KR20020064374A

KR20020064374A - Ｍｃｐ-1 수용체 길항제인 인돌 유도체

Info

Publication number: KR20020064374A
Application number: KR1020027009020A
Authority: KR
Inventors: 알란 웰링톤 파울; 제이슨 그랜트 케틀
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2002-08-07
Also published as: IL150276A0; NO20023381L; CA2393597A1; BR0107405A; JP2003519684A; MXPA02006612A; NZ519311A; ZA200204351B; WO2001051467A1; DE60117517T2; GB0000625D0; NO20023381D0; EP1268423A1; CN1395564A; US6984657B1; ATE318800T1; AU2387401A; DE60117517D1; EP1268423B1; AU779502B2

Abstract

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

R³은 할로기, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 알콕시, 트리플루오로메틸, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 n은 0, 1 또는 2이고 R⁷은 알킬기이고,

R⁴는 할로, 트리플루오로메틸, 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시 또는 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고,

R⁵는 수소, 할로, 시아노, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 COR⁸인데, 여기서 R⁸은 저급 알킬이고,

R⁶은 수소, 할로, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 COR⁹인데, 여기서 R⁹는 저급 알킬이나,

단, R¹이 수소, 할로 또는 메톡시인 경우, R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고, R⁵및 R⁶은 둘다 수소이고, R³또는 R⁴중 하나는 클로로, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고, 이 때 다른 하나는 할로 또는 트리플루오로메틸이 아니다.

이들 화합물은 염증성 질환의 치료를 위한, 특히 인간과 같은 온혈 동물에서 MCP-1 매개 작용을 길항작용하는 유용한 활성을 가진다.

Description

ＭＣＰ-1 수용체 길항제인 인돌 유도체 {Indole Derivatives as MCP-1 Receptor Antagonists}

본 발명은 CCR2 수용체 (또한 MCP-1 수용체로도 공지되어 있음)의 길항작용에 의해 작용하는, 특히 단구 화학주성 단백 1 (MCP-1)의 억제를 일으키는 항염증 화합물에 관한 것이다. 이들 화합물은 인돌 잔기를 함유한다. 또한 본 발명은 이들을 포함하는 제약 조성물, 이들의 제조 방법, 이들의 제조에서 유용한 중간체 및 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

MCP-1은 백혈구 화학주성 및 활성을 매개하는 전-염증 단백질의 케모카인 (chemokine) 군의 일원이다. MCP-1은 가장 효능있고 선택적인 공지된 T-세포 및 단핵세포 화학주성 물질 및 활성화제 중의 하나인 C-C 케모카인이다. MCP-1은 류마티스성 관절염, 사구체 신염, 폐섬유증, 재발협착증 (국제 특허 출원 WO 94/09128), 폐포염 (Jones et al., 1992, J. Immunol., 149, 2147) 및 천식을 포함하는 다수의 염증성 질환의 병리 생리학과 관련되어 있다. MCP-1이 병리에 작용하는 것으로 생각되는 다른 질환 분야는 죽상동맥경화증 (예를 들어 Koch et al., 1992, J. Clin. Invest., 90, 772-779), 건선 (Deleuran et al., 1996, J. Dermatological Science, 13, 228-236), 피부 지연 과민증 반응, 염증성 장질환 (Grimm et al., 1996, J. Leukocyte Biol., 59, 804-812), 다발성 경화증 및 뇌 손상 (Berman et al., 1996, J. Immunol., 156, 3017-3023)이 있다. MCP-1 저해제는 또한 발작, 재관류 손상, 국소빈혈, 심근경색 및 이식 거부반응의 치료에 유용하다.

MCP-1은 CCR2 수용체를 통해 작용한다. MCP-2 및 MCP-3도 또한 적어도 일부분은 상기 수용체를 통해 작용한다. 따라서 본 명세서에서, "MCP-1의 저해 또는 길항작용" 또는 "MCP-1 매개 작용"에 대해 언급하는 경우 MCP-2 및(또는) MCP-3가 CCR2 수용체를 통해 작용할 때 MCP-2 및(또는) MCP-3 매개 작용의 저해 또는 길항작용을 포함한다.

본 출원인은 MCP-1에 대한 저해 활성화제로 유용한 인돌 잔기를 함유하는 화합물의 종류를 밝혀냈다. 국제 특허 출원 공개 공보 WO 99/07351은 MCP-1 저해 활성을 가지는 인돌의 종류를 개시한다. 본 출원은 특정 치환된 5-히드록시 인돌이 효능 및(또는) 혈중 농도 및(또는) 생체이용률 및(또는) 용해도 면에서 예기치 않은 유익한 특성을 가진 MCP-1 저해제라는 놀라운 발견을 기초로한다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 제공한다.

상기 식에서,

R¹은 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

단, R¹이 수소, 할로 또는 메톡시인 경우, R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고, R⁵및 R⁶은 둘다 수소이고, R³또는 R⁴중 하나는 클로로, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고, R³또는 R⁴중 다른 하나는 할로 또는 트리플루오로메틸이 아니다.

본 명세서에서 용어 "알킬"은 직쇄 및 분지쇄 알킬기 둘 다를 포함하지만 "프로필"과 같은 개별적인 알킬기에 대한 언급은 직쇄만을 특별히 나타낸다. 비슷한 용어 "알케닐" 및 "알키닐"은 직쇄 또는 분지쇄 불포화 잔기를 나타낸다. 다른 언급이 없는 한, 알킬기는 1 내지 10 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6 개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 적절히 함유한다. 알케닐 및 알키닐 기는 2 내지 10 개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 6 개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 4 개의 탄소 원자를 적절히 함유한다. 접두사 "저급"은 6 개 이하 바람직하게는 4 개 이하의 탄소 원자를 갖는 기를 지시한다. 용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 나타낸다.

R¹은 수소 또는 클로로 또는 플루오로와 같은 할로가 바람직하고, 수소가 가장 바람직하다.

R²는 수소 또는 클로로 또는 플루오로와 같은 할로가 바람직하고, 수소가 가장 바람직하다.

R³의 적절한 예는 클로로와 같은 할로, 니트로 또는 메톡시와 같은 알콕시를 포함한다.

한 실시양태에서, R³은 트리플루오로메틸이고 R⁴는 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시, 알킬, 특히 메틸 또는 알키닐, 특히 에티닐이다.

R⁴의 특별한 예는 클로로와 같은 할로, 메틸과 같은 알킬, 메톡시와 같은 알콕시 또는 트리플루오로메톡시이다.

다른 바람직한 실시양태에서, R⁴는 클로로와 같은 할로 또는 트리플루오로메틸이고 R³은 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 R⁷및 n은 상기 정의된 바와 같고, R⁷은 특히 메틸 또는 에틸이다.

R⁵는 수소가 바람직하다.

R⁶은 수소가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에서 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 제공한다.

상기 식에서,

R¹및 R²는 상기 정의된 바와 같고,

R^3'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 트리플루오로메틸, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 R⁷은 알킬기이고,

R^4'는 할로, 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시 또는 메틸 기이나,

단, R^3'이 트리플루오로메틸인 경우, R^4'는 트리플루오로메틸 또는 할로가 아니다.

R¹및 R²는 수소가 바람직하다.

R^3'은 메톡시, 클로로 또는 니트로에서 선택되는 것이 바람직하다.

R^4'는 클로로, 메틸, 메톡시 또는 트리플루오로메톡시에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물은 하기 표 1에 예시된 예 중 임의의 하나를 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 화학식 I의 화합물의 모든 토토머 형태에 관한 것이다.

특정 화학식 I의 화합물은 용매화물 형태뿐만 아니라 예를 들어 수화물 형태와 같은 불용매화물 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 용매화물 형태를 포함한다.

화학식 I의 화합물은 단구 화학주성 단백-1의 저해제이다. 추가로, 이들은 화학주성을 유도하는 RANTES를 저해하는 것으로 보인다. RANTES (활성, 발현되는 정상 T-세포 및 분비의 조절 (Regulated uponActivation,NormalT-cellExpressed andSecreted))은 MCP-1과 같은 군에서 선택된, 비슷한 생물학적 프로파일을 가지는 다른 케모카인이지만, CCR1 수용체를 통해 작용한다. 그 결과, 이들 화합물은 이들 약물에 의해 매개된 질환, 특히 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

화학식 I의 화합물의 적합한 제약상 허용되는 염은 알칼리 금속 염, 예를 들어 나트륨, 알칼리 토금속 염, 예를 들어 칼슘 또는 마그네슘, 유기 아민 염, 예를 들어 트리에틸아민, 모르폴린, N-메틸피페리딘, N-에틸피페리딘, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질에틸아민, 또는 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 다른 양태에서, 화합물이 충분히 염기성인 경우, 적합한 염은 메탄술포네이트, 푸마레이트, 염산염, 브롬화수소산염, 시트르산염, 말레인산염 및 인산 및 황산으로 형성된 염과 같은 산 부가 염을 포함한다. 전하를 띤 작용기의 개수 및 양이온 또는 음이온의 원자가에 따라 하나 이상의 양이온 또는 음이온이 있을 수 있다. 바람직한 제약상 허용되는 염은 나트륨 염이다.

