit 50 μg Streptomycin/ml, Gibco BRL), angezogen. Die Herstellung der Membranfragmente erfolgte nach Zellyse/Differentialzentrifugationsverfahren wie zuvor beschrieben (Siciliano et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 19658). Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Proteinassay (Pierce, Rockford, Illinois) gemäß den Anweisungen des Herstellers abgeschätzt.
iii) Assay
¹²⁵I-MCP-1 wurde durch Bolton-Hunter-Konjugation (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc) hergestellt. Die Gleichgewichts-Bindungsassays wurden nach der Methode von Ernst et al., 1994, J. Immunol., 152, 3541 durchgeführt. Kurz gesagt wurden verschiedene Mengen von ¹²⁵I-markiertem MCP-1 zu 7 μg gereinigten CHO-CCR2B-Zellmembranen in 100 μl Bindungspuffer gegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bindungsreaktionsmischungen filtriert und 5mal über ein Plattenwaschgerät (Brandel Cell Harvester MLR-96T) mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen. Die Filtermatten (Brandel GF/B) wurden vor der Verwendung 60 Minuten in 0,3% Polyethylenimin eingeweicht. Nach Filtration wurden einzelne Filter in 3,5-ml-Röhrchen (Sarstedt Nr. 55.484) separiert, und gebundenes ¹²⁵I-markiertes MCP-1 wurde bestimmt (LKB 1277 Gammamaster). Kaltkompetitionsstudien wurden wie oben unter Verwendung von 100 pM ¹²⁵I-markiertem MCP-1 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von nicht markiertem MCP-1 durchgeführt. Die unspezifische Bindung wurde durch Zusatz eines 200fachen molaren Überschusses an nicht markiertem MCP-1 zum Ansatz bestimmt.
Ligandenbindungsstudien mit aus CHO-CCR2B-Zellen hergestellten Membranfragmenten zeigten, daß der CCR2B-Rezeptor in einer Konzentration von 0,2 pmol/mg Membranprotein vorlag und MCP-1 selektiv und mit hoher Affinität (IC₅₀ = 110 pM, K_d = 120 pM) band. Die Bindung an diese Membranen war vollständig reversibel und erreichte nach 45 Minuten bei Raumtemperatur den Gleichgewichtszustand, und bei Verwendung von MCP-1-Konzentrationen zwischen 100 pM und 500 pM bestand eine lineare Beziehung zwischen der MCP-1-Bindung und der CHO-CCR2B-Zellmembrankonzentration.
In DMSO (5 μl) gelöste Testverbindungen wurden in einer Konkurrenzreaktion mit 100 pM markiertem MCP-1 über einen Konzentrationsbereich (0,01–50 μM) in Doppelbestimmung unter Verwendung von Dosiswirkungskurven mit jeweils acht Punkten getestet und die IC₅₀-Konzentrationen berechnet.
Die untersuchten erfindungsgemäßen Verbindungen wiesen im hier beschriebenen hMCP-1-Rezeptorbindungsassay IC₅₀-Werte von 50 μM oder weniger auf.
b) MCP-1-vermittelter Calciumfluß in THP-1-Zellen
Die humane Monozyten-Zellinie THP-1 wurde in einem synthetischen Zellkulturmedium RPMI 1640, das mit 10% fötalem Kälberserum, 6 mM Glutamin und Penicillin- Streptomycin (mit 50 μg Streptomycin/ml, Gibco BRL) supplementiert war, angezogen. Die THP-1-Zellen wurden in HBSS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) + 1 mg/ml BSA gewaschen und im gleichen Puffer in einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Danach wurden die Zellen mit 1 mM FURA-2/AM 30 min bei 37°C beladen, zweimal in HBSS gewaschen und mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die THP-1-Zellsuspension (0,9 ml) wurde in eine 5-ml-Einwegküvette mit Magnetrührstab und 2,1 ml vorgewärmter (37°C) HBSS mit 1 mg/ml BSA, 1 mM MgCl₂ und 2 mM CaCl₂ überführt. Die Küvette wurde in ein Fluoreszenzspektralphotometer (Perkin Elmer, Norwalk, CT) gestellt und unter Rühren 4 min bei 37°C vorinkubiert. Die Fluoreszenz wurde über 70 s aufgezeichnet, wobei die Zellen nach 10 s durch die Zugabe von hMCP-1 in die Küvette stimuliert wurden. (Ca²⁺)i wurde durch abwechselnde Anregung bei 340 nm und 380 nm und nachfolgende Messung der Intensität der Fluoreszenzemission bei 510 nm gemessen. Das Verhältnis (R) der Intensitäten des nach Anregung bei 340 nm bzw. 380 nm emittierten Fluoreszenzlichts wurde berechnet und angezeigt, so daß daraus gemäß der Gleichung:
in der die K_d für den FURA-2-Ca²⁺-Komplex bei 37°C mit 224 nm angenommen wurde, die [Ca²⁺] im Zytoplasma abgeschätzt werden konnte. R_max ist das nach Zugabe von 10 mM Ionomycin bestimmte maximale Fluoreszenzverhältnis, R_min ist das durch die nachfolgende Zugabe einer Ca²⁺-freien Lösung mit 5 mM EGTA bestimmte minimale Verhältnis, und Sf2/Sb2 ist das Verhältnis der Fluoresenzwerte, die bei R_min bzw. R_max bei einer Anregung von 380 nm bestimmt wurden.
Die Stimulierung von THP-1-Zellen mit hMCP-1 induzierte einen schnellen, vorübergehenden Anstieg der [Ca²⁺]_i auf spezifische und dosisabhängige Weise. Die Dosiswirkungskurven deuteten auf einen ungefähren EC₅₀-Wert von 2 nm hin. Die in DMSO (10 μl) gelösten Test verbindungen wurden auf die Hemmung der Calciumfreisetzung getestet, indem sie 10 s vor der Zugabe des Liganden zu der Zellsuspension gegeben wurden und die Verringerung des transienten Anstiegs von (Ca²⁺]i gemessen wurde. Die Testverbindungen wurden auch auf fehlenden Agonismus untersucht, indem sie anstelle von hMCP-1 zugesetzt wurden.
c) Durch hMCP-1 und RANTES vermittelte Chemotaxis
Die in-vitro-Chemotaxis-Assays wurden mit der humanen Monozyten-Zellinie THP-1 durchgeführt. Die Wanderung der Zellen durch Polycarbonatmembranen wurde gemessen, indem die durch die Membranen hindurchgehenden Zellen entweder direkt in einem Coulter-Zähler oder indirekt mit einem kolorimetrischen Viabilitätsassay, bei dem die Spaltung eines Tetrazoliumsalzes durch die mitochondriale Atmungskette gemessen wurde (Scudiero D.A., et al., 1988, Cancer Res., 48, 4827–4833), gezählt wurden.
In eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die die untere Vertiefung einer mit einer PVP-freien Polycarbonatfiltermembran mit einer Porengröße von 5 μm und Kleberahmen (NeuroProbe MB series, Cabin John, MD 20818, USA) ausgestatteten Chemotaxiskammer bildet, wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers Chemoattraktoren gegeben. Der Chemoattraktor wurde in geeigneter Weise mit synthetischem Zellkulturmedium, RPMI 1640 (Gibco) verdünnt oder mit 2 mM Glutamin und 0,5% BSA oder alternativ dazu mit HBSS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ ohne Phenolrot (Gibco) plus 0,1% BSA supplementiert. Die einzelnen Verdünnungen wurden 30 min unter Vakuum entgast und in die unteren Vertiefungen der Kammer gegeben (400 μl), und in den einzelnen Vertiefungen der oberen Kammer wurden TBP-1-Zellen (5 × 10⁵ in 100 μl RPMI 1640 + 0,5% BSA) inkubiert. Zur Inhibierung der Chemotaxis wurde der Chemoattraktor auf einer konstanten submaximalen Konzentration, die zuvor bestimmt worden war (1 nM für MCP-1), gehalten und zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der in DMSO (DMSO-Endkonzentration < 0,05 v/v) gelösten Testverbindungen zur unteren Vertiefung gegeben. Die Kammer wurde 2 h bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das Medium aus den oberen Vertiefungen wurde entfernt, die Vertiefungen wurden mit 200 μl physiologischer Kochsalzlösung ausgewaschen, und die Kammer wurde dann geöffnet, wonach die Membranoberfläche trocken gewischt und die Platte mit den 96 Vertiefungen zum Ernten der Zellen 5 min bei 600 g zentrifugiert wurde. Der Überstand (150 μl) wurde abgesaugt, wonach 10 μl Zellproliferationsreagens WST-1, {4-[3-(4-Iodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-phenyldisulfonat}, sowie ein Elektronkupplungsreagens (Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1644 807) in die Vertiefungen gegeben wurde. Die Platte wurde 3 h bei 37°C inkubiert, wonach die Absorption des löslichen Formazanprodukts bei 450 nm auf einem Mikrotiterplattenlesegerät abgelesen wurde. Die Daten wurden in ein Tabellenkalkulationsprogramm eingegeben und auf eine etwaige zufällige Wanderung in Abwesenheit von Chemoattraktor korrigiert, wonach die mittleren Absorptionswerte, die Standardabweichung und Signifikanztests berechnet wurden. hMCP-1 induzierte eine konzentrationsabhängige Zellwanderung mit einer charakteristischen zweiphasigen Reaktion mit einem Maximum von 0,5–1,0 nm.
Bei einer alternativen Form des obigen Assays kann man zur Endpunktbestimmung fluoreszenzmarkierte Zellen verwenden. In diesem Fall werden die verwendeten THP-1-Zellen durch 45 Minuten Inkubation im Dunkeln in Gegenwart von 5 mM Calcein AM (Glycin-N,N'-[[3',6'- bis (acetyloxy)-3-oxospiro[isobenzofuran-1 (3H), 9'-[9H]-xanthen]-2',7'-diyl]bis(methylen)]bis[N-[2-[(acetyloxy)-methoxy]-2-oxoethyl]] -bis [(acetyloxy)methyl]ester; Molecular Probes) fluoreszenzmarkiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet und in HBSS (ohne Phenolrot) mit Ca²⁺, Mg²⁺ und 0,1% BSA resuspendiert.
50 μl (2 × 105 Zellen) der Zellsuspension werden auf den Filter über den einzelnen Vertiefungen gegeben, und die Einheit wird wie oben 2 Stunden lang bei 37°C und unter 5% CO₂ inkubiert. Danach werden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung von der oberen Oberfläche des Filters abgewaschen, der Filter wird aus der Platte entnommen, und die Zahl der Zellen, die entweder an der Unterseite des Filters oder der unteren Vertiefung haften, wird durch Ablesen der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm (fmax, Molecular Devices) abgelesen. Die Daten wurden in ein Tabellenkalkulationsprogramm eingegeben und auf eine etwaige zufällige Wanderung in Abwesenheit von Chemoattraktor korrigiert, und es können die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte, die Standardabweichung, die prozentuale Inhibierung und der IC₅₀-Wert von getesteten Verbindungen und Signifikanztests berechnet werden. Mit dieser alternativen Form des Assays wurde neben der MCP-1-induzierten Chemotaxis auch die Hemmung der durch RANTES (2 nM) induzierten Chemotaxis gemessen.
d) Bindung an humane periphere mononukleäre Blutzellen (human peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)
i) Herstellung von humanen PBMCs
Frisches menschliches Blut (200 ml) von freiwilligen Spendern wurde in Behältern mit Natriumcitrat als Antikoagulationsmittel gesammelt, so daß sich eine Endkonzentration von 0,38% ergab. Das Blut wurde mit Sedimentationspuffer vermischt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde abgetrennt und 5 Minuten bei 1700 U/min zentrifugiert (Sorvall RT6000D). Das erhaltene Pellet wurde in 20 ml RPMI/BSA (1 mg/ml) resuspendiert, und 4 × 5 ml Lymphoprepä (Nycomed) wurden in 15-ml-Zentrifugenröhrchen vorsichtig mit 4 × 5 ml Zellen überschichtet. Die Röhrchen wurden 30 Minuten bei 1700 U/min zentrifugiert (Sorvall RT6000D), und die erhaltene Zellschicht wurde entnommen und in 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden zur Entfernung jeglicher verbliebener roter Blutkörperchen zweimal mit Lysepuffer gewaschen und dann zweimal in RPMI/BSA gewaschen. Die Zellen wurden in 5 ml Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellzahl wurde in einem Coulter-Zähler bestimmt, und es wurde mit zusätzlichem Bindungspuffer bis zu einer Endkonzentration von 1,25 × 10⁷ PBMCs/ml versetzt.
ii) Assay
[¹²⁵I]MCP-1 wurde durch Bolton-Hunter-Konjugation (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc] hergestellt. Die Gleichgewichts-Bindungsassays wurden nach der Methode von Ernst et al., 1994, J. Immunol., 152, 3541, durchgeführt. Kurz gesagt wurden 50 μl von ¹²⁵I-markiertem MCP-1 (Endkonzentration 100 pM) zu 40 μl (5 × 10⁵ Zellen) Zellsuspension in einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Verbindungen wurden in Ganzzellen-Bindungspuffer aus einer Stammlösung von 10 mM in DMSO verdünnt in einem Endvolumen von 5 μl zugesetzt, um die DMSO-Konzentration im Assay konstant bei 5% zu halten. Die Gesamtbindung wurde in Abwesenheit von Verbindung bestimmt. Die nichtspezifische Bindung wurde durch Zugabe von 5 μl kaltem MCP-1 zu einer Assayendkonzentration von 100 nM definiert. Die Assay-Vertiefungen wurden mit Ganzzellen-Bindungspuffer auf ein Endvolumen von 100 μl aufgefüllt, und die Platten wurden versiegelt. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37°C wurden die Bindungsreaktionsmischungen filtriert und auf einem Plattenwaschgerät (Brandel MLR-96T Cell Harvester) 10 Sekunden mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen. Die Filtermatten (Brandel GF/B) wurden vor der Verwendung 60 Minuten lang in 0,3% Polyethylenimin plus 0,2% BSA eingeweicht. Nach Filtration wurden die einzelnen Filter in 3,5-ml-Röhrchen (Sarstedt Nr. 55.484) separiert, und gebundenes ¹²⁵I-markierte MCP-1 wurde bestimmt (LKB 1277 Gammamaster).
Die Wirksamkeit der Testverbindung wurde in Doppelbestimmung unter Verwendung von Dosiswirkungskurven mit jeweils sechs Punkten bestimmt, und die IC₅₀-Konzentrationen wurden berechnet.
Für die getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen wurde bei der effektiven Dosis keine physiologisch unannehmbare Toxizität beobachtet.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, aber nicht eingeschränkt, wobei die folgenden allgemeinen Verfahrensweisen angewandt wurden, sofern nicht anders vermerkt.

