DE60116107T2

DE60116107T2 - Reinigung von hbv-antigenen zur verwendung in impfstoffen

Info

Publication number: DE60116107T2
Application number: DE60116107T
Authority: DE
Inventors: Koen De Heyder; Peter Schu; Michelle Serantoni; Omer Van Opstel
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-08-08
Also published as: SK288079B6; SI1307473T1; CY1106310T1; UA79735C2; CZ2003385A3; DK1666487T3; ATE412665T1; HK1056884A1; ES2314555T3; KR100804922B1; JP2004505992A; NZ524012A; CN1468256A; EA200300129A1; BG107545A; EP1666487B1; HU228932B1; ATE313558T1; IL154301A0; KR20030029127A

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Impfstoffs zur Verwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen mit dem Hepatitis B-Virus (HBV).
Eine chronische Hepatitis B-Virus-(HBV)-Infektion, für die es derzeit eine beschränkte Behandlung gibt, stellt ein globales öffentliches Gesundheitsproblem mit enormen Ausmaßen dar. Chronische Träger von HBV, deren Anzahl auf mehr als 300 Millionen weltweit geschätzt wird, sind dem Risiko der Entwicklung von chronischer aktiver Hepatitis, Zirrhose und primärem Leberzellkarzinom ausgesetzt.
Viele Impfstoffe, die derzeit verfügbar sind, erfordern ein Konservierungsmittel zur Verhinderung des Abbaus. Ein häufig verwendetes Konservierungsmittel ist Thiomersal, das eine quecksilberhaltige Verbindung ist. Einige Bedenken wurden gegen die Verwendung von Quecksilber in Impfstoffen erhoben, obwohl die Kommentatoren betont haben, daß die potentiellen Gefahren von thiomersalhaltigen Impfstoffen nicht überbewertet werden sollten (P. A. Offit, JAMA Bd. 283, Nr. 16). Dennoch wäre es vorteilhaft, neue und potentiell sicherere Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zu finden, um die Verwendung von Thiomersal im Herstellungsverfahren zu ersetzen. Es besteht deshalb ein Bedarf an der Entwicklung von Impfstoffen, die thiomersalfrei sind, insbesondere von Hepatitis B-Impfstoffen. Handelsübliche Hepatitis B-Impfstoffe mit reduzierten Thiomersalgehalten schließen Engerix-B^TM und Recombivax HB^TM als pädiatrische Formulierungen ein; siehe Morbidity and Mortality Weekly Report, Bd. 49, 21.7.2000, S. 642–651.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Impfstoffs bereit, wobei der Impfstoff ein gereinigtes Hepatitis B-Oberflächenantigen und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt, wobei das Antigen weniger als 0,025 μg Quecksilber auf 20 μg Protein umfaßt, worin das Antigen in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit einer freien -SH-Gruppe gereinigt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Hepatitis B-Antigens ohne eine Spur von Thiomersal bereit, welches die Reinigung des Antigens in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit einer freien -SH-Gruppe umfaßt.
Die Antigenzubereitung ist allgemein ohne Spur von Thiomersal, wenn Thiomersal im gereinigten Antigenprodukt unter Verwendung von Absorptionsspektrophotometrie für Quecksilber wie hier beschrieben nicht nachweisbar ist.
Die Hepatitis-Antigenzubereitung umfaßt weniger als 0,025 μg Quecksilber auf 20 μg Protein, in geeigneter Weise durch Absorptionsspektrophotometrie gemessen.
Bevorzugt wird die Reinigung in Abwesenheit von Thiomersal durchgeführt, und das gereinigte Antigen ist völlig frei von Thiomersal.
Bevorzugt ist das Antigen stabil, in geeigneter Weise im wesentlichen so stabil wie Hepatitis-Antigen, das in Gegenwart von Thiomersal gereinigt wird, wie hier in Beispiel 1 exemplarisch umrissen.
Bevorzugt ist das Hepatitis-Antigen immunogen.
Bevorzugt wird das Reduktionsmittel während des Antigen-Reinigungsverfahrens zugegeben, bevorzugt nach dem Züchten von Zellen, die das Antigen exprimieren.
Bevorzugt ist das Reduktionsmittel Cystein, Dithiothreit, β-Mercaptoethanol oder Glutathion, wobei Cystein am meisten bevorzugt ist.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen immunogenen Hepatitis B-Antigens ohne eine Spur von Thiomersal bereit, welches die Reinigung des Antigens in Gegenwart von Cystein umfaßt.
Bevorzugt wird die Reinigung in Gegenwart einer Cysteinlösung durchgeführt.
Bevorzugt wird das Cystein in Lösung oder Pulverform während des Verfahrens auf eine Endkonzentration zwischen 1 und 10 mM, bevorzugt 1 bis 5 mM zugegeben. Besonders bevorzugt wird das Cystein auf eine Endkonzentration von ca. 2 mM zugegeben.
Bevorzugt ist das Cystein L-Cystein.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Hepatitis B-Antigens ohne eine Spur von Thiomersal bereit, worin das rohe Antigen einer Gel-Permeationschromatographie unterworfen wird, einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen wird und mit einem Reduktionsmittel mit einer freien -SH-Gruppe vermischt wird.
Bevorzugt ist die Ionenaustauschchromatographie eine Anionenaustauschchromatographie.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Antigens bereit, das frei von Thiomersal ist, worin das Antigen wenigstens so immunogen und antigen wie das Hepatitis B-Antigen ist, das in Gegenwart von Thiomersal hergestellt wird.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Hepatitis B-Antigens mit einem mittleren ELISA-Proteinverhältnis von mehr als 1,5 und einem RF1-Gehalt mit einem wenigstens 3-fach niedrigeren IC₅₀-Wert als demjenigen des Hepatitis B-Oberflächenantigens bereit, das in Gegenwart von Thiomersal hergestellt wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis-Antigens, das zur Verwendung in einem Impfstoff geeignet ist, wobei das Verfahren die Reinigung des Antigens in Gegenwart von Thiomersal und die anschließende Behandlung von Antigen in Gegenwart eines Reduktionsmittels umfaßt, das eine freie -SH-Gruppe umfaßt.
In geeigneter Weise folgt der Behandlung ein Reinigungsschritt wie ein Dialyseschritt, um Thiomersal zu entfernen.
Bevorzugt ist das Reduktionsmittel Cystein, DTT, Glutathion oder 2-Mercaptoethanol.
Hepatitis B-Antigen kann entweder für die Behandlung oder für die Prophylaxe von Hepatitis B-Infektionen verwendet werden, speziell zur Behandlung oder Prophylaxe von zum Beispiel chronischen Hepatitis B-Infektionen.
Eine Impfstofformulierung, die ein Hepatitis B-Antigen umfaßt, umfaßt auch einen Hilfsstoff. Bevorzugt ist der Hilfsstoff ein Aluminiumsalz oder ein bevorzugter Stimulator der TH1-Zellreaktion.
Bevorzugt ist das Antigen ein Hepatitis B-Oberflächenantigen.
Die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen ist gut dokumentiert. Siehe zum Beispiel Harford et al., Develop. Biol. Standard 54, S. 125 (1983), Gregg et al., Biotechnology 5, S. 479 (1987), EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 und Verweise darin.
Wie hier verwendet schließt der Ausdruck "Hepatitis B-Oberflächenantigen" oder "HBsAg" jedes HBsAg-Antigen oder Fragment davon ein, das die Antigenität von HBV-Oberflächenantigen zeigt. Man wird verstehen, daß HBsAg wie hier beschrieben zusätzlich zu der Sequenz des HBsAg-S-Antigens mit 226 Aminosäuren (siehe Tiollais et al., Nature, 317, 489 (1985) und Verweise darin) nach Wunsch die gesamte oder einen Teil einer Prä-S-Sequenz wie in den obigen Verweisen und in EP-A-0 278 940 beschrieben enthalten kann. HBsAg wie hier beschrieben kann auch Varianten bezeichnen, zum Beispiel die in WO 91/14703 beschriebene "Escape-Mutante".
HBsAg kann auch in EP 0 198 474 oder EP 0 304 578 beschriebene Polypeptide bezeichnen.
Normalerweise wird das HBsAg in Partikelform sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das HBsAg im wesentlichen aus dem hier oben genannten HBsAg-S-Antigen bestehen.
Der Impfstoff kann vorteilhaft einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten wie einen geeigneten Hilfsstoff einschließen. Geeignete Hilfsstoffe sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel Freundsches unvollständiges Adjuvans und vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat; Salze von Calcium, Eisen oder Zink; eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin; acylierte Zucker; kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide; Polyphosphazene; biologisch abbaubare Mikrokügelchen; Monophosphoryllipid A und Quil A. Cytokine wie GM-CSF oder Interleukin-2, -7 oder -12 können auch als Hilfsstoffe verwendet werden.
In den Formulierungen der Erfindung ist es bevorzugt, daß die Hilfsstoffzusammensetzung eine Immunreaktion vorherrschend vom TH1-Typ induziert. Hohe Mengen von Cytokinen vom Th1-Typ (z.B. IFN-γ, TNFα, IL-2 und IL-12) neigen dazu, die Induktion von zellvermittelten Immunreaktionen gegen ein verabreichtes Antigen zu begünstigen. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform, in der eine Reaktion vorherrschend vom TH1-Typ ist, wird der Gehalt an Cytokinen vom TH1-Typ in einem größeren Ausmaß zunehmen als der Gehalt an Cytokinen vom Th2-Typ. Die Gehalte dieser Cytokine können leicht unter Verwendung von Standardtests bewertet werden. Für eine Übersicht über die Familien von Cytokinen siehe Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145–173, 1989.