전구약물의 다양한 형태는 당 업계에 공지되어 있다. 이런 전구약물 유도체의 예는 하기와 같다.

a) [Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985)] 및 [Methods in Enzymology, Vol.42, p.309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985)],

b) [A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen] 및 [H. Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs", by H. Bundgaard p.113-191 (1991)],

c) [H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992)],

d) [H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285(1988)], 및

e) [N. Kakeya, et al., Chem Pharm Bull, 32, 692 (1984)].

이런 전구약물의 예는 본 발명의 화합물의 생체 내 절단 가능한 에스테르이다. 카르복시 기를 함유하는 본 발명의 화합물의 생체 내 절단 가능한 에스테르의 예로는 인간 또는 동물의 체내에서 절단되어 모 산을 생성하는 제약상 허용되는 에스테르가 있다. 카르복시에 대한 적합한 제약상 허용되는 에스테르는 C_1-6알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 또는 에틸; C_1-6알콕시메틸 에스테르, 예를 들어 메톡시메틸; C_1-6알카노일옥시메틸 에스테르, 예를 들어 피발로일옥시메틸; 프탈리딜 에스테르; C_3-8시클로알콕시카르보닐옥시 C_1-6알킬 에스테르, 예를 들어 1-시클로헥실카르보닐옥시에틸; 1,3-디옥솔란-2-일메틸 에스테르, 예를 들어 5-메틸-1,3-디옥솔란-2-일메틸; C_1-6알콕시카르보닐옥시에틸 에스테르, 예를 들어 1-메톡시카르보닐옥시에틸; 아미노카르보닐메틸 에스테르 및 그의 모노- 또는 디-N-(C_1-6알킬) 형태, 예를 들어 N,N-디메틸아미노카르보닐메틸 에스테르 및 N-에틸아미노카르보닐메틸 에스테르를 포함하고 본 발명의 화합물 내의 임의의 카르복시 기에서 형성될 수 있다. 히드록시 기를 함유하는 본 발명의 화합물의 생체 내 절단 가능한 에스테르의 예로는 인간 또는 동물의 체내에서 절단되어 모 히드록시 기를 생성하는 제약상 허용되는 에스테르가 있다. 히드록시에 대한 적합한 제약상 허용되는 에스테르는 C_1-6알카노일 에스테르, 예를 들어 아세틸 에스테르; 및 페닐 기가 아미노메틸 또는N-치환된 모노- 또는 디-C_1-6알킬 아미노메틸로 치환될 수 있는 벤조일 에스테르, 예를 들어 4-아미노메틸벤조일 에스테르 및 4-N,N-디메틸아미노메틸벤조일 에스테르를 포함한다.

본 발명의 다른 양태는

a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물과 반응시키는 단계, 및 a) 단계후에 필요한 경우,

i) 화학식 I의 화합물을 화학식 I의 다른 화합물로 전환하는 단계,

ii) 임의의 보호기를 제거하는 단계, 또는

iii) 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 형성하는 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물의 제조 방법을 제공한다:

상기 식에서,

R¹, R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶은 화학식 I에서 정의된 바와 같고,

R^a는 카르복시 또는 그의 보호된 형태이고,

R^b는 수소 또는 적합한 히드록시 보호기이고,

L은 치환 가능한 기이다.

적합한 L의 예로는 할로게노 또는 술포닐옥시 기, 예를 들어 클로로, 브로모, 메탄술포닐옥시 또는 톨루엔-4-술포닐옥시 기가 있다.

화학식 II 및 III의 화합물을 수산화 나트륨, 수소화 나트륨 또는 탄산 칼륨과 같은 염기 존재하에 N,N-디메틸포름아미드, 디클로로메탄 또는 아세토니트릴과 같은 불활성 용매 중에서 함께 적절히 반응시킨다. 적합한 반응은 황산수소 테트라-n-부틸암모늄과 같은 상 전이 촉매 존재하에서 수행된다. 반응 시간은 1 내지 6 시간, 바람직하게는 1 내지 3 시간의 범위이다. 15 내지 30 ℃, 바람직하게는 20 내지 25 ℃의 적절한 온도에서 수행된다.

화학식 II의 화합물은 상업적으로 입수가능하거나, 또는 공지된 방법을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 화학식 II의 화합물을 변형함으로써 제조할 수 있다. 특히, 이들은 하기 화학식 IV의 화합물을 하기 화학식 V의 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 식에서,

R¹, R⁵, R⁶및 R^b는 상기 정의된 바와 같고,

R^c및 R^c'은 C_1-4알킬로부터 독립적으로 선택된다.

화학식 IV 및 V의 화합물을 15 내지 30 ℃, 바람직하게는 20 내지 25 ℃의 온도에서 10 내지 20 시간 동안, 바람직하게는 15 내지 17 시간 동안 포타슘 에톡시드와 같은 염기 존재하에 테트라히드로푸란과 같은 불활성 용매 중에서와 같은 레이서트 (Reissert) 반응 조건하에서 함께 적절히 반응시킨다. 생성된 화합물을 분리시키고 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산과 같은 유기 산에 용해시키고 10 % Pd/C와 같은 전이 금속 촉매 및 시클로헥센을 첨가한다. 그 다음, 혼합물을 60 내지 120 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃의 온도에서 15 내지 25 시간, 바람직하게는 16 내지 20 시간 동안 가열하여 R^a가 -CO₂C_1-4알킬인 화학식 II의 화합물을 얻는다.

별법으로, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 VI의 화합물을 하기 화학식 VII의 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 식에서,

R¹, R⁵, R⁶및 R^b는 상기 정의된 바와 같고,

R^d는 C_1-4알킬이다.

화학식 VI 및 VII의 화합물을 60 내지 90 ℃, 바람직하게는 78 내지 85 ℃의 온도에서, 1 내지 5 시간, 바람직하게는 1 내지 3 시간 동안, 에탄올과 같은 알코올 중에서 아세트산과 같은 유기산과 함께 반응시키는 피셔 (Fischer) 조건하에서 함께 적절히 반응시킨다. 생성된 화합물을 폴리인산과 같은 강산과 혼합하고 90 내지 150 ℃, 바람직하게는 100 내지 120 ℃에서, 30 분 내지 4 시간 동안, 바람직하게는 30 분 내지 2 시간 동안 가열하여 R²가 수소인 화학식 II의 화합물을 얻는다. 그 다음, 원하는 경우, R²를 문헌에 공지된 기술을 사용하여 화학식 I에서 정의된 다른 R²로 임의로 전환시킬 수 있다.

바람직한 별법으로, 하기 화학식 VIII의 화합물의 고리화에 의해 화학식 II의 화합물을 수득한다.

상기 식에서,

R¹, R^a, R^b및 R²는 상기 정의된 바와 같다.

고리화는 크실렌과 같은 유기 용매 중에서 화합물을 환류하여 수행할 수 있다. 화학식 VIII의 화합물은 하기 화학식 IX의 화합물을 하기 화학식 X의 화합물과 반응시켜 적절히 제조할 수 있다.

상기 식에서,

R¹, R², R^b및 R^a는 상기 정의된 바와 같다.

반응은 알코올, 특히 메탄올과 같은 유기 용매 중에서, 알칼리 금속 알콕시드, 특히 나트륨 메톡시드와 같은 염기 존재하에 적절히 수행된다. -30 내지 20 ℃의 적절한 온도에서 적절히 수행된다.

화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) 및 (X)의 화합물은 공지되었거나 상업적으로 입수 가능하거나 또는 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 물질을 표준 조작하여 당업계에 공지된 방법으로 제조한다.

R^c및 R^d는 C_1-4알킬이다. 바람직하게는 R^c및 R^d는 메틸 또는 에틸이다.

본원에서 언급된 임의의 반응에서 화합물의 임의의 민감한 기를 보호하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 보호가 필요하거나 바람직한 실례 및 적합한 보호 방법은 당 업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 따라서, 반응물이 카르복시 또는 히드록시와 같은 기를 포함하는 경우 본원에서 언급된 임의의 반응에서 기의 보호가 바람직할 수 있다.