i) N,N-Dimethylformamid (DMF) wurde über 4-Å-Molekularsieb getrocknet. Wasserfreies Tetrahydrofuran (THF) wurde SURESEAL^TM-Flaschen von Aldrich entnommen. Andere im Handel erhältliche Reagentien und Lösungsmittel wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt, sofern nicht anders vermerkt. Extrakte organischer Lösungsmittel wurden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet.
ii) ¹H-, ¹³C- und ¹⁹F-NMR wurden mit WM200-, WM250-, WM300- oder WM400-Geräten von Bruker aufgezeichnet, wobei DMSO-d₆ mit Me₄Si bzw. CCl₃F als internem Standard verwendet wurde, sofern nicht anders vermerkt. Chemische Verschiebungen sind in d (ppm) angegeben, und die Signalmultiplizitäten sind folgendermaßen bezeichnet: s: Singulett; d: Dublett; dd: Dublett von Dubletts; t: Triplett; dt: Dublett von Tripletts; q: Quartett; m: Multiplett; br: breit.
iii) Massenspektren wurden auf einem 12-12-Quadrupol-Spektrometer von VG, einem 70-250-SE-Spektrometer von VG, einem ZAB-2-SE-Spektrometer von VG oder einem von VG modifizierten AEI/Kratos-MS9-Spektrometer aufgenommen.
iv) Für die DC-Analyse, wurden vorbeschichtete DC-Platten von Merck (Kieselgel 60 F254, d = 0,25 mm) verwendet.
v) Die Flashchromatographie wurde an Kieselgel (Merck Kieselgel: Art. 9385) durchgeführt.

