DE2610717C3

DE2610717C3 - Hepatitis-B-Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2610717C3
Application number: DE2610717A
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr.Med. Stamford Conn. Mayer Prince; Alexander Robert Dr. Neurath; N.Y. New York; John Bronx Vnek
Original assignee: Community Blood Council Of Greater New York Inc New York Ny (vsta)
Current assignee: Community Blood Council Of Greater New York Inc New York Ny (vsta)
Priority date: 1975-03-14
Filing date: 1976-03-13
Publication date: 1981-02-05
Also published as: DE2610717A1; JPS51133414A; NL7602621A; CA1066190A; MX3473E; AT349136B; SE437329B; ATA186276A; AU505999B2; AU1196776A; SE7602871L; US4118478A; DE2610717B2

Description

Epidemiologische Untersuchungen sowie Versuche an Freiwilligen, die in den Jahren 1939 und 1967 ausgeführt wurden, erbrachten den Nachweis der Existenz zwei Hauttypen von Hepatitiviren: des Virus A und des Virus B. Zunehmend wurde deutlich, daß für das weitere Verständnis der Virologie dieser Viren und die Verhütung der von ihnen verursachten Krankheiten die Entwicklung immunologischer Methoden erforderte. Zahlreiche Untersuchungen konzentrierten sich auf diese Viren, insbesondere auf das Virus B. Das Virus B wurde bei Patienten gefunden, die Injektionen oder Bluttransfusionen erhalten hatten, weshalb die von diesem Virus hervorgerufene Krankheit auch als Scrumhepatitis bezeichnet wurde. Nach der Entdeckung von Antigenen, die für Injektionen mit dem Hepatitisvirus B spezifisch waren (Prince und Mitarbeiter, Am. J. Hyg. 79, 365, 1964; Blumberg und Mitarbeiter, JAMA 191,541,1965; Prince, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 60,814, 1968), wurde offensichtlich, daß das »Serumhepatitis-Virus« unter bestimmten Umständen tatsächlich kontagiös war. Es erschien daher zweckmäßig, die Terminologie zu ändern. Der Virushepälitis-Aüsschüß der Fachgruppe Medizinische Wissenschaften in der Akademie der Wissenschaften, National Research Council, empfahl daher 1972, zur früheren Terminologie, nämlich Hepatitisvirus A für den Erreger der infektiöser. Hepatitis und Hepatitisvirus B für den Erreger der Serumhepatitis, zurückzukehren. Gleichzeitig empfahl der Ausschuß die Benutzung der Bezeichnung Hepatitis-B-Antigen (HB-Ag) für das Antigen anstelle der

früher benutzten Bezeichnungen, z. B, Australia-Antigen (Au-Ag) nach der erstmaligen Feststellung des Antigens australischer Ureinwohner, Serumhepatitis-Antigen (SH), Hepatitis verursachendes Antigen (HAA) usw, zu verwenden,

In der Folgezeit konzentrierten sich die Untersuchungen auf Antigen-Besonderheiten bei Infektionen mit dem Hepatitisvirus B und auf Antigen-Untertypen, die heute als HBsAg/adywr usw., Hepatitis-B-Kemantigen (HBcAG), entdeckt von Almeida, e-Antigen, entdeckt von Magnius und Espmark, sowie als Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBoAG) bezeichnet werden. Antikörperfür HBoAG werden als Anti-HBo bezeichnet.

Viele der ersten Forscher, darunter Blumberg, glaubten, daß die HepatitLs-B-Antigene ihren genetisehen Ursprung im Wirt hätten. Andere Forscher, darunter Prince und Vnek, waren der Ansicht, daß die Hepatitis-B-Antigene von dem Genom des Hepatitisvirus B bestimmt würden. Immer mehr wurde klar, daß zur Verhinderung von Infektionen durch dieses Virus eine aktive Immunisierung nötig sein würde, und die Forschungen konzentrierten sich deshalb auf die Herstellung eines Impfstoffs.

Gegenwärtig werden Teilchen im menschlichen Serum mit einer Teilchengröße im Bereich von etwa 20 bis 25 nm als die vorherrschenden Teilchen angesehen, die die Hepatitis-B-Oberflächenantigene tragen. Forschungen konzentrieren sich auf die Trennung dieser Teilchen von anderen Proteinstoffen im Blut, insbesondere von den größeren, 42 nm großen Dane-Partikel, die von vielen für das infektiöse Virion gehalten werden. Es wird angenommen, daß man, falls es gelänge, das Antigen in dem erforderlichen Ausmaß zu reinigen und die Dane-Partikel zu entfernen, ein Material erhalten könnte, das nach der Verdünnung mit einem physiologisch unbedenklichen Medium und sicherheitshalber weiterer Inaktivierung einen Impfstoff für die aktive Immunisierung darstellen würde. Um dies zu erreichen, wird von Blumberg in der US-PS 36 36 191 die Behandlung von Blutplasma von HBo-Ag-Trägern mit einem Gemisch von Enzymen vorgeschlagen, die die neuen Teilchenproteine spalten sollen. Daran schließen sich bekannte Behandlungen in der Zentrifuge zur Gewinnung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens auf Teilchen an, deren Größe etwa 22 nm beträgt. Blumberg und Mitarbeiter hatten erkannt, daß die zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehörenden 22 nm großen Teilchen die Form eines Hohlkörpers ohne Kern hatten und gegen die bei dem Spaltverfahren verwendeten Enzyme im wesentlichen beständig waren. Blumberg konnte so einen Impfstoff mit einer Dichte in der Größenordnung von 1,21 g/cm³ gewinnen, der — nach Blumberg — mit einem physiologisch unbedenklichen Medium veidünnt und als aktives Immunisierungsmittel verwendet werden kann. Der nach dem Verfahren von Blumberg erhältliche Impfstoff mag hinsichtlich einer Anregung der Synthese von Antikörpern in einem Wirtskörper, wie in dem eines Menschen, wirksam sein, doch ist heute bekannt, daß derartige Antikörper nur eine begrenzte Spezifität haben und keine Antikörper gegen bestimmte Antigene, z. B. dem e-Antigen, das nur auf den größeren Teilchen, wie den Dane-Partikeln (d. h. dem Virion) vorkommen, einschließen. Der von Blumberg vorgeschlagene Impfstoff bietet daher keinen Schutz gegen hohe Virus-Dosen, denen Patienten, z. B. bei Bluttransfusionen, ausgesetzt sind. (In den F i g. 1 und 2 sind die theoretischen Grundlagen für diese Folgerung angegeben.) Zwar wäre es theoretisch möglich, sehr hohe Titer von HB-Antikörpern z-j erzeugen, doch stehen hierzu keine für den Menschen geeignete Mittel zur Verfügung. Theoretisch könnte man das Freundsche Adjuvans zur Stimulierung der Produktion hoher Mengen Antikörper anwenden. Dann könnten die sehr hohen Konzentrationen der H B-Antikörper sowohl das Hepatitis-B-Oberflächenantigen als auch das mit den Virionen verbundene e-Antigen wirksam neutralisieren (siehe F i g. 2). Wegen

ίο der möglichen Carcinogenität und anderer nachteiliger Nebenwirkungen des Freundschen und anderer bekannter Adjuvantia ist jedoch gegenwärtig keine Methode für die Erzeugung derart hoher Titer von HB-Antikörpern im Menschen bekannt

Es stellt sich daher die Aufgabe, einen Virushepatitis-Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der nicht nur die Produktion von HB-Antikörpern, sondern auch die Produktion von spezifisch gegen das Virion selbst, d. h. gegen da* 42 nm große Dane-Partikel bzw. das e-Antigen, gerichteten Antikörper^ anregt und stimuliert Bisher war die Herstellung eir.es derartigen Impfstoffs aus gesammeltem menschlichen Blutplasma, das HB-Oberflächenantigen enthielt, nicht möglich, weil derartiges gesammeltes Plasma einen Oberschuß an e-Antikirpern enthält Diese Antikörper verbinden sich mit den e-Antigen enthaltenden Teilchen, was zu deren Ausfällung führt Die das ausgefällte e-Antigen enthaltenden Teilchen sind, wenn überhaupt, nur sehr schwierig mit herkömmlichen Methoden zu reinigen und kommen daher im Endprodukt nicht vor.

Es stellt sich daher die Teilaufgabe, ein Verfahren zur Isolierung das Hepatitis-B-Oberflächenantigens zusammen mit freies, ungebundenes und nicht gefälltes e-Antigen enthaltenden Teilchen anzugeben, dessen Endprodukt als Impfstoff für die aktive Immunisierung verwendet werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die in den Ansprüchen 1 und 7 gekennzeichneten Maßnahmen gelöst

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen 2 bis 6 angegebein.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß einige wenige »ausgewählte« (etwa 2%) klinisch gesunder Menschen, die Träger des Hepatitis-B-Oberflächenantigens sind, im Blut Teilchen haben, die freies e-Antigen enthalten. Damit ist gemeint, daß ihr Blut nicht nur HBo-Ag in Hohlkörperform mit einer Teilchengröße von etwa 22 nm (wie von Blumberg u. a. berichtet), sondern auch größere Teilchen enthält, die entweder fadenförmige Teilchen mit einem Durchmesser von 20 bis 45 nm oder Dane-Partikel von im allgemeinen zylindrischer Form mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 42 nm enthält, die neben dem herkömmlichen HBo-Ag auch e-Antigen ohne Lücke (e) enthalten.

Es wurde gefunden, daß ein Impfstoff nu* aus dem Blut dieser »ausgewählten« (d. h. e-Antigen-positiven, e-Antikörper-negativen) Spendern hergestellt werden kann.

Eine wichtige Grundlage für diese Feststellung ist die Tatsache, daß die Dane=Partikel und die größeren fadenförmigen Teilchen e-Antigen enthalten. Diese Feststellung bildet eine rationale Basis für die in den Tabellen I und II aufgeführten Zusammenhänge.

Ferner wurde gef'inden, daß das e-Antigen außer auf den größeren HBo-Ag-Teilchen im Serum auch in einer »löslichen« Form mit einem Molekulargewicht von unter 1 Million, im allgemeinen 50 000 bis 200 000, vorkommt. Das Blut solcher positiven e-Antigen-Träger

enthält natürlich auch die zum HBo-Ag gehörenden hohlkörperförmigen Teilchen mit einer Größe von etwa 22 nm, die kein e-Antigen aufweisen (siehe F i g. I).