Entsprechend schließen geeignete Hilfsstoffe zur Verwendung in der Hervorrufung einer Reaktion vorherrschend vom Th1-Typ zum Beispiel eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz ein. Andere bekannte Hilfsstoffe, die vorzugsweise eine Immunreaktion vom TH1-Typ induzieren, schließen CpG-haltige Oligonukleotide ein. Die Oligonukleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß das CpG-Dinukleotid unmethyliert ist. Solche Oligonukleotide sind wohlbekannt und werden zum Beispiel in WO 96/02555 beschrieben. Immunstimulatorische DNA-Sequenzen werden auch zum Beispiel von Sato et al. beschrieben, Science 273: 352, 1996. Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff ist ein Saponin, bevorzugt QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), das allein oder in Kombination mit anderen Hilfsstoffen verwendet werden kann. Zum Beispiel beinhaltet ein gesteigertes System die Kombination aus einem Monophosphoryllipid A und einem Saponin-Derivat, wie zum Beispiel die Kombination aus QS21 und 3D-MPL wie in WO 94/00153 beschrieben, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, worin das QS21 mit Cholesterin gedämpft wird, wie in WO 96/33739 beschrieben. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
Ein Impfstoff, der ein Hepatitis B-Oberflächenantigen umfaßt, kann zusätzlich einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff umfassen. Der TH-1-induzierende Hilfsstoff wird aus der Gruppe aus Hilfsstoffen ausgewählt, die 3D-MPL, QS21, eine Mischung aus QS21 und Cholesterin und ein CpG-Oligonukleotid umfaßt. Ein Impfstoff, der ein Hepatitis B-Oberflächenantigen umfaßt, kann mit einem Monophosphoryllipid A oder einem Derivat von, QS21 und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion als Hilfsstoff versetzt werden.
Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich ein Saponin, besonders bevorzugt QS21. Eine weitere besonders geeignete Hilfsstofformulierung, die CpG und ein Saponin einschließt, wird in WO 00/09159 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung. Am meisten bevorzugt ist das Saponin in dieser besonderen Formulierung QS21. Bevorzugt umfaßt die Formulierung zusätzlich eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol.
Eine Impfstofformulierung, die ein Hepatitis B-Oberflächenantigen und einen Hilfsstoff umfaßt, kann zusätzlich ein oder mehrere Antigene umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Diphterietoxoid (D), Tetanustoxoid (T), azellulären Pertussis-Antigenen (Pa), inaktiviertem Poliovirus (IPV), Haemophilus influenzae-Antigen (Hib), Hepatitis A-Antigen, Herpes simplex-Virus (HSV), Chlamydia, GSB, HPV, Streptococcus pneumoniae- und Neisseria-Antigenen besteht. Antigene, die Schutz für andere Krankheiten verleihen, können auch in der Impfstofforumulierung kombiniert werden.
Die Impfstofformulierung kann ein Hepatitis B-Oberflächenantigen in Verbindung mit einem Hilfsstoff und einem inaktivierten Poliovirus umfassen.
Impfstoffe werden eine immunschützende Menge des Antigens enthalten und können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in Pharmaceutical Biotechnology, Bd. 61., Vaccine Design – the subunit and adjuvant approach, herausgegeben von Powell und Newman, Plenum Press, 1995; New Trands and Developments in Vaccines, herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978. Die Verkapselung innerhalb von Liposomen wird zum von Fullerton beschrieben, US-PS 4,235,877. Die Konjugation von Proteinen mit Makromolekülen wird zum Beispiel von Likhite, US-PS 4,372,945, und von Armor et al., US-PS 4,474,757, offenbart. Die Verwendung von Quil A wird von Dalsgaard et al. offenbart, Acta Vet. Scand., 18: 349 (1977). 3D-MPL ist von Ribi Immunochem, USA, erhältlich und wird in GB 2220211 und US-PS 4,912,094 offenbart. QS21 wird US-PS 5,057,540 offenbart.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, aber nicht beschränkt, worin gilt:
1 veranschaulicht das thiomersalfreie Herstellungsverfahren für Engerix B^TM;
2 veranschaulicht die SDS-PAGE-Analyse von Bulk-Antigenchargen; und
3 veranschaulicht verbleibende Hefeproteine in Bulk-Antigenchargen, die durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 1:
Herstellungsverfahren für Hepatitis B-Oberflächenantigen in Gegenwart von Thiomersal
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) von monovalentem Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals (Engerix B^TM) wird als rekombinantes Protein in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (siehe Harford et al., loc. cit.). Das 24 kD-Protein wird intrazellulär erzeugt und in den rekombinanten Hefezellen angereichert. Am Ende der Fermentation werden die Hefezellen geerntet und in Gegenwart eines milden Tensids wie Tween 20 aufgeschlossen, um das gewünschte Protein freizusetzen. Anschließend wird das Zellhomogenat, das die löslichen Oberflächenantigenpartikel enthält, in einer Reihe von Ausfällungen vorgereinigt und dann durch Ultrafiltration aufkonzentriert.
Eine weitere Reinigung des rekombinanten Antigens wird in nachfolgenden chromatographischen Trennungen durchgeführt. In einem ersten Schritt wird das rohe Antigenkonzentrat einer Gelpermeationschromatographie an Sepharose 4B-Medium unterworfen. Thiomersal ist im Elutionspuffer im 4B-Gelpermeationschromatographieschritt vorhanden. Der Elutionspuffer hat die folgende Zusammensetzung: 10 mM Tris, 5% Ethylenglykol, pH 7,0, 50 mg/l Thiomersal. Thiomersal wird in diesem Puffer zur Bekämpfung der biologischen Belastung eingeschlossen. Der Großteil dieses Thiomersals wird während der nachfolgenden Reinigungsschritte entfernt, die eine Ionenaustauschchromatographie, Ultrazentrifugieren und Entsalzen (Gelpermeation) einschließen, so daß durch das ursprüngliche Verfahren hergestellte gereinigte Bulk-Antigenzubereitungen ca. 1,2 μg und weniger als 2 μg Thiomersal auf 20 μg Protein enthalten.
Ein Ionenaustauschromatographieschritt wird unter Verwendung einer DEAE-Matrix durchgeführt, und diese Ansammlung wird dann einem Ultrazentrifugieren mit Cäsium-Gradienten an vier vorher eingerichteten Schichten unterschiedlicher Cäsiumchlorid-Konzentrationen unterworfen. Die Antigenpartikel werden von verunreinigenden Zellbestandteilen gemäß ihrer Dichte im Gradienten getrennt und am Ende des Zentrifugierverfahrens eluiert. Cäsiumchlorid wird dann aus dieser Ansammlung durch eine zweite Gelpermeation an Sepharosegel entfernt.
Wenn HBsAg durch das Verfahren hergestellt wird, das Thiomersal im 4B-Gelpermeationspuffer enthält, werden Proteinkonzentrationen von über 30 mg/ml in den vereinigten HBsAg-haltigen Fraktionen aus dem CsCl-Gradienten gewonnen, was einer äquivalenten Konzentration von HBsAg gemäß Test durch das AUSZYME-Kit von Abbott Laboratories entspricht.
Der CsCl-Ultrazentrifugenschritt eliminiert gewöhnlich verbleibende Lipide, DNA und kleine Protein-Verunreinigungen aus der HBsAg-Zubereitung. Er wird durch zonales Zentrifugieren in einem Ti 15-Rotor von Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornien bei einer Geschwindigkeit von 30 000 U/min für ca. 40 bis 60 Stunden durchgeführt. Die zu reinigende Probe wird auf Schichten aus CsCl-Lösung mit Endkonzentrationen von 0,75, 1,5, 2,5 und 3,25 M CsCl aufgetragen. Am Ende des Zentrifugierens wird der Gradient in Fraktionen eluiert. Fraktionen, die HBsAg enthalten, können durch UV-Extinktion bei 280 nm oder durch Untersuchen von Verdünnungen der Fraktionen mit dem AUSZYME-Kit identifiziert werden. Die HBsAg-Bande liegt bei einer Dichte von 1,17 bis 1,23 g/cm³.
Die Lösung, die das gereinigte HBsAg enthält, wird sterilfiltriert, bevor sie zur Herstellung einer Impfstofformulierung verwendet wird.
Die Reinigung aus dem Hefezelllysat ist komplex, da das Antigen intrazellulär erzeugt wird und eine Reihe von Trenntechniken, die zur Eliminierung unterschiedlicher Typen von (Hefe-) Verunreinigungen entwickelt wurden, notwendig zum Erhalt von reinem Bulk-Antigen sind. Die Schritte der Reinigung sind wichtig, da das zu reinigende Produkt ein Lipoproteinpartikel ist, das mehrfache Kopien des Oberflächenantigenpolypeptids enthält, und diese Struktur während des Reinigungsprozesses beibehalten werden muß. Es ist eine Besonderheit dieses Prozesses, daß er Oberflächenantigenpartikel liefert, die vollständig immunogen sind, ohne die Notwendigkeit zur weiteren chemischen Behandlung zur Steigerung der Immunogenität (vgl. EP 0135435 ).
Die Einzelheiten des Herstellungsverfahrens werden weiter in EP 0199698 beschrieben.
Beispiel 2
Herstellung und Charakterisierung von aus Hefe stammendem HBsAg durch ein thiomersalfreies Verfahren
1. Herstellung und Reinigung von aus Hefe stammendem HBsAg
1.1 Überblick über das Herstellungsverfahren
Hepatitis B-Oberflächenantigen kann durch Fermentation eines geeigneten Stammes von Saccharomyces cerevisiae, zum Beispiel des in Harford et al. (loc. cit.) beschriebenen, hergestellt werden.
Am Ende der Fermentation des rekombinanten Hefestammes in großem Maßstab werden die Zellen geerntet und in Gegenwart eines milden Tensids wie Tween 20 aufgebrochen. Das Oberflächenantigen wird dann durch ein mehrstufiges Extraktions- und Reinigungsverfahren genau wie oben in Beispiel 1 beschrieben bis zu dem Schritt der ersten Gelpermeation an Sepharose 4B isoliert.
1.2 Thiomersalfreies Reinigungsverfahren
Im thiomersalfreiem Verfahren wurden die folgenden zwei Veränderungen im Vergleich mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren eingeführt.