히드록시 기에 대한 적합한 보호기의 예로는 아실 기, 예를 들어 아세틸과 같은 알카노일기, 아로일 기, 예를 들어 벤조일, 또는 아릴메틸 기, 예를 들어 벤질이 있다. 상기 보호기에 대한 탈보호 조건은 보호기의 선택에 따라 물론 다양할 것이다. 따라서, 예를 들어 알카노일과 같은 아실 기 또는 아로일 기는 예를 들어, 수산화 알칼리 금속, 예를 들어 수산화 리튬 또는 수산화 나트륨과 같은 적합한 염기로 가수분해함으로써 제거할 수 있다. 별법으로 벤질 기와 같은 아릴메틸 기는 예를 들어, 탄소상 팔라듐과 같은 촉매로 수소화하여 제거할 수 있다.

카르복시 기에 대한 적합한 보호기의 예로는 에스테르화 기, 예를 들어 수산화 나트륨과 같은 염기로 가수분해함으로써 제거할 수 있는 메틸 또는 에틸 기, 또는 산, 예를 들어 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로 처리함으로써 제거할 수 있는 t-부틸 기, 또는 탄소상 팔라듐과 같은 촉매로 수소화함으로써 제거할 수 있는 벤질 기가 있다.

보호기는 화학계에 잘 공지된 통상적인 기술을 사용하여 합성의 임의의 용이한 단계에서 제거할 수 있다.

본원에 기술된 임의의 중간체는 화학식 II의 중간체와 같이 신규일 수 있고, 그 자체로 본 발명의 추가의 특징을 제공할 수 있다.

화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염은 필요한 경우, 예를 들어 상기 화합물을 생리적으로 허용되는 음이온을 생성하는 적절한 산 또는 생리적으로 허용되는 양이온을 생성하는 적절한 염기와 반응시킴으로써, 또는 임의의 다른 통상적인 염 형성 방법에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따라 상기 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 경구 용도, 예를 들어 정제, 로젠지, 경질 또는 연질 캡슐, 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 분산 가능한 분말 또는 과립, 시럽 또는 엘릭시르; 경피 용도, 예를 들어 크림, 연고, 겔 또는 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액; 흡입에 의한 투여, 예를 들어 미세 분말 또는 액체 에어로졸; 주입에 의한 투여, 예를 들어 미세 분말; 또는 비경구 투여, 예를 들어 정맥, 피하, 근육내 또는 근육내 투여를 위한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 직장 투여를 위한 좌약의 적합한 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당 업계에 잘 공지된 통상적인 제약상 부형제를 사용하여 통상적인 방법에 의해 수득할 수 있다. 따라서, 경구용의 조성물은 예를 들어, 하나 이상의 착색제, 감미료, 향료 및(또는) 방부제를 함유할 수 있다.

정제 제형을 위한 적합한 제약상 허용되는 부형제는 예를 들어, 락토오스, 탄산 나트륨, 인산 칼슘 또는 탄산 칼슘과 같은 불활성 희석제, 옥수수 녹말 또는 알긴산과 같은 과립 및 붕해제, 녹말과 같은 결합제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제, 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 방부제, 및 아스코르브산과 같은 항 산화제를 포함한다. 정제 제형은 코팅을 하지 않거나 위장관내에서 활성 성분의 분해 및 연속적인 흡수를 변형시키거나, 또는 이들의 안정성 및(또는) 외관을 개선시키기 위해 당 업계에 잘 공지된 통상적인 코팅제 및 방법을 사용하여 코팅을 할 수 있다.

경구 용도의 조성물은 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 피넛 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.

일반적으로 수성 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아라비아 고무와 같은 하나 이상의 현탁제; 레시틴 또는 지방산 (예를 들어 스테아르산 폴리옥시에틸렌)과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 장쇄 지방족 알코올 (예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세타놀)과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 지방산 및 모노올레인산 폴리옥시에틸렌 소비톨과 같은 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 장쇄 지방족 알코올 (예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세타놀)과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 지방산 및 모노올레인산 폴리옥시에틸렌 소비톨과 같은 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 지방산 및 모노올레인산 폴리에틸렌 소르비탄과 같은 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물과 같은 분산 또는 습윤제와 함께 미세 분말 형태의 활성 성분을 함유한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 방부제, 아스코르브산과 같은 항 산화제, 착색제, 향료 및(또는) 수크로오스, 사카린 또는 아스파탐과 같은 감미료를 함유할 수 있다.

유성 현탁액은 식물성 오일 (예를 들어 땅콩 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일) 또는 광물성 오일 (예를 들어 액체 파라핀) 중에 활성 성분을현탁시킴으로써 제제화할 수 있다. 유성 현탁액은 또한 밀납, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 농후제를 함유할 수 있다. 상기에 언급한 감미료 및 향료는 맛있는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가할 수 있다. 이들 조성물은 아스코르브산과 같은 항 산화제를 첨가함으로써 보존할 수 있다.

일반적으로 물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산 가능한 분말 및 과립은 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 함께 활성 성분을 함유한다. 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제는 이미 상기에 언급하여 예시하였다. 감미료, 향료 및 착색제와 같은 추가의 부형제가 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 물 중 오일 에멀젼 형태일 수 있다. 오일 상은 올리브 오일, 땅콩 오일과 같은 식물성 오일 또는 액체 파라핀과 같은 광물성 오일 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀젼화제의 예로는 아라비아 고무 또는 트라가칸트 고무와 같이 천연 고무, 대두, 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물 (예를 들어 모노올레인산 소르비탄)로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르 및 모노올레인산 폴리옥시에틸렌 소르비탄과 같은 에틸렌 옥시드와 상기 부분 에스테르의 축합 생성물일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미료, 향료 및 방부제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 아스파탐 또는 수크로오스와 같은 감미료와 함께 제제화할 수 있고, 또한 진통제, 방부제, 향료 및(또는) 착색제를 함유할 수 있다.

제약 조성물은 또한 멸균의 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수있고, 상기 언급된 하나 이상의 적절한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 멸균의 주사 가능한 제제는 또한 비-독성 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균의 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액일 수 있다.

좌약 제형은 활성 성분을 보통 온도에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장 내에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 함께 혼합하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 적합한 부형제는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

크림, 연고, 겔 및 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액과 같은 경피 제형은 일반적으로 활성 성분을 통상적인, 경피로 허용되는, 부형제 또는 희석제와 함께 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제제화함으로써 수득할 수 있다.

주입에 의해 투여되는 조성물은 30 μ또는 이보다 훨씬 작은 평균 직경의 입자를 함유하는 미세 분말 형태일 수 있는데, 분말은 활성 성분 단독이거나 또는 락토오스와 같은 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체로 희석되는 것을 포함한다. 주입용의 분말을 공지된 나트륨 크로모글리케이트 제의 주입에 사용되는 터보-흡입 장치와 함께 사용하기 위해 1 내지 50 mg의 활성 성분을 함유하는 캡슐 중에 용이하게 보유한다.

흡입에 의해 투여되는 조성물은 미세 고체를 함유하는 에어로졸 또는 액체 방울인 활성 성분을 분배하기 위한 통상적인 가압 에어로졸 형태일 수 있다. 휘발성의 불소화 탄화수소 또는 탄화수소와 같은 통상적인 에어로졸 분사제를 사용할수 있고 에어로졸 장치는 활성 성분의 계량된 양을 분배하기 위해 용이하게 배열된다.

제형의 추가의 정보를 위해서 독자는 문헌 [Chapter 25.2. in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990]을 참고한다.

1회 투약 형태를 생산하기 위해 하나 이상의 부형제와 조합된 활성 성분의 양은 물론 치료 숙주 및 각각의 투여 방법에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하기 위한 제형은 일반적으로, 0.5 mg 내지 2 g의 활성 성분을, 예를 들어 전체 조성물의 약 5 내지 약 98 중량부로 변화될 수 있는 적절하고 용이한 양의 부형제와 배합하여 함유한다. 투약 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유할 것이다. 투여 방법 및 투약 계획 (Routes of Administration and Dosage Regimes)에 대한 추가의 정보를 위해서 독자는 문헌 [Chapter 25.3. in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990]을 참고한다.

화학식 I의 화합물의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 투여량의 크기는 물론 잘 공지된 의약의 원리에 의거, 증상의 특성 및 중증도, 동물 또는 환자의 연령 및 성별 및 투여 방법에 따라 다양할 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 MCP-1 및(또는) RANTES의 단독 작용에 기인하거나 또는 MCP-1 및(또는) RANTES의 부분적 작용에 기인할 수 있는 질환 또는 의료 상태, 예를 들어 류마티스성 관절염의 치료에 유용하다.