Beispiel 1
N-(3-Methoxy-4-chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
Eine gerührte Lösung von N-(3-Methoxy-4-chlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester (305 mg) in Methanol (3 ml) und THF (3 ml) wurde mit Natriumhydroxid (2 M, 1,9 ml) versetzt. Der Ansatz wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung im Vakuum aufkonzentriert und mit Wasser (5 ml) verdünnt. Die Lösung wurde durch Zugabe von wäßriger Salzsäure (2 M) angesäuert, mit Essigsäureethylester extrahiert, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von 20–100% Essigsäureethylester als Elutionsmittel gereinigt, was das gewünschte Produkt in Form eines Feststoffs ergab (177 mg, 70%), NMR (CD₃SOCD₃): d 3,95 (s, 3H), 5,95 (s, 2H), 6,35 (d, 1H), 6,8 (dd, 1H), 6,9 (d, 1H), 7,0 (d, 1H), 7,1 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,3 (d, 1H), 9,0 (s, 1H); m/z 332 (M + H⁺).
Es wurde unter Verwendung des entsprechenden Indolesters als Ausgangsstoff analog obigem Beispiel verfahren. So wurden die nachstehend beschriebenen Verbindungen erhalten.
Beispiel 2
N-(3-Chlor-4-methoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