1. Der Elutionspuffer im 4B-Gelpermeationschromatographieschritt enthält kein Thiomersal mehr.
2. Cystein (2 mM Endkonzentration) wird zur Eluatansammlung aus dem Anionenaustauschchromatographieschritt gegeben.

Es wurde festgestellt, daß das Auslassen von Thiomersal aus dem 4B-Gelpermeationspuffer zu einer Ausfällung der HBsAg-Partikel während des CsCl-Dichtegradientenzentrifugenschrittes mit Produktverlust und Aggregation oder Verklumpung des gewonnen Antigens führen kann.
Die Zugabe von Cystein in 2 mM Endkonzentration zur Eluatansammlung aus dem vorhergehenden Anionenaustauschchromatographieschritt verhindert die Ausfällung und den Verlust von Antigen während des CsCl-Dichtzentrifugierens.
Cystein ist ein bevorzugter Stoff für diese Behandlung, da es eine natürlich vorkommende Aminosäure ist und sie im anschließenden Entsalzungsschritt an einer Gelpermeationssäule unter Verwendung von Sepharose 4BCLFF als Säulenmatrix entfernt werden kann.
Es gibt keine anderen Veränderungen im Herstellungsverfahren im Vergleich mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Das thiomersalfreie Verfahren liefert Bulk-Antigen einer Reinheit und mit Eigenschaften, die vergleichbar dem Antigen aus dem Verfahren von Beispiel 1 sind.
1.2a
Es wird angenommen, daß das zum 4B-Puffer mit 50 μg/ml zugesetzte Thiomersal zersetzt wird, und das resultierende Ethylquecksilber kann kovalent an freie Sulfhydryl-Gruppen an Cysteinresten des Proteins binden. Das Protein enthält 14 Cysteinreste, von denen sich 7 zwischen den Positionen 101 und 150 befinden.
Es wird angenommen, daß sich diese Region des Protein auf der Oberfläche des Partikels befindet und die hauptsächliche antigene Region von HBsAg enthält, einschließlich der immundominanten a-Region und der Erkennungsstelle für den monoklonalen RF1-Antikörper (J. Waters et al., Postgrad. Med. J., 1987: 63 (Suppl. 2): 51–56, und Ashton-Rickardt and Murray, J. Med. Virology, 1989: 29: 196). Antigen, das mit im 4B-Gelpermeationspuffer vorhandenen Thiomersal gereinigt wurde, enthält ca. 0,5–0,6 μg Quecksilber am Ende des Reinigungsverfahrens. Dieses Quecksilber wird nicht vollständig durch einfache Dialyse entfernt.
In einem Experiment wurden 0,56 μg Quecksilber auf 20 μg Protein in einer Bulk-Antigenzubereitung gemessen. Diese Zubereitung wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur gegen 150 mM NaCl, 10 mM NaPO₄-Puffer pH 6,9 dialysiert. Am Ende der Dialyse wurde eine Konzentration von 0,33 μg Hg auf 20 μg Protein gemessen.
Im Gegensatz führt eine Dialyse in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie L-Cystein mit 0,1 bis 5,0 mg/ml, DTT mit 50 mM oder 2-Mercaptoethanol mit 0,5 M, gefolgt von einer zweiten Dialyse zur Entfernung des Reduktionsmittels zur Reduktion des Quecksilbergehaltes in der Antigenzubereitung auf weniger als 0,025 μg Quecksilber auf 20 μg Protein. Dies ist die niedrigste Nachweisgrenze des Verfahrens.
Der Quecksilbergehalt wurde durch Absorptionsspektrophotometrie bestimmt. Das Antigen wird in einer Lösung verdünnt, die 0,01% G/V Kaliumbichromat (K₂Cr₂O₇) und 5% V/V Salpetersäure enthält. Standardlösungen werden mit Thiomersal als Quecksilberquelle hergestellt. Die Atomabsorption von Proben- und Standardlösungen wird nach Verdampfung in einem Dampferzeuger mit einer quecksilberspezifischen Kathode bei 253,7 nm gemessen. Die Atomabsorption der Verdünnungsflüssigkeit wird als Leerprobe gemessen. Der Quecksilbergehalt der Probe wird über die Kalibrierungskurven berechnet, die aus den Standardlösungen erhalten werden. Ergebnisse werden als μg Quecksilber pro 20 μg Protein ausgedrückt.
1.3 Herstellung von thiomersalfreiem Bulk-Antigen
Die Verfahrensschritte zur Reinigung von Bulk-Antigen sind in 1 gezeigt.
1.4 Zusammensetzung von Impfstoff, der ohne Thiomersal formuliert wird
Eine typische quantitative Zusammensetzung für einen Hepatitis B-Impfstoff ohne Konservierungsmittel, formuliert aus Antigen, das durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellt wurde, ist in Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1
Die Zusammensetzung kann durch Zugabe von 3D-MPL und/oder anderen Hilfsstoffen variiert werden.
2. Charakterisierung von Bulk-Antigen und Impfstoff, die durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellt werden
2.1. Untersuchungen und Assays an gereinigtem Bulk-Antigen
2.1.1. Vergleichsbasis
Drei Chargen von Bulk-Antigen wurden durch das thiomersalfreie Verfahren gemäß diesem Beispiel (Beispiel 1.2) hergestellt und werden als HEF001, HEF002 und HEF003 identifiziert. Diese wurden mit einer Charge von Bulk-Antigen (HEP2055) verglichen, die durch das vorhergehende Verfahren (wie in Beispiel 1 beschrieben) in Gegenwart von Thiomersal hergestellt wurde.
2.1.2 Untersuchungen und Assays an Bulk-Antigen
Die drei durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellten Bulk-Antigenchargen wurden untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Der Proteingehalt wurde durch das Verfahren von Lowry et al. gemessen (J. Biol. Chem. 1951: 193: 265).
Der Endotoxin-Gehalt wurde durch eine Limulus-Gelgerinnungstechnik unter Verwendung eines handelsüblichen Kits von Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA gemessen. Das Reagens ist gegen den Endotoxin-Referenzstandard des US-Arzneibuchs standardisiert.
Tween 20 wurde durch das Verfahren von Huddleston und Allred gemessen (J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965: 42: 983).
Der HBsAg-Gehalt wurde durch das handelsübliche AUSZYME-Kit von Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA gemessen. Testverfahren B des Herstellers wurde eingesetzt. Eine Charge von Bulk-Antigen, die durch das thiomersalhaltige Verfahren gereinigt wurde, wurde als Standard verwendet, um die Dosis-Reaktions-Kurve einzurichten.
Polysaccharide wurden durch das Verfahren von Dubois et al. gemessen (Anal. Chem. 1956: 28: 350).
Lipide wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Merkotest Total Lipids 3321) von E. Merck, BP. 4119, Darmstadt D-6100, Deutschland, gemessen.
Der DNA-Gehalt wurde durch das Threshold-Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung und Reagentien gemessen, die erhältlich sind von Molecular Devices Corp., Gutenbergstraße 10, Ismaning, München, Deutschland.
Die in den Untersuchungen und Assays gefunden Werte sind in dem Bereich, der für Bulk-Antigenchargen beobachtet wird, die unter Verwendung von Thiomersal im Elutionspuffer des Sepharose 4B-Gelpermeationsschrittes hergestellt wurden, mit der Ausnahme der antigenen Aktivität durch ELISA. Die werte für diese Messung für die drei HEP-Zubereitungen sind höher (1,63–2,25) als für die Bulk-Antigencharge HEP2005, die ein ELISA/Protein-Verhältnis von 1,13 hat. Die durch das AUSZYME-Kit für thiomersalhaltige Chargen von Bulk-Antigen gemessenen ELISA/Protein-Verhältnisse sind allgemein ca. 1,0 und im Bereich von 0,8–1,2 und übersteigen sehr selten 1,4.
2.1.3 SDS-PAGE-Gelanalyse
Die Bulk-Antigenzubereitungen wurden durch SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen und durch Coomassie Blue-Anfärbung getestet. Alle Proben zeigten eine Hauptbande bei 24 K mit Spuren eines dimeren Proteins. Die Proben werden als von hoher Reinheit (> 99% rein) beurteilt gemäß Bewertung durch die Abwesenheit von sichtbaren Banden von verunreinigenden Proteinen.
Proben (1 μg) der Bulk-Antigenzubereitungen wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen und durch Silberanfärbung getestet (2). Unter reduzierenden Bedingungen zeigten die Proben eine intensive Bande, die bei 24 K mit Spuren von dimeren und multimeren Formen wanderte. Die Gelmuster sind ununterscheidbar von denjenigen von HEP2055 als Vergleich. Die Proben wurden ebenfalls unter nichtreduzierenden Bedingungen laufen gelassen. Unter diesen Bedingungen wandert ein geringerer Teil des Material bei 24 K, und die Menge an Polypeptid, die mit dimeren und multimeren Positionen wandert, ist erhöht. Die thiomersalfreie Bulk-Antigencharge scheint einen etwas höheren Polymerisationsgrad zu haben als die HEP2055-Vergleichscharge.