치료 또는 예방을 목적으로 화학식 I의 화합물을 사용할 때의 투여량은 일반적으로 1 일 투여량은 체중 1 kg 당 0.5 mg 내지 75 mg의 범위이고, 필요한 경우 나누어 투여할 수 있다. 일반적으로 비경구 방법을 사용하는 경우 이보다 더 낮은 투여량으로 투여할 것이다. 따라서, 예를 들어, 정맥 투여를 위해서는, 체중 1 kg 당 0.5 mg 내지 30 mg 범위의 투여량이 일반적으로 사용될 것이다. 비슷하게, 흡입에 의한 투여를 위해서는 체중 1 kg 당 0.5 mg 내지 25 mg 범위의 투여량이 사용될 것이다. 그러나 경구 투여가 바람직하다.

본 발명의 추가의 양태에 따라 요법에 의해 인간 또는 동물의 치료 방법에서 사용하기 위한, 상기 기술된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물이 제공된다. 편리하게, 본 발명은 상기 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물 또는 그의 제약 조성물을 투여함으로써 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 특징은 의약으로서 사용하기 위한, 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물이다.

편리하게 본 발명의 추가의 양태는 인간과 같은 온혈 동물에서 MCP-1 (및(또는) RANTES) 매개 작용을 길항작용 하는 의약으로 사용하기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물이다.

본 발명의 추가의 양태에 따라 인간과 같은 온혈 동물에서 MCP-1 (및(또는) RANTES) 매개 작용을 길항작용하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 양태에 따라 상기 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물의 유효량을 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 동물에서 MCP-1 (및(또는) RANTES) 매개 작용을 길항작용하는 방법을 제공한다.

생물학적 시험

하기 생물학적 시험 방법, 데이타 및 실시예는 본 발명의 예시를 제공한다.

약어:

ATCC 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 로크빌, USA.

BCA 비신크로닌 산 (황화 구리와 함께 단백질 분석에 사용됨)

BSA 소 혈청 알부민

DMEM 둘베코 모디파이드 이글 미디아

EGTA 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산

FCS 소 태아 혈청

HEPES (N-[2-히드록시메틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산])

HBSS 행크 밸런스 염 용액

hMCP-1 인간 단구 화학주성 단백-1

PBS 포스페이트 완충 염수

PCR 중합효소 연쇄 반응

퍼킨-엘머 세투스 (Perkin-Elmer Cetus)로부터 입수 가능한 AMPLITAQ^TM을 내열성 DNA 중합효소로서 사용한다.

결합 완충용액은 1 M NaOH로 pH 7.2로 맞춘 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.5 % 소 태아 혈청이다.

비-필수 아미노산 (100 X 농축)은 890 mg/l의 L-알라닌, 1320 mg/l의 L-아스파라진, 1330 mg/l의 L-아스파르트 산, 1470 mg/l의 L-글루타민 산, 750 mg/l의 글리신, 1150 mg/l의 L-프롤린 및 1050 mg/l의 L-세린이다.

하이포크산틴 및 티미딘 보충물 (50 X 농축)은 680 mg/l의 하이포크산틴 및 194 mg/l의 티미딘이다.

페니실린-스트렙토마이신은 5000 단위/ml의 페니실린 G (나트륨 염) 및 5000 ㎍/ml의 스트렙토마이신 술페이트이다.

인간 단핵 세포주 THP-1 세포는 ATCC에서 기탁번호 ATCC TIB-202로 입수 가능하다.

행크 밸런스 염 용액 (HBSS)는 깁코 (Gibco) ([Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1949, 71, 196] 참조)에서 구입하였다.

합성 세포 배양 배지, RPMI 1640은 깁코에서 구입했는데, 이는 무기 염 [100 mg/l의 Ca(NO₃)₂·4H₂O, 400 mg/l의 KCl, 100 mg/l의 MgSO₄·7H₂O, 6000 mg/l의 NaCl, 2000 mg/l의 NaHCO₃및 800 mg/l의 Na₂HPO₄(무수물)], 2000 mg/l의 D-글루코오스, 1 mg/l의 환원된 글루타치온, 아미노산 및 비타민을 함유한다.

FURA-2/AM은 1-[2-(5-카르복시옥사졸-2-일)-6-아미노벤조푸란-5-옥시]-2-(2'-아미노-5'-메틸페녹시)-에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 펜타아세톡시메틸 에스테르이고 몰레큘라 프로브 (Molecular Probe, Eugene, Oregon USA)에서 구입하였다.

혈액 침강 완충용액은 8.5 g/l의 NaCl 및 10 g/l의 히드록시에틸 셀룰로오스를 함유한다.

용균 완충용액은 0.15 M NH₄Cl^-, 10 mM KHCO₃, 및 1 mM EDTA이다.

완전 세포 결합 완충용액은 1 M NaOH로 pH 7.2로 맞춘 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.5 % BSA, 및 0.01 % NaN₃이다.

세척 완충용액은 1 M NaOH로 pH 7.2로 맞춘 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.5 % 열 불활성 FCS, 및 0.5 M NaCl이다.

일반적인 분자 생물학 방법은 문헌 ["Molecular Cloning- A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)]에 기술된 임의의 방법을 따를수 있다.

i) hMCP-1 수용체의 클로닝 및 발현

MCP-1 수용체 B (CCR2B) cDNA는 공개된 MCP-1 수용체 서열 [Charo et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752]에 기초한 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 THP-1 세포 RNA로부터 PCR에 의해 클로닝하였다. 생성된 PCR 생성물은 벡터 PCR-II^TM(In Vitrogen, San Diego, CA)에서 클로닝하였다. 에러없는 CCR2B cDNA를 진핵 발현 벡터 pCDNA3 (In Vitrogen)에서 Hind III-Not I 단편으로 하부 클로닝하여 pCDNA3/CC-CKR2A 및 pCDNA3/CCR2B를 각각 생성하였다.

선형화된 pCDNA3/CCR2B DNA를 인산 칼슘 침전 [Wigler et al., 1979, Cell, 16, 777]에 의해 CHO-K1 세포로 형질감염하였다. 세포를 형질감염시키고 24 시간 후에, 형질감염된 세포를 1 mg/ml의 제네티신 술페이트 (Geneticin Sulphate) (G418, Gibco BRL)를 첨가함으로써 선별했다. RNA 및 노던 블롯의 제조는 전술한 문헌 [Needham et al., 1995, Prot. Express. Purific., 6, 134]에 따라 수행하였다. CHO-K1 클론 7 (CHO-CCR2B)는 가장 높은 MCP-1 수용체 B 익스프레서 (expressor)로 확인하였다.

ii) 막 단편의 제조

CHO-CCR2B 세포를 10 % 소태아 혈청, 2 mM 글루타민, 1 x 비-필수 아미노산, 1 x 하이포크산틴 및 티미딘 보충물 및 페니실린-스트렙토마이신 (50 ㎍ 스트렙토마이신/ml, Gibco BRL)으로 보충된 DMEM에서 성장시켰다. 막 단편은 전술한 문헌 [Siciliano et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 19658]에 따른 세포 용균/분별 원심 분리 방법을 사용하여 제조하였다. 단백질 농도는 제조사의 지시에 따라 BCA 단백질 분석 (피어스 (Pierce), Rockford, Illinois)에 의해 측정하였다.

iii) 분석

¹²⁵I MCP-1은 볼튼 (Bolton) 및 헌터 (Hunter) 결합 [Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc.]을 사용하여 제조하였다.평형 결합 분석은 에른스트 (Ernst) 등의 문헌 [1994, J. Immunol., 152, 3541]의 방법을 사용하여 수행하였다. 간략히,¹²⁵I-표지된 MCP-1의 다양한 양을 100 ㎕의 결합 완충용액 중 7 ㎍의 정제된 CHO-CCR2B 세포 막에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 항온배양한 후 결합 반응 혼합물을 여과하고 빙냉 결합 완충용액을 사용한 플레이트 세정기 (Brandel MLR-96T Cell Harvester)로 5회 세척하였다. 60 분 동안 0.3 % 폴리에틸렌이민 중에 미리 담가둔 후 여과기 매트 (Brandel GF/B)를 사용했다. 여과 후에 각각의 여과기를 3.5 ml 튜브 (Sarstedt No. 55.484)로 분리하고 결합된¹²⁵I-표지된 MCP-1을 LKB 1277 감마마스터 (Gammamaster)로 측정하였다. 냉각 경쟁 연구는 비표지된 MCP-1이 다양한 농도로 존재할 때 100 pM의¹²⁵I-표지된 MCP-1을 사용하여 상기에 따라 수행하였다. 비-특정 결합은 반응 중에 200 배 과량의 비표지된 MCP-1을 포함함으로써 결정하였다.