88% Ausbeute. NMR (CD₃SOCD₃): d 3,75 (s, 3H), 5,7 (s, 2H), 6,8 (dd, 1H), 6,9–7,1 (m, 5H), 7,4 (d, 1H), 9,0 (bs, 1H); m/z 330 (M – H⁺).

Beispiel 3
N-(3-Chlor-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

63% Ausbeute; m/z 314 (M – H⁺).

Beispiel 4
N-(3-Nitro-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

5% Ausbeute; m/z 326 (M – H⁺).

Beispiel 5
N-(3-Chlor-4-trifluormethoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

82% Ausbeute. NMR (CD₃SOCD₃): d 5,8 (s, 2H), 6,8 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,45 (m, 1H), 9,0 (s, 1H), 12,82 (s, 1); m/z 384 (M – H⁺).

Beispiel 6
N-(3-Nitro-4-chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

56% Ausbeute. NMR (CD₃SOCD₃): d 5,85 (s, 2H), 6,85 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,8 (d, 1H), 9,0 (s, 1H).

Beispiel 7
N-(3-Fluor-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure

18% Ausbeute. NMR (CD₃SOCD₃): d 5,7 (s, 2H), 6,7 (m, 3H), 6,9 (s, 1H), 7,1 (m, 3H), 7,3 (m, 1H), 9,0 (s, 1H), 12,8 (s, 1H); m/z 298 (M – H⁺).

Beispiel 8
N-[(4-Chlor-3-ethinylphenyl)methyl]-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
Eine Lösung von N-[(4-Chlor-3-trimethylsilylethinylphenyl)methyl]-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester (0,14 g) in Methanol (5 ml) wurde mit Natriumhydroxid (2 M, 1,8 ml) versetzt, wonach die Mischung 3 Stunden gerührt wurde. Nach Entfernung des Methanols wurde der erhaltene Rückstand mit Wasser (20 ml) verdünnt und zweimal mit Essigsäureethylester (jeweils 20 ml) extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit wäßriger Salzsäure (2 M) angesäuert und mit Essigsäureethylester (3 × 25 ml) extrahiert. Die vereinigten Essigsäureethylesterextrakte wurden mit Wasser (30 ml) und Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in einer Mischung aus Essigsäureethylester und Isohexan (1:1) gelöst und durch eine 5g-Siliciumoxid-Isolute-Säule geschickt, wobei als Elutionsmittel eine Mischung aus Essigsäureethylester und Isohexan (1:1) verwendet wurde, was die Titelverbindung (65 mg) ergab. NMR (CD₃SOCD₃): d 4,5 (s, 1H), 5,7 (s, 2H), 6,8 (m, 1H), 6,9 (m, 2H), 7,1 (m, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,4 (m, 2H), 9,0 (s, 1H); m/z 324,4 (M – H).
Herstellung von Ausgangsstoffen
Die Ausgangsstoffe für die obigen Beispiele sind entweder im Handel erhältlich oder nach Standardmethoden aus bekannten Substanzen leicht zugänglich. So sind beispielsweise die folgenden Umsetzungen (Methoden A–D) Erläuterungen, aber keine Einschränkungen der Herstellung der bei den obigen Umsetzungen verwendeten Ausgangsstoffe.
Methode A
5-Acetoxy-N-(3-methoxy-4-chlorbenzyl)indol-2-carbonsäureethylester
i) 5-Hydroxyindol-2-carbonsäureethylester
Bortribromid (64,58 g) wurde bei –78°C unter Argonatmosphäre zu einer gerührten Lösung von 5-Methoxyindol-2-carbonsäureethylester (20 g) in Dichlormethan (1000 ml) getropft. Der Ansatz wurde auf Raumtemperatur kommen gelassen und noch 2 Stunden gerührt. Dann wurde der Ansatz unter Rühren in Eis/gesättigte wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und wäßriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Nach Aufkonzentrieren der Lösung im Vakuum wurde der Rückstand mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von 0–60% Diethylether/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, was das Produkt in Form eines weißen Feststoffs ergab (9,02 g, 48%). NMR: 1,31 (t, 3H), 4,29 (q, 2H), 6,79 (dd, 1H), 6,90 (dd, 1H), 7,22 (d, 1H), 8,84 (s, 1H), 11,52 (brs, 1H); m/z 206 (M + H⁺).
ii) 5-Acetoxyindol-2-carbonsäureethylester
Eine gerührte Lösung von 5-Hydroxyindol-2-carbonsäureethylester (7,79 g) und 4-Dimethylaminopyridin (20 mg) in Essigsäureanhydrid (80 ml) wurde 4 Stunden auf 80°C erhitzt. Dann wurde der Ansatz im Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in Essigsäureethylester gelöst. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzsäure (2 M), gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und wäßriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum aufkonzentriert, was das Produkt in Form eines gelben Feststoffs ergab (9,39 g, 100%). NMR: 1,20 (t, 3H), 2,10 (s, 3H), 4,19 (q, 2H), 6,86 (dd, 1H), 6,97 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,29 (d, 1H); m/z 248 (M + H⁺).
iii) 5-Acetoxy-N-(3-methoxy-4-chlorbenzyl)indol-2-carbonsäureethylester
Eine Lösung von 5-Acetoxyindol-2-carbonsäureethylester (283 mg) in DMF (6 ml) wurde mit Natriumhydrid (54 mg, 60%ige Dispersion in Öl) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten gerührt und mit einer katalytisch wirksamen Menge Kaliumiodid und einer Lösung von 3-Methoxy-4-chlorbenzylbromid (345 mg) in DMF (2 ml) versetzt. Die Mischung wurde 2 Stunden gerührt, mit Wasser gequencht und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet und eingedampft, wonach die erhaltene gummiartige Substanz mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von 20% Essigsäureethylester/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt wurde, was das gewünschte Produkt in Form eines Öls ergab, das beim Stehen fest wurde (310 mg, 63%). NMR (CDCl₃): d 1,4 (t, 3H), 2,3 (s, 3H), 3,8 (s, 3H), 4,35 (q, 2H), 5,8 (s, 2H), 6,5 (dd, 1H), 6,7 (d, 1H), 7,05 (dd, 1H), 7,2–7,4 (m, 4H); m/z 402 (M + H⁺).
Es wurde unter Verwendung des entsprechenden Benzylhalogenids wie in den Methoden A i)–iii) verfahren. So wurden die nachstehend beschriebenen Verbindungen erhalten.
N-(3-Chlor-4-methoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäureethylester

58% Ausbeute; m/z 402 (MH⁺).