Die Identität des 24 K-Polypeptids, gezeigt durch Coomassie Blue- oder Silberanfärbung, wurde durch Western-Blotting mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern bestätigt, die gegen Plasma-HBsAg erzeugt wurden. Die Bulk-Antigenzubereitungen zeigen eine Hauptbande bei 24 K zusammen mit dimeren und trimeren Formen. Die Technik zeigt geringfügige Spuren an Abbauprodukten des Oberflächenantigenproteins. Es gibt keine Unterschiede zwischen dem durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellten Bulk-Antigen und der HEP2055-Charge.
Die Gegenwart von verbleibenden Hefeproteinen wurde durch SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen und Western-Blotting mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum getestet, das gegen Hefeproteine erzeugt wurde (3). Die Technik ist qualitativ und erlaubt keine Quantifizierung der Verunreinigungen.
Ein konstantes Bandenmuster wird über die drei Bulk-Antigenchargen, die durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellt wurden, und die HEP2055-Charge mit einer Ausnahme gezeigt.
Eine stark anfärbende Bande, die bei ±23 K im HEP2055-Bulk-Antigen vorhanden ist, fehlt praktisch in den drei HEF-Zubereitungen. Das Western-Blotting zeigt, daß das thiomersalfreie Reinigungsverfahren zu einem reineren Antigenprodukt führt.
Tabelle 2: Ergebnisse von Untersuchungen und Assays an gereinigtem, thiomersalfreiem Bulk-Antigen
2.1.4 Andere biochemische Untersuchungen und Assays
2.1.4.1 DNA-Gehalt
Der DNA-Gehalt der 3 Bulk-Antigenchargen wurde durch das Threshold-Verfahren (Molecular Devices Corp.) gemessen. Die gemessenen Mengen waren weniger als 10 pg DNA auf 20 μg Protein (Tabelle 2); der gleiche Grad an DNA-Gehalt, der bei Bulk-Antigen beobachtet wird, das durch das derzeit zugelassene Verfahren hergestellt wird.
2.1.4.2 Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung der drei HEF-Bulk-Antigenchargen wurde nach saurer Hydrolyse mit 6 N HCl durch Chromatographie der Aminosäuren an einer Ionenaustauschersäule mit nachgeschalteter Ninhydrin-Detektion bestimmt. Prolin und Tryptophan wurden nicht bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die gefunden Zusammensetzungen sind guter Übereinstimmung mit der an HEP2055 bestimmten und mit der erwarteten Zusammensetzung, die aus der DNA-Sequenz abgeleitet wird. Obwohl die Anzahl von für HEP2055 gemessenen Glycinresten nahe der erwarteten Zusammensetzung ist, wird ein Wert von 16 bis 17 Resten gewöhnlicher für Bulk-Antigenzube reitungen gemessen. Die mittlere Anzahl von gefundenen Cysteinresten sind die erwarteten 14, was zeigt, daß keine zusätzlichen Cysteinreste als Ergebnis der Behandlung im CsCl-Gradientenschritt an das Partikel gebunden werden.
2.1.4.3 Quantifizierung von freiem Cystein
Die Menge von freiem Cystein, das in Bulk-Antigenzubereitungen vorhanden ist, die gemäß dem beschriebenen Verfahren erhalten werden, wurde nach Oxidation der Partikel mit Perameisensäure ohne vorherige saure Hydrolyse gemessen. Oxidierte freie Cysteinreste wurden an einer Ionenaustauschersäule mit nachgeschalteter Detektion durch Ninhydrin getrennt. Die Nachweisgrenze von Cystein durch dieses Verfahren beträgt 1 μg pro ml. Kein freies Cystein konnte in den 3 HEF-Antigenzubereitungen bei Untersuchung in den in Tabelle 2 angegebenen Anfangsproteinkonzentrationen gemessen werden. Die Technik mißt sowohl im Puffer vorhandene freie Cysteinreste als auch Cysteinreste, die an das HBsAg-Protein durch Disulfidbindung gebunden sind, die aber keinen Teil der Polypeptidsequenz bilden.
2.1.4.4 N-terminale Sequenzanalyse
Die Gegenwart von möglichen Proteinverunreinigungen und Abbauprodukten in den drei durch das modifizierte Verfahren hergestellten Bulk-Antigenchargen wurde durch N-terminale Sequenzanalyse auf Basis des Edman-Abbaus getestet. Die N-terminale Sequenz MENITS... des HBsAg-Proteins wurde ohne Störung von anderen Sequenzen detektiert. Es wurde ebenfalls bestätigt, daß das N-terminale Methionin zu 60–75% durch Acetylierung blockiert war, wie es zuvor für durch das routinemäßige Verfahren erzeugtes HBsAg-Polypeptid beobachtet wurde.
Tabelle 3: Aminosäurezusammensetzung von HBsAg
2.1.4.5 Laserlichtstreuanalyse
Partikelgrößenvergleiche wurden durch Laserlichtstreuung zwischen den HBsAg-Partikeln, die unter Verwendung des modifizierten Verfahrens hergestellt wurden, und der HEP2055-Referenzcharge vorgenommen (Tabelle 4). Die festgestellten mittleren Molekulargewichte zeigten eine gute Übereinstimmung zwischen den Zubereitungen.
Tabelle 4: Molekulargewichte der HBsAg-Partikel gemäß Laserlichtstreuung
2.1.4.6 Elektronenmikroskopie
Die Bulk-Antigenzubereitungen wurden durch Elektronenmikroskopie nach Fixierung und Anfärbung mit Uranylacetat untersucht. Die beobachteten Partikel waren ähnlich in allen Proben und stimmten mit den für HBsAg typischen subsphärischen oder kieselsteinartigen Partikeln mit ± 20 nm überein. Die in den 3 HEF-Chargen beobachteten Partikel waren von HEP2055 ununterscheidbar.
2.1.5 Immunologische Analysen
2.1.5.1 Reaktivität gegenüber monoklonalem RF1-Antikörper
Die drei Bulk-Antigenzubereitungen wurden auf ihre Reaktivität mit dem monoklonalen RF1-Antikörper durch ELISA-Inhibitionstest untersucht. Es wurde gezeigt, daß der monoklonale RF1-Antikörper Schimpansen gegen Kontakt mit HBV schützt, und es wird angenommen, daß er ein schützendes Konformationsepitop auf dem HBsAg-Partikel erkennt (S. Iwarson et al., 1985, J. Med. Virol., 16: 89–96).
Das RF1-Hybridom kann in der peritonealen Höhle von Balb/C-Mäusen oder in Gewebekultur vermehrt werden.
Auf 1/50000 im Sättigungspuffer (PBS, das 1% BSA und 0,1% Tween 20 enthält) verdünnte Bauchwasserflüssigkeit wurde 1:1 mit verschiedenen Verdünnungen in PBS der zu untersuchenden HBsAg-Proben vermischt (Endkonzentration im Bereich zwischen 100 μg und 0,05 μg/ml).
Die Mischung wurden in Nunc-Immunoplatten (96 U) für 1 h bei 37°C inkubiert, bevor sie für 1 h bei 37°C auf Platten übertragen wurden, die mit einer Standardzubereitung von HBsAg beschichtet waren. Die Standard-HBsAg-Zubereitung war eine Charge von Bulk-Antigen (HEP286), die durch das thiomersalhaltige Verfahren gereinigt wurde. Nach einem Waschschritt mit PBS, das 0,1% Tween 20 enthielt, wurde Biotin-konjugiertes Schaf-Anti-Maus-IgG, verdünnt 1/1000 in Sättigungspuffer, hinzugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde Streptavidin-biotinylierter Peroxidasekomplex, verdünnt 1/1000 in Sättigungspuffer, zu den gleichen Vertiefungen hinzugegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit einer Lösung aus OPDA 0,04%, H₂O₂ 0,03% in 0,1 M Citratpuffer pH 4,5 für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2 N H₂SO₄ beendet, und die optischen Dichten (O.D.) wurden bei 490/630 nm gemessen und graphisch aufgetragen. Der IC50-Wert, definiert als die Konzentration an Antigen (Inhibitorkonzentration), die 50% der Antikörperbindung an aufgetragenes HBsAg hemmt, wurde unter Verwendung einer Gleichung mit 4 Parametern berechnet und in ng/ml ausgedrückt.
Eine Reihe von HEP-Antigenchargen, einschließlich HEP2055, wurde ebenfalls zusammen mit dem Herpes simplex-gD-Antigen als Negativkontrolle untersucht. Der Test mißt die Fähigkeit jedes Testantigens, die Bindung von RF1 an eine Standardantigenzubereitung (HEP286), die an Mikrotiterplatten gebunden ist, zu inhibieren.
Tabelle 5 gibt die Konzentrationen für jedes Antigen an, von denen festgestellt wurde, daß sie 50% der RF1-Bindung an das fixierte Antigen hemmen. Tabelle 5: Inhibierung der Bindung von monoklonalem RF1-Antikörper an HBsAg