CHO-CCR2B 세포로부터 제조된 막 단편과의 리간드 결합 연구는 CCR2B 수용체가 0.2 pmole/mg의 막 단백질 농도로 존재하고, 선택적이고 높은 친화성 (IC₅₀= 110 pM, K_d= 120 pM)을 가지고 MCP-1과 결합한다는 것을 보여주었다. 이들 막과의 결합은 완전히 가역적이고 실온에서 45 분 후에 평형에 도달하였고, 100 pM 과 500 pM 사이 농도의 MCP-1을 사용한 경우, MCP-1 결합과 CHO-CCR2B 세포 막 농도는 선형 관계였다.

DMSO (5 ㎕) 중 용해된 0.01 내지 50 μM의 농도 범위의 시험 화합물을 100pM의 표지된 MCP-1과 8 개 투여량에 대해 중복하여 경쟁 시험함으로써 투여량 반응 곡선을 얻고 IC₅₀농도를 계산하였다.

본 발명의 시험한 화합물은 본원에서 상기 기술한 hMCP-1 수용체 결합 분석에서 50 μM의 IC₅₀값을 가졌다.

b) THP-1 세포에서 MCP-1 매개된 칼슘 유량

인간 단핵 세포주 THP-1을 10 % 소태아 혈청, 6 mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신 (50 ㎍ 스트렙토마이신/ml, Gibco BRL)으로 보충된 합성 세포 배양 배지 RPMI 1640에서 성장시켰다. THP-1 세포를 HBSS (Ca²⁺및 Mg²⁺결핍) + 1 mg/ml BSA로 세척하고 3 x 10⁶세포/ml의 밀도로 같은 완충용액에 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 1 mM FURA-2/AM으로 부하하였고, HBSS로 2 회 세척하고, 1 x 10⁶세포/ml로 재현탁시켰다. THP-1 세포 현탁액 (0.9 ml)을 자석 교반기 막대를 함유하고, 1 mg/ml BSA, 1 mM MgCl₂및 2 mM CaCl₂를 함유한 예열한 (37 ℃) 2.1 ml의 HBSS를 함유한 5 ml일회용 큐벳에 첨가하였다. 큐벳을 형광 분광 광도계 (Perkin Elmer, Norwalk, CT)에 두고 교반시키면서 37 ℃에서 4 분 동안 예비 항온 배양하였다. 형광은 70 초에 걸쳐 기록되었고 세포를 10 초 후에 큐벳에 hMCP-1을 첨가함으로써 자극하였다. [Ca²⁺]i는 340 nm 및 별법으로 380 nm에서 여기시킴으로써 측정하고 후속적으로 510 nm에서 형광 방출의 강도를 측정하였다.340 nm 및 380 nm에서 여기시킨 후의 방출된 형광 빛의 강도 비, (R)이 계산되었고 이를 대입하여 하기 방정식에 따라 세포질 [Ca²⁺]을 추정하였다.

[Ca²⁺]i =

상기 식에서 37 ℃에서 FURA-2 Ca²⁺복합체에 대한 Kd 값은 224 nm로 주어졌다. Rmax는 10 mM의 이오노마이신 첨가 후에 측정된 최대 형광비이고, Rmin은 5 Mm EGTA를 함유한 Ca²⁺없는 용액의 후속적인 첨가에 의해 측정된 최소 비이며, Sf2/Sb2는 Rmin 및 Rmax에서 각각 측정된 380 nm 여기에서의 형광값 비이다.

hMCP-1으로 THP-1 세포를 자극하는 것은 특이적이고 투여량 의존하는 방식으로 [Ca²⁺]i의 빠르고 일시적인 증가를 유도하였다. 투여량 반응 곡선은 거의 2 nm의 EC₅₀을 나타내었다. DMSO (10 ㎕) 중 용해된 시험 화합물을 리간드를 첨가하기 10 초전에 세포 현탁액에 첨가하고 [Ca²⁺]i의 일시적인 증가가 감소하는 것을 측정함으로서 칼슘 방출의 저해를 분석하였다. 시험 화합물을 또한 hMCP-1을 대신하여 첨가함으로써 아고니스트 활성의 결핍을 조사하였다.

c) hMCP-1 및 RANTES 매개 화학주성

시험관 내 화학주성 분석을 인간 단핵 세포주 THP-1을 사용하여 수행하였다. 폴리카르보네이트 막을 통한 세포 이동을 쿨터 (Coulter) 계수기에 의해 직접적으로 또는 미토콘드리아 호흡 사슬에 의한 테트라졸륨 염의 절단을 측정하는 비색 생존도 분석 [Scudiero D. A. et al. 1988, Cancer Res., 48, 4827-4833]을 사용하여 간접적으로 이들의 통과를 하나하나 셈으로써 측정하였다.

제조사의 지시에 따라 화학주성 물질을 PVP 없는 기공 크기 5 ㎛의 폴리카르보네이트 접착제 프레임의 필터 막 (NeuroProbe MB series, Cabin John, MD 20818, USA)을 가진 화학주성 챔버의 하층 웰인 96-웰 미량적가 플레이트에 넣었다. 화학주성 물질을 합성 세포 배양 배지, RPMI 1640 (Gibco) 또는 2 mM 글루타민 및 0.5 % BSA로 보충된 RPMI 1640, 또는 별법으로 Ca²⁺및 Mg²⁺가 있고 페놀 레드 (Gibco) 가 없으며 0.1 % BSA를 첨가한 HBSS에서 적절히 희석시켰다. 각 희석액을 진공하에서 30 분 동안 기체를 제거시키고 챔버의 하층 웰에 넣고 (400 ㎕) THP-1 세포 (100 ㎕ RPMI 1640 + 0.5 % BSA 중 5 x 10⁵개)를 상층 챔버의 각 웰에서 항온 배양하였다. 화학주성을 저해하기 위해 화학주성 물질을 상기 측정된 일정한 준최대 농도 (1 nM MCP-1)로 유지시키고 다양한 농도의 DMSO (최종 DMSO 농도 < 0.05 % v/v) 중 용해된 시험 화합물과 함께 하층 웰에 첨가하였다. 챔버를 5 % CO₂하에 37 ℃에서 2 시간 동안 항온 배양시켰다. 상층으로부터 배지를 제거한 후 200 ㎕의 생리 식염수로 세척하고 챔버를 열고, 막 표면을 닦아서 건조시키고 600 g에서 5 분 동안 96-웰 플레이트를 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상층액 (150 ㎕)을 빨아내고 전자 커플링 시약 (Boehringer Mannheim, Cat.no. 1644807)을 첨가한 세포 증식 시약, WST-1, {4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오] -1,3-페닐디술포네이트} 10 ㎕를 웰에 다시 첨가하였다. 플레이트를 3 시간 동안37 ℃에서 항온 배양하고 가용성 포르마잔 생성물의 흡광도를 450 nm에서 미량적가 플레이트 판독기로 읽었다. 데이타를 스프레드시트에 입력하고 화학주성 물질이 없을때 임의의 랜덤 이동으로 교정하고, 평균 흡광 값, 평균값의 표준 에러 및 유의성 시험을 계산하였다. hMCP-1은 특징적인 이상성 반응으로 최대 0.5 내지 1.0 nm의 농도 의존성 세포 이동을 유도하였다.