N-(3-Chlor-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäureethylester

73% Ausbeute; m/z 386 (MH⁺).

N-(3-Nitro-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäureethylester

41% Ausbeute; m/z 396 (MH⁺).

N-(3-Chlor-4-trifluormethoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäureethylester

86% Ausbeute. NMR (CD₃SOCD₃): d 1,25 (t, 3H), 2,25 (s, 3H), 4,25 (q, 2H), 5,85 (s, 2H), 6,95 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,39 (m, 2H), 7,45 (m, 2H), 7,6 (m, 1H); m/z 456 (MH⁺).

N-(3-Nitro-4-chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäureethylester

55% Ausbeute; NMR (CD₃SOCD₃): d 1,39 (t, 3H), 2,31 (s, 3H), 4,32 (q, 2H), 5,81 (s, 2H), 7,04–7,15 (m, 2H), 7,21–7,3 (m, 1H), 7,36–7,44 (m, 3H), 7,62 (s, 1H).

Methode B
3-Methoxy-4-chlorbenzylbromid
(i) 3-Methoxy-4-chlortoluol
Eine Lösung von 2-Chlor-5-methylphenol (15,95 g) in Aceton (200 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (38 g) und Dimethylsulfat (11,7 ml) versetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt und dann filtriert, was das gewünschte Produkt ergab, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde (16,95 g, 98%). NMR (CDCl₃): d 2,35 (s, 3H), 3,9 (s, 3H), 6,7–6,8 (m, 2H), 7,15–7,3 (m, 1H).
(ii) 3-Methoxy-4-chlorbenzylbromid
Eine Mischung von 3-Methoxy-4-chlortoluol (9,62 g) und N-Bromsuccinimid (12,05 g) wurde unter Bestrahlung mit Licht unter Verwendung einer Photoflood-Lampe 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde die Mischung abgekühlt, filtriert und zu einem Öl eingedampft, welches mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Diethylether als Elutionsmittel gereinigt wurde, was das gewünschte Produkt in Form eines Öls ergab (14,67 g, 95%). NMR (CDCl₃): d 3,9 (s, 3H), 4,45 (s, 2H), 6,9–7,0 (m, 2H), 7,3–7,4 (m, 1H).
Analog dazu, aber ausgehend von 2-Chlor-4-methylphenol, wurde folgende Verbindung hergestellt.
3-Chlor-4-methoxybenzylbromid

96% Ausbeute. NMR (CDCl₃): d 3,9 (s, 3H), 4,45 (s, 2H), 6,9 (d, 1H), 7,25 (dd, 1H), 7,4 (d, 1H).

Methode C
3-Nitro-4-chlorbenzylbromid
Eine auf 5°C abgekühlte Lösung von 3-Nitro-4-chlorbenzylalkohol (4,67 g) und Triphenylphosphin (6,53 g) in Dichlormethan (150 ml) wurde unter Argonatmosphäre mit Tetrabromkohlenstoff (8,27 g) versetzt. Die erhaltene Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Mischung aufkonzentriert und mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan, ansteigend auf 20% Essigsäureethylester/Isohexan, als Elutionsmittel gereinigt, was das gewünschte Produkt in Form eines gelben Öls ergab (5,39 g, 86%). NMR (CDCl₃): d 4,5 (s, 2H), 7,5 (s, 2H), 7,9 (s, 1H).
Methode D
N-[(4-Chlor-3-trimethylsilylethinylphenyl)methyl]-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester
(i) 4-Chlor-3-iodbenzylalkohol
Boran-THF-Komplex (10 ml) wurde über einen Zeitraum von 20 Minuten zu einer Lösung von 4-Chlor-3-iodbenzoesäure (1,4 g) in THF (25 ml) getropft. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden gerührt und dann auf einem Eisbad abgekühlt und vorsichtig mit Methanol (20 ml) versetzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Methanol (10 ml) gelöst und 2 Stunden mit 2 M Natronlauge (10 ml) gerührt. Nach Zugabe von Essigsäureethylester (50 ml) wurde die Mischung mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung (50 ml) gewaschen. Die wäßrigen Extrakte wurden mit Essigsäureethylester (2 × 50 ml) gewaschen, wonach die vereinigten Essigsäureethylesterextrakte mit Wasser (50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und getrocknet wurden. Durch Entfernung des Lösungsmittels wurde 4-Chlor-3-iodbenzylalkohol (1,15 g) erhalten. NMR (CD₃SOCD₃): d 4,45 (d, 2H), 5,3 (t, 1H), 7,3 (m, 1H), 7,5 (m, 1H), 7,8 (s, 1H).
(ii) 4-Chlor-3-iodbenzylbromid
Eine Lösung von 4-Chlor-3-iodbenzylalkohol (1,1 g) in Dichlormethan (40 ml) wurde bei 0°C portionsweise mit Triphenylphosphin (1,1 g) versetzt und noch 10 Minuten gerührt. Dann wurde über einen Zeitraum von 2 Minuten portionsweise Tetrabromkohlenstoff (1,5 g) zugegeben, wonach die Reaktionsmischung auf Umgebungstemperatur kommen gelassen und 15 Stunden gerührt wurde. Danach wurde die Lösung direkt auf eine mit Siliciumoxid gefüllte Chromatographiesäule aufgegeben und mit Dichlormethan eluiert, was 4-Chlor-3-iodbenzylbromid (1,9 g) ergab. NMR (CD₃SOCD₃): d 4,6 (s, 2H), 7,5 (m, 2H), 7,6 (s, 1H), 8,0 (m, 1H).
(iii) N-[(4-Chlor-3-iodphenyl)methyl]-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester
Eine Lösung von 5-Acetoxyindol-2-carbonsäureethylester (1,29 g) und Tetra-n-butylammoniumiodid (10 mg) in wasserfreiem DMF (25 ml) wurde unter Argonstrom mit Natriumhydrid (0,23 g einer 60%igen Dispersion in Öl) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten gerührt und dann mit einer Lösung von 4-Chlor-3-iodbenzylbromid (1,9 g) in DMF (5 ml) versetzt. Die Mischung wurde 15 Stunden gerührt und dann mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (5 ml) versetzt. Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (50 ml) verdünnt und mit Essigsäureethylester (3 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigten Essigsäureethylesterextrakte wurden mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und getrocknet. Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie an Siliciumoxid unter Verwendung einer Mischung von Essigsäureethylester und Isohexan (1:9) als Elutionsmittel gereinigt, was die Titelverbindung ergab (0,21 g). NMR (CD₃SOCD₃): d 1,1 (t, 3H), 2,2 (s, 3H), 4,3 (m, 2H), 5,8 (s, 2H), 6,9 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,4 (m, 2H), 7,6 (m 2H), 7,7 (m, 2H); m/z 497,5 (M + H).
(iv) N-[(4-Chlor-3-trimethylsilylethinylphenyl)methyl]-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester
Eine entgaste Lösung von N-[(4-Chlor-3-iodphenyl)methyl]-5-acetoxyindol-2-carbonsäureethylester (0,2 g), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (2 mg), Triethylamin (56i1) und Kupfer(I)-iodid (1 mg) in Acetonitril wurde mit Trimethylsilylacetylen (114i1) versetzt, wonach die Mischung 12 Stunden unter Argon atmosphäre gerührt wurde. Nach Zugabe eines weiteren Aliquots von Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (2 mg) und Trimethylsilylacetylen (11411) wurde noch 2 Stunden gerührt. Nach Zugabe eines weiteren Aliquots von Trimethylsilylacetylen (11411) wurde noch 12 Stunden gerührt. Nach Zusatz einer kleinen Menge Siliciumoxid zur Reaktionsmischung wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde auf eine 5-g-Siliciumoxid-Isolute-Säule aufgegeben und mit einer Mischung von Essigsäureethylester und Isohexan (1:4) eluiert, was die Titelverbindung in Form eines farblosen Öls ergab (0, 15 g). NMR (CD₃SOCD₃): d 0,0 (s, 9H), 1,1 (t, 3H), 2,1 (s, 3H), 4,1 (m, 2H), 5,6 (s, 2H), 6,7 (m, 2H), 6,9 (m, 2H), 7,1 (m, 1H), 7,2 (m, 2H), 7,3 (m, 1H), 7,4 (m, 1H); m/z 468,5 (M + H).
Beispiel 9
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In diesem Beispiel werden pharmazeutische Dosierungsformen der Erfindung gemäß der vorliegenden Definition (wobei der Wirkstoff als „Verbindung X" bezeichnet wird) zur therapeutischen oder prophylaktischen Verwendung an Menschen erläutert, aber nicht eingeschränkt:
Beispiel A (a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(k)
(l)
Anmerkung:

Bei der Verbindung X in der obigen Formulierung kann es sich um eine der hier in Beispielen erläuterten Verbindungen handeln.
Die obigen Formulierungen sind durch in der Pharmazie gut bekannte und übliche Verfahrensweisen erhältlich. Die Tabletten (a)–(c) können mit herkömmlichen Mitteln magensaftresistent beschichtet werden, beispielsweise mit einem Überzug aus Celluloseacetatphthalat. Die Aerosolformulierungen (h)–(k) können in Verbindung mit Standarddosieraerosoldispensern verwendet werden, und die Suspendiermittel Sorbitantrioleat und Sojalecithin können durch ein alternatives Suspendiermittel, wie z.B. Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat, Polysorbat 80, Polyglycerinoleat oder Ölsäure, ersetzt werden.

Claims

Verbindung der Formel (I):
worin: R¹ für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht; R² für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht; R³ für eine Halogengruppe, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Alkoxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin n 0, 1 oder 2 bedeutet und R⁷ eine Alkylgruppe bedeutet, steht; R⁴ für Halogen, Trifluormethyl, Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy oder C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl steht; R⁵ für Wasserstoff, Halogen, Cyano, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl oder COR⁸, worin R⁸ C_1-6-Alkyl bedeutet, steht; R⁶ für Wasserstoff, Halogen, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl oder COR⁹, worin R⁹ C_1-6-Alkyl bedeutet, steht; mit der Maßgabe, daß dann, wenn R¹ für Wasserstoff, Halogen oder Methoxy steht, R² für Wasserstoff, Halogen, Methyl, Ethyl oder Methoxy steht, R⁵ und R⁶ beide für Wasserstoff stehen und eine der Gruppen R³ oder R⁴ für Chlor, Fluor oder Trifluormethyl steht, die andere nicht für Halogen oder Trifluormethyl steht; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein in vivo spaltbarer Ester davon.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der in der Formel (I): R¹ für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R² für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R³ für eine Halogengruppe, Nitro oder Alkoxy steht; R⁴ für eine Halogengruppe, C_1-4-Alkyl, Methoxy oder Trifluormethoxy steht; R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der in der Formel (I): R¹ für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R² für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R³ für Trifluormethyl steht; R⁴ für Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy, C_1-6-Alkyl oder C_2-6-Alkinyl steht; R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der in der Formel (I): R¹ für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R² für Wasserstoff oder eine Halogengruppe steht; R³ für C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Alkoxy, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin R⁷ und n die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, steht; R⁴ für eine Halogengruppe oder Trifluormethyl steht; R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich um eine Verbindung der Formel (IA) handelt:
worin: R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen; R^3' für Chlor, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Alkoxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, C(O)R⁷ oder S(O)_nR⁷, worin R⁷ und n die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, steht; R^4' für eine Halogengruppe, Methylthio, Methoxy, Trifluormethoxy oder Methyl steht; mit der Maßgabe, daß dann, wenn R^3' für Chlor oder Trifluormethyl steht, R^4' nicht für Halogen steht; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein in vivo spaltbarer Ester davon.
Verbindung nach Anspruch 5, bei der in der Formel (IA): R¹ und R² für Wasserstoff stehen; R^3' für Methoxy, Chlor oder Nitro steht; R^4' für Chlor, Methyl, Methoxy oder Trifluormethoxy steht.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich um eine der folgenden Verbindungen handelt: N-(3-Methoxy-4-chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Chlor-4-methoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Chlor-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Nitro-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Chlor-4-trifluormethoxybenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Nitro-4-chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-(3-Fluor-4-methylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure; N-[(4-Chlor-3-ethinylphenyl)methyl]-5-hydroxyindol-2-carbonsäure.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines in vivo spaltbaren Esters davon, bei dem man: (a) eine Verbindung der Formel (II):
worin R¹, R², R⁵ und R⁶ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, R^a für Carboxy oder eine geschützte Form davon steht, und R^b für Wasserstoff oder eine geeignete Hydroxyschutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel (III):
worin R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und L für eine austauschbare Gruppe steht, umsetzt; und gegebenenfalls danach: (b) (i) eine erhaltene Verbindung der Formel (I) in eine andere Verbindung der Formel (I) umwandelt; (ii) Schutzgruppen abspaltet oder (iii) ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen in vivo spaltbaren Ester davon bildet.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein in vivo spaltbarer Ester davon zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein in vivo spaltbarer Ester davon zur Verwendung als Arzneimittel.
Verbindung nach Anspruch 10 zur Verwendung als Arzneimittel zur Antagonisierung einer durch MCP-1 vermittelten Wirkung bei einem Warmblüter.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen in vivo spaltbaren Ester davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- oder Trägerstoff.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines in vivo spaltbaren Esters davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Antagonisierung einer durch MCP-1 vermittelten Wirkung bei einem Warmblüter.