* IC₅₀ = Antigenkonzentration (ng/ml), die 50% der RF1-Bindung an fixiertes Antigen hemmt.

Die Ergebnisse zeigen, daß 4- bis 7-fach weniger HEF-Antigen erforderlich ist, um die RF1-Bindung zu hemmen (Tabelle 5). Dies zeigt, daß das durch das modifizierte Verfahren hergestellte Antigen eine erhöhte Darbietung des RF1-Epitops im Vergleich mit dem HEP-Bulk-Antigen aufweist.
Der gleiche Typ Inhibitionsassay wurde unter Verwendung von Humanseren aus Engerix B^TM-Impflingen anstelle des RF1-mAb durchgeführt und zeigte keine Unterschiede zwischen den HEP-Antigenchargen und den HEF-Antigenen.
2.1.5.2 Affinität der Bindung an monoklonales RF1
Die kinetischen Parameter der monoklonalen RF1-Antikörperbindung an die 3 HEF-Antigenchargen und an HEP2055 wurden durch Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung einer Vorrichtung Biacore 2000 von Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK gemessen. Die gemessenen kinetischen Parameter waren wie folgt:

ka:: die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (M^–1s^–1)
kd:: die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (s^–1)
Ka:: die Gleichgewichts- oder Affinitätskonstante (M^–1) mit