상기 분석의 다른 형태에서, 형광 태그 (tag)가 부착된 세포를 사용하여 종말점 관측을 용이하게 할 수 있다. 이런 경우에, 사용된 THP-1 세포를 어두운 곳에서 45 분 동안 5 mM 칼세인 (Calcein) AM (글리신, N,N'-[[3',6'-비스(아세틸옥시)-3-옥소스피로[이소벤조푸란-1(3H),9'-[9H]크산텐]2',7'-디일]비스(메틸렌)]비스[N-[2-[(아세톡시)메톡시]-2-옥소에틸]]-비스[(아세톡시)메틸]에스테르, Molecular Probes) 존재하에 항온 배양함으로써 형광 태그를 부착한다. 세포를 원심분리하여 수확하고 Ca²⁺, Mg²⁺및 0.1% BSA와 함께 (페놀 레드 없는) HBSS 중에 재현탁시킨다. 50 ㎕ (2 x 10⁵세포)의 세포 현탁액을 각 웰 위의 여과기에 놓고, 상기에 언급한대로, 단위를 5 % CO₂하에 2 시간 동안 37 ℃에서 항온 배양시킨다. 항온 배양이 끝날때, 세포를 포스페이트 완충 염수로 여과기 윗 면에서 세척하고, 플레이트로부터 여과기를 제거하고 여과기의 아래쪽 또는 하층 웰에 부착된 세포의 수를 485 nm 여기, 538 nm 방출 파장 (fmax, Molecular Devices)에서 형광을 읽음으로써 추정하였다. 데이타를 스프레드시트에 입력하고 화학주성 물질이 없을때 임의의 랜덤 이동으로 교정하고, 평균 흡광 값, 평균값의 표준 에러, 저해 퍼센트,시험하에서 화합물의 IC₅₀및 유의성 시험을 계산할 수 있다. 화학주성을 유도하는 MCP-1 외에, 다른 형태의 분석 방법을 화학주성을 유도하는 RANTES (2 nM)의 저해를 측정하기 위해 또한 사용하였다.

d) 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)에 결합

i) 인간 PBMCs의 제조

인간 신선혈 (200 ml)을 자원하는 제공자로부터 수득하고, 시트르산 나트륨 항응고제로 수집하여 최종 농도 0.38 %를 얻었다. 혈액을 침강 완충용액과 혼합하고 20 분 동안 37 ℃에서 항온 배양시켰다. 상층액을 수집하고 1700 rpm으로 5 분 동안 (Sorvall RT6000D) 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 20 ml의 RPMI/BSA (1 mg/ml) 중에 재현탁시키고 4 x 5 ml의 세포를 15 ml 원심분리 튜브내의 4 x 5 ml의 림포프레페 (Lymphoprepa) (Nycomed) 위에 조심스럽게 층으로 쌓았다. 튜브를 1700 rpm으로 30 분 동안 (Sorvall RT6000D) 원심분리하고 생성된 세포층을 제거하고 50 ml 팔콘 (Falcon) 튜브로 옮겼다. 세포를 용균 완충용액 중에서 2 회 세척하고 임의의 잔류 적혈구 세포를 제거한 후 RPMI/BSA로 2 회 세척하였다. 세포를 5 ml의 결합 완충용액에 재현탁시켰다. 세포 수를 쿨터 계수기로 측정하고 추가의 결합 완충용액을 첨가하여 1.25 x 10⁷PBMCs/ml의 최종 농도를 얻었다.

ii) 분석

[¹²⁵I]MCP-1을 볼튼 및 헌터 결합 [Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc.]을 사용하여 제조하였다. 평형 결합 분석은 에른스트 (Ernst) 등의 문헌 [1994, J. Immunol., 152, 3541]의 방법을 사용하여 수행하였다. 간략히, 50 ㎕의¹²⁵I-표지된 MCP-1 (최종 농도 100 pM)을 96 웰 플레이트의 40 ㎕의 세포 현탁액 (5 x 10⁵세포)에 첨가하였다. DMSO 중 10 mM의 원액으로부터 완전 세포 결합 완충용액에 희석한 화합물을 최종 부피가 5 ㎕가 되게 첨가하여 분석 중 5 %의 일정한 DMSO 농도를 유지하였다. 전체 결합은 화합물이 없을때 측정하였다. 비-특정 결합을 5 ㎕의 냉각 MCP-1의 첨가에 의해 결정되어 100 nM의 최종 분석 농도를 얻었다. 분석 웰은 완전 세포 결합 완충용액 및 밀폐된 플레이트를 포함한 최종 부피가 100 ㎕가 되게 하였다. 37 ℃에서 60 분 동안 항온 배양한 후 결합 반응 혼합물을 여과시키고 10 초 동안 플레이트 세정기 (Brandel MLR-96T Cell Harvester)를 사용한 빙냉 세척 완충용액을 사용하여 세척하였다. 60 분 동안 0.2 % BSA를 첨가한 0.3 % 폴리에틸렌이민 중에 미리 담가둔 후 여과기 매트 (Brandel GF/B)를 사용했다. 여과 후에 각각의 여과기를 3.5 ml 튜브 (Sarstedt No. 55.484)로 분리하고 결합된¹²⁵I-표지된 MCP-1을 LKB 1277 감마마스터로 측정하였다.

시험 화합물 효능을 6 개 투여량에 대한 투여량 반응 곡선을 사용하여 중복하여 분석함으로써 결정하였고 IC₅₀농도를 측정하였다.

생리적으로 허용되지 않는 독성은 본 발명의 시험 화합물의 유효한 투여량에서는 관측되지 않았다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만, 이에 의해 제한되지는 않으며, 실시예에서는 다른 언급이 없는 한 하기 일반적인 방법이 사용된다.

i) N,N-디메틸포름아미드 (DMF)를 4 Å 분자체 위에서 건조시켰다. 무수 테트라히드로푸란 (THF)을 알드리치 (Aldrich) SURESEAL^TM병으로 구입하였다. 다른 상업적으로 입수가능한 시약 및 용매는 다른 언급이 없는 한 추가의 정제 없이 사용하였다. 유기 용매 추출물을 무수 MgSO₄로 건조시켰다.

ii)¹H,¹³C 및¹⁹F NMR은 다른 언급이 없는 한, 적절한 내부 표준으로 Me₄Si 또는 CCl₃F와 함께 DMSO-d₆을 사용하는 브루커 (Bruker) WM200, WM250, WM300 또는 WM400 기기로 기록하였다. 화학적 이동은 d(ppm)으로 나타내고 피크 다중도는 하기에 따라 정의한다: s, 단일항; d, 이중항; dd, 이중항의 이중항; t, 삼중항; dt, 삼중항의 이중항; q, 사중항; m, 다중항; br, 넓음.

iii) 질량 스펙트럼은 VG 12-12 사중극자, VG 70-250 SE, VG ZAB 2-SE 또는 VG 변형된 AEI/Kratos MS9 분광계로 기록하였다.

iv) TLC 분석을 위해, 머크 (Merck)의 프리코팅된 TLC 플레이트 (실리카 겔 60 F254, d = 0.25 mm)를 사용하였다.

v) 플래쉬 크로마토그래피를 실리카 (Merck Kieselgel, Art.9385)에서 수행하였다.

실시예 1

N-(3-메톡시-4-클로로벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

수산화 나트륨 (2 M, 1.9 ml)을 메탄올 (3 ml) 및 THF (3 ml) 중 에틸 N-(3-메톡시-4-클로로벤질)-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트 (305 mg)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 진공으로 농축한 후 물 (5 ml)로 희석하였다. 용액을 수성 염산 (2 M)을 첨가하여 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 건조시키며 증발시켰다. 잔류물을 20 % 내지 100 % 에틸 아세테이트로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 고체인 원하는 생성물 (177 mg, 70 %)을 수득하였다.

상기 실시예에 기술한 방법을 출발 물질로서 적절한 인돌 에스테르를 사용하여 반복하였다. 이와 같이 하여 하기 기술된 화합물을 수득하였다.

실시예 2

N-(3-클로로-4-메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

실시예 3

N-(3-클로로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

63 % 수율, m/z 314 (M-H⁺).

실시예 4

N-(3-니트로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

5 % 수율, m/z 326 (M-H⁺).

실시예 5

N-(3-클로로-4-트리플루오로메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

실시예 6

N-(3-니트로-4-클로로벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

실시예 7

N-(3-플루오로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산

실시예 8

N-[(4-클로로-3-에티닐페닐)메틸]-5-히드록시인돌-2-카르복시산

수산화 나트륨 (2 M, 1.8 ml)을 메탄올 (5 ml) 중 에틸 N-[(4-클로로-3-트리메틸실릴에티닐페닐)메틸]-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트 (0.14 g)의 용액에 첨가하고 혼합물을 3 시간 동안 교반시켰다. 메탄올을 제거하고 수득된 잔류물을 물 (20 ml)로 희석하고 에틸 아세테이트 (매 회 20 ml)로 2 회 추출하였다. 수성층을 수성 염산 (2 M)으로 산성화시키고 에틸 아세테이트 (3 x 25 ml)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 혼합하고 물 (30 ml) 및 염수 (30 ml)로 세척하고 건조시켰다 (MgSO₄). 용매를 제거하여 수득된 잔류물을 에틸 아세테이트 및 이소-헥산 (1:1)의 혼합물에 용해시키고 에틸 아세테이트 이소-헥산 혼합물 (1:1)로 용출시키는 5 g 실리카 이솔루트 (Isolute) 칼럼을 통과시켜 표제 화합물 (65 mg)을 수득하였다.