Der rationale und theoretische Vorteil dieses Impfstoffs wird durch das Schema der Fig. 2 veran- > schaulicht. Man beachte, daß die mäßigen HB-Antikörpertiter, die mit den bekannten Impfstoffen mit 20 nm großen Teilchen, wie der Impfstoff von Blumberg, erhalten werden, nur Schutz bieten, wenn die Angriffsdosis außerordentlich niedrig ist; wenn größere Mengen m des HB-Virus und der zu ihm gehörenden HBo-Ag enthaltenden Teilchen auftreten, neutralisieren diese die kleinen Mengen der HB-Antikörper. so daß die Dane-Partikel frei bleiben und die Leber des Wirtes infizieren können. Wenn dagegen die Bildung von ι. e-Antikörpern angeregt wird, können diese sich spezifisch mit den infektiösen Virionen (Dane-Partikel) verbinden, ohne daß sie durch den großen Überschuß an kleinen HBo-Ag-Teilchen (in der Regel 500 kleine Teilchen je 1 Dane-Partikel) neutralisiert werden. :n

Der Impfstoff gemäß der Erfindung zeichnet sich daher durch das Vorkommen von Teilchen im Bereich von 30 bis 50 nm, vorzugsweise im Bereich von 35 bis 45 nm, aus. Bei diesen größeren Teilchen, die im allgemeinen mit Teilchen der Größe von 16 bis 22 nm, :ί die ebenfalls HBo-Ag enthalten, lassen sich im allgemeinen zwei Hauttypen unterscheiden: Fadenförmige Teilchen und die oben beschriebenen Dane-Partikel.

Der Impfstoff enthält daher beide Antigen-Spezifitä- κι ten, Proteine und Nucleinsäuren, die in dem Impfstoff gemäß der US-PS 36 36 191, die nur die kleineren HBo-Ag-enthaltenden Teilchen enthält, nicht vorkommen (siehe F i g. 1). Man beachte, daß die Dane-Partikel sowohl einen Kern als auch einen Mantel haben, wobei η der Kern DNS, DNS-Polymerase und HBcAg enthält. Der Mantel des Dane-Partikels enthält HBo-Ag sowie e-Antigen (e) und ähnliche Dane-spezifische Antigene. Daher muß der Gesamtimpfstoff Teilchen mit einer höheren Dichte als die Teilchen des Impfstoffs gemäß der US-PS 36 36 191 enthalten. Die Dichte des schein Dichtegefälle unter Verwendung von Caesiurnchlorid-Lösungen abgestufter Dichte.

Der Impfstoff hat folgende Eigenschaften: Jede Dosis enthält 20 bis 50 ng HBoAg-Teilchen-Protein mit 10" bis 10'·' (vorzugsweise 10"' bis \0") Dane-Partikel, ferner eine gleiche oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen. Selbstverständlich enthält der Impfstoff nur solche größeren (30 bis 50 nm) Teilchen, in denen das e-Antigen frei, d.h. nicht an einem entsprechenden e-Antigenkörper gebunden, ist.

F.in besonderes Kennzeichen des Impfstoffs ist das Vorkommen freien e-Antigens auf Dane- oder fadenförmigen Teilchen. Der Impfstoff enthält jedoch in dem verwendeten physiologisch unbedenklichen Medium auch noch e-Antigen in löslicher Form.

Das Vorhandensein von e-Antigen kann mit Hilfe einer Anzahl von Methoden festgestellt werden; die nachstehend beschriebene Methode reicht für die Zwecke dieser Erfindung aus:

Unempfindlicher Test zur Bestimmung
der Gegenwart von freiem e-Antigen

Die mittlere Vertiefung einer Agar-Gel-Diffusionsplntte, die vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise aus einer Lösung von 0,5 bis 0,7% Agarose in einer Lösung hergestellt ist, die 0.1 -m NaCI,0,01 -m Tris-Puffer mit eitiem pH-Wert von 7.2, 0,001-m EDTA, 2,0 Gi:w.-Teilen/100 Vol.-Teilen Dextran 250 und 0,1 Gi:w.-Teil/100 Vol.-Teilen Protaminsulfat enthält, wird mit e-Antikörperserum gefüllt, wie es beispielsweise von der Blood Derivatives Division des New York Blood Center erhalten werden kann. Die Randvertiefungen werden entweder mit einem Bezugs-e-Antigen (von Dr. Lars Magnius) für den Agar-Gel-Diffusions-»Identitättstest« oder Testserum gefüllt. Eine Prözipitinlinie, die nach dreitägigem Bebrüten bei Raumtemperatur, 30 oder 37°C erscheint und auf einer Reaktion mit dem Bezugsantigen beruht, zeigt die Gegenwart einer großen Menge e-Antigen an.

Die Merkmale von HBo-Ag-Trägern in Abhängigkeit

lüipiatiMia gLtnau vici i,iiiiiuuiig »vgl im u\.ivivu 'wii 1,23 bis 1.34 g/cm^J, vorzugsweise im Bereich von 1,24 bis 1,34 g/cm^J, bestimmt durch Zentrifugieren mit isopykni-

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oder e-Antikörpern sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.

Tabelle 1

Merkmale von HBo-Ag-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart von e-Antigen oder e-Antikörpern

Merkmale Ergebnisse einer Agar-Gel-Diffusionsprüfung

»e«-Ag+ »e«-Antikörper+

Anteil bei Blutspendern 1-5%

(symptomlosen HBo-AG-Trägern)

Anteil von HBo-AG-Trägern unter 20-70%

ständigen Benutzern von Dialysegeräten

Patienten mit chronischer Hepatitis, bei den meisten

festgestellt durch Leberbiopsie

Patienten mit chronischer Hepatitis, bei den meisten

diagnostiziert aufgrund erhöhter

SGPT-Werte

Kontakt- oder spontane Infektionen bei vielen

30-70%
5-20%

bei sehr
wenigen

wahrscheinlich

überhaupt

nicht

Tabelle 2

Merkmale des Plasmas von HBoAg-Trägern in Abhängigkeit von der Gegenwart von e-Antigen oder e-Antikörpem

Merkmale

Ergebnisse einer Agar-Gel-DiiTusionsprüfung
e-AG + e-Antikörper+

Dane-Partikel im Plasma 10^s - 10¹VmI

Mit HBo-Ag verbunden nachweisbar

DNS-Polymerase im Plasma

Nachweisbares HBc-Ag nachweisbar

im Plasma (RIA oder IAHA Tests)

HBoAg-Titer 10¹' - I0¹⁴

Teilchen/ml

*) Bei der Elektronenmikroskopie nicht sichtbar. IO⁶*)

nicht nachweisbar

10¹² - 10"
Teilchen/ml

Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs

Die kritische Phase bei der Herstellung des Impfstoffs ist der erste Schritt, nämlich die Wahl eines als Ausgangsmaterial geeigneten Plasmas von einem chronischen HBo-Ag-Träger, bei dem mit Hilfe des vorstehend beschriebenen unempfindlichen Tests e-Antigen nachweisbar ist. Ein derartiges Plasma enthält natürlich reichliche Mengen Dane-Partikel und Fäden, die nicht mit e-Antikörpern verbunden sind (siehe oben). Ein Plasma dieser Art kann zweckmäßigerweise von klinisch symptomlosen menschlichen HB-Trägern oder auch von Schimpansen erhalten werden, die eine natürliche oder künstliche Infektion mit dem HB-Virus durchgemacht haben und chronische e-Antigen-positive HBo-Ag-Träger geworden sind. Ganz allgemein ist Plasma brauchbar, das HBo-Ag des gewünschten Untertyps oder der gewünschten Untertypen enthält. Das Ausgangsplasma muß durch die oben beschriebene

die oben beschriebene Methode nachweisbaren e-Antikörper enthalten. Derartiges Plasma ist verhältnismäßig selten, für das Verfahren aber unerläßlich.

Unter der Voraussetzung, daß Ausgangsmaterial mit den oben beschriebenen Eigenschaften vorhanden ist, läßt sich die Isolierung der e-Antigen enthaltenden größeren Teilchenfraktionen zusammen mit einer geringeren Menge kleinerer HBo-Ag enthaltenden Teilchen und einer nur geringen Verunreinigung durch Serumproteine nach folgendem einfachen Verfahren ausführen:

1. Fraktionierte Fällung des Antigens mit Polyäthylenglykol und

2. Adsorption der Verunreinigungen an Hydroxylapatit unter Bedingungen, die die Adsorption der größeren HBo-Ag enthaltenden Teilchen im Größenbereich von 24 bis 50 nm verhindern.

Das erhaltene Produkt kann leicht konzentriert, mit kleinen Mengen menschlichem Serumalbumin stabilisiert, in einem physiologischen Träger suspendiert und mit Hilfe einer Kombination bekannter Virus-Inaktivierungsmethoden nichtinfektiös gemacht werden. Von diesem Impfstoff werden dann immunisierende Mengen in solchen Intervallen injiziert, daß eine ausreichende und lang dauernde Bildung von e-Antikörpern und HB-Antikörpern hervorgerufen wird. Eine derartige Immunisierung dürfte Schutz gegen Infektionen mit hohen und niedrigen Dosen des Hepatitisvirus B bieten. Die Erzielung eines Schutzes gegen Infektionen durch solche niedrige und hohe Dosen mit Hilfe des bekannten Hepatitis-B-Impfstoffs ist, wenn überhaupt möglich, sehr schwierig.

JO

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65 Ausgangsmaterial

Als Ausgangsmaterial für das nachstehend beschriebene Reinigungsverfahren geeignetes Plasma wird mit Hilfe bekannter Plasmaphoreseverfahren aus dem Blut chronischer HBo-Ag-Träger gewonnen. Diese können Menschen oder auch Tiere, wie Schimpansen, sein, in denen ein chronischer H B-Trägerzustand erzeugt werden kann. Die Schimpansen bieten den praktischen Vorteil, daß sie mit menschlichen Hepatitis-B-Stämmen jcucii gcnuiiäiilicil ullillulluIuglMjIlCII Ü'lHcrtypS iniiziert werden können und dann chronische Infektionszustände entwickeln, die nach bisher vorliegender Erfahrung besonders hohe HBo-Ag-Titer ergeben und häufig hohe Konzentrationen von Dane-Partikel und e-Antigen im Plasma ergeben. Außerdem können diese Tiere in kurzen Intervallen einer herkömmlichen Plasmapherese unterworfen werden, ohne daß sie gesundheitlich geschädigt werden oder der HBo-Agod~r e-Ag-Gehalt im Plasma abnimmt

Das zur Herstellung des Impfstoffs als Ausgangsmaterial verwendete Sammelplasma muß folgenden Anforderungen genfigen:

A. Mit einer unempfindlichen Methode wie der Agar-Gel-Diffusion muß e-Antigen nachweisbar sein. Es ist zu beachten, daß bei einer Grundgesamtheit von Blutspendern nur 1 bis 5% der chronischen HBo-Ag-Träger dieser Forderung genügen.