Die gefundenen Werte sind in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6: Affinitätskonstanten der RF1-Bindung an HBsAg
Die drei HEF-Antigenchargen ergaben ähnliche Asszoiations/Dissoziationskonstanten und Bindungsaffinitätswerte. Im Gegensatz besitzt HEP2055 eine schwächere Affinität für die Bindung an RF1.
Dies stimmt mit den Ergebnissen aus dem ELISA-Inhibitionstest überein, der zeigte, daß durch das thiomersalfreie Verfahren hergestelltes Antigen eine erhöhte Darbietung des RF1-Epitops besaß.
2.2. Untersuchung und Assays an Impfstoff, der mit durch das modifizierte Verfahren erzeugtem Antigen formuliert ist
Die drei HEF-Antigenchargen wurden an Aluminiumhydroxid adsorbiert und als Impfstoff gemäß der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung formuliert. Die Darreichung ist die Erwachsenendosis in Fläschchen (20 μg Antigenprotein in 1 ml). Die Chargen werden als DENS001A4, DENS002A4 und DENS003A4 identifiziert.
Die Impfstoffwirksamkeit wurde durch einen In-vitro-Antigengehaltstest unter Verwendung des AUSZYME ELISA-Kits von Abbott Laboratories und einer klassischen Charge von Impfstoff, formuliert mit 50 μg/ml Thiomersal, als Standard gemessen. Die Impfstoffwirksamkeit wurde unter Verwendung von Verfahren B gemessen, wie es in PharmaEuropa Sonderausgabe Bio97-2 (Dezember 1997) beschrieben wird. Die drei HEF-Chargen ergeben hohe Werte für den Antigen-Gehalt, beinahe zweimal den angegebenen Gehalt von 20 μg Antigenprotein.
2.2.1 Reaktivität von DENS-Impfstoff mit monoklonalem RF1-Antikörper
Die Antigenität des adsorbierten Impfstoffs wurde weiter in einem Inhibitionstest mit monoklonalem RF1-Antikörper untersucht. Der Test mißt die Fähigkeit der Impfstoffprobe, die RF1-Bindung an fixiertes Bulk-Antigen (HEP286) zu hemmen.
Bauchwasserflüssigkeit, verdünnt auf 1/50000 in Sättigungspuffer (PBS, das 1% BSA und 0,1% Tween 20 enthält), wurde 1:1 mit verschiedenen Verdünnungen in PBS der zu untersuchenden Impfstoffproben vermischt (Konzentration im Bereich zwischen 20 μg und 0,05 μg/ml).
Die Mischungen wurden in Nunc-Immunoplatten (96 U) für 2 h bei 37°C unter Rühren inkubiert, bevor sie auf HBsAg-beschichtete Platten übertragen wurden. Die für die Beschichtung verwendete HBsAg-Zubereitung war eine Charge von Bulk-Antigen (HEP286), die durch das thiomersalhaltige Verfahren gereinigt wurde. Diese Platten werden dann für 2 h bei 37°C unter Rühren inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS, das 0,1% Tween 20 enthält, wurde Biotin-konjugiertes Schaf-Anti-Maus-IgG, verdünnt 1/1000 in Sättigungspuffer, hinzugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde Streptavidin-biotinylierter Peroxidasekomplex, verdünnt 1/1000 in Sättigungspuffer, zu den Vertiefungen gegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und für 20 min bei Raumtemperatur mit einer Lösung inkubiert, die OPDA 0,04%, H₂O₂ 0,03% in 0,1 M Citratpuffer pH 4,5 enthielt. Die Reaktion wurde mit 2N H₂SO₄ beendet, und die optischen Dichten (O.D.) wurden bei 490/630 nm gemessen und graphisch aufgetragen.
Der IC₅₀-Wert, definiert als die Konzentration an Antigen (Inhibitorkonzentration), die 50% der Antikörperbindung an aufgetragenes HBsAg hemmt, wurde unter Verwendung einer Gleichung mit 4 Parametern berechnet und in ng/ml ausgedrückt.
Impfstoff, der aus Bulk-Antigen hergestellt wurde, das durch das modifizierte Verfahren erzeugt wurde, wurde mit Engerix B^TM-Impfstoff verglichen, formuliert aus klassischem HEP-Bulk-Antigen und ohne Thiomersal als Konservierungsmittel. Die Assays wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben und zeigen, daß etwa die Hälfte der Menge von DENS-Impfstoff erforderlich ist, um 50% Inhibierung der RF1-Bindung zu erreichen, verglichen mit dem konservierungsmittelfreien Engerix B^TM-Impfstoff. Dies spiegelt eine erhöhte Darbietung des RF1-Epitops am HEF/DENS-Antigen wider und stimmt mit den Untersuchungen überein, die mit RF1-Antikörper am gereinigten Bulk-Antigen durchgeführt wurden. Tabelle 7: Inhibierung der RF1-Bindung durch formulierten Impfstoff

(1) Konzentration an Impfstoff, die 50% der RF1-Antikörperbindung an fixiertes Antigen hemmt

2.2.2 Immunogenität von DENS-Impfstoff in Mäusen
Eine Untersuchung wurde an Balb/C-Mäusen durchgeführt, um die Immunogenität der drei DENS-Konsistenzchargen mit Engerix B^TM zu vergleichen, das gemäß dem derzeitigen Antigen-Herstellungsverfahren hergestellt und mit Thiomersal formuliert war.
Die folgenden Chargen wurden untersucht:
#DENS001A4
#DENS002A4
#DENS003A4
#ENG2953A4/Q als Referenz
Kurz gesagt wurden Gruppen von 12 Mäusen intramuskulär zweimal in einem zweiwöchigen Intervall mit Impfstoffdosen immunisiert, die 1/10 (2 μg) oder 1/50 (0,4 μg) der erwachsenen Humandosis entsprachen. Die Antikörperreaktion auf HBsAg und das isotypische Profil, die durch die Impfung induziert wurden, wurden aus am Tag 28 entnommenen Seren überwacht.
Experimenteller Aufbau
Gruppen von 12 Balb/C-Mäusen wurden intramuskulär in beiden Beinen (2 × 50 μl) an den Tagen 0 und 15 mit den folgenden Impfstoffdosen immunisiert:
Tabelle 8: Gruppen und Impfstoffdosis
An den Tagen 15 (2 Wochen post I) und 28 (2 Wochen post II) wurde Blut aus dem Sinus retroorbitalis entnommen. Für den Aufbau dieses Experiments (4 Formulierungen × 2 Dosen mit 12 Mäusen pro Gruppe) wurde die Macht a priori mit dem statistischen PASS-Programm abgeschätzt. Das statistische Programm PASS (Power and Sample Size) wurde von NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037 erhalten. Für die zweifaktorielle Varianzanalyse sollte eine 2,5-fache Differenz des GMT zwischen Formulierungen mit einem alpha-Fehler von 5% bei einer Macht von > 90% detektiert werden.
Ergebnisse
Serologie:
Humorale Reaktionen (Gesamt-Ig und Isotypen) wurden durch einen ELISA-Assay unter Verwendung von HBsAg (HEP286) als Hüllantigen und von Biotin-konjugierten Anti-Maus-Antikörpern gemessen, um die Anti-HBs-Antikörperbindung aufzuzeigen. Nur Post II-Seren wurden analysiert.
Tabelle 9 zeigt den Mittelwert und GMT-Wert von Anti-HBs-Ig-Antikörperreaktionen, gemessen an individuellen Seren 2 Wochen post II.
Vergleichbare Antikörperreaktionen werden durch die DENS- und klassischen Hepatitis B-Formulierungen induziert: GMT-Werte im Bereich zwischen 2304 und 3976 EU/ml für die DENS-Chargen waren vergleichbar mit 2882 EU/ml für monovalenten Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals (Engerix B^TM) bei der Dosis mit 2 μg, und GMT-Werte im Bereich zwischen 696 und 1182 EU/ml für die DENS-Chargen waren vergleichbar mit 627 EU/ml für den monovalenten Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals (Engerix B^TM) bei der Dosis mit 0,4 μg.

– Wie erwartet wird ein klarer Effekt des Antigen-Dosisbereiches für alle Formulierungen in den Dosen mit 2 μg und 0,4 μg bei einem 3- bis 6-fachen Unterschied der GMT-Werte beobachtet.
– Vier "Non-Responder"-Mäuse (Titer < 50 EU/ml) wurden ohne klare Verbindungen zu den für die Injektion verwendeten Antigendosen oder -chargen beobachtet (Gruppen 1, 2, 3 und 8; eine Maus pro Gruppe).

Auf der Basis der statistischen Analyse (Grubbs-Test) wurden diese Mäuse aus der weiteren Analyse entfernt.
Tabelle 9: Antikörperreaktion in Mäusen am Tag 28 (2 Wochen post II)
Statistische Analyse:
Eine zweifaktorielle Varianzanalyse wurde an den Anti-HBs-Titern nach logarithmischer Umwandlung der Daten post II unter Verwendung der Impfstoffe (4 Chargen) und Antigendosen (2 μg und 0,4 μg) als Faktoren durchgeführt. Diese Analyse bestätigte, daß ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den zwei Antigendosen (p-Wert < 0,001) beobachtet wurde, und zeigte keinen signifkanten Unterschied zwischen den Impfstoffchargen (p-Wert = 0,2674). Wie zuvor erwähnt wurde, wurde die Macht a priori abgeschätzt, und der Aufbau des Experiments war derart, daß ein 2,5-facher Unterschied des GMT-Wertes bei einem alpha-Fehler von 5% zwischen den Formulierungen mit einer Macht von > 90% detektiert werden konnte.
Isotypisches Profil:
Tabelle 10 zeigt die isotypische Verteilung (IgG1, IgG2a und IgG2b), berechnet aus einer Analyse an vereinigten Seren zum Zeitpunkt Post II.