출발 물질의 제조

상기 실시예를 위한 출발 물질은 상업적으로 입수가능하거나 공지된 물질로부터 표준 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어 하기 반응 (방법 A 내지 D)은 예시이지만 상기 반응에 사용된 출발 물질의 제조를 제한하지는 않는다.

방법 A

에틸 5-아세톡시-N-(3-메톡시-4-클로로벤질)인돌-2-카르복실레이트

i) 에틸 5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

삼브롬화 붕소 (64.58 g)을 아르곤 분위기 하에서 -78 ℃의 디클로로메탄 (1000 ml) 중 에틸 5-메톡시인돌-2-카르복실레이트 (20 g)의 교반시킨 용액에 적가하였다. 반응물을 실온으로 데우고 2 시간 동안 추가로 교반시켰다. 반응물을 얼음/포화된 탄산 수소 나트륨 수용액에 교반시키면서 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 혼합하고 포화된 탄산 수소 나트륨 수용액, 물, 포화된 염화 나트륨 수용액으로 세척하고 건조시켰다. 용액을 진공으로 농축하고 잔류물을 용출액으로 0 내지 60 % 디에틸 에테르, 이소-헥산을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 (9.02 g, 48 %)을 백색 고체로 수득하였다.

ii) 에틸 5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트

아세트산 무수물 (80 ml) 중 에틸 5-히드록시인돌-2-카르복실레이트 (7.79 g) 및 4-디메틸아미노피리딘 (20 mg)의 교반시킨 용액을 4 시간 동안 80 ℃에서 가열하였다. 반응물을 진공으로 농축하고 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 추출물을 혼합하고 염산 (2 M), 포화된 탄산 수소 나트륨 수용액, 물, 포화된 염화 나트륨 수용액으로 세척하고 건조시켰다. 용액을 진공으로 농축시켜 생성물 (9.39 g, 100 %)을 황색 고체로 수득하였다.

iii) 에틸 5-아세톡시-N-(3-메톡시-4-클로로벤질)인돌-2-카르복실레이트

DMF (6 ml) 중 에틸 5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트 (283 mg)의 용액에 수소화 나트륨 (54 mg, 오일 중 60 % 분산액)을 첨가하였다. 혼합물을 30 분 동안 교반시키고, 요오드화 칼륨의 촉매량 및 DMF (2 ml) 중 3-메톡시-4-클로로벤질 브로마이드 (345 mg)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 교반시키고, 물로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 건조시키고, 증발시키고 생성된 고무를 20 % 에틸 아세테이트/이소헥산으로 용출하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 방치하면 고화되는 원하는 생성물 (310 mg, 63 %)을 오일로 수득하였다.

방법 A i) 내지 iii)에 기술된 방법을 적절한 할로겐화 벤질을 사용하여 반복하였다. 이와 같이 하여 하기 기술된 화합물을 수득하였다.

에틸 N-(3-클로로-4-메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

58 % 수율, m/z 402 (MH⁺).

에틸 N-(3-클로로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

73 % 수율, m/z 386 (MH⁺).

에틸 N-(3-니트로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

41 % 수율, m/z 396 (MH⁺).

에틸 N-(3-클로로-4-트리플루오로메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

에틸 N-(3-니트로-4-클로로벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복실레이트

방법 B

3-메톡시-4-클로로벤질 브로마이드

i) 3-메톡시-4-클로로톨루엔

아세톤 (200 ml) 중 2-클로로-5-메틸 페놀 (15.95 g)의 용액에 탄산 칼륨 (38 g) 및 디메틸 술페이트 (11.7 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 환류시킨 후 여과하여 원하는 생성물 (16.95 g, 98%)을 수득하고 추가의 정제없이 사용하였다.

ii) 3-메톡시-4-클로로벤질 브로마이드

3-메톡시-4-클로로톨루엔 (9.62 g)과 N-브로모숙신이미드 (12.05 g)의 혼합물을 포토플러드 램프 (photoflood lamp)로 2 시간 동안 빛을 조사하면서 환류시켰다. 혼합물을 냉각시키고, 여과하며 증발시켜 오일을 수득하였고 디에틸 에테르로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (14.67 g, 95 %)을 오일로 수득하였다.

비슷한 방법으로 2-클로로-4-메틸페놀로부터 시작하여3-클로로-4-메톡시벤질 브로마이드를 제조하였다.

방법 C

3-니트로-4-클로로벤질 브로마이드

아르곤 분위기 하에서 5 ℃로 냉각시킨, 디클로로메탄 (150 ml) 중 3-니트로-4-클로로벤질 알코올 (4.67 g) 및 트리페닐 포스핀 (6.53 g)의 용액에 사브롬화 탄소 (8.27 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 농축하고 20 % 에틸 아세테이트/이소헥산으로 증가시켜 이소헥산에서 용출시키는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (5.39 g, 86 %)을 황색 오일로 수득하였다.

방법 D

에틸 N-[(4-클로로-3-트리메틸실릴에티닐페닐)메틸]-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트

i) 4-클로로-3-요오도벤질 알코올

붕소-THF 복합체 (10 ml)를 THF (25 ml) 중 4-클로로-3-요오도벤조산 (1.4 g)의 용액에 20 분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반시킨 후 냉각 (얼음조)하고 메탄올 (20 ml)을 조심스럽게 첨가하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 메탄올 (10 ml) 중에 용해시키고 2 시간 동안 수성 2 M 수산화 나트륨 (10ml)과 함께 교반시켰다. 에틸 아세테이트 (50 ml)를 첨가하고 혼합물을 포화된 중탄산 나트륨 수용액 (50 ml)으로 세척하였다. 수성 추출물을 에틸 아세테이트 (2 x 50 ml)로 세척하고 에틸 아세테이트 추출물을 혼합하여 물 (50 ml) 및 염수 (50 ml)로 세척하고 건조시켰다. 용매를 제거하여 4-클로로-3-요오도벤질 알코올 (1.15 g)을 수득하였다.

ii) 4-클로로-3-요오도벤질 브로마이드

트리페닐포스핀 (1.1 g)을 0 ℃의 디클로로메탄 (40 ml) 중 4-클로로-3-요오도벤질 알코올 (1.1 g)의 용액에 나누어 첨가하고 교반을 10 분 동안 지속하였다. 그 다음 사브롬화 탄소 (1.5 g)를 2 분 동안 나누어 첨가하고, 반응 혼합물을 주위의 온도로 데우고 15 시간 동안 교반시켰다. 용액을 실리카 채워진 크로마토그래피 칼럼에 직접 첨가하고 디클로로메탄으로 용출시켜 4-클로로-3-요오도벤질 브로마이드 (1.9 g)를 수득하였다.

NMR (CD₃SOCD₃); d 4.6 (s, 2H), 7.5 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 8.0 (m, 1H).

iii) 에틸 N-[(4-클로로-3-요오도페닐)메틸]-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트

수소화 나트륨 (오일 중 60 % 분산액의 0.23 g)을 아르곤 스트림하에서 무수 DMF (25 ml)중 에틸 5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트 (1.29 g) 및 테트라-n-부틸암모늄 요오드화물 (10 mg)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 교반시키고 DMF (5 ml) 중 4-클로로-3-요오도벤질 브로마이드 (1.9 g)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 15 시간 동안 교반시킨 후, 포화된 수성 염화 암모늄 (5 ml)을 첨가하였다. 용매를 제거하여 수득된 잔류물을 포화된 수성 염화 암모늄 (50 ml)으로 희석하고 에틸 아세테이트 (3 x 30 ml)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 혼합하고 염수 (100 ml)로 세척하며 건조시켰다. 용매를 제거하여 수득된 잔류물을 에틸 아세테이트와 이소-헥산의 혼합물 (1:9)로 용출시키는 실리카 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (0.21 g)을 수득하였다.

NMR (CD₃SOCD₃); d 1.1 (t, 3H), 2.2 (s, 3H), 4.3 (m, 2H), 5.8 (s, 2H), 6.9 (m, 1H), 7.1 (m, 1H), 7.35 (m, 1H), 7.4 (m, 2H), 7.6 (m, 2H), 7.7 (m, 2H); m/z 497.5 (M+H).

iv) 에틸 N-[(4-클로로-3-트리메틸실릴에티닐페닐]-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트

트리메틸실릴아세틸렌 (114 ml)을 아세토니트릴 중 에틸 N-[(4-클로로-3-요오도페닐)메틸]-5-아세톡시인돌-2-카르복실레이트 (0.2 g), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 (II) 클로라이드 (2 mg), 트리에틸아민 (56 ml) 및 요오드화 구리 (I) (1 mg)의 기체를 제거한 용액에 첨가하고 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 12 시간 동안 교반시켰다. 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 (II) 클로라이드 (2 mg) 및 트리메틸실릴아세틸렌 (114 ml)의 추가의 분액을 첨가하고 교반을 12 시간 동안 지속하였다. 소량의 실리카를 반응 혼합물에 첨가하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 5 g실리카 이솔루트 칼럼에 첨가하고 에틸 아세테이트 이소-헥산 혼합물 (1:4)로 용출시켜 표제 화합물 (0.15 g)을 무색 오일로 수득하였다.