B. Es dürfen keine e-Antikörper nachweisbar sein. Man beachte, daß die Mehrzahl einer HBo-Ag-Träger einer Grundgesamtheit von Blutspendern e-Antikörper haben. Falls derartiges Plasma mit dem erwünschten Plasma vereinigt wird, tritt eine Ausfällung der e-Antigen enthaltenden Teilchen ein, durch die deren Isolierung nach der beschriebenen Methode verhindert wird

C. Dane-Partikel, die mit Hilfe bekannter Methoden der Elektronenmikroskopie (negative Färbung) nachweisbar sind, sollen vorzugsweise in hoher Konzentration vorhanden sein.

D. Das HBo-AG soll hinsichtlich der Antigen-Untertypen eine Zusammensetzung haben, die den Hauptun.ertypen entspricht, die in dem geographischen Gebiet auftreten, für das der Impfstoff bestimmt ist. Beispielsweise soll in einem Impfstoff, der in Sudostasien verwendet werden soll, der Untertyp r vorherrschen, während ein Impfstoff, der für Europa oder die Vereinigten Staaten bestimmt ist, vorzugsweise HBo-Ag von überwiegend dem Untertyp w enthalten soll.

E. Um eine breite immunologische Schutzwirkung zu erzielen, ist Plasma von einer so großen Zahl von Spendern zu verwenden, daß eine repräsentative Mischung der Untertypen erhalten wird, die in dem geographischen Gebiet, für das der Impfstoff bestimmt ist, vorherrschen. In den meisten Fällen sind mindestens 10 Spender erforderlich. Die Verwendung von »Hybridstämmen«, wie HBo-Ag/ adywr, bietet offensichtliche Vorteile. Solche Hybridstämme können in Schimpansen fortgepflanzt werden.

F. Das Ausgangsmaterial muß innerhalb von 4 Stunden nach dem Sammeln bei -70°C eingefroren und bis zum Einfrieren auf einer Temperatur von 4° C gehalten werden.

G. Das Ausgangsmaterial muß bakteriologisch steril und frei von fremden Viren sein, die nach bekannten Isolierungsmethoden (Impfung angebrüteter Eier, Gewebekulturen, säugende Mäuse, Meerschweinchen und Kaninchen), wie sie bei der Qualitätskontrolle anderer Virusimpfstoffe üblich sind, nachgewiesen werden können.

Die Reinigung des Ausgangsmaterials kann nach einem bereits anderweitig (US-Patentanmeldung Ser.

30 auf 5,0, eingeteilt, wodurch ein Proteinstoffe und Polyäthylenglykol enthaltender Niederschlag und eine flüssige Phase gebildet werden, die Hepatitis-B-Antigen enthält, das sich durch die Gegenwart von Dane-Partikel und/oder fadenförmigem Material auszeichnet. Die flüssige Phase wird abgetrennt und auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Bei diesem pH-Wert wird die flüssige Phase mit 3,5 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, gemischt, wobei ein Niederschlag ausfällt, der folgende Bestandteile enthält:

A. Gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das hohlkörperförmige Teilchen mit einer Größe zwischen 20 und 30 nm enthält, sowie

B. 1. fadenförmige Teilchen mit einem Durchmesser

zwischen 20 und 50 nm, die HBo-Ag und e-Antigen enthalten, das frei von e-Antikörpern ist, und

2. meist kugelförmige Dane-Partikel mit einer Größe von 40 bis 50 nm, die einen Außenmantel aus Lipoprotein, der HBo-Ag und e-Antigene enthält, und einen Kern haben, der DNS, DNS-Polymerasen und HBc-Ag enthält.

Das so gereinigte Antigenmaterial wird gewonnen und kann dann einer Behandlung zur Inaktivierung des Virus unterworfen werden. Das Material ist nun fertig zur Verdünnung mit einem physiologisch unbedenklichen Medium.

Vorzugsweise wird bei der Trennung die Temperatur einer jeden Mischung nach jedem Mischvorgang und während der Bildung des Niederschlags im Bereich zwischen 0 und 8° C gehalten. Die Reinigung wird erleichtert, wenn die Niederschläge nach dem Fällen durch Zentrifugieren gewonnen werden. Das Polyäthylenglykol kann als solches oder in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden, vorzugsweise in einer solchen, die etwa 30 Gew.-% Polyäthylenglykol enthält. Im allgemeinen empfiehlt sich die Verwendung eines Polyäthylenglykols, das ein Molekulargewicht im

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werden. Hierbei wird das in dem flüssigen Blutplasma enthaltene Antigen von den Verunreinigungen abgetrennt Dazu wird das Plasma zunächst auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 eingestellt. Dies führt zur Ausfällung einer kleinen Menge Niederschlag, der zusammen mit restlichen Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugieren mit mäßiger Drehzahl, z. B. 20 Minuten bei 10 000 U/min, entfernt werden kann. Danach wird das Material mit 2£ bis 44 Gew.-%, vorzugsweise 3,0 bis 4,5 Gew.-%, Polyäthylenglykol gemischt Mit niedrigen Konzentrationen, etwa 3 bis 4%, kann man selektiv große Teilchenformen ausfällen. Sie sind daher unter bestimmten Umständen von Vorteil. Die Gewichtsprozent-Menge des Polyäthylenglykols bezieht sich auf das Gesamtgewicht der Mischung. Durch den Zusatz der angegebenen PoIyäthylenglykol-Menge wird sowohl das Hepatitis-B-Antigenmaterial der großen Teilchen von z. B. 30 bis 50 nm Größe als auch ein Teil des bekannten hohlkörperförmigen Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Materials ausgefällt Der Niederschlag wird abgetrennt und mit einer solchen Menge Wasser versetzt, daß ein flüssiges Zwischenprodukt entsteht, dessen Antigen-Konzentra- « tion gleich oder größer als diejenige des ursprünglichen Blutplasmas ist Das flüssige Zwischenprodukt wird auf einen ρίί-Wert im Bereich von etwa 4$ bis 5,1, optimal

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Eine weitere Reinigung der gereinigten Antigene kann durch Adsorption an Hydroxylapatit nach den Methoden der Ansatz- oder Säulenchromatographie vorgenommen werden. Im letztgenannten Falle werden die teilgereinigten Antigene durch eine Chromatographiesäule gegeben, die Hydroxylapatit enthält, das die Antigene adsorbiert Die weiter gereinigten Antigene werden dann durch eine mehrstufige, z. B. etwa dreistufige, Elution wiedergewonnen. Teilchen der Größe von 25 bis 50 nm werden getrennt von einer Fraktion kleinerer Teilchen (16 bis 22 nm) und der Hauptmenge der Serumproteine wiedergewonnen.

Inaktivierung des Infizierungsvermögens

Die nach der Reinigung erhaltene Fraktion der großen Teilchen muß als infektiös angesehen werden. Mit Hilfe chemischer und physikalischer Verfahren muß daher das gesamte Infizierungsvermögen wirksam inaktiviert werden. Das Hepatitisvirus ist als sehr beständig bekannt Dies ist wahrscheinlich auf die kleine Größe seiner Nucleinsäure sowie auf andere Eigenschaften seiner tertiären und quarternären Struktur und seines morphologischen Aufbaus zurückzuführen.

Die Inaktivierung kann durch jede Kombination der verschiedenen in der Technik der Impfstoffherstellung

bekannten Methoden erfolgen. Durch die Anwendung von Kombinationen sollen »resistente Fraktionen« beseitigt werden, die gegen eine einzige Inaktivierungsbehandlung beständig sein könnten. Diese werden durch eine zweite oder dritte Behandlung inaktiviert, deren Inaktivierungsmechanismen von demjenigen der ersten Behandlung verschieden sind. Dieses Vorgehen ist zur Vernichtung resistenter Fraktionen, z. B. bei der Behandlung bestimmter bakterieller Infektionen, bei denen resistente Erregerformen häufig vorkommen, mit einer Kombination verschiedener Antibiotika, gebräuchlich. Eine schematische Darstellung dieses Prinzips ist in F i g. 3 veranschaulicht.

Jede Koinb'nation der derzeit bekannten Inaktivierungsmethoden, die der vorstehenden Forderung genügen, kann angewendet werden. Folgende Methoden, vorzugsweise in Kombination, werden vorgeschlagen:

1. Bestrahlung mit einer Kobaltquelle von 2,5 _2Q Milliontv/rad;

2. Behandlung mit Formalin von einer Konzentration von I : 2000 während einer Dauer von 4 Tagen bei 37⁰C nach den üblichen Methoden; dabei wird der Impfstoff vor dem Zusatz von Formalin (oder dem nachstehend genannten /J-Propiolacton) zur Entfernung von Aggregaten durch Filtration durch ein O,22^m-Miliiporenfilter od. dgl. geklärt;

3. Behandlung mit /3-Propiolacton nach Methoden, wie sie gegenwärtig bei der Inaktivierung von Tollwutimpfstoff angewendet werden.

Nach der Inaktivierung wird das Endprodukt durch ein Amicon-Füter PM30 od. dgl. gegen 0,9%ige Natriumchlorid-Lösung, die Thiomerosal in einer Verdünnung von 1 :10 000 und einen gebräuchlichen Stabilisator enthält, diafiltriert, um alle niedermolekularen Verbindungen, die zur Inaktivierung verwendet oder bei dieser entstanden sind, zu entfernen. Das Amicon-Filter PM30 ist ein Cellulosefilter mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser, der nominell den

Durchgang vuii muickü'icii Uni ciiiciit iviuic'nuiaigcwitiu

von über 30 000 ausschließt. Thiomerosal ist die empfohlene Kurzbezeichnung für Natriumäthylquecksilberthiosalicylat, ein gebräuchliches antibakteriell wirksames Konservierungsmittel. Das filtrierte Produkt wird sodann einer Sterilfiltration unterworfen und aseptisch in sterile Ampullen zur Gefriertrocknung oder zum Tiefgefrieren abgefüllt

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Sicherheitsprüfung

Danach muß jeder Ansatz auf Sicherheit, d. h. auf Freiheit von Infizierungsaktivität, geprüft werden. Solange es keine Gewebekultur- oder andere Standardmethode zur Bestimmung der Infektaktivität des Hepatitisvirus B und ähnlicher Viren gibt, muß jede zu menschlichem Gebrauch bestimmte Impfstoff-Charge durch Impfung HB-seronegativer empfänglicher Tiere, wie Schimpansen oder Gibbonaffen, geprüft werden. Mindestens vier seronegative Tiere (von denen zwei mit fünf 20^g-Dosen und zwei mit 500 20^g-Dosen intravenös geimpft werden) müssen für diesen Zweck verwendet werden. Eine einwandfreie Charge führt weder zu einer Hepatitis noch zur Produktion von HBo-Ag oder einer HBc-AntikörpcrrcaRtion, auf die es jedes geimpfte Tier mit den derzeit empfindlichsten zur Verfügung stehenden Methoden zu untersuchen ist Auf diese Weise kann die Sicherheit des Produktes, d. h. das Fehlen jeglicher Infektaktivität, leicht festgestellt werden. Natürlich wird man vor der klinischen Erprobung erster Chargen eine größere Anzahl Tiere für die Prüfung heranziehen.

Potenzpriifung

Der Impfstoff wird auf eine Konzentration voi: im allgemeinen etwa 5 bis 100μg, vontugsweise 20 bis 50 μg, HBo-Ag-Protein je Dosis eingestellt, um ihr eine geeignete Immunisierungswirkung zu erteilen. Im allgemeinen beträgt die Menge der «-Antigen enthaltenden Teilchen in einer solchen Dosis etwa 2 bis 5 μg. Die Potenz wird durch Bestimmung der Mindestkon-/!entration einer jeden Impfstoffcharge kontrolliert, die bei Meerschweinchen, Mäusen oder anderen geeigneten Versuchstieren eine bestimmte spezifische HB- und e-Antikörperreaktion hervorruft.

Der Impfstoff muß eine so hohe Potenz haben, daß er in mindestens 4 Schimpansen, die mit 2 Dosen des Standardimpfstoffs nach den empfohlenen Richtlinien immunisiert worden sind, bei der Prüfung durch passive Hämaglutination (standardisiert durch Prüfung an einer Kontrollprobe aus gefrorenem Antikörperserum) einein HB-Antikörpertiter von mindestens 1 :100 ergibt. Diese HB-Antikörper müssen mindestens 1 Jahr vom Zeitpunkt der Immunisierung dieser Schimpansen ab mit einem Titer von mehr als 1:10 nachweisbar sein. Außerdem müssen die Schimpansen eine meßbare e-Antikörperreaktion zeigen.

Verabreichung der Dosen
und Anwendung des Impfstoffs

Der Impfstoff kann durch subcutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Zwar steht der bevorzugte Verabreichungsweg noch nicht fest, doch wird angenommen, daß die intramuskuläre Injektion zu bevorzugen ist. Die Häufigkeit der Verabreichung beträgt etwa 2 Dosen im Abstand von einem Monat, gefolgt von einer Auffrischungsdosis nach 6 Monaten bis zu einem Jahr nach der Erstimmunisierung. Die Höhe der Dosis hängt natürlich von der Größe des zu

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Auffrischungsdosis hängen von dem Antikörpc. spiegel im Blut nach der Erstimmunisierung ab. Zugelassene Adjuvantia, wie sie üblicherweise bei der Impfstoffherstellung verwendet werden, können benutzt werden.

Der Impfstoff empfiehlt sich für alle Personen, die dem Risiko einer Infektion mit dem Hepatitisvirus B ausgesetzt sind, insbesondere solche Personen, die, wie Patienten und Personal von Hämodialysegeräten, medizinisches Personal, Personen, die sich in tropischen Gebieten aufhalten oder diese besuchen, einem besonders hohen Risiko ausgesetzt sind. Bei der Bevölkerung tropischer und subtropischer Gebiete, wie insbesondere Afrika, Asien, das Mittelmeergebiet und Südamerika, wo ständig ein verbreitetes Vorkommen von Hepatitis-B-Infektionen beobachtet wird, sollte der Impfstoff schon in einem frühen Lebensalter verabreicht werden, um die Entstehung eines chronischen Infektionsträgerzustandes zu verhindern, der in diesen Gebieten bereits in den ersten 5 Lebensjahren vorzukommen pflegt

Wenn ausreichende Mengen Impfstoff zur Verfügung stehen und ihre Wirksamkeit sich erwiesen hat, kann der Impfstoff bei allen Personen angewendet werden, die nicht schon durch eine vorher erworbene Immunität gegen Infektionen mit dem Hepatitisvirus B geschützt sind.

Die besondere Bedeutung des Hepatitisvirus-B-Impfstoffs ist in der Verhinderung eines chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustandes mit dem ständigen Risiko einer Erkrankung an einem chronischen Leberleiden, wie chronisch aktiver Hepatitis, Leberzirrhose und primärem Lebercarcinom. Ein Zusammenhang zwischen einem chronischen Hepatitisvirus-B-Trägerzustand und diesen Erkrankungen kann heute als erwiesen gelten, und die Rolle der durch das Hepatitisvirus B hervorgerufenen chronischen Hepatitis als Cofaktor in der Ätiologie dieser Erkrankungen steht ebenfalls fest (Prince, A. M, in The Liver: Normal and Abnormal Funktions, herausgegeben von F. F. Becker, M. Dekker-Verlag, New York, 1965).

Die Anwendung des neuen Hepatitisvirus-B-Impf- is Stoffs kann auf lange Sicht einen wesentlichen Einfluß auf die Verhütung dieser chronischen Leberleiden haben, die in den genannten Gebieten, insbesondere in den Tropen, wo ein chronischer Hepatitisvirus-B-Trägerzustand fast die Rege! ist, so außerordentlich häufig sind. Beispielsweise ist in Senegal, wo 14% der Bevölkerung chronische HBo-Ag-Träger sinC, die Erkrankungsrate an primärem Leberkrebs 50 bis lOOmal so hoch wie in den Vereinigten Staaten, wo nur durchschnittlich etwa 03% der Bevölkerung chronische Träger des Hepatitisvirus B sind.

Ausdrücklich sei darauf hingewiesen, daß die hier beschriebenen Methoden zur Reinigung der die großen Teilchen enthaltenden Fraktionen nicht die einzigen für diesen Zweck sind Für bestimmte Zwecke und Bedürfnisse lassen sich auch Abwandlungen und weitere Methoden entwickeln. Worauf es bei der Erfindung ankommt, ist die Verwendung der große Teilchen und e-Antigen enthaltenden Fraktionen, die bisher stets routinemäßig verworfen wurden, zur Herstellung eines Impfstoffs. Daher sind alle Impfstoffe in Erwägung zu ziehen, die solche Teilchen, lösliche spezielle Komponenten solcher Teilchen oder synthetische spezielle Untereinheiten dieser Teilchen mit Antigenwirkung enthalten, da sie bei einer aktiven Immunisierung gegen e-Antigen oder ähnliche für Dane-Partikel spezifische Antigene brauchbar sind.

Beschreibung der Zeichnungen

F i g. 1 zeigt in graphischer Darstellung die verschiedenen morphologischen Formen, die zu dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehören. Zusammen mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen kommt noch ein e-Antigen vor, das auf Dane-Partikel zugegen ist, die Hepatitis-B-Kernantigen (HBc-Ag) enthalten. Diese Dane-Partikel zeichnen sich dadurch aus, daß sie Desoxyribonucleinsäure (DNS) und ihre Polymerase enthalten. In der Figur sind ferner die möglichen Antikörper dargestellt: Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen, gegen das Hepatitis-B-Kernanti- gen und gegen das e-Antigen.

Fig.2 ist eine graphische Darstellung der unterschiedlichen Wirkungen der Antikörper gegen das e-Antigen und der Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen bei der Neutralisation von Däne- Partikel in Abhängigkeit von der einwirkenden Dosis. Aus dieser Darstellung ist ersichtlich, daß die von einem HBo-Ag-lmpfstoff,der frei von e-Antigen ist, erzeugten Antikörper für eine völlige Neutralisation der antigenhaltigen Stellen unzureichend sind. Die von einem Impfstoff, der sich durch die Gegenwart von e-Antigen auszeichnet, erzeugten Antikörper reichen jedoch auch bei einer hohen Dosierung des Antigens aus, um praktisch alle Antigenstellen zu neutralisieren. Dies zeigt, daß die Gegenwart von e-Antigen in einem Impfstoff erheblich das Ausmaß beeinflußt, in dem eine Neutralisierung aller Antigene stattfindet

Fig.3 veranschaulicht graphisch die Tatsache, daß bei jedem gegebenen Inaktivierungsverfahren ein kleiner Teil der infektiösen Viren gegenüber der Inaktivierung widerstandsfähig ist Wenn jedoch verschiedene Inaktivierungsmethoden nacheinander angewendet werden, können auch diese resistenten Fraktionen inaktiviert werden.

Fig.4 spiegelt die Ergebnisse wider, die bei der säulenchromatographischen Fraktionierung eines mit Polyäthylenglykol gefällten HBo-Ag-Materials in einer 500-ml-Säule aus Hydroxylapatit erhalten werden. Die Ergebnisse stammen von einem in 50 ml Flüssigkeit wiedersuspendierten mit Polyäthylenglykol gefälltem HBo-Ag/e-Ag bei der Chromatographie auf einer 500-ml-Hydroxylapatit-Säule. Das Antigen wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von jeweils 1 Liter 0,02 m, 0,05-m und 0,10 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert Fraktionen von je 10 ml wurden aufgefangen und durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Protein

( ) und durch CEP auf HBo-Ag (x-x-x)

analysiert

F i g. 5 zeigt die Ergebnisse der Celluloseacetat-Elektrophorese vereinigter konzentrierter Proben von HBo-Ag/e-Ag, die durch Chromatographie an Hydroxylapatit (Tabelle 4) gereinigt worden waren. Der Streifen wurde nach dem Anfärben mit Ponceau-Rot in einem Beckman-Mikrozonendensitometer abgetastet

Linie A: HBo-Ag/e-Ag enthaltendes Originalplasma;

Linie B: Wiedersuspendierter Niederschlag von HBo-Ag/e-Ag aus der Fällung mit Polyäthylenglykol;

Linie C: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag

— Sammelprobe IH;

Linie D: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag

— Sammelprobe II;

Linie E: Säuleneluat von HBo-Ag/e-Ag

— Sammelprobe I.

Fig.6 ist eine graphische Darstellung der bei der Reinigung von mit Polyäthylenglykol ausgefälltem HBo-Ag/e-Ag-Material durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit erzielten Ergebnisse. Eine Menge von 200 ml des wiedersuspendierten PEG-Niederschlags aus HBo-Ag/e-Ag wurde auf eine 1000-ml-Säule aus Hydroxylapatit aufgegeben. Das Antigen wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von 0,51, 0,02-m und einem Liter 0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert Fraktionen von 12 und 13 ml wurden gesammelt und durch Messung der optischen Dichte auf Protein analysiert

Fig. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Ergebnisse der Säulenchromatographie eines HBo-Ag/e-Ag-Materials an Hydroxylapatit Die Sammelprobe I des von dem Hydroxylapatit II (P i g. 6) eluierten HBo-Ag/ e-Ag wurde auf 75 ml konzentriert und erneut auf eine 600-ml-Hydroxylapatit-Säule aufgegeben. Das Antigen wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von jeweils einem Liter 0,02-m, 0,05-m und 0,10-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 eluiert. Fraktionen von jeweils 18 ml wurden gesammelt und durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Proteine (— - ·), durch CEP (x - χ - χ) und

K)

25

RIA (ο — ο — ο) auf H Bo-Ag analysiert.

F i g. 8 zeigt die Ergebnisse der Immunelektrophorese von HBo-Ag/e-Ag-Fraktionen, die von Hydroxylapatit eluiert worden waren. Die Proben wurden mit Antiserum geprüft, das durch Immunisierung von Kaninchen mit normalem Schimpansenplasma hergestellt worden war.

Proben: (1) Sammelprobe I; (2) Sammelprobe II;

(3) Sammelprobe III;

(4) Sammelprobe IV; (5) Sammelprobe V;

(6) Sammelprobe VI;

(7) Sammelprobe VII-VIIl.

Fig.9 zeigt die Ergebnisse der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigter HBo-Ag/e-Ag-Präparate, die mit Coomassie-Blau angefärbt waren. Die Proben wurden in einem 7,5^o/oigen SDS-Acrylamid-Gel unter den oben beschriebenen Bedingungen laufengelassen. Nach dem Anfärben der Gele mit Coomassie-Blau wurden sie in einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer abgetastet:

A: 20—22 nm große kugelförmige Teilchen von

HBo-Ag; B: 22—28 nm große kugelförmige Teilchen von

HBo-Ag; C: HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die hauptsächlich aus

Faden und Dane-Partikel bestehen.

Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese von Proben aus gereinigtem HBo-Ag/e-Ag, die parallel zu der Elektrophorese gemäß F ig. 9 vorgenommen wurde. Nach dem Anfärben mit Schiffscher Base wurden die Gele in einem Joyce-Loebl-Mikrodensitometer abgetastet.

F i g. 11 zeigt eine Reihe elektronenmikroskopischer 3s Aufnahmen von HBo-Ag/e-Ag-Teilchen, die durch chargenweise Elution von Hydroxylapatit und Zonen-Ultrazentrifugieren gereinigt worden waren. Die Bilder wurden nach negativem Anfärben mit Phosphorwolframat in einem Cleatron-Mikroskop JEOL 100 B bei 67 OOOfacher Vergrößerung aufgenommen.

a: Zonen-Ultrazentrifugation — Sammelprobe I:

Dane-Partikel und große Fäden; b: Zonen-Ultrazentrifugation — Sammelprobe It:

Fäden und 22—28 nm kugelförmige Teilchen; c: Zonen-Ultrazentrifugation— Sammelprobe III:

20—28 nm große kugelförmige Teilchen.

Die Fi %. 12A und 12B sind graphische Darstellungen der Ergebnisse, die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung vereinigter konzentrierter Proben von HBo-Ag/e-Ag in Sephadex G-75, die in l%igem Ampholin von pH 3—6 gelöst waren. Die Fraktionen wurden in der oben beschriebenen Weise durch RtA

( ) auf HBo-Ag und auf den pH-Wert (x-x-x)

analysiert

A: Sammelprobe I: 22—28 nm große kugelförmige

Teilchen von HBo-Ag; B; Sammelprobe N; 22-28 nm große kugelförmige

Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel.

Die Fig. 13A und 13B sind graphische Darstellungen weiterer Ergebnisse, die bei der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung des gleichen Materials aus vereinigten konzentrierten Proben von HBo-Ag/e-Ag t,, (Tabelle 4) in l%igem Ampholin von pH 3,5 bis 10,0 nach der Behandlung mit Triton X-100 erhalten wurden. Die Fraktionen wurden in der oben beschriebenen

45 Weise durch RIA (·-·-·) auf HBo-Ag und auf den pH-Wert (x — χ — x) untersucht

A: Sammelprobe I: 22—28 nm große kugelförmige

Teilchen; B: Sammelprobe II: 22—28 nm große kugelförmige

Teilchen, Fäden und einige Dane-Partikel. Beispiele

Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung näher veranschaulicht

Zunächst werden die allgemeinen Maßnahmen zur Reinigung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens aus Human- oder Schimpansenplasma durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) und nachfolgende Re-aigung an Hydroxylapatit beschrieben. Danach werden die Ergebnisse der Anwendung dieser Verfahrensmaßnahmen bei der Reinigung und Fraktionierung von Schimpansen-Hepatitis-B-Oberflächenaniigen, das e-Antigen aufweisende Teilchen enthält, in größerem Maßstab mitgeteilt Die in den einzelnen Reinigungsstufen erhaltenen Proben wurden mit Hilfe elektrophoretischer und chromatographischer Verfahren eingehend analysiert Mit Fraktionen verschiedener morphologischer Formen der zusammen mit dem gereinigten Schimpansen-HBo-Ag auftretenden Teilchen wurden Vergleichsuntersuchungen durch isoelektrische Dünnschichtfokussierung und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ausgeführt

Beispiel 1 Reinigung und Charakterisierung

der zum Hepatitisvirus B gehörenden Teilchen

aus 7,8 Liter Plasma eines einzigen

H Bo-Ag-Träger-Schimpansen Materialien und Methoden Herkunft des HBo-Ag

Das Antigen wurde aus dem gesammelten Plasma eines Träger-Schimpansen gewonnen, der zuvor mit HBo-Ag-positivem Humanplasma vom Untertyp ADW geimpft worden war. In dem verwendeten Plasma befand sich an der Oberfläche identifizierbarer Dane-Partikel das e-Antigen.

Reinigung des HBo-Ag und des e-Antigens

Das HBo-Ag und das e-Antigen wurden aus dem Plasma durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) isoliert Der wiedersuspendierte Niederschlag aus HBo-Ag und e-Antigen wurde durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit gereinigt Die abschließenden Reinigungsmaßnahmen bestanden in Zentrifugieren mit einem Dichtegefälle. Nachstehend werden diese Verfahrensmaßnahmen kurz beschrieben:

In einer Vorreinigungsstufe wurden 7800 ml HBo-Ag und freies e-Antigen enthaltendes Plasma auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt und mit einer 30%igen Lösung von PEG in destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von etwa 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen und dann durch Zentrifugieren geklärt Das HBo-Ag in der überstehenden Flüssigkeit wurde durch Erhöhung der PEG-Konzentration auf 4% ausgefällt. Die nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei 4°C überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und verworfen. Das e-Antigen enthaltende Sediment von HBo-Ag wurde in 500 ml destilliertem Wasser rücksusDendiert. Die

ίο

15

20

Hauptmenge des PEG wurde zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Einstellen der Lösung auf einen pH-Wert von 5,0 ausgefällt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde erneut auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt, und das HBo-Ag sowie die zu dem e-Antigen gehörenden Teilchen (HBo-Ag/e) wurden durch Zusatz einer 30%igen Lösung von PEG bis zu einer Endkonzentration von 4% ausgefällt Das HBo-Ag/e wurde nach dem Stehenlassen der Probe über Nacht bei 4° C durch Zentrifugieren abgetrennt Danach wurde der Niederschlag von HBo-Ag/e erneut in 320 ml destilliertem Wasser suspendiert.

Säulenchromatographie an Hydroxylapatit

In einem Vorversuch wurden 50 ml der Suspension aus dem mit PEG gefällten HBo-Ag/e auf eine Hydroxylapatit-Säule von 6,5 χ 16,5 cm aufgegeben und mit einem diskontinuierlichen Gradienten von Phosphatpuffer eluiert In einem nachfolgenden Versuch wurden 200 ml der Probe auf eine Hydroxylapatit-Säule von 6,5 χ 35 cm teilgereinigt Das eluierte HBo-Ag mit dem ersten Protein-Peak wurde ein zweites Mal durch eine Hydroxylapatit-Säule gegeben.

Dichtegefälle-Zentrifugation

Fraktionen des durch Säulenchromatographie isolierten HBo-Ag wurden durch Zonen-Ultrazentrifugieren jo gereinigt Aus 3 ml 60%iger und 7 ml 40%iger Sucrose in 0,02-m Natriumphospiiat-Puf'jrlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (dieO.02% NaN₃ enthielt) wurde ein diskontinuierlicher Gradient gebil^lit. In jedes Röhrchen wurde eine 20-ml-Probe gefüllt und in einer jd Spinco-Zentrifuge SW 25.1 18 Stunden bei 18 000 U/min zentrifugiert Aus dem Unterteil der Röhrchen abtropfende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von 1 ml gesammelt und auf HBo-Ag analysiert Die Peak-Fraktionen mit Antigenwirkung wurden vereinigt, gründlich dialysiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Sperre bei einem Molekulargewicht von 30 000 (Amicon PM-30) konzentriert. Die konzentrierten HBo-Ag-Fraktionen wurden anschließend einer Endreinigung durch isopyknisches Banding in einem linearen CsCl-Gradienten und Zonen-Ultrazentrifugation in einem kontinuierlichen Sucrose-Gradienten unter den normalerweise angewendeten Bedingungen unterworfen.

Untersuchungsmethoden

Der Gehalt an HBo-Ag wurde durch Gegenelektrophorese (CEP) oder den Radioimmunversuch (Ausria I oder II, Abbot Laboratories) in fester Phase ,erfolgt. Die Proteinkonzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm und durch Bestimmung des Stickstoffs nach einem Mikro-Kjehldahl-Verfahren abgeschätzt Die Methoden waren die gleichen, wie sie in der schon erwähnten US-Patentanmeldung Serial No. 4 26 825 beschrieben sind.

Kriterien der HBo-Ag-Reinheit

Nach jeder Reinigungsstufe wurden die Proben durch Celluloseacetat-Elektrophorese, Immunelektrophorese und Agar-Gel-Diffusionstests gegen polyvalentes Antinormalhumanplasmaprotein Antiserum analysiert.

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Aliquote Teile der Proben, die 0,01-m Natriumphosphat-Pufferlösung nut einem pH-Wert von 7,2, 1% Natriumdodecylsulfat 1% j3-Mercaptoäthanol und 10% Glycerin enthielten, wurden 2 Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt, auf 73- oder 10%ige Natriumdodecylsuifat-Acrylamid-Gele aufgetragen und einer Elektrophorese nach Maizel unterworfen. Die Proteine im Gel wurden mit Coomassie-Blau, die Kohlenhydrate mit Schiffscher Base nach der Methode von Glossman und Neville angefärbt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Reinigung der HBo-Ag/e-positiven Seren durch die Fällung mit Polyäthylenglykol sind in Tabelle III aufgeführt. Anscheinend wurden 87% des ursprünglichen Plasmaproteins bei der ersten Fällung des HBo-Ag (zu der auch die Vorreinigung mit einer 2%igen PEG-Konzentration gehörte) entfernt. Das nach zwei aufeinanderfolgenden Fällungen mit PEG erhaltene Endpräparat zeigte eine quantitative Gewinnung des HBo-Ag mit nur 4% der ursprünglichen Proteine.

Tabelle 3

Reinigung von vereinigtem Schimpansen-HBo-Ag durch Fällung mit PEG 6000

Probe	Volumen (ml)	HBo-Ag CEP-Titer¹)	Gesamt protein (g)	% Ausbeute²) HBo-Ag	Fache³) Reinigung
Ursprüngliches HBo-Ag-PIasma Erster 4%-PEO Niederschlag Zweiter 4%-PEG-Niederschlag ¹I Kjehldahl. ²) [HBo-Ag] Probe X Volumen	7800 500 320	512 7080 10000	429,0 55,0 16,6	100 89 80	6,9 20,7
[HBo-Ag] Plasma X Volumen ') [Protein] Plasma % Ausbeute	. IUU. HBo-Ag

[Protein] Probe

100

Hydroxylapatit-Chormatographie |

Bei einem Vorversuch wurden 50 ml der Suspension aus dem rücksuspendierien, mit PEG gefällten HBo-Ag durch Säulenchromatographie an Hydroxylapatit fraktioniert. Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung sind in Fig.4 wiedergegeben. Das Eluat wurde in 7 Fraktionen getrennt, die gegen eine 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt) dialysiert und durch Ultrafiltration konzentriert. Die konzentrierten Proben wurden durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Proteine und durch Gegenelektrophorese auf HBo-Ag analysiert Die Ergebnisse der Fraktionierung sind in Tabelle 4 zusammengestellt

Tabelks 4

Hydroxylapatit-Chromatographie I Reinigung des zweiten 4%-PEG-Niederschlags von HBo-Ag

Probe

Volumen	HBo-Ag	Gesamt-')	% Ausbeute²)	Fache³)
	CEP-Titer	protein	HBo-Ag	Reinigung
[ml)		(mg)

Zweiter 4%-PEG- 50
Niederschlag von HBo-Ag
Ottapatit I:

Sammelprobe I 4

Sammelprobe II 6

Sammelprobe III 5

Sammelprobe IV 6

Sammelprobe V 6

Sammelprobe VI 10

Sammelprobe VII 7

#lKjehldahl #s2-8O.D. 280nm E

²) [HBo-Ag] Probe X Volumen [HBo-AgJ Plasma X Volumen

³) [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag [Protein] Probe * lÖÖ

1,143.
X 100.

10000

800

20000

10000

2 600,0

100

63,2	B
87,2	12
183,9	10
110,0	1
72,6	1
984,0	40
338,3	14

3,3
3,6
1,4
0,2
0,3
1,1
1,1

Die Celluloseacetat-Elektrophorese (Fig.5) zeigte im Vergleich zu dem ursprünglichen Plasma (F i g. 5A) zwei Proteinbande in den Fraktionen I (Fig.5E) und Fraktion II (Fig.5D), die zwischen den Bereichen Aiphai, Alpha2 sowie den Fibrinogen- und Beta-GIobulin-Bereichen wanderten. Die Fraktion HI (F i g. 5C) zeigte zwei zusätzliche Komponenten im Bereich des Beta-Globulins und Albumins. Der suspendierte PEG-Niederschlag von HBo-Ag (bei 24facher Konzentration) zeigte kräftige Linien zwischen den Bereichen Alphai und Alpha₂ sowie dem Ursprung (Fibrinogen) und zwei zusätzliche Bande in dem Bereich des Albumins und Gamma-Globulins (F i g. 5B).
Wie in Fig.4 angegeben, wurde das HBo-Ag in drei Antigen-Peaks zerlegt. Die Untersuchung der Proben mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergab hauptsächlich kugelförmige Teilchen von 22 bis 28 nm Durchmesser im ersten Peak (Fraktion I) und Teilchen verschiedener Größe, darunter Dane-Partikel und

so große Fäden, im zweiten Peak (Fraktion II). Der dritte Antigen-Peak (Fraktion VI) enthielt hauptsächlich 16 b'u 22 nm große kugelförmige Teilchen.

Hydroxylapatit-Chromatographie II

Weitere 200 ml der Suspension aus dem resuspendierten PEG-Niederschlag des HBo-Ag wurde auf einer 1000-ml-Hydroxylapatit-Säule fraktioniert. Die Ergebnisse der ehromatögraphisehen Trennung sind in F i g. 6 6ö tion auf 75 ml konzentriert, wiedergegeben. Die HBo-Ag-Fraktionen des ersten

Protein-Peaks (Sammelprobe I: Fraktionen 38 bis 83) und das Resteiuat (Sammelprobe II: Fraktionen 84— 110) wurden jeweils vereinigt und durch Ultrafiltra-

Hydroxylapatit-Chromatographie 111

Die konzentrierte SamTvelprobe I aus der vorstehend beschriebenen Trennung wurde erneut auf einer 1000-ml-Hydroxylapatit-Säule Chromatographien. Die Ergebnisse dieser chromatographischen Trennung sind in Fig. 7 dargestellt. Das Eluat wurde zu 8 Fraktionen gemäß der Figur vereinigt. Die vereinigten Proben

wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mit 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (die 0,02% Natriumazid enthielt)

gewaschen. Dann wurden die Proben auf Proteine und HBo-Ag analysiert. Die Ergebnisse sind >n Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Hydroxylapatit-Chromatographie III

Reinigung der Sammelproben aus der Hydroxylapalit-Chromatographie Il

Volumen

(ml)

0 Hydroxylapatit II:

Sammelprobe I 75

0 Hydroxylapatit III:

Sammelprobe I 5

Sammelprobe II 5

Sammelprobe III 4

Sammelprobe IV 4

Sammelprobe V 12

Sammelprobe VI 7

Sammelprobe VII 45

') O.D._?80nm Ei^ = 3,16
*) [HBo-Ag] Probe X Volumen
[HBo-Ag) Plasma X Volumen
·') [Protein] Hydroxylapatit-Sammelprobe 1 [Protein] Probe

MBo-Ag CF.I'-Titcr

10000

% Ausbeute HBo-Ag Gesamt protein

(mg)

ⁿ> Ausbeute ) I IBo-Ag

706.0

100

Fache¹) Reinigung

8000	51,8	5.3	0,12
2000	14.2	1.3	0,65
I 600	11,4	0,9	0,56
3 200	7,3	1,7	1,64
16000	181,6	25,6	1,00
8000	79,6	7,5	0,61
4000	332,8	24,0	0,51

100

Eine Analyse der Proben auf Verunreinigungen durch Immunelektrophorese (F i g. 8) zeigte eine sehr schwache Präzipitinlinie bei der Fraktion I, eine stärkere Linie bei den Fraktionen Il bis Vl und eine sehr breite Linie bei den vereinigten Fraktionen VII und VIII. Alle wanderten zwischen dem Alphas- und Albumin-Bereich.

Die Elektronenmikroskopie der Proben ergab bei den Fraktionen I bis III hauptsächlich kugelförmige Teilchen von 22 — 28 nm Durchmesser, bei den Fraktionen IV bis Vl kugelförmige Teilchen und Fäden und bei den Fraktionen VII und VIII meist kleine kugelförmige Teilchen.

Die konzentrierten Proben dieser Reinigungsstufe wurden einer vollständigen Reinigung durch dichte Gradienten-Zentnfugation unter den im Abschnitt »Methoden« beschriebenen Bedingungen unterworfen.

Die gereinigten HBo-Ag-Präparate bestanden hauptsächlich aus 20—22 nm großen kugelförmigen Teilchen, 22—28 nm großen kugelförmigen Teilchen, Fäden verschiedener Größe sowie Dane-Partikel, wobei jedes Präparat Ι00μ§ Protein enthielt dessen Polypeptid-Zusammensetzung durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese untersucht wurde (Fig.9). Bei den Protein-Peaks der einzelnen Proben konnten anscheinend quantitative Unterschiede beobachtet werden. Weitere Unterschiede wurden bei dem Peak 5 gefunden, der bei dem Präparat mit 20—22 nm grollen Teilchen nur eine kleine Schulter zeigte (Fig.9A), die bei dem Präparat mit 22—28 nm großen Teilchen (Fig. 9B) und der hauptsächlich Fäden und Dane-Partikel (F i g. 9C) ausgeprägt war. Aliquote Teile der 20—22 nm (Fig. 10A) und 22-28 nm große kugelförmige Teilchen (Fig. 10B) enthaltende Präparate wurden parallel zu den vorstehend beschriebenen Untersuchungen durch Anfärben mit Schiffscher Base auf Kohlenhydrate geprüft 7s ist ersichtlich, daß die Peaks Pi, P₂, Ρ« und P₆ Kohlenhydrate enthalten.

Die niedermolekularen Kohlenhydrate der Peaks (rechts in Fig. 10) sind wahrscheinlich Glycolipide, da

sie sich mit Coomassie-Blau nicht anfärben lassen. Die ungefähren Molekulargewichte der Polypeptide sind in Tabelle 6 aufgeführt

Tabelle 6

Molekulargewicht (X 10³) der Polypeptide der HBo-Ag/e-Teilchen Untertyp: adwx

Peak-Nummer

Pl

P2

P3

P4

P6

P7

P8

P9

Schimpansen-HBo-Ag/e 23-24 26-27 — 44-45 68-69 103-105 108-110 115-118

Aus den die großen Teilchen enthaltenden Fraktionen wurde ein Impfstoff hergestellt, indem 0,5 mg/ml Humanserum-Alb'imin zugesetzt und anschließend eine Inaktivierung durch Kobaltbestrahlung (mit 2.5 Millionen rad). Inaktivierung mit Formalin nach herkömmli- ". chen Methoden (96h bei 37'C, Konzentrationen 1 :20WN und Behandlung mit Beta-Propiolacton nach den bei der Herstellung von Tollwut-Impfstoff gebräuchlichen Verfahren ausgeführt wurde.

IO

Beispiel 2

Modifiziertes, verbessertes PEG-Verfahren zur Isolierung von HBo-Ag/e

Ein modifiziertes Verfahren zur PEGFällung wurde r> auf 2,6 Liter vereinigtes Plasma angewandt, das von einem einzigen Träger-Schimpansen stammte und HBo-Ag sowie e-Antigen in ungebundener, nicht gefällter Form enthielt. Das Plasma wurde auf einen pH-Wert von ungefähr 4,6 eingestellt und unmittelbar 2n danach mit einer 30%igen Lösung von PEG bis zu einer Endkonzentration von 2% versetzt. Die Flüssigkeit wurde auf Eis 30 Minuten abgekühlt (statt sie wie bei dem Verfahren des Beispiels I über Nacht bei 4" C stehenzulassen), und der Niederschlag wurde durch 2^r> Zentrifugieren entfernt.

Die das HBo-Ag enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde durch Zusatz von 6,6 Teilen einer 3O°/oigen PEG-Lösungje 100 Teile Flüssigkeit bei Raumtemperatur auf eine PEG-Konzentration von 4% (statt auf 4,5% wie im Beispiel 1) gebracht. Die Suspension wurde erneut 30 Minuten auf Eis gekühlt, und das ausgefällte HBo-Ag/e wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde erneut in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die Hauptmenge des PEG und einige begleitende Verunreinigungen wurden durch Einstellung des pH-Wertes auf 5.0, 30 Minuten Abkühlen der Flüssigkeit auf Eis und Abtrennen des ausgefallenen Niederschlages durch Zentrifugieren entfernt. Der pH-Wert der klaren überstehenden Flüssigkeit wurde erneut auf 4,6 eingestellt, und 30%iges PEG wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (statt 4,0 bis 4,5% wie im Beispiel I) zugesetzt. Das Material wurde erneut 30 Minuten auf Eis abgekühlt, und der aus HBo-Ag/e bestehende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.

Der das HBo-Ag/e enthaltende Niederschlag wurde erneut in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Hauptmenge des PEG wurde wiederum durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 ausgefällt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4°C wurde die Suspension durch Zentrifugieren geklärt. Die das HBo-Ag/e enthaltende klare überstehende Flüssigkeit wurde mit einer 0,5-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis zu einer Endkonzentration von 0,02-m versetzt, und die Flüssigkeit wurde mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 120 ml gebracht.

Die in Tabelle 7 zusammengestellten Ergebnisse dieser Reinigung zeigen, daß dadurch eine über 33fache Reinigung des HBo-Ag (gegenüber einer 24fachen Reinigung bei dem Verfahren des Beispiels 1) erreicht werden konnte.

Tabelle 7

Reinigung des HBo-Ag durch Fällung mit P.EG 6000

Probe	Volumen	ν inn	100	HBo-Ag	Gesamt	% Ausbeute	Fache
		Λ IUU.	1/CEP-Titer	protein	HBo-Ag²)	Reinigung³)
	(ml)	³) [Protein] Plasma % Ausbeute HBo-Ag		(g)¹)
uiapiuiigiiLiics Plasma	2600	[Protein] Probe ^Λ	50	130,0	100,0	ö,ö
Erste 4%-PEG-Fällung	1200	160	22,8	92,3	5,3
Zweite 3%-PEG-Fällung	120	1600	3,6	92,3	33,3
') Kjehldahl.
2^ [HBo-Ag] Probe X Volumen
[HBo-Ag] Plasma X Volumen

Zu dem besseren Ergebnis des Verfahrens gemäß Beispiel 2 tragen folgende Faktoren bei:

1. Das Abkühlen der Flüssigkeiten 30 Minuten auf Eis statt des Stehens über Nacht verkürzt die Reinigung auf einen Arbeitstag, während bei dem ω Verfahren des Beispiels 1 mehrere Tage nötig sind.

2. Die Verkürzung der Abkühlzeit führt zu einer spezifischeren Fällung des HBo-Ag/e und zu einer geringeren Verunreinigung durch Plasmaproteine.

3. Durch die Verringerung des Volumens der Probe es nach der ersten Fällung des ABo-Ag/e können in den nachfolgenden Stufen kleinere Mengen PEG für die selektive Fällung verwendet werden, und es kann eine zweite Fällung bei einem pH-Wert von 5,0 zur Entfernung der Hauptmenge des PEG aus der Probe vorgenommen werden.

Aus dem Produkt wird Impfstoff durch Zusatz von Albumin und anschließende Inaktivierung in der gleichen Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Fraktionierung von HBo-Ag/e durch
chargenweise Behandlung mit Hydroxylapatit

Der wiedersuspendierte Niederschlag von HBo-Ag/e aus der PEG-Fällung (Beispiel 2) wurde chargenweise

JO

mit Hydroxylapatit statt nach dem Verfahren der Säulenchromatographie behandelt. Eine Menge von 500 ml Füllkörper-Hydroxylapatit wurde in 800 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,? suspendiert, und die Suspension wurde -, nach Zusatz des oben beschriebenen HBo-Ag/e-Präparates 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer gerührt. Die Aufschlämmung wurde in zwei gleiche aliquote Teile geteilt, die in I-I-Bechern 10 Minuten bei 4000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge κι RC-3 geschleudert wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und das Sediment nacheinander mit jeweils 1 Liter 0,02-m und 0,05-m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 gewaschen. Die Eluate wurden vereinigt, durch Ultrafiltration unter ι -> Verwendung einer Membran PM-30 konzentriert, mit 0,02-m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2. die 0,09% NaNj enthielt, diafiltriert und mit der gleichen Pufferlösung auf ein Volumen von 60 ml eingestellt.

Die konzentrierte Probe wurde weiter durch Zonen-Ultrazentrifugation in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten gereinigt.

Die abgetrennten HBo-Ag/e-Teilchen wurden zu drei Fraktionen vereinigt, dialysiert und durch Ultrafiltration 2 > in der oben beschriebenen Weise konzentriert. Eine Untersuchung der Proben mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergab hauptsächlich große Fäden und Dane-Partikel in der Fraktion I (Fig. Ha), Fäden, Dane-Partikel und 22—28 nm große kugelförmige Teilchen in der Fraktion II (Fig. 11b) und 20—28 nm große kugelförmige Teilchen in der Fraktion III (Fig. lic).

Die chargenweise Behandlung des rücksuspendierten PEG-Niederschlags von HBo-Ag/e hat gegenüber dem zuvor beschriebenen Verfahren der Säulenchromatographie den Vorteil, daß die Fraktionierung an einem Tag ausgeführt werden kann, während bei der Säulenchromatographie zur Eluierung 5 Tage erforderlich sind.

Aus dem Produkt wird Impfstoff durch Zusatz von Albumin und Inaktivierung in der gleichen Weise hergestellt, wie im Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 4

Desaggregation der HBo-Ag/e-Teilchen
mit ionenaktiven und nichtionogenen Tensiden

HBo-Ag/e-Teilchen wurden bei Raumtemperatur (5 Minuten bis 2 Stunden) mit folgenden Tensiden _ä0 behandelt: 0,5- bis 2%ige Lösungen von Nonidet NP-40 (einem grenzflächenaktiven Produkt der Shell Oil Co.), 0,5- bis 2%igen Lösungen von Tween 80 (grenzflächenaktives Mittel), 5- bis 10°/oigen Lösungen von Triton X-100 (grenzflächenaktives Mittel), 0,1- bis l,0%igen Lösungen von Natriumdodecylsulfat usw. Dadurch sollten folgende Ziele erreicht werden: 1. Potenzierung der Antigenaktivität in den mit den Tensiden behandelten Proben und 2. Inaktivierung des Infizierungsvermögens der Proben.

Die optimalen Behandlungsbedingungen wurden anhand von Analysen der Proben vor und nach der Tensidbehandlung mit Hilfe der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung bestimmt Die einzelnen Komponenten der desaggregierten Proben können mit Hilfe verschiedener Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Molekularexklusion, Adsorption, Ionenaustausch, Chromatographie, Ultrazentrifugation, verschiedene

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45 Elektrophorese Methoden usw. Eine dieser hochwirksamen Methoden ist die nachstehend beschriebene isoelektrische Fokussierung mit Zonenkonvektion.

Isoelektrische Fokussierung

Aus dem Cellulose-Gel Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in einer l°/oigen Ampholin-Lösung mit einem pH-Wert von 4,0—6,0 oder 3,5 bis 10,0 wurden nach der Methode von Radola dünne Trägerschichten hergestellt. Die Versuche mit diesen Platten wurden in einem LKB-Multiporenapparat ausgeführt. Prints of Whatmann-Chromatographiepapier 3 MM wurden längs der Linie der getrennten Proben unterteilt und in 0,5 bis I cm breite Zonen geschnitten. Die einzelnen Zonen wurden wiederum in kleinere Teile zerschnitten, mit 0,2 ml gepufferter Kochsalzlösung angefeuchtet und mit 0,2 mi normalem Hiimanspnim (frei von HBo-Ag und HB-Antikörpern) eluiert. Ein aliquoter Teil von 200 μΙ eines jeden Eluats wurde für den Radioimmunversuch verwendet. Die Streifen zwischen den getrennten Proben wurden ebenfalls zerschnitten und mit 0,4 ml entgastem destilliertem Wasser eluiert; dieses Eluat wurde zu pH-Messungen verwendet. Soweit zwei Prints aufgenommen wurden, wurde ein Print zum Anfärben des Proteins und der andere für den HBo-Ag-Radioimmunversuch sowie die pH-Messungen verwendet. Ein aliquoter Teil einer jeden Probe wurde vor dem Auftragen auf das Gel mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 5- bis 10%igen Lösung eines nichtionogenen Tensids (Triton X-100) behandelt und zusammen mit einer unbehandelten Vergleichsprobe unter den oben beschriebenen Bedingungen dem Versuch unterworfen.

Isoelektrische Fokussierung
mit Zonenkonvektion

Nach den von Valmet (US-PS 36 16 456) angegebenen Grundsätzen wurde ein Gerät aus Lucit gebaut. Es bestand aus 32 Kammern mit einem Gesamtvolumen von 50 ml. Bestimmte Modifikationen führten zu Verbesserungen. Der Trog wurde mit 50 ml einer Lösung gefüllt, die 1% Ampholin (LKB) des gewünschten pH-Bereichs und 10% Glycerin enthielt. Die Lösung in den Kammern 4,5 und 6 (von der Anode aus gezählt) wurde durch 1,5, 3,0 oder 4,5 ml der Probe ersetzt, die 1% Ampholin und 10% Glycerin enthielt. Die Elektrofokussierung wurde 4 Tage bei 4⁰C mit einer Spannung von 1000 bis 1500V ausgeführt. Nach Abnahme des Deckels wurden die Fraktionen aus den einzelnen Kammern herausgenommen, durch Zentrifugieren geklärt und durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm auf Proteine, durch RIA auf HBo-Ag und auf den pH-Wert untersucht

Analyse der mit Triton X-100
behandelten HBo-Ag/e-Präparate

Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wurden Fraktionen der durch Säuienchromatographie an Hydroxylapatit (Fig.4) isolierten HBo-Ag/e-Teilchen mit Hilfe der isoelektrischen Dünnschichtfokussierung analysiert Ein Präparat das hauptsächlich aus 22—28 nm großen kugelförmigen Teilchen (Fig. 12A) bestand, und ein heterogenes Gemisch, das hauptsächlich aus größeren Teilchen (Fäden, Dane-Partikel) (Fig. 12B) bestand, ergaben eine verhältnismäßig geringe Heterogenität bei den Oberflächenladungen der Teilchen. Ein Hauptpeak der Antigenaktivität

wurde bei einem pH-Wert von 4,8 gefunden, und zwei kleinere Aktivitätspeaks wurden bei pH-Werten im Bereich von 4,0 bis 4,1 sowie 4,4 bis 4,6 beobachtet. Die mit Triton X-IOO behandelten Proben zeig .en bei planimetrischer Auswertung eine zweifache Verstär- ί kung der Antigenaktivität (Fig. 13). Bei anderen Versuchen schwankte die Verstärkung der Aktivität zwischen 2- und 8fach. Abgesehen von einer geringen Antigen-Restaktivität in dem ursprünglichen niedrigen pH-Bereich (pH 4,1—5.0). wurden die Hauptpeaks der i< > Antigenaktivität in einem höheren pH-Bereich von 5,3 und 5,8 bis 5,9, ein kleinerer Peak auch bei pH 7,1 bis 7,2 gefunden. Eine Aktivität des e-Antigens wurde nur in dem pH-Bereich 5,6 bis 7,4 beobachtet. Dieses Antigen wurde in dem Bereich durch den unempfindlichen r> Agar-Gel-Diffusionstest nachgewiesen. Die Menge des e-Antigens in diesem Bereich ist als offensichtlich hoch. Der Peak beim Radioimmunvers'ich in di?s?m Bereich könnte dahei gut eine Verunreinigung der bei der Ausria-Meth.xle (Abbott Laboratories) verwendeten mit J-125 markierten »HBo-Antikörper« durch eine sehr kleine Menge e-Antikörper darstellen.

Eine Desaggregation der HBo-Ag/e durch das nichtionogene Tensid Triton X-100 führt also zu einer Potenzierung der Antigenaktivität. Dies hat bei der Herstellung von Antigenmaterial für die aktive Immunisierung einen offensichtlichen Voiteil. Ein weiterer Vorteil der durch das Tensid hervorgerufenen Desaggregation ist der Umstand, daß dies zu einer physikalischen Dissoziation der HB-Teilchen führt. Wenn überhaupt, so bleiben bei der Behandlung mit Triton X-100 unter den beschriebenen Bedingungen nur wenige Teilchen intakt. Schon dies allein ist ein wichtiger Schritt bei der Inaktivierung des lnfizierungsvermögens. Darüber hinaus kann, falls gewünschi, diese Maßnahme mit anderen Behandlungen, wie der Fällung mit HBc-Antikörpern und/oder der Behandlung mit Desoxyribonuclease, kombiniert werden, um alles zu dem Hepatitisvirus B gehörendes genetisches Material aus dem Impfstoff zu entfernen. Dies kann sich wegen der (theoretischen) Möglichkeit einer Oncogenität als* wünschenswert erweisen.

Dieser Versuch zeigt daher eine Methode zur Reinigung von e-Antigen von den zu dem HBo-Af/e gehörenden Teilchen durch eine Kombination einer Dissoziation durch Triton X-100 und der isoelektrischen Fokussierung mit Zonenictinvektion auf. Nachdem jetzt Geräte zur Ausführung dieser Methode im Mehrliter-Maßstab zur Verfugung stehen (Roche Institute), eignet sich die beschriebene Methode zur Herstellung eines e-Antigen enthaltenden Impfstoffs, der im wesentlichen frei von herkömmlichen HBo-Ag ist. Wie vorstehend dargelegt, bietet ein derartiger Impfstoff offenkundige Vorteile.

Der fertige Impfstoff wird aus der mit Tensid behandelten Fraktion durch Zusatz von Albumin und Inaktivierung nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt

Beispiel

Reinigung von löslichem e-Antigen aus dem Plasma chronischer HBo-Ag/e-Träger zur Verwendung als Impfstoff

Wie vorstehend angegeben (siehe F i g. 2), enthält HBo-Ag/e- positives Plasma auch e-Antigen in löslicher Form (d.h.. nicht in Verbindung mit Teilchen und mit einem Molekulargewicht von unter 1 Million). Tatsächlich dominiert diese Form in vielen derartigen Plasmen, so daß diese eine ideale e-Antigenquelle für die Immunisierung darstellen.

Die Eigenschaften des löslichen e-Antigens sind von Magnius, Ohori und den Erfindern in vorläufiger Weise wie folgt bestimmt worden: Dichte (CsCl) 1,28 bis 1,29 g/cm³; S20.W = 11,6; Molekulargewicht 150 000 bis 900 000; isoelektrischer Punkt 5,5 bis 6,6; Elution von Diäthylaminoäthylcellulose bei 0,15-m NaCl.

Auf der Grundlage dieser und anderer Eigenschaften wurde folgendes Reinigungsverfahren entwickelt:

1. HBo-Ag/e enthaltendes Plasma wird zunächst mit PEG 6000 fraktioniert gefällt, wodurch die zu dem HBo-Ag gehörenden Teilchen und einige Serumproteine entfernt werden. Die Fällung wird bei einer PEG-6000-Konzentration von 5 bis 9 Gew.-%, vorzugsweise 8 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, bei einem pi I-Wert von 7,0 und 20° C ausgeführt. Daran schließt sich die Fällung des e-Antigens und einiger Plasmaproteine mit PEG bei einer Konzentration von 9 bis 13% an. Einzelheiten der fraktionierten Fällung, z. B. der pH-Wert, die Temperatur, die PEG-Konzentration usw. können geändert werden; auch die Fällung bei einem pH-Wert von 5,0 zur Entfernung des PEG kann angewendet werden.

2. Der bei der Fällung mit PEG erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser oder eine* geeigneten Pufferlösung (1/10 des ursprünglichen Volumens) rücksuspendiert und einer isoelektrischen Fokussierung in 10%igem Glycerin, das 1 bis 2% Ampholyte des pH-Bereichs von 3,5 bis 10,0 enthält, unterworfen.

3. das Material des e-Ag-Peaks wird vereinigt, auf einem Amicon-Filter PM 30 gegen eine 0,05-m Phosphatpufferlösung, die 0,01-m Tritou X-100 enthält und einen pH-Wert von 7,6 hat, diafiltriert und einer Säule aus Diäthylaminoäthylcellulose aufgegeben, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis 0,5-m NaCl in der gleichen Pufferlösung ausgeführt. Das e-Antigen wird bei etwa 0,15-m NaCl in hohem Reinheitszustand eluiert.

4. Nach Konzentrierung durch Diafiltration wie zuvor werden die restlichen Verunreinigungen entfernt, falls gewünscht durch Zonen-Ultrazentrifugation in einem 10- bis 30%igen Sucrose- oder äquivalenten Dichtegradienten, wobei das Material des Peaks 11,6 s gewonnen wird.

5. Gereinigtes e-Antigen wird durch Zusatz von Humanserum-Albumin bis zu einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml stabilisiert Die Konzentration und Natur des kolloidalen Stabilisators ist natürlich nicht kritisch.

Derartige Präparate können mit einer Konzentration von etwa 20 μg je Dosis ansteile der Teilchen enthaltenden HBo-Ag/e-Vaccine verwendet und den beschriebenen Inaktivierungs- und Sterilisierungsbehandlungen unterworfen werden.

Hierzu 13 Blatt Zeichnuneen

Claims

Patentansprüche:

1. Hepatitis-B-Impfstoff, der

A. Antigen-Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 30 bis 50 nm aufweist, die ungefällte, freie Hepathis-B-Oberflächenantigene enthalten und aus

a) fadenförmigen Proteinteilchen von länglicher Form und einer Teilchengröße von 30 ι ο bis 50 nm und/oder

b) Dane-Partikel mit einer Teilchengröße zwischen 40 und 50 nm bestehen,

B. weniger als 10 Einheiten Antikörper für Hepatitis-B-Oberflächenantigene je 1000 Einheiten Hepatitis-B-Oberflächenantigene enthält und

C mindestens 5% der Teilchen in dem Größeitbereich vsa 30 bis 50 nm ungefälltes e-Antigen enthält,

erhältlich aus Blutplasma eines chronischen Trägers des Hepatitis-B-Oberflächenantigens, das zum Hepatitis-B-Oberflächenantigen gehörende Teilchen mit einer Größe von 16 bis 50 nm enthält, von denen mindestens einige im Größenbereich von 30 bis 50 nm liegen, und das im wesentlichen frei von Hepatitis-B-Oberflächenantikörpern und e-Antikörpern ist, wobei mindestens 1% der Teilchen sich durch die Gegenwart von freiem, ungebundenem und nicht gefälltem e-Antigen auszeichnen, gewonnen durch Entfernen von Proteinstoffen aus dem Plasma, Inaktivieren altar Virer, in dem Material und Verdünnen des erhaltenen Materials mit physiologisch unbedenklichen Mitteln.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekenn- js zeichnet, daß mindestens 1% der Teilchen in dem Größenbereich von 30 bis 50 nm Desoxyribonucleinsäure (DNS) enthalten.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er lösliches, freies und nicht gefälltes a-Antigen mit einer Dichte von 1,28 bis 1,29 g/cm³ und einem Molekulargewicht von 50 000 bis 900 000 in einem physiologisch unbedenklichen Medium enthält.

4. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, daß er eine Dichte von 1,23 bis 134 g/cm^J hat.

5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er weniger als 10% andere als zu den Hepatitis-B-OberflächerVintigen oder e-Antigen gehörende Proteinstoffe enthält

6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er zu 20 bis 50 μg

Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Teilchen-Protein mit 10⁸ bis 10'² Dane-Partikel und eine oder größere Anzahl fadenförmiger Teilchen dosiert ist.

7. Verfahren zum Herstellen des Impfstoffes nach den Ansprüchen I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Blutplasma auf einen pH-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,7 einstellt, bei diesem pH-Wert zum Ausfällen eines Hepatitis-B-Antigen, das Hepatitis-B-Oberflächenantigen und e-Antigen enthält, enthaltenden Niederschlages mit 3,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, mischt, den Niederschlag abtrennt, mit so viel Wasser versetzt, daß das freie Zwischenprodukt die gleiche oder eine höhere Konzentration ^n Hepatitis-B-Antigen als das ursprüngliche Blutserum hat, das Zwischenprodukt auf einen pH-Wert im Bereich von 4,9 bis 5,1 einstellt und dadurch die nicht zum Hepatitis-B-Antigen gehörenden Proteinstoffe sowie Polyäthylenglykol ausfällt, die die Hepatitis-B- und e-Antigen-Teilchen enthaltende flüssige Phase abtrennt, auf einen pH-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,7 einstellt und zur Ausfällung eines Niederschlages, der gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen und e-Antigen enthält, mit 3,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, mischt und den das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen und e-Antigen enthaltenden Niederschlag, der fadenförmige Protein- und Dane-Teilchen enthält, die ihrerseits nicht gefälltes, ungebundenes, freies e-Antigen enthalten, gewinnt, eine infektiöse Restaktivität des Impfstoffs mit Hilfe von Inaktivierungsmitteln beseitigt und in üblicher Weise zum Impfstoff konfektioniert.