– Wie erwartet, wird eine klare TH2-Reaktion durch diese auf Alaun basierten Impfstoffe induziert, da hauptsächlich IgGl-Antikörper beobachtet werden.

Kein Unterschied wird zwischen den DENS-Chargen oder dem monovalenten Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals in Bezug auf das isotypische Profil beobachtet.
Tabelle 10: Verteilung von IgG-Isotypen in vereinigten Seren vom Tag 28
Beispiel 3: Formulierung von kombinierten Impfstoffen
Das Bulk-Antigen der Erfindung ist besonders geeignet zur Formulierung in einem kombinierten Impfstoff, der IPV umfaßt.
Stabilitätsuntersuchungen, die an ursprünglichen Chargen aus einem kombinierten DTPa-HBV-IPV-Impfstoff durchgeführt wurden, zeigten eine Abnahme der Wirksamkeit der IPV-Komponente, insbesondere vom Typ 1 Poliomyelitis-Antigen, wenn ein In-vitro-Immunoassay (Bestimmung des D-Antigengehalts durch ELISA) und ein In-vivo-Wirksamkeitstest an der Ratte verwendet wurden. Kein Wirksamkeitsverlust wurde für Typ 3 beobachtet. Für Typ 2 war der Wirksamkeitsverlust innerhalb des erwarteten Bereichs (nicht mehr als 10% Verlust pro Jahr Lagerung).
Die Untersuchungen wurden eingeleitet, um die Ursache für diesen Wirksamkeitsverlust im kombinierten DTPa-HBV-IPV-Impfstoff zu bestimmen. Aus der Beobachtung, daß die Stabilität von IPV im DTPa-IPV-Impfstoff von SB Biologicals zufriedenstellend ist (nicht mehr als 10% Antigengehaltverlust pro Jahr Lagerung), wurde gefolgert, daß die HBV-Komponente wahrscheinlich verantwortlich für die Instabilität von IPV im DTPa-HBV-IPV-Impfstoff ist.
Die in der ursprünglichen DTPa-HBV-IPV-Formulierung verwendete HBV-Komponente ist das aus gereinigter r-DNA, aus Hefe stammende HBsAg, das auch zur Herstellung von monovalentem Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals verwendet und wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde.
Als erster Versuch zur Bestimmung, welches Element in der HBV-Komponente nachteilig für IPV war, wurde der HBsAg-Bulk auf Gegenwart von Thiomersal analysiert. Es wurde zuvor festgestellt (Davisson et al., 1956, J. Lab. Clin. Med. 47: 8–19), daß das als Konservierungsmittel in DTP-Impfstoffen verwendete Thiomersal "nachteilig für das Poliomyelitis-Virus" in einer DTP-IPV-Kombination war. Diese Beobachtung wurde von Impfstoffherstellern berücksichtigt, die Thiomersal gegen andere Konservierungsmittel ausgetauscht haben, um ihre IPV-haltigen Impfstoffe zu formulieren. Vor kurzem wurde erneut die Wirkung von Thiomersal auf die IPV-Wirksamkeit unter Bedingungen einer Langzeitlagerung bei +4°C untersucht. Der Verlust an Wirksamkeit von Typ 1-Poliovirus-Antigen auf nicht-nachweisbare Mengen nach 4–6 Monaten wurde berichtet (L. A. Sawyer et al. 1994, Vaccine 12: 851–856).
Unter Verwendung von Atomadsorptionsspektroskopie wurden ca. 0,5 μg Quecksilber (Hg) auf 20 μg HBsAg in gemäß Beispiel 1 gereinigtem Antigen nachgewiesen.
Diese Quecksilbermenge (als Thiomersal und Ethylquecksilberchlorid, dem Thiomersalabbauprodukt) kann die ELISA-Reaktion für den D-Antigen-Typ 1-Gehalt in einem IPV-Bulk-Konzentrat, das für 7 Tage bei 37°C inkubiert wurde, auf nicht nachweisbare Mengen reduzieren.
Ein Verfahren wurde eingerichtet, um im HBsAg-Bulk vorhandenes Quecksilber freizusetzen. Es wurde postuliert, daß Quecksilber an Thiol-Gruppen auf dem HBsAg-Partikel gebunden sein könnte und deshalb in Gegenwart von Reduktionsmitteln freigesetzt werden könnte. Nach Experimentieren mit anderen Reduktionsmitteln wurde L-Cystein als Mittel zur Freisetzung von Quecksilber aus dem HBsAg-Partikel ausgewählt. Nach Dialyse von HBsAg-Bulk gegen Kochsalzlösung, die 5,7 mM L-Cystein enthielt, wurde kein Quecksilber im Retentat nachgewiesen (Nachweisgrenze des Testverfahrens: 25 ng Hg/20 μg HBsAg). Das dialysierte Antigen wurde mit IPV-Bulk-Konzentrat vermischt, und die Stabilität des Typ 1-Virus wurde durch Messung des D-Antigengehalts nach Inkubation für 7 Tage bei 37°C getestet. Das IPV-Bulk-Konzentrat, unvermischt und vermischt mit HBsAg, das nicht mit Cystein behandelt war, wurde als Kontrollen verwendet. Der Referenz-ELISA-Titer wurde an bei +2 bis 8°C für 7 Tage gelagerten Proben erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt. Tabelle 11

⁽¹⁾ Ausgedrückt in D-Antigeneinheiten (DU)

Die aus diesen Laborzubereitungen erhaltenen Daten zeigen deutlich, daß die Stabilität des Typ 1-Poliovirus signifikant verbessert ist, falls HBsAg mit Cystein behandelt wird, um verbleibendes Quecksilber zu entfernen, vor dem Vermischen mit IPV.
Die oben angegebenen Daten zeigen ebenfalls einen Verlust an D-Antigengehalt von 23% für die Referenz-IPV-Zubereitung nach Inkubation für 7 Tage bei 37°C. Dies bestätigt die innewohnende Instabilität des Typ 1 Mahoney-Poliovirus, wie sie zuvor angegeben wurde (L. A. Sawyer et al. (1994), Vaccine 12: 851–856).
Obwohl kommerzielle Chargen von DTPa-HBV-IPV- und DTPa-HBV-IPV/Hib-Impfstoffen unter Verwendung eines Dialyseverfahrens mit 5,7 mM L-Cystein zur Entfernung von verbleibendem Quecksilber und zur Bewahrung der Stabilität von IPV hergestellt wurden, ist das Dialyseverfahren nicht für eine Produktion im großen Maßstab geeignet und beinhaltet eine Reihe von ergänzenden Schritten zur Herstellung von thiomersal- oder quecksilberfreiem HBsAg. Im Gegensatz kann das HBsAg der vorliegenden Erfindung, das ohne Thiomersal hergestellt wird, direkt in Formulierungen von kombinierten Impfstoffen verwendet werden, speziell denjenigen, die IPV enthalten.
4. Zusammenfassung
Das zuvor verwendete Verfahren zur Reinigung von aus Hefe stammendem Oberflächenantigen enthält einen Gelpermeationsschritt, in dem die quecksilberhaltige antimikrobielle Verbindung Thiomersal im Elutionspuffer eingeschlossen wird, um die biologische Belastung zu bekämpfen. Das Thiomersal wird während der anschließenden Schritte des Verfahrens nicht vollständig entfernt, so daß ca. 1,2 μg Thiomersal auf 20 μg Protein im gereinigten Bulk-Antigen vorhanden sind.
Zur Herstellung eines völlig thiomersal-(quecksilber)-freien Bulk-Antigens wurde das Reinigungsverfahren in zwei Schritten verändert.