실시예 9

제약 조성물

이 실시예는 인간에서 치료 또는 예방 용도를 위해 본원에서 정의된 본 발명의 대표적인 제약 투여량 형태 (용어 "화합물 X"인 활성 성분)를 예시하고 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

실시예 A

정제 I	mg / 정제
화합물 X	100
락토오스 Ph. Eur	182.75
크로스카멜로오스 나트륨	12.0
옥수수 녹말 페이스트 (5 % w/v 페이스트)	2.25
스테아르산 마그네슘	3.0

정제 II	mg / 정제
화합물 X	50
락토오스 Ph. Eur	223.75
크로스카멜로오스 나트륨	6.0
옥수수 녹말	15.0
폴리비닐피롤리돈 (5 % w/v 페이스트)	2.25
스테아르산 마그네슘	3.0

정제 III	mg / 정제
화합물 X	1.0
락토오스 Ph. Eur	93.25
크로스카멜로오스 나트륨	4.0
옥수수 녹말 페이스트 (5 % w/v 페이스트)	0.75
스테아르산 마그네슘	1.0

캡슐	mg / 캡슐
화합물 X	10
락토오스 Ph. Eur	488.5
마그네슘	1.5

주사 I	(50 mg / ml)
화합물 X	5.0 % w/v
1 M 수산화 나트륨 용액	15.0 % w/v
0.1 M 염산	pH 7.6으로 맞추기 위한 양
폴리에틸렌 글리콜 400	4.5 % w/v
주사용 물	100 %로 만드는 양

주사 II	(10 mg / ml)
화합물 X	1.0 % w/v
인산 나트륨 BP	3.6 % w/v
0.1 M 수산화 나트륨 용액	15.0 % w/v
주사용 물	100 %로 만드는 양

주사 III	(1 mg / ml, pH 6 완충용액)
화합물 X	0.1 % w/v
인산 나트륨 BP	2.26 % w/v
시트르산	0.38 % w/v
폴리에틸렌 글리콜 400	3.5 % w/v
주사용 물	100 %로 만드는 양

에어로졸 I	mg / ml
화합물 X	10.0
소르비탄 트리올리에이트	13.5
트리클로로플루오로메탄	910.0
디클로로디플루오로메탄	490.0

에어로졸 II	mg / ml
화합물 X	0.2
소르비탄 트리올리에이트	0.27
트리클로로플루오로메탄	70.0
디클로로디플루오로메탄	280.0
디클로로테트라플루오로에탄	1094.0

에어로졸 III	mg / ml
화합물 X	2.5
소르비탄 트리올리에이트	3.38
트리클로로플루오로메탄	67.5
디클로로디플루오로메탄	1086.0
디클로로테트라플루오로에탄	191.6

에어로졸 IV	mg / ml
화합물 X	2.5
대두 레시틴	2.7
트리클로로플루오로메탄	67.5
디클로로디플루오로메탄	1086.0
디클로로테트라플루오로에탄	191.6

연고	ml
화합물 X	40 mg
에탄올	300 ㎕
물	300 ㎕
1-도데실아자시클로헵탄-2-온	50 ㎕
프로필렌 글리콜	1 ml로 만드는 양

주의: 상기 제형에서 화합물 X는 본원의 실시예에서 예시한 화합물을 포함할 수 있다.

상기 제형은 제약계에 잘 공지된 통상적인 방법으로 수득할 수 있다. 정제 a 내지 c는 통상적인 방법에 의한, 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트의 코팅을 제공하기 위한 장용성 코팅일 수 있다. 에어로졸 제형 h 내지 k는 표준, 계량된 투여량 에어로졸 분사기와 함께 사용될 수 있고, 현탁제 소르비탄 트리올리에이트 및 대두 레시틴을 소르비탄 모노올리에이트, 소르비탄 세스퀴올리에이트,폴리소르베이트 80, 폴리글리세롤 올리에이트 또는 올레산과 같은 다른 현탁제로 대체할 수도 있다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고,

R³은 할로기, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 알콕시, 트리플루오로메틸, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 n은 0, 1 또는 2이고 R⁷은 알킬기이고,

R⁴는 할로, 트리플루오로메틸, 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시 또는 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고,

R⁵는 수소, 할로, 시아노, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 COR⁸인데, 여기서 R⁸은 저급 알킬이고,

R⁶은 수소, 할로, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 COR⁹인데, 여기서 R⁹는 저급 알킬이나,

단, R¹이 수소, 할로 또는 메톡시인 경우, R²는 수소, 할로, 메틸, 에틸 또는 메톡시이고, R⁵및 R⁶은 둘다 수소이고, R³또는 R⁴중 하나는 클로로, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고, 이 때 다른 하나는 할로 또는 트리플루오로메틸이 아니다.
제1항에 있어서,

R¹이 수소 또는 할로기이고,

R²가 수소 또는 할로기이고,

R³이 할로기, 니트로 또는 알콕시이고,

R⁴가 할로기, 알킬 또는 알콕시이고,

R⁵및 R⁶은 수소인 화학식 I의 화합물.
제1항에 있어서,

R¹이 수소 또는 할로기이고,

R²가 수소 또는 할로기이고,

R³이 트리플루오로메틸이고,

R⁴가 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시, 알킬 또는 알키닐이고,

R⁵및 R⁶은 수소인 화학식 I의 화합물.
제1항에 있어서,

R¹이 수소 또는 할로기이고,

R²가 수소 또는 할로기이고,

R³이 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 R⁷및 n은 제1항에 정의된 바와 같고,

R⁴가 할로기 또는 트리플루오로메틸이고,

R⁵및 R⁶은 수소인 화학식 I의 화합물.
제1항에 있어서, 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물인 화합물.

<화학식 IA>

상기 식에서,

R¹및 R²는 제1항에 정의된 바와 같고,

R^3'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 트리플루오로메틸, 니트로, 시아노, 트리플루오로메톡시, C(O)R⁷또는 S(O)_nR⁷인데, 여기서 R⁷은 알킬기이고,

R^4'는 할로기, 메틸티오, 메톡시, 트리플루오로메톡시 또는 메틸이나,

단, R^3'이 트리플루오로메틸인 경우, R^4'는 트리플루오로메틸 또는 할로가 아니다.
제5항에 있어서,

R¹및 R²가 수소이고,

R^3'이 메톡시, 클로로 또는 니트로이고,

R^4'가 클로로, 메틸, 메톡시 또는 트리플루오로메톡시인 화학식 IA의 화합물.
제1항에 있어서, 하기 화합물 중 임의의 화합물:

N-(3-메톡시-4-클로로벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-클로로-4-메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-클로로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-니트로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-클로로-4-트리플루오로메톡시벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-니트로-4-클로로벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-(3-플루오로-4-메틸벤질)-5-히드록시인돌-2-카르복시산,

N-[(4-클로로-3-에티닐페닐)메틸]-5-히드록시인돌-2-카르복시산.
a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물과 반응시키는 단계, 및 a) 단계 후에 임의로,

b) i) 생성된 화학식 I의 화합물을 화학식 I의 다른 화합물로 전환하는 단계,

ii) 임의의 보호기를 제거하는 단계, 또는

iii) 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 형성하는 단계를 포함하는제1항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물의 제조 방법:

<화학식 II>

<화학식 III>

상기 식에서,

R¹, R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶은 제1항에 정의된 바와 같고,

R^a는 카르복시 또는 그의 보호된 형태이고,

R^b는 수소 또는 적합한 히드록시 보호기이고,

L은 치환 가능한 기이다.
요법에 의해 인간 또는 동물의 치료 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물.
의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물.
제10항에 있어서, 온혈 동물에서 MCP-1 매개 작용을 길항작용하기 위한 의약으로서 사용되는 화합물.
제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 함께, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 포함하는 제약 조성물.
온혈 동물에서 MCP-1 매개 작용을 길항작용하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물의 용도.
치료가 필요한 숙주에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물, 또는 제12항에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물, 또는 제12항에 따른 제약 조성물의 유효량을 치료가 필요한 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는 상기 동물에서 MCP-1 매개 작용을 길항작용하는 방법.