– Thiomersal wird im Elutionspuffer im 4B-Gelpermeationsschritt ausgelassen.
– Cystein (2 mM Endkonzentration) wird zur Eluatansammlung aus dem Anionenaustauschchromatographieschritt hinzugegeben. Dies verhindert die Ausfällung von Antigen während des CsCl-Dichtegradientenzentrifugierens. Es gibt keine anderen Veränderungen im Herstellungsverfahren.

Das durch das modifizierte Verfahren hergestellte Bulk-Antigen wurde charakterisiert. Physikochemische Untersuchungen und Tests zeigen, daß das thiomersalfreie Antigen ununterscheidbar in seinen Eigenschaften von Antigen ist, das durch das zuvor verwendete Verfahren hergestellt wird. Die Antigenpartikel haben die gleichen Bestandteile. Die Identität und Integrität des HBsAg-Polypeptids sind unbeeinflußt durch das modifizierte Verfahren gemäß Bewertung durch SDS-PAGE-Analyse, Western-Blotting unter Verwendung polyklonaler Anti-HBsAg-Antikörper, N-terminale Sequenzanalyse und Aminosäurezusammensetzung. Elektronenmikroskopie und Laserlichtstreuanalyse zeigen, daß die Partikel die typische Form und Größe besitzen, die für aus Hefe stammendem HBsAg erwartet werden. Analyse durch Western-Blotting mit Anti-Hefeproteinserum zeigt, daß das durch das thiomersalfreie Verfahren hergestellte Antigen ein ähnliches Muster an verunreinigenden Hefeproteinen hat. Jedoch ist die Menge einer bei 23 K wandernden verunreinigenden Bande in den 3 HBsAg-Chargen stark reduziert, die unter Verwendung des modifizierten Verfahrens hergestellt wurden.
Immunologische Analyse zeigen, daß die thiomersalfreien Partikel eine erhöhte Antigenität haben. Die Partikel sind reaktiver gegenüber dem AUSZYME-Kit von Abbott (das eine Mischung monoklonaler Antikörper enthält), wobei ELISA/Protein-Verhältnisse von 1,6 bis 2,25 erhalten werden. Diese erhöhte Antigenität wird ebenfalls mit dem schützenden monoklonalen RF1-Antikörper gezeigt. Ca. 4- bis 7-mal weniger thiomersalfreies Antigen sind erforderlich, um die RF1-Bindung an ein fixiertes Standardantigen zu hemmen. Die thiomersalfreie und klassische Antigeninhibierung der Bindungskurven fallen in zwei unterschiedliche Familien. Dieser Unterschied wird auch durch Messungen der Bindungsaffinitätskonstante für RF1 unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz gezeigt. Die Bindungsaffinitäten der thiomersalfreien Zubereitungen sind 3- bis 4-mal höher im Vergleich mit der Charge von klassischem Bulk-Antigen.
Die Bulk-Antigenzubereitungen wurden als Impfstoff durch Adsorption an Aluminiumhydroxid und ohne Konservierungsmittel formuliert.
Untersuchung auf In-vitro-Wirksamkeit unter Verwendung des AUSZYME ELISA-Kits von Abbott und von thiomersalhaltigem monovalentem Hepatitis B-Impfstoff von SB Biologicals als Standard zeigte, daß hohe In-vitro-Wirksamkeitswerte erhalten wurden. Der durch diesen Test gemessene Antigengehalt war beinahe das doppelte des angegebenen Wertes von 20 μg Protein pro ml.
Eine erhöhte Reaktivität des aus thiomersalfreiem Antigen hergestellten Impfstoffs wurde auch in einem Inhibitionsassay mit monoklonalem RF1-Antikörper zur Bindung an fixiertes Antigen beobachtet. Etwa die Hälfte der Menge an thiomersalfreiem Impfstoff war erforderlich, um 50% Inhibierung der RF1-Bindung an fixiertes Antigen zu ergeben, verglichen mit Antigen, das durch das zuvor verwendete Verfahren gereinigt und ohne Konservierungsmittel formuliert wurde. Diese erhöhte Antigenität des thiomersalfreiem Impfstoffs in bezug auf RF1 stimmt mit den Ergebnissen aus dem Test auf In-vitro-Wirksamkeit (Antigengehalt) und mit den RF1-Antikörperuntersuchungen überein, die an Bulk-Antigenzubereitungen durchgeführt wurden. Ein Immunogenitätstest an der Maus wurde unter Verwendung von Vor- und Auffrischungsimpfungen im Abstand von zwei Wochen und mit Dosen von 2 und 0,4 μg Antigen durchgeführt. Den Mäusen wurde Blut am Tag 28 entnommen, 14 Tage nach der Auffrischung. Die Seren wurden auf Antikörpertiter und Isotyp-Zusammensetzung analysiert. Ein klarer Antigen-Dosis-Effekt wurde für die zwei verabreichten Dosen beobachtet, aber es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Reaktion in bezug auf Antikörpertiter (GMT) zwischen thiomersalfreien und konservierungsmittelfreien Impfstoffen. Keine substantiellen Unterschiede wurden in den Isotypprofilen beobachtet.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Impfstoffs, wobei der Impfstoff ein gereinigtes Hepatitis B-Oberflächanantigen und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfasst, wobei das Antigen weniger als 0,025 μg Quecksilber auf 20 μg Protein umfasst, worin das Antigen in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit einer freien -SH-Gruppe gereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Impfstoff ohne Konservierungsmittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Konservierungsmittel Thiomersal ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Hepatitis-Antigen auf Aluminiumhydroxid adsorbiert wird.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, worin eine rohe Hepatitis B-Antigenzubereitung (a) einer Gelpermeationschromatographie unterworfen wird; (b) einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen wird; und (c) mit einem Reduktionsmittel mit einer freien -SH-Gruppe vermischt wird.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, worin das Reduktionsmittel Cystein, Glutathion, Dithiothreit oder β-Mercaptoethanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Reduktionsmittel Cystein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das Cystein auf eine Endkonzentration von 1 bis 10 mM hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das Cystein auf eine Endkonzentration von ca. 2 mM hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, worin das Antigen in Gegenwart von Thiomersal vor der Behandlung mit dem Reduktionsmittel gereinigt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das gereinigte Antigen völlig frei von Thiomersal ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin der Impfstoff ein thiomersalfreier Impfstoff ist.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, worin der Impfstoff einen Hilfsstoff umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, worin der Hilfsstoff ein Aluminiumsalz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, worin das Aluminiumsalz Aluminiumhydroxid ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 13 bis 15, das einen TH1-induzierenden Hilfsstoff umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin der TH1-induzierende Hilfsstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die 3-DMPL, QS21, 3-DMPL und QS21, und ein CpG-Oligonucleotid umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, worin der Impfstoff zusätzlich ein oder mehrere der Antigene umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Diphterietoxoid (D), Tetanustoxoid (T), acellulären Pertussis-Antigenen (Pa), inaktiviertem Poliovirus (IPV), Haemophilus influenzae-Antigen (Hib), Hepatitis A-Antigen, Herpes simplex-Virus (HSV), Chlamydia, GSB, HPV, Streptococcus pneumoniae- und Neisseria-Antigenen besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Oberflächenantigens, das zur Verwendung in einem Impfstoff geeignet ist, wobei das Verfahren die Reinigung des Antigens in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit einer freien -SH-Gruppe umfasst, worin das Antigen in Gegenwart von Thiomersal vor der Behandlung mit dem Reduktionsmittel gereinigt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Antigens gemäß Anspruch 19, worin das gereinigte Antigenprodukt weniger als 0,025 μg Quecksilber auf 20 μg Protein umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Antigens gemäß Anspruch 19 oder 20, worin eine rohe Hepatitis B-Antigenzubereitung: (a) einer Gelpermeationschromatographie unterworfen wird; (b) einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen wird; und (c) mit einem Reduktionsmittel mit einer -SH-Gruppe vermischt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Antigens gemäß Anspruch 19 bis 21, worin das Reduktionsmittel Cystein, Glutathion, Dithiothreit oder β-Mercaptoethanol